Avaliao de detergentes na solubilizao de protenas de membrana eritrocitria humana em eletroforese bidimensional

Cleyton C. Domingues Mestre em Biologia Funcional e Molecular - UNICAMP Professor da Faculdade Comunitria de Santa Brbara e-mail: cleytoncd@hotmail.com Elizabeth S. Cunha Graduada em Enfermagem - UNICAMP e-mail: bescunha@uol.com.br Flavia V. Winck Graduada em Cincias Biolgicas - UNICAMP e-mail: flavia@proteome.ibi.unicamp.br Sonia V. P Malheiros . Doutora em Cincias Biolgicas, rea: Bioqumica - UNICAMP Professora da Faculdade de Medicina de Jundiai e-mail: sonia.malheiros@uol.com.br Eneida de Paula Doutora em Qumica - USP Professora da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP e-mail: depaula@unicamp.br

Resumo H dcadas a composio protica da membrana eritrocitria vem sendo estudada por eletroforese bidimensional. Avanos tecnolgicos tm proporcionado uma separao cada vez melhor dessas protenas, onde a escolha do detergente fundamental. Novos detergentes tm sido sintetizados, principalmente para melhorar a solubilizao das protenas mais hidrofbicas. A solubilizao das protenas da membrana eritrocitria humana, promovida pelo uso de diferentes concentraes e associaes dos detergentes CHAPS, ASB14, ASB-16 e Triton X-100 foi avaliada atravs da tcnica de eletroforese bidimensional. CHAPS solubilizou um maior nmero de protenas em relao aos demais detergentes utilizados, porm verificamos que ASB-14 e ASB-16 solubilizaram seletivamente outras protenas. Embora o uso de associao entre CHAPS e ASB no tenha resultado em um aumento no nmero de spots em relao ao uso de CHAPS, os detergentes ASB-14 e ASB-16 se mostraram promissores para a caracterizao das protenas de membrana eritrocitria e tambm para estudos protemicos. Palavras-chave: protenas, membrana, eritrcito, detergente, eletroforese.

Abstract In the last decades bidimensional electrophoresis has been extensively used to determine the protein composition of the erythrocyte membrane. Technological advances allowed increased resolution of membrane proteins, depending also in the choice of the proper detergents. Novel detergents have been synthesized, especially for the solubilization of the more hydrophobic proteins. In this work, using bidimensional electrophoresis, we have evaluated the solubilization of human erythrocyte membrane proteins promoted by different concentrations and associations of detergents: CHAPS, ASB14, ASB-16 and Triton X-100. Among these detergents, CHAPS revealed a greater number of protein spots, but ASB-14 and ASB-16 selectively solubilized other proteins not visualized by CHAPS. Although the association of CHAPS and ASB has not improved the resolution of gels in comparison to CHAPS alone, the use of aminosulfobetaine ASB-14 and ASB-16 detergents proved to be very useful for the identification and characterization of erythrocyte membrane proteins and for proteomic studies. Key-words: proteins, membrane, erythrocyte, detergent, electrophoresis.

