Floresta e Ambiente 2010 jan./jun.; 17(1):37-43 doi 10.4322/floram.2011.

008 ISSN 1415-0980 (impresso) ISSN 2179-8087 (online) Artigo de Pesquisa

Perfis Enzimticos de Gentipos de Caesalpinia ferrea var. leyostachia e Cassia grandis

Allvia Rouse Ferreira dos Santos1, Erica Moraes de Souza2, Renata Silva-Mann3, Robrio Anastcio Ferreira3, Ana Veruska Cruz da Silva4
1

Universidade de Santiago de Compostela USC

2

Universidade Federal de Lavras UFLA Universidade Federal de Sergipe UFS

4

Embrapa Tabuleiros Costeiros

RESUMO
A Caesalpinia ferrea var. leyostachia (pau-ferro) e Cassia grandis (canafstula) apresentam importncia para obteno de mudas para recuperao de reas degradadas, porm pouco se tem na literatura sobre estas espcies. Objetivando-se identificar diferenas em perfis enzimticos destes indivduos foi realizado o presente trabalho. Realizou-se extrao de enzimas lcool Desidrogenase, Esterase, Glutamato Oxaloacetato Transaminase, Peroxidase e Glucose Desidrogenase. Em apenas trs dos sistemas observou-se atividade, sendo a Esterase a que apresentou maior nmero de bandas. Notaram-se perfis diferenciados entre os gentipos de canafstula e entre os gentipos de pau-ferro avaliados, permitindo-se inferir sobre a diversidade existente entre os indivduos.

Palavras-chave: variabilidade gentica, sementes, isoenzimas.

Enzymatic Profile of Caesalpinia ferrea var. Leyostachia and Cassia grandis

ABSTRACT
Caesalpinia ferrea var. Leyostachia and Cassia grandis are important species for obtaining and propagating seedlings for reforestation in degraded areas, but rare is the information about those species in the literature. This study was carried out to estimate the genetic diversity between individuals of C. ferrea and between individuals of C. grandis. The enzymes used were the following: Alcohol Dehydrogenase, Esterase, Glutamate Oxaloacetate Transaminase, Peroxidase and Glucose Dehydrogenase. Only three of the systems presented activities and the Esterase system presented a higher number of bands. Differentiated patterns between C. ferrea individuals and between C. grandis individuals were observed, thus, permitting to infer that there is genetic diversity of individuals.

Keywords: genetic variability, seed, isoenzymes.

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1. INTRODUO
O Estado de Sergipe sofre com as transformaes causadas pela destruio dos recursos naturais relacionadas com a mata ciliar e florestas naturais, restando destes, faixas isoladas e distantes, contribuindo para a homogeneidade da natureza. Sendo assim, necessrio um estudo da diversidade gentica das matrizes fornecedoras de sementes, para que sejam montadas estratgias de manejo e auxlio em reas degradadas visando conservao e manuteno da variabilidade gentica de forma a assegurar geraes futuras. Esta perda de recursos naturais tem sido consequncia da ao antrpica, em que diversas espcies tm desaparecido, dentre elas a canafstula (Cassia grandis Linnaeus f.) e o pau-ferro (Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth), pertencentes Famlia Leguminosa Caesalpinoideae. Ambas apresentam grande importncia na vegetao marginal dos cursos de gua, controlando a eroso, o assoreamento, auxiliando no controle da temperatura e tambm podem ser usadas como quebra-vento. Na rea urbana, seu papel est relacionado a fins paisagsticos proporcionando bem-estar populao. A importncia do estudo da diversidade de espcies arbreas, em programas de restaurao dos ecossistemas degradados, vem se consolidando ao longo dos anos. Estes estudos promovem inferncias quanto escolha de indivduos que funcionem como matrizes fornecedoras de sementes, assim como na forma de dispor as mudas dessas espcies no campo a fim de promover a sustentabilidade da futura populao (Kageyama e Gandara, 2000). A canafstula e o pau-ferro so espcies pouco conhecidas geneticamente, e tm potencial uso em programas de restaurao de reas degradadas. As anlises da variao isoenzimtica tm se expandido em pesquisas de gentica florestal. As principais aplicaes destas tcnicas tm sido na investigao dos padres de variao gentica e dos sistemas de cruzamento. Estas aplicaes aumentam o conhecimento da estrutura gentica em populaes naturais, aumentando a eficincia do programa e dos esforos de conservao de genes de rvores ameaadas de extino (Oliveiraetal., 2002).

