5/18/2012

BIOCHEMISTRY

Chemistry
1st cycle/3rd year

Processos genticos

1- Transcrio

2- Processamento do RNA

3- Traduo

4- Replicao

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Learning Goals

Key Words
Genoma DNA e RNA [estrutura; constituintes; bases, acares, ligaes fosfodister, regras de Chargaff]

Estrutura do DNA de Watson-Crick [emparelhamento de bases, hlice dupla, DNA A,B, Z]

Fuso do DNA [hipocromismo, temperatura de fuso, renaturao]

DNA de procariotas

[superenrolamento]

DNA de eucariotas

[cromossomas nas clulas haplides e diplides;

compactao: cromatina, histonas, nucleossomas, cromatossomas, solendes, fibras; DNA codificante e no codificante; cdigo gentico]

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Key Words
Replicao do DNA [processo semiconservativo; replicao em procariotas; mecanismo de iniciao e propagao; enzimas envolvidas; pontos de origem; forquilha de replicao, fragmentos de Okazaki, cadeia lider e cadeia seguidora] Mecanismo de replicao do DNA em procariotas [primase, DNA polimerase Iii, DNA polimerase I, ligase, origem da replicao, complexo iniciador; helicase, proteinas SSB, destruio dos superenrolamentos, topoisomerases I e II (girase)] Replicao em eucariotas [diferenas em relao ao procariotas] Telmeros e telomerase Reparao do DNA [erros de replicao, modificaes expontneas e causadas por agentes qumicos e fsicos]

Key Words
Mutaes [pontuais: silenciosas, missense e nonsense; inseres, delees; quebra das cadeias] Mecanismos de reparao [directa, por exciso exinuclease actua sobre dmeros de timina; reparao de quebra de cadeias por reparao homloga ou juno de extremidades]

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Think about it... Possible questions

Se o conteudo GC dum DNA for 48%, quais so as percentagens de cada um dos quatro nucletidos? Porque que molculas de DNA de fontes diferentes tm temperaturas de fuso (Tf) diferentes? Como determina experimentalmente Tf? Quantas ligaes fosfodister 3-5 esto presentes num polinucletideo com 20 unidades de nucleotdeos?

Escreva a sequncia complementar (na notao padro 5-3) de a) GATCAA; b) TCGAAC; c) TACCAT

Por que se diz que as cadeias do DNA da hlice dupla tm Polaridades opostas?

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Quais as diferenas entre as estruturas do A-DNA, B-DNA e Z-DNA?

O que entende por cadeia molde na replicao do DNA?

Porque que a replicao pararia na ausncia da topoisomerase II?

Quais as diferenas entre a topoisomerase I e II?

Quais as diferenas entre as DNA polimerases I e III?

O que entende por replicao descontnua do DNA?

Que reao catalizada pela DNA ligase e qual o seu papel na Replicao do DNA?

Qual a diferena entre actividade endonuclease 5-3e 3-5 da DNA polimerase III? Quais as diferenas entre a replicao do DNA em procariotas e eucariotas?

A telomerase no activa na maioria das clulas humanas, mas a activao do gene da telomerase necessria para a clula se tornar cancerosa. Porqu? Uma estratgia anticancergena inibir a telomerase. Porqu?

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Genoma e DNA

Bibliografia: Berg, Tymoczo e Stryer, Biochemistry, 7. edio, Freeman, UK, 2012 Cap. 4 e 28 Cooper e Hausman, The Cell, 4. edio, ASL Press, USA, 2004 Cap. 3 e 4

Fluxo de informao gentica: dogma de Crick

Figure 1-4 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)

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Modelo de estrutura de DNA em dupla hlice (Watson e Crick, 1953) Cadeias de DNA Antiparalelas
Complementares
Terminal 5