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Introduo A composio da membrana eritrocitria lhe permite desempenhar suas funes assim como manter sua capacidade de deformao e estabilidade (CHASIS & SHOHET, 1987). Devido sua resistncia mecnica e flexibilidade, a membrana plasmtica permite ao eritrcito atravessar o sistema vascular enquanto mantm sua forma bicncava, necessria para mxima troca gasosa. Alm disso, a membrana plasmtica tambm isola o contedo celular do meio exterior, regula concentraes intracelulares de ons e interage com o ambiente, via receptores de membrana (LOW et al., 2002). Baseando-se no seqenciamento completo do genoma humano foi postulado que 30% das protenas celulares presentes no eritrcito so protenas transmembranares (PAULSEN et al., 1998; WALLIN et al., 1998). Desde a dcada de 70 muitos trabalhos tm sido conduzidos na aplicao de eletroforese bidimensional para separar e catalogar as protenas de membrana eritrocitria (BHAKDI et al., 1975; RUBIN & MILIKOWSKI, 1978; RABILLOUD et al., 1999). No entanto, somente nos ltimos anos que os avanos tecnolgicos nas tcnicas de separao de protenas (principalmente eletroforese bidimensional e espectrometria de massas) associados bioinformtica tm possibilitado um conhecimento cada vez mais detalhado sobre a estrutura e a funo dessas protenas (LOW et al., 2002). A eletroforese bidimensional um mtodo fundamental de separao e identificao de protenas na rea protemica, pois pode ser usada para visualizar um grande nmero de protenas simultaneamente e suas diferentes isoformas (HAYNES et al., 2000; LOW et al., 2002). No entanto, a eletroforese bidimensional apresenta ainda algumas limitaes como reprodutibilidade e boa resoluo de protenas pouco abundantes e/ou hidrofbicas de alta massa molecular. Dessa forma, o processo de solubizao de protenas um passo muito importante em estudos protemicos e, em relao natureza e concentrao de detergentes, diferentes protocolos tm sido sugeridos. A adio de detergentes a sais caotrpicos como uria e tiouria nos tampes de amostra para focalizao isoeltrica demonstraram aumentar o nmero de protenas visualizadas em gel bidimensional, permitindo separar protenas hidrofbicas como as integrais de membrana (HERBERT, 1999). Entre os novos detergentes utilizados pra extrao de protenas de membrana esto os zwiterinicos da famlia amidosulfobetana contendo cadeia alquil com 14 e 16

tomos de carbono, ASB-14 e ASB-16, respectivamente, que foram sintetizados por Chevallet et al. (1998). Esses detergentes apresentam propriedades combinadas de detergentes inicos e no inicos de acordo com o pH do meio. O uso dos detergentes ASB-14 e ASB-16 em tampes contendo uria/tiouria tem favorecido a solubilizao de um maior nmero de classes proticas, em relao a outros detergentes mais convencionais como CHAPS (CHEVALLET et al., 1998; MOLLOY et al., 1999; HENNINGSEN et al., 2002). Dessa forma, nesse estudo investigamos o efeito detergentes CHAPS, ASB-14, ASB-16 (zwiterinicos) e Triton X-100 (no inico) na solubilizao de protenas de membrana eritrocitria, utilizando eletroforese bidimensional. Materiais e Mtodos Os detergentes ASB-14 e ASB-16 foram obtidos da Calbiochem (La Jolla, EUA) e os detergentes CHAPS e Triton X-100 da Sigma Chemical Co. (St. Louis, EUA). Membranas eritrocitrias foram obtidas partir de sangue humano, fornecido pelo Hemocentro da UNICAMP. Isolamento da membrana eritrocitria (ghosts) O sangue humano foi lavado 3 vezes com PBS 5 mM (NaH2PO4 1 mM, Na2HPO4 4 mM e NaCl 147 mM), pH 7,4 para remoo do plasma, clulas brancas e gorduras. O concentrado de hemceas foi ento submetido centrifugao com tampo fosfato 5 mM, pH 8,0 (5P8) na presena de inibidor de proteases (1mM PMSF) a 4C, por 20 min, a 26000 x g; o sobrenadante foi descartado e esse processo foi repetido diversas vezes (5-8 lavagens), segundo a tcnica de Dodge et al. (1963). A dosagem de protenas nas preparaes de ghosts de eritrcitos foi realizada de acordo com o mtodo de Lowry et al. (1951), utilizandose uma curva-padro de soro albumina bovina. As amostras foram ento congeladas a 70 C para os testes de solubilizao de protenas de membrana. Focalizao isoeltrica A focalizao isoeltrica foi realizada com fitas IPG (gradiente de pH imobilizado, GE Biosciences) com gradiente de pH 3-10 no-linear de 18 cm. As fitas foram reidratadas em 350 mL de tampo de reidratao que continha 60 mg de protenas de membrana, 7 M de uria, 2 M de tiouria, 60 mM de ditiotreitol, 5% de tampo 39