A conservao gentica de uma espcie requer o conhecimento de seu sistema de reproduo, variabilidade e estrutura gentica. Tais estudos podem ser eficientemente realizados com base em dados de marcadores bioqumicos, como isoenzimas (Furnieretal., 1986; Gillet & Hattemer, 1989) Estes marcadores so importantes ferramentas para avaliar a estrutura gentica e a distribuio da variabilidade entre indivduos em programas de restaurao. Uma condio fundamental para que haja evoluo a existncia de variao gentica. A seleo natural atua entre as variantes dentro das populaes em relao adaptao ao ambiente, proporcionando variao entre populaes e, por fim, variao entre espcies (Torggleretal., 1995). A conservao de espcies tem por base a manuteno dos nveis naturais de variabilidade gentica nas populaes (Yeehetal., 1996). Na regio do Estado de Sergipe, as espcies arbreas utilizadas para programas de restaurao tm sido encontradas em nmero reduzido de indivduos, em particular, para a espcie de pauferro e canafstula, somente foi possvel encontrar cinco indivduos na regio do Campus da UFS no municpio de So Cristvo, os quais tm sido empregados na coleta de sementes. Contudo, para que esta ao seja continuada, realizou-se o presente trabalho visando verificao da proximidade gentica destes cincos indivduos de pau-ferro e canafstula utilizando marcadores enzimticos. Com as informaes de similaridade gentica podero ser definidas estratgias para coleta e conservao de sementes e obteno de mudas, que sero empregadas para recuperao de reas degradadas.

2. MATERIAL E MTODOS 2.1. Material vegetal

Folhas jovens de cinco indivduos de canafstula e de cinco indivduos de pau-ferro localizados no Campus da Universidade Federal de Sergipe (UFS), ambos fornecedores de sementes para programa de restaurao de reas degradadas, foram coletadas, sendo estes indivduos georreferenciados com auxlio do aparelho GPS (Global Positioning System) - Etrex modelo Camo.

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2.2. Extrao de enzimas

Foram macerados dois gramas do material jovem e tenro de ambas as espcies, individualmente, com uso de almofariz e pistilo de porcelana previamente resfriados. Adicionou-se 1.000 L de Tampo n 1 de Alfenas et al. (1991), 10 mg de PVP e 10 L de -mercaptoetanol. Aps a macerao, os extratos foram colocados em microtubos de 1,5 mL, previamente identificados e levados centrifugao por 10 minutos a 4 C e rotao de 12.000 RPM, sendo posteriormente armazenados em freezer a 18 C, para que no ocorresse a degradao das enzimas.

cada espcie, de acordo com a frmula proposta por Nei & Li (1979) (Equao 1):
Sij = X ni X nj N (1)

em que: Sij = similaridade gentica entre o gentipo i e o gentipo j; Xni = escore para a banda n no gentipo i; Xnj = escore para a banda n no gentipo j; N = total de bandas avaliadas. A matriz de similaridade gentica obtida entre os gentipos foi submetida a uma anlise pelo Mtodo de Agrupamento pela Mdia (UPGMA) no programa NTSYS-PC (Rohlf, 2001).

3. RESULTADOS E DISCUSSO
Nas inferncias sobre a diversidade gentica de ambas as espcies, foram utilizados cinco sistemas enzimticos, porm, apenas trs apresentam atividade enzimtica, alguns destes com locos altamente polimrficos sugerindo uma possvel variabilidade gentica. O pau-ferro apresentou maior nmero total de bandas e alelos do que a canafstula (Figura 1). Para a espcie de pau-ferro, houve a presena total de 16 locos com 24 alelos; j para a canafstula,

2.3. Corrida eletrofortica

Foram utilizados 30 L do sobrenadante em gel de poliacrilamida descontnuo, sendo o gel concentrador de 4,5% e o gel separador de 7,5% (Alfenas et al., 1991). A corrida vertical durou 3 horas e 30 minutos, sob amperagem de 10 mA temperatura de 4 C.