Ligaes de H Terminal 3

Terminal 3

Terminal 5

Estrutura do DNA
Dupla hlice estabilizada por: - ligaes de hidrognio entre bases complementares - foras hidrofbicas (van der Waals) entre bases empilhadas no interior da hlice Ies estabilizadores: Na+, Mg2+ Ies instabilizadores: Cd2+, Pb2+, Hg2+

Ligaes de H

Dupla hlice

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Diferentes conformaes da dupla hlice de DNA

A estrutura do DNA pode alterar-se com a temperatura

Fuso ou desnaturao do DNA por aumento de temperatura duas cadeias separam-se Temperatura de fuso Tm: qual 50% das bases esto separadas Hipocromismo: bases do DNA empilhadas absorvem menos no UV que as separadas Curva de fuso do DNA seguida por UV-vis a 260 nm determina-se Tm Tm aumenta com %GC (par mais forte que AT, pois tem 3 lig. H) Processo reversvel: renaturao Propriedade importante na replicao e na hibridizao do DNA

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DNA de procariotas

- O genoma de procariotas (bactrias) e de virus de DNA constituido por um s cromossoma circular. Se o eixo da hlice do B- DNA no estiver torcido est relaxado h uma volta de 360 (twist) em cada 10.5 bases no B- DNA O eixo da hlice do DNA pode torcer-se (writhe): superhlice (supercoiled) estrutura mais compacta do cromossoma. Ambas para a direita so negativas, para a esquerda so positivas. A soma tem que
Superhlice negativa (3 voltas direitas)

ser constante.

Microscopia electrnica do DNA do virus SV40

Cromosoma bacteriano: 106 a 3 x 107 pb: codifica 1000 a 5000 proteinas

Uma hlice direita (Tw <0) origina superenrolamento negativo (Wr < 0) pois mais estvel.

O superenrolamento do DNA pode ser alterado por enzimas: Topoisomerases

Compactao do DNA nos cromossomas de eucariotas

Resumo dos nveis de organizao da cromatina

04.2-chromosome_coil.mov

Cromatina: Nucleossomas: DNA + 8 histonas (2 de H2a, H2b, H3 e H4); Cromatossoma: nucleossoma + H1; Seis associam-se num anel e os anis num cilindro solenide; os solenides podem formar loops em relao a um centro proteico; cromossoma tem centrmero, telmeros (terminais) e vrios pontos origem de locais de replicao (OriR). Fosforilao de H1 dissocia os solenides em nucleossomas estendidos; fosforilao da topoisomerase II leva a loops dos solenides. S o DNA nos nucleossomas pode sofrer replicao.

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Complexidade dos genomas sequenciados

Organism Genome size (Mb)
0.58 1.8 4.6

Number of Genes

Protein-coding sequence

Bacteria
Mycoplasma genitalium H. influenzae E. coli 470 1743 4288 88% 89% 88%

Yeasts
S: cerevisiae S. pombe 12 12 97 180 125 390 370 1000 3200 6000 4800 19000 13600 26000 37000 20000-23000 20000-23000 20000-25000 70% 60% 25% 13% 25% 12% 10% 3% 1.2%

Invertebrates
C. elegans Drosophila

Plants
A. thaliana Rice

Fish
Pufferfish

Birds
Chicken

Mammals
Human

Mb = milhes de pares de bases

Cdigo gentico
relao de sequncia do DNA com a sequncia da proteina expressa

Tambm significa iniciao da leitura do gene

20 aminocidos / 4 nucletidos / tripleto de nucletidos

42= 16; 43 = 60

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Replicao e Reparao do DNA

Bibliografia: Berg, Tymoczo e Stryer, Biochemistry, 7. edio, Freeman, UK, 2012 Cap. 4 e 28 Cooper e Hausman, The Cell, 4. edio, ASL Press, USA, 2004 Cap. 5

Replicao do DNA: procariotas

3. As duas cadeias tm que se desenrolar comeando num local de origem (oriC) e o processo prossegue nas duas direces opostas (replicao bidireccional), criando duas forquilhas de replicao, que progridem (alongamento: 60,000 bases/min) e acabam por se encontrar do outro lado do cromossoma e fundir (regio terminal), completando a nova cpia de DNA e libertando-a.