IPG pH 3-10 no-linear e 65 ou 46 mM de detergente (ASB-14, ASB-16, CHAPS ou Triton X-100). Em alguns experimentos foram utilizadas associaes de CHAPS (65 mM) e ASB (46 mM). Aps 12 horas de reidratao a focalizao isoeltrica foi iniciada, nas seguintes condies: 50 mA/strip; no primeiro estgio utilizou-se 500 V durante 1 hora; no segundo estgio 1000V durante 1 hora; e no terceiro estgio 8000 V, at se atingir o acumulo de 96000 Vh. Em seguida ao trmino da focalizao isoeltrica, as fitas IPG foram imediatamente equilibradas para a segunda dimenso (SDS-PAGE) ou congeladas a -80C. Eletroforese SDS-PAGE A SDS-PAGE foi realizada com o tampo Trisglicina descrito por Laemmli (1970), usando-se um sistema de eletroforese Hoefer SE 600 (GE Biosciences). Os gis de poliacrilamida foram preparados a 12,5%. Utilizou-se 60 mg de protenas de ghosts de eritrcitos e a corrida procedeu em duas etapas: a primeira com 60 V fixos durante 1 hora e a segunda com 30 mA por gel durante aproximadamente 3 horas. A colorao dos gis foi feita por impregnao com prata (BLUM et al., 1987) e a deteco dos spots foi feita atravs do software ImageMaster 2D verso 3.01 (GE Biosciences). Os gis foram feitos em triplicata. Resultados e Discusso A separao de protenas hidrofbicas, principalmente aquelas de alta massa molecular, um desafio nos gis de eletroforese bidimensionais, e tendo em vista que a presena de SDS incompatvel com o sucesso da primeira dimenso (focalizao isoeltrica) necessrio o uso de detergentes moderados como o CHAPS (HAYNES et al., 2000). O uso de reagentes capazes de aumentar a solubilizao de protenas de membrana tem permitido, cada vez mais, que protenas hidrofbicas como as protenas integrais de membrana sejam visualizadas em gis bidimensionais. O uso de uria e tiouria nas solues de amostras para focalizao isoeltrica aumenta a solubilidade de protenas em IPGs e o nmero de protenas visualizadas na segunda dimenso. Como a tiouria requer altas concentraes de uria para favorecer sua solubilidade em gua, foi proposto (RABILLOUD et al., 1997) o uso de uma soluo de amostra otimizada para focalizao isoeltrica contendo 7 M de uria, 2 M de tiouria e 4% de CHAPS. No entanto, a solubilidade de alguns detergentes empregados na soluo de amostra para focalizao 40

isoeltrica diminuda na presena de altas concentraes de uria. Os detergentes zwiterinicos desenvolvidos por Chevallet et al. (1998) foram sintetizados com o intuito de resolver o problema de incompatibilidade existente entre os agentes caotrpicos e alguns detergentes. Dessa forma ASB-14 e ASB-16, que apresentam maior carter polar que outros detergentes, alm de serem solveis em altas concentraes de uria (7-8 M), permitem a separao e a deteco de um maior nmero de protenas de membrana (CHEVALLET et al., 1998; MOLLOY et al., 1999; HENNINGSEN et al., 2002). CHAPS, a 4%, tem sido intensamente utilizado nos processos de eletroforese bidimensional (SANTONI et al., 1999, LOW et al., 2002, ZHANG et al., 2005). Low et al. (2002) utilizando CHAPS em gel bidimensional de ghosts de eritrcitos humanos e espectrometria de massa, identificaram 102 spots diferentes e verificaram ainda que algumas protenas eram detectadas exclusivamente no gel monodimensional (SDS-PAGE). J para os detergentes ASB 14 e ASB 16 tem-se descrito na literatura o uso de solues a 12% (CHEVALLET et al., 1998, OLIVIERI et al., 2001, HENNINGSEN et al., 2002, ZHANG et al. 2005). Neste trabalho, fizemos uma anlise comparativa da solubilizao das protenas de membrana eritrocitria na presena dos detergentes CHAPS, ASB-14, ASB16 e Triton X-100 em gis bidimensionais, utilizando as diferentes concentraes descritas na literatura. A Figura 1A mostra o perfil eletrofortico das protenas de ghosts de eritrcitos humanos em gel bidimensional, com o uso convencional de CHAPS a 4% (65 mM), resultando em 105 spots detectados. Os perfis eletroforticos obtidos com o uso de ASB-16, ASB-14 e Triton X-100 esto representados nas figuras 1B, 1C e 1D, respectivamente, e o nmero de spots detectados foram: 73 para ASB-16, 81 para ASB-14 e 67 para Triton X-100.