2.4. Revelao das enzimas

Aps a corrida eletrofortica, procedeu-se revelao dos gis segundo Alfenas et al. (1991), para o sistema enzimtico Esterase (EST 3.1.1.1), Glutamato Oxaloacetato Transaminase (GOT 2.6.1.1), Peroxidase (EC 1.11.1.7). lcool Desidrogenase (ADH EC 1.1.1.1) e Glucose Desidrogenase (GLUDH EC 1.1.1.47). Aps o surgimento das bandas, os gis foram retirados da soluo de revelao, lavados em gua corrente e fixados em soluo de glicerol a 10%.

2.5. Clculo da mobilidade relativa (RF)

Foi empregada a frmula sugerida por Alfenas (1991): Rf = (d/D) x 100, onde: d = distncia percorrida pela molcula e D = distncia percorrida pela corrente eltrica.
Figura 1. Zimograma obtido de trs sistemas isoenzimticos: Esterase (EST), Glutamato Oxaloacetato Transaminase (GOT) e Peroxidase (EC) para cinco indivduos de Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) e Cassia grandis (CF). Figure 1. Zimogrames obtained for tree isoenzimatic systems: Esterase (EST), Glutamate Oxaloacetate Transaminase (GOT) and Peroxise (EC) for five individuals of Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) and Cassia grandis (CF).

2.6. Similaridade gentica

Foi utilizada uma matriz binria de 0 (ausncia de banda) e 1 (presena de banda), realizando o clculo de Similaridade Gentica (Sij) entre os gentipos de

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12 locos com 20 alelos, distribudos entre os trs perfis isoenzimticos (Tabela 1). Pinto & Carvalho (2004) estudaram duas populaes de Xylopia brasiliensis Sprengel por meio de sete sistemas isoenzimticos, visando determinar os nveis de variabilidade gentica mantidos entre e dentro das populaes, verificaram a presena de 36 alelos totais distribudos em 16 locos. No nosso estudo, pode-se inferir, em comparao com o trabalho anterior, que apesar do nmero reduzido de indivduos e de sistemas utilizados, h um polimorfismo relativamente alto para as espcies. O sistema EST foi o sistema que mais apresentou polimorfismo e locos para ambas as espcies, sendo todos polimrficos. Para a espcie de pau-ferro houve maior atividade enzimtica, com 11 locos, e em canafstula 8 locos. O sistema isoenzimtico Esterase constitudo por um complexo e heterogneo grupo de enzimas reativas com uma ampla gama de substratos especficos (Scandalios, 1969). As variantes dessas protenas encontradas em plantas, por exemplo, so geralmente monomricas ou dimricas (Weeden & Wendel, 1990), com um alto nvel de variabilidade (Gillespie & Langley, 1974). Em razo disso, Esterase um dos sistemas isoenzimticos mais polimrficos em plantas (Weeden & Wendel, 1990). Para o sistema GOT, houve atividade para trs das matrizes de pau-ferro (PF3, PF4 e PF5) com dois locos. J para a canafstula, esse sistema apresentou maior quantidade de locos (quatro). As matrizes CF1 e CF5 no apresentaram atividade enzimtica, e nas demais (CF2, CF3 e CF4) o nmero de bandas variaram de dois a trs. Resultado semelhante foi encontrado em espcies do mesmo gnero, o pau-brasil (C. equinata),

encontrando no sistema GOT somente uma zona de atividade enzimtica, interpretada como um loco monomrfico com um alelo fixado (GiudiceNetoetal., 2004). A enzima Glutamato Oxalocetato Transaminase tem uma importante participao em reaes de transaminao, durante a eliminao do nitrognio dos aminocidos e na formao de grupos ceto para o Ciclo de Krebs e gluconeognese (Tanksley, 1983). No sistema EC, somente a espcie de pau-ferro apresentou atividade enzimtica, sendo que apenas para os indivduos PF1 (uma banda) e PF5 (trs bandas distintas), totalizando trs locos. O no aparecimento de banda no gel pode estar ligado a alelos nulos ou raros, ou ainda ocorre ocasio em que a segregao pode estar distorcida por modificaes ps-transcricionais ou ainda por algum fator na hora da extrao (Ricketal., 1979). Limaetal. (2002) complementa que a atividade da peroxidase pode ser alterada por fatores externos como luz ou outras radiaes, estresse (sais e temperatura). Estas enzimas tm sido caracterizadas durante a germinao de sementes, assim como, nos estgios de crescimento (Egleyetal., 1983; Van Huystee, 1987). Observando a mobilidade relativa (Rf) entre os indivduos, tanto para o pau-ferro quanto para a canafstula, nota-se que houve distintos valores para mobilidade relativa entre os perfis eletroferticos adquiridos pelos sistemas enzimticos (Tabela 2). Para o sistema EST, para o pau-ferro, o maior valor da Rf foi observado para o indivduo PF3 (72,5) e a menor para PF4 (24,36), j para a canafstula foram para o CF1 (39,24) e CF5 (78,75), respectivamente. Analisando a posio das bandas entre os indivduos, percebe-se que os indivduos