O DNA circular parcialmente replicado forma uma bolha devido replicao bidireccional

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Cadeias de DNA superenroladas frente da forquilha

11. O DNA est naturalmente superenrolado negativamente, o que facilita a separao das cadeias necessria na replicao. O superenrolamento positivo condensa o DNA mas dificulta a separao das cadeias. Porm, medida que a helicase desenrola e separa o DNA, o DNA sua frente acima da bifurcao fica com um superenrolamento positivo. Este dificulta a progresso da forquilha de replicao.

Possibilidade de bloqueio da replicao

Complexo de replicao

movie

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Procariotas: Modelo para forquilha de replicao

Subunits of polymerase III complex

Movie: 05.5-DNA_replication_fork

Passos na replicao do DNA nos procariotas (E. Coli) : resumo

Iniciao
1. Molcula de DNA original (cadeias a vermelho)

2. Proteinas iniciadoras ligam-se a um local de iniciao especfico (oriC), reconhecido como uma dada sequncia de nucletidos do DNA.

3. A DNA helicase liga-se ao local de iniciao. A DNA helicase uma enzima que desdobra a hlice dupla, e quebra as ligaes de hidrognio. Outras proteinas (SSB: single strand binding proteins) estabilizam a cadeia simples.

4. Forma-se a forquilha de replicao a regio do DNA na frente da replicao. medida que o DNA se abre (unzips) numa dada regio pela DNA helicase, esta promove a aco da DNA primase, gera uma sequncia de RNA que serve de ponto de partida (primer) para a sntese da nova cadeia de DNA (Helicase + Primase = Primosoma).

5. Comeo da sntese do DNA na cadeia condutora usando a DNA polymerase III, que sintetiza a cadeia de DNA complementar no sentido 5 matriz. 3 usando a cadeia original como

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Passos na replicao do DNA nos procariotas (E. Coli) : resumo

Elongao
1. Produo da nova cadeia de DNA pela DNA polymerase III, no sentido 5' a partir da cadeia condutora como matriz (no sentido 3' sntese da cadeia condutora contnua desde o primer at forquilha de replicao. Entretanto a DNA primase (castanho claro) ligou um RNA primer (prpura) cadeia original condutora. A outra nova cadeia a atrazada e a sua sntese descontnua. 2. Produo do primeiro fragmento de Okazaki (a) na cadeia atrazada produzido pela DNA polymerase III a partir do primer (b). Uma vez que as proteinas iniciadoras no se movem nesta altura, a DNA polymerase tem que parar a sntese quando as encontra. O primer (c) mostra-se sendo sintetizado pela DNA primase. 3. Sintese do DNA continua ao longo da cadeia condutora. Produo de mais fragmentos de Okazaki. Quando os vrios fragmentos foram produzidos, o primer removido por outra DNA polymerase, a DNA polymerase I: usa o DNA vizinho como primer e polimeriza o DNA, deslocando o RNA primer (b). Ento, outra enzima, a DNA ligase, junta os fragmentos de DNA (remove os nicks) (a). Este processo continua at todo o DNA tiver sido replicado. 3'

5' dessa cadeia). A

4. Separao dos dois cromossomas filhos que esto intercatenados pela topoisomerase II

Replicao de DNA: Procariotas versus Eucariotas Quais as principais diferenas?

1. Mecanismos de iniciao de replicao diferentes. 2. Vrias origens de replicao: nos eucariotas, com cromossomas lineares, os vrios locais de iniciao funcionam ao mesmo tempo e juntam-se no fim. Uma nica origem implicaria que a replicao de DNA humano demorasse bem mais de 3 semanas, considerando o tamanho e a compactao do DNA. 3. DNA polimerase: enquanto nos procariotas h a DNA Pol I e III (com subunidades), nos eucariotas h mais polimerases (,,,) e mais complexas mais subunidades. Tem tambm outras proteinas associadas 4. Mecanismos de introduo de primers (priming) e sua remoo diferentes. 5. Problemas na replicao das extremidades dos cromossomas telmeros.