pH3

pH 10

Em relao aos spots obtidos com o uso de ASB-14 (Figura 1C), somente 18,5% deles apresentaram homologia com aqueles obtidos com o uso de CHAPS (Figura 1A). No entanto, quando ASB-16 e Triton X-100 foram usados, as quantidades de spots homlogos, em relao aos obtidos com CHAPS, foram superiores a 40% (42,5% com uso de ASB-16 e 47,8% com uso de Triton X-100). Dessa forma, apesar de um maior nmero de spots ter sido encontrado com o uso de CHAPS, necessrio levar em considerao que vrios spots diferenciais foram obtidos com uso dos outros detergentes (Figuras 1B, 1C e 1D), principalmente ASB-14. Alm disso, comparando os spots obtidos nos gis tratados com ASB-16 e ASB-14, 35,6% deles apresentaram homologia, evidenciando a existncia de um efeito diferencial desses detergentes sobre a solubilizao das protenas de membrana eritrocitria. Embora a atribuio das protenas identificadas em gis de eletroforese bidimensional esteja associada espectrometria de massas, a anlise dos gis apresentados na Figura 1 revelou a presena de protenas com diferentes massas moleculares e pontos isoeleltricos. As caractersticas dos spots detectados na Figura 1 esto descritas nas Tabelas 1, 2, 3 e 4. Embora CHAPS e ASB sejam detergentes da mesma famlia (amidosulfobetana), a poro hidrofbica do CHAPS distinta dos ASB e isso pode levar a formao de um agregado micelar que favorea a 41

solubilizao diferencial de protenas pelo CHAPS, em relao aos ASB, justificando os resultados obtidos. Alm disso, observa-se que os detergentes altamente lticos, Triton X-100 e ASB, permitiram a visualizao de um menor nmero de protenas em relao ao CHAPS, que possui um menor potencial ltico (PRET et al., 2002; DOMINGUES, 2004). Esses resultados sugerem que o potencial de solubilizao proteica de um detergente no est diretamente relacionado ao seu potencial ltico.

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43

A concentrao de detergente utilizada no processo de solubilizao de protenas pode, muitas vezes, no ser a ideal para atingir o mximo da solubilizao. No entanto, a eficincia mxima da solubilizao depende tambm da razo em massas entre surfatante/protena (SCHUCK et al., 2003). Sendo assim, uma diferena mais significativa no efeito solubilizante pode ser encontrada pelo aumento dessa razo. Nas nossas condies experimentais verificamos que o nmero de spots obtidos quando utilizamos uma menor razo detergente/protena (46 mM detergente) praticamente no se altera, para os ASB. No entanto, para o CHAPS uma diminuio na concentrao afetou significativamente sua eficincia em solubilizar protenas (dados no mostrados). Nas concentraes testadas (65 e 46 mM) os detergentes ASB-14 e ASB-16 esto mais 44