Tabela 1. Nmero total de locos e alelos para os sistemas isoenzimticos: Esterase (EST), Glutamato Oxalacetato Transaminase (GOT) e Peroxidase (EC) para indivduos de Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) e Cassia grandis (CF). Table 1. Total number of loco and alleles for isoenzyme systems: Esterase (EST), Glutamate Oxaloacetate Transaminase(GOT) and peroxidase (EC) to individuals of Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) and Cassia grandis (CF). Espcie
PF CF Total

Locos
2 4 6

GOT

Alelos
3 8 11

Locos
11 8 22

EST

Alelos
17 12 27

Locos
3 3

EC

Alelos
4 4

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Tabela 2. Mobilidade relativa dos sistemas isoenzimticos: Esterase (EST), Glutamato Oxalacetato Transaminase (GOT) e Peroxidase (EC) para indivduos de Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) e Cassia grandis (CF). Table 2. Relative mobility the system isozymes: Esterase (EST), Glutamate Oxaloacetate Transaminase (GOT) and peroxidase (EC) to individuals of Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) and Cassia grandis (CF). Matrizes PF
Rf = 25,00 Rf = 33,75 Rf = 53, 75 Rf4 = 58,75 Rf = 43,75 Rf = 51,25 Rf = 55,00 Rf4 = 60,00 Rf = 43,75 Rf = 50,00 Rf = 60,00 Rf4 = 72,5 Rf = 53,16 Rf = 62,02 Rf = 24,36 Rf = 34,61 Rf = 70,51

EST

CF
Rf1=39,24 Rf2=50,63

PF
-

GOT

CF
-

EC PF
Rf = 18,28

Rf1=40,00 Rf2=51,25

Rf1=41,77 Rf2=46,83

Rf1=40,74 Rf2=51,85 Rf3=76,54 Rf1=41,25 Rf2=53,75 Rf1=42,50 Rf2=53,75 Rf3=78,75

Rf = 50,00

Rf1=39,24 Rf2=43,03 Rf3=49,36 Rf1=39,24 Rf2=43,03 Rf3=49,36 -

Rf = 46,15

Rf = 50,00

Rf = 7,53 Rf = 18,28 Rf = 26,88

PF2 e CF3 (51,25), PF2 e PF3 (60,00) e CF4 e CF5 (53,75) apresentaram a mesma mobilidade relativa. Para a o sistema GOT, os indivduos de pau-ferro, o maior valor foi observado para PF3 e PF5 (50,00) e o menor para PF4 (46,15), j para a canafstula os valores foram verificados para o CF3 e CF4 (49,36; 39,24). Para o sistema isoenzimtico EC, o maior e menor valor da Rf foi observado para o indivduo PF5 (26,88; 7,53) e houve entre PF1 e PF5 a mesma mobilidade relativa (18,28). Entre todos os sistemas isoenzimticos foram verificadas as mesmas Rfs entre o sistema EST e GOT (PF3 e PF5 50,00; PF31, PF3 e PF5 - 53,75) As diferenas de mobilidades encontradas neste estudo contriburam para avaliar o polimorfismo existente bem como a diversidade gentica entre os indivduos. A mobilidade relativa nas bandas no gel importante para definir codominncia, segregao de alelos, sendo bastante caracterstico de enzimas monomricas em que cada alelo de um loco tem uma banda caracterizada por uma distncia de migrao (Quirs, 1993). De acordo com Ballv (1988), o deslocamento uniforme das bandas quanto ocorrncia de maior ou menor nmero de bandas