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Replicao eucariota: extremidades dos cromossomas

Telmeros
Estruturas no final dos cromossomas eucariotas lineares Compostos por satlites de DNA (minisatlite): mltiplas cpias de uma sequncia curta de DNA, por ex: 5-TTAGGG-3 TxGy numa cadeia, CyAx na cadeia complementar (x,y=1-4) Cadeia TxGy maior do que a complementar, deixando uma poro de DNA em cadeia simples no terminal 3 da cadeia TxGy Repeties chegam a milhares de bases nos mamferos

Telmero humano

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Telomerase
(Transcriptase reversa que possui o molde de RNA)

Estrutura dos telmeros

(controlo da actividade da telomerase)

Loop T: protege as extremidades 3 dos cromossomas

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Reparao do DNA
Fidelidade da replicao muito importante: - Frequncia de erros na introduo de nucletidos pela DNA polimerase: 1/109 - muito inferior aos erros naturais devido s pequenas diferenas das bases: 1/103 Isto deve-se a que existem mecanismos de deteco de erros e reparao do DNA. Consistem em: 1. Reconhecer a(s) base(s) errada(s). 2. Remover essa(s) base(s). 3. Reparar o espao vazio com a(s) base(s) correcta(s).
Exemplo:

- A DNA polimerase III corrige muitos erros que ocorreram durante a replicao verifica a sequncia de DNA (reviso proof-reading) verificando a geometria do par de bases: devido a alterao conformacional em pares errados remove a base incorrecta - actividade de exonuclease 35 da DNA polimerase; frequncia de erros na replicao desce para 1/109

Erros e leses do DNA

Estabilidade gentica mantida pela fidelidade de replicao mas tambm por mecanismos que reparam alteraes que ocorrem no DNA Ocorrem erros e leses no DNA, que podem levar a mutaes, morte celular, cancro (pele, clon, prstata, ovrios, leucemia, etc.). Exemplo: sensibilidade extrema a radiao UV porque o mecanismo de reparao de fotoprodutos de DNA est afectado Tipos de erros e leses no DNA, que provocam mutaes Erros introduzidos durante a replicao: incorporao de bases incorrectas do emparelhamentos errados, no Watson-Crick (ex: A:::C) Modificaes no DNA espontneas ou causadas pela exposio a agentes qumicos ou fsicos (radiao).

Modificaes nas bases: substituio, deleco, insero

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Modificaes no DNA: Resumo

1. 2. 3.

Erros introduzidos durante a replicao Bases anormais (desaminao, metilao, depurinao) Leses no DNA que causam alteraes estruturais (dmeros de timina, por exemplo)

4. 5.

Quebra das cadeias de DNA Oxidao de bases e acares

Efeito das mutaes

Mutaes silenciosas (incluem as que ocorrem na regio de DNA intergnico e nas regies no codificantes dos genes) Mutaes nas regies codificantes dos genes: Mutaes pontuais: conforme os casos podem ser silenciosas (entre codes sinnimos, ex: GGC e GGA = gly, no altera o aa) ou ter efeitos: codes no sinnimos missense , altera o aa; ou altera um codo criando um codo de paragem (UGA, UAA, UAG) nonsense- resulta em polipptideos mais curtos que o normal. Inseres ou deleces

1.

2.

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Mecanismos de reparao de DNA

Os erros que no so corrigidos por proof-reading podem s-lo por sistemas especificos de enzimas de reparao. Exemplos:

Reparao directa

Reparao por exciso

Reparao das quebras nas cadeias de DNA (por recombinao homloga)

Reparao das quebras nas cadeias de DNA

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