de 100 e 1000 vezes, respectivamente, acima da suas CMC (concentrao micelar critica: 0,1 mM para ASB14 e 0,01 mM para ASB-16, DOMINGUES, 2004). Desta forma o ambiente micelar formado nessas condies deve ser suficiente para solubilizar o mximo de protenas. J para o CHAPS (CMC = 6-10 mM) que mostrou ter um efeito solubilizador concentraodependente nos experimentos realizados, verificamos que abaixo de 65 mM seu efeito solubilizador diminudo, ou seja, a separao das protenas mxima quando o CHAPS utilizado em concentrao pelo menos 10 vezes acima da sua CMC. Tambm investigamos o efeito da associao entre CHAPS e os detergentes ASB na solubilizao das protenas de membrana eritrocitria (Figura 2). Utilizando as concentraes usuais de CHAPS (65 mM) e ASB (46 mM) descritas na literatura, verificamos que no houve aumento no nmero de spots visualisados, em relao ao uso individual de CHAPS. No entanto, recentemente, Martins et al. (2007) demonstraram que a solubilizao de protenas de amostras de crebro humano favorecida pelo uso de associao entre CHAPS e ASB, resultando num maior nmero de spots em relao ao emprego isolado de CHAPS, ASB-14 ou ASB-16. Esses resultados demonstram, portanto, que a solubilizao de protenas por esses detergentes pode variar de acordo com a composio e tipo celular avaliado. No estudo feito por Schuck et al. (2003), foi demonstrado que preparaes de DRM (membrana resistente a detergentes) obtidas com uma variedade de detergentes moderados apresentam considerveis diferenas qualitativas e quantitativas no contedo protico e lipdico, e essas diferenas tambm dependem do tipo celular. Alm disso, diferenas de solubilizao podem acontecer pelo simples fato que a habilidade dos detergentes em extrair protenas integrais de membranas biolgicas geralmente depende da sua capacidade de solubilizar os lipdios da membrana (le MAIRE et al., 2000).

pH3

pH 10

uso dos detergentes ASB pode ser promissor no estudo de diversas doenas, favorecendo os estudos protemicos com membranas sadias e alteradas.
Referncias Bibliogrficas BHAKDI, S.; KNUFERMANN, H; WALLACH, D.F. Two-dimensional separation of erythrocyte membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta., 394 (4), 550-557, 1975. BLUM, H.; BEIER, H.; GROSS, H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrilamide gels. Electrophoresis, 8, 93-95, 1987. CHASIS, J. A.; SHOHET, S.B. Red-cell biochemical anatomy and membrane-properties. Ann. Rev. Physiol., 49, 237-248, 1987. CHEVALLET, M.; SABTONI, V.; POINAS, A.; ROUQUIE, D.; FUCHS, A.; KIEFFER, S.; ROSSIGNOL, M.; LUNARDI, J.; GARIN, J.; RABILLOUD, T. New zwitterionic detergents improve the analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis, 19, 1901-1909, 1998. DODGE, J.T. ; MITCHELL, C.; HANAHAN, D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobinfree ghosts of human erythrocyte. Arch. Biochem. Biophys., 100, 119-130, 1963. DOMINGUES, C.C. Avaliao da Solubilizao de membranas eritrocitrias e suas protenas por novos surfatantes zwiterinicos. 2004. 86p. Dissertao de Mestrado em Biologia Funcional e molecular, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas. HAYNES, P.A.; YATES, J.R. Proteome profiling-pitfalls and progress. Yeast, 17, 81-87, 2000. HEBERT, B. Advances in protein solubilisation for twodimensional eletrophoresis. Electrophoresis, 20, 660-663, 1999. HENNINGSEN, R.; GALE, B.L.; STRAUB, K.M., DeNAGEL, D.C. Application of zwitterionic detergents to the solubilization of integral membrane proteins for twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics, 2, 1479-1488, 2002. LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685, 1970. le MAIRE, M.; CHAMPEIL, P.; MOLLER, J.V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta., 1508, 86-111, 2000. LOW, T.Y.; SEOW, T.K.; CHUNG, M.C.M. Separation of human erythrocyte membrane associated proteins with one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis followed by identification with matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry. Proteomics, 2, 1229-1239, 2002. LOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FARRAH, S.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chim., 193, 265-275, 1951.