em amostras extradas em diferentes estdios de desenvolvimento so fenmenos comuns e refletem modificaes ps-traduo e/ou expresso de locos especficos em certas fases de desenvolvimento do vegetal. Autores concordam que a mobilidade relativa importante para identificao de diferenas e similaridade entre espcie, alm da identificao e caracterizao de perfis de uma espcie (Lima & Menezes, 2002). Os resultados de Rf apresentados permitem que estes sejam utilizados em outros trabalhos de investigao e empregados para comparao, pois no se encontram na literatura resultados deste tipo com estas espcies nativas. Com base nos perfis eletroforticos, foi possvel obter o agrupamento entre os indivduos a partir da similaridade gentica de Nei & Li (1979). Com base no dendrograma, utilizando o critrio de corte 30% de similaridade gentica para ambas as espcies, houve a formao de cinco grupos (Figura 2). Em canafstula, observou-se a formao de trs grupos principais: o primeiro foi composto pelo gentipo CF1; o segundo por CF2, CF3 e CF4; e o terceiro grupo foi composto por CF5. As matrizes de pau-

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gentica entre as sementes que formaro as mudas que futuramente iro compor o ambiente degradado. A tcnica de isoenzimas auxilia na caracterizao das distncias genticas, sendo o uso deste marcador til para estimar diferenas entre indivduos. Este tipo de estudo possibilita a obteno de informaes prvias da estrutura gentica da populao, permitindo, dessa forma, obter inferncias sobre o nvel de variabilidade e do potencial de manipulao, podendo os resultados gerados servir de ferramentas para definio de estratgias de conservao gentica (Pimentel, 1988). Assim, com base no exposto, as matrizes de pauferro e canafstula do Campus da UFS apresentaram variabilidade em relao ao padro e nmero de bandas para os trs sistemas enzimticos, sendo as informaes geradas teis para originar informaes para manejo das espcies em programas de restaurao. So limitados os estudos sobre estas espcies em Sergipe, em especial o pau-ferro: uma espcie que apresenta carter de risco de extino no Estado e no mais encontrada em algumas regies.

Figura 2. Dendrograma de similaridade gerado pelo mtodo de agrupamento pela mdia (UPGMA) relativo aos indivduos de Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) e Cassia grandis (CF), para Esterase (EST), Glutamato Oxaloacetato Transaminase (GOT) e Peroxidase (EC), agrupados de acordo com a similaridade de Nei & Li (1979). Figure 2. Similarity dendrogram generated by Unweighted Pair Group Method with Arithmetic (UPGMA) on individuals of Caesalpinia ferrea var. leyostachia Benth (PF) and Cassia grandis (CF) for Esterase (EST), Glutamate Oxaloacetate Transaminase (GOT) and Peroxise (EC), grouped according to similarity of Nei & Li (1979).

4. CONCLUSES
O sistema Esterase apresenta maior polimorfismo e nmero de bandas para ambas as espcies. Existe variabilidade gentica entre os gentipos de C. ferrea var. leyostachia e C. grandis avaliados.

ferro dividiram-se em dois grupos, sendo o primeiro formado pelos indivduos PF1 e PF5, e o outro pelos indivduos PF2, PF3 e PF4. Os indivduos de pau-ferro mais similares foram PF2 e PF3 (75%), sendo o indivduo mais divergente PF4 (59%). Para canafstula, o par CF3 e CF4 (88%) foram os mais semelhantes, ao contrrio do indivduo CF1 (100%), que se destacou como o mais divergente. Com base nos resultados de similaridade gentica, pode-se inferir que os indivduos podem ser utilizados como matrizes fornecedoras de sementes para produo de mudas, contudo como h indivduos semelhantes, como estratgia de coleta, a depender da poca e da quantidade de indivduos em frutificao, deve-se suprimir um dos indivduos PF2 e PF3, para o pau-ferro, e CF3 e CF4, para a canafstula, a fim de promover a maior variabilidade

STATUS DA SUBMISSO
Recebido: 09/04/2009

AUTOR(ES) PARA CORRESPONDNCIA

Renata Silva-Mann Universidade Federal de Sergipe UFS, Av. Marechal Rondon, s/n, CEP 49100-000, Sao Cristvo, SE, Brasil e-mail: renatamann@gmail.com Allvia Rouse Ferreira dos Santos Universidade de Santiago de Compostela USC, Campus Universitrio de Lugo c/ Benigno Ledo, s/n, CP 27002, Lugo, Espanha e-mail: alliviarouse@hotmail.com

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