Nossos resultados indicam que, entre os detergentes estudados no processo de solubilizao de protenas de membrana eritrocitria, o mais eficiente em relao ao nmero de spots visualizados foi o CHAPS, seguido pelo ASB-14, ASB-16 e finalmente pelo Triton X-100. Embora o uso associado de CHAPS e ASB no tenha demonstrado vantagens quantitativas, o uso de ASB-14 e ASB-16 pode ser uma ferramenta auxiliar importante no processo de solubilizao de protenas de membranas biolgicas, pois esses detergentes parecem facilitar a solubilizao de protenas possivelmente no visualizadas anteriormente em gel bidimensional com o uso de CHAPS. Dessa forma, o

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MARTINS, D.; MENEZES, B.O.; FARIAS, A.S.; HORIUCHI, R.S.O.; DOMINGUES, C.C.; dePAULA, E.; MARANGONI, S.; GATTAZ, W.F.; DIAS-NETO, E., NOVELLO, J.C. The use of ASB-14 in combination with CHAPS is the best for solubilization of human brain proteins for two- dimensional gel electrophoresis. Brief. Funct. Genomic. Proteomic, on line, Junho, 2007. MOLLOY, M.P.; HEBERT, B.R.; WILLIAMS, K.L.; GOOLEY, A.A. Extraction of Escherichia coli proteins with organic solvents prior to two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis, 20, 701-704, 1999. OLIVIERI, E.; HEBERT, B.; RIGHETTI, P.G. The effect of protease inhibitors on the two-dimensional electrophoresis pattern of red blood cell membranes. Electrophoresis, 22, 560 - 565, 2001. PAULSEN, I.T.; SLIWINSKI, M.K.; NELISSEN, B.; GOFFEAU, A.; SAIER M.H.Jr. Unified inventory of established and putative transporters encoded within the complete genome of Saccharomyces cerevisia. FEBS Let.t, 430(1-2), 116-125, 1998. PRETE, P.S.C.; MALHEIROS, S.V.P.; MEIRELLES, N.C.; dePAULA, E. Quantitative assessment of human erythrocyte membrane solubilization by Triton X-100. Biophys. Chem., 97, 1-5, 2002. RABILLOUD T.; ADESSI, C.; GIRAUDEL A.; LUNARDI J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 18, 307-316, 1997. RABILLOUD, T.; BLISNICK, T.; HELLER, M.; LUCHE, S.; AEBERSOLD, R.; LUNARDI, J.; BRAUNBRETON, C. Analysis of membrane proteins by twodimensional electrophoresis: Comparison of the proteins extracted from normal or Plasmodium falciparum infected erythrocyte ghosts. Electrophoresis, 20, 36033610, 1999. RUBIN, R.W & MILIKOWSKI, C. Over two hundred polypeptides resolved from the human erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta., 509 (1), 100-110, 1978. SANTONI, V.; RABILLOUD, T., DOUMAS, P.; ROUQUIE, D.; MANSION, M.; KIEFFER, S.; GARIN, J.; ROSSIGNOL, M. Towards the recovery of hydrophobic proteins on two-dimensional electrophoresis gels. Electrophoresis, 20, 705-711, 1999. SCHUCK, S.; HONSHO, M.; EKROOS, K.; SHEVCHENKO, A.; SIMONS, K. Resistance of cell membranes to different detergents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 5795-5800, 2003. WALLIN, E. & VON HEIJNE, G. Genome wide analysis of integral membrane proteins eubacterial, archean and eukaryotic organisms. Protein Sci, 7, 1029-1038, 1998. ZHANG, L.; XIE, J.; WANG, X.; LIU, X.; TANG, X.; CAO, R.; HU, W.; NIE, S.; FAN, C.; LIANG, S. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: Use

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Recebido em 16 de julho de 2007 e aprovado em 13 de agosto de 2007.

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