Quim. Nova, Vol. 28, No.

5, 801-804, 2005 TRITERPENIDES TIPO CICLOARTANO DE PRPOLIS DE TERESINA - PI Maria do Socorro Sousa da Silva, Antnia Maria das Graas Lopes Cit*, Mariana H. Chaves e Jos Arimatia Dantas Lopes Departamento de Qumica, Universidade Federal do Piau, 64049-480 Teresina - PI Recebido em 1/7/04; aceito em 16/2/05; publicado na web em 11/7/05

CYCLOARTANE TRITERPENOIDS OF PROPOLIS FROM TERESINA - PI. The chemical study of the propolis produced in Teresina city, state of Piaui, resulted in the identification of six cycloartane triterpenoids: isomangiferolic acid, 24methylenecycloartane-3,26-diol, mangiferolic acid, mangiferonic acid, ambonic acid and ambolic acid. The substances were characterized by one and two-dimensional 1H and 13C NMR analysis. Keywords: propolis; triterpenoids; cycloartane.

INTRODUO Prpolis um produto elaborado na colmia a partir de substncias resinosas, gomosas e balsmicas, coletadas pelas abelhas de brotos, flores e exsudatos de plantas, acrescidas de secrees salivares, ceras e plen. A palavra prpolis derivada do grego pro, em defesa de, e polis, a cidade, o que quer dizer em defesa da cidade ou da colmia 1,2. As abelhas utilizam a prpolis para proteg-las contra insetos e microrganismos, recobrindo a parede da colmia, reforando os favos, preenchendo fissuras, restringindo a entrada e embalsamando animais; utilizam-na tambm no preparo de locais asspticos para a postura da abelha rainha2,3. Existem relatos do uso de prpolis em medicina popular desde a antiguidade1. No Egito antigo era empregada para embalsamar os mortos. Na frica do Sul, na guerra ao final do sculo XIX, foi amplamente utilizada devido s suas propriedades cicatrizantes e na Segunda Guerra Mundial foi empregada em vrias clnicas soviticas, como base de uma pomada para tratar ferimentos, apresentando excelentes resultados3-5. Atualmente, bastante usada em alimentos e beberagens para manter a sade e prevenir doenas coronrias, diabetes e at mesmo cncer6. A prpolis e seus constituintes qumicos apresentam vrias atividades farmacolgicas, tais como antioxidante7, antiinflamatria8, antibacteriana9, antiviral10, antifngica11 e antitumoral12. A prpolis apresenta em sua composio vrios tipos de substncias, entre as quais triterpenides, flavonides, cidos aromticos, cidos graxos, fenis, aminocidos, vitaminas A, B1, B2, B6, C e E e minerais, como Mn, Cu, Ca, Al, V, Ni, Zn e Cr. A proporo dessas substncias varia e depende do local e da poca da coleta1,12. Pesquisas mostraram que a composio da prpolis muito similar dos exsudatos de brotos das plantas visitadas pelas abelhas13. A prpolis brasileira apresenta em sua composio compostos aromticos14 e, recentemente, tm sido relatados triterpenides15. Essas substncias apresentam diversas atividades farmacolgicas, tais como antiinflamatria16,17, antiviral15,16 e antitumoral16. Devido aos diversos usos da prpolis e de sua complexa composio, que varia de acordo com a flora apcola da regio de sua produo, vrios estudos sobre os constituintes qumicos e a ao farmacolgica tm sido realizados para indicar seu real potencial como produto teraputico.
*e-mail: gracito@ufpi.br

O estado do Piau apresenta um forte potencial apcola, mas sua pesquisa nesta rea ainda incipiente; da surgiu nosso interesse em estudar a composio qumica da prpolis piauiense. Em estudos anteriores sobre a prpolis piauiense foi relatada a presena de derivados de cido anacrdico, triterpenides pentacclicos e derivados do cicloartano18. O presente trabalho relata o estudo de trs amostras de prpolis produzidas em diferentes pocas na cidade de Teresina - PI, nas quais foram identificados seis triterpenides derivados do cicloartano: cido isomangiferlico ( 1 ), cido mangiferlico ( 2 ), cido mangifernico ( 3 ), 24-metilenocicloartano-3,26-diol (4), cido amblico (5) e cido ambnico (6) inditos em prpolis. Triterpenides com esqueletos C30 e C31, baseados no cicloartano, so caractersticos da espcie Mangifera indica (Anacardiaceae)19.

Figura 1. Triterpenides tipo cicloartano identificados em prpolis de Teresina-PI

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PARTE EXPERIMENTAL Procedimentos experimentais gerais Os espectros de RMN 1H e 13 C foram registrados em espectrmetros Brker modelos Avance DRX-500 e Avance DPX300. Os deslocamentos qumicos foram registrados em (ppm), utilizando-se CDCl3 como solvente e TMS como padro interno. As anlises em CCD foram realizadas em cromatoplacas de gel de slica, constitudas de uma mistura na proporo 1:1 de gel de slica G 60 e gel de slica GF254. As cromatoplacas foram reveladas atravs de irradiao com luz ultravioleta em comprimentos de onda de 254 e 366 nm em boxe da CAMAG e/ou aquecimento em uma placa eltrica, aps borrifao com uma soluo de sulfato crico, [Ce(SO4)2.5H2O]20. Para as colunas cromatogrficas utilizou-se gel de slica com granulometria de 0,063 a 0,20 mm. As colunas em Sephadex LH-20 foram antecedidas de purificao do gel mediante aquecimento em metanol, seguido de filtrao a vcuo e secagem em estufa a 55-60 C por 12-16 h. Os eluentes utilizados nas colunas em Sephadex LH-20 foram hexano-CH2Cl2 (1:4), CH2Cl2-acetona (3:2) e CH2Cl2-acetona (1:4)21. Coleta das amostras As amostras de prpolis da espcie Apis mellifera foram coletadas no apirio do Departamento de Zootecnia do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Piau, em Teresina, nos meses de abril, julho e setembro de 2002, acondicionadas em recipientes de vidro e mantidos sob refrigerao. Estas amostras foram denominadas A, B e C, respectivamente. Extrao e isolamento dos constituintes qumicos As amostras de prpolis A (13,3 g), B (16,0 g) e C (16,0 g) foram submetidas extrao com metanol em aparelhagem Soxhlet, por um perodo de 5 h e 30 min (amostras A e B) e por 10 h (amostra C). Os extratos filtrados a quente foram diludos com gua, na proporo de 2:1, extrato:gua e, em seguida, foram efetuadas sucessivas extraes com hexano e ter etlico22. Aps concentrao dos extratos obteve-se as fraes hexnicas A1 (0,6 g), B1 (1,7 g) e C1 (1,1 g) e as fraes etreas A2 (3,5 g), B2 (2,5 g) e C2 (6,9 g). As fraes obtidas foram analisadas por CCD, sendo as fraes A2, B2 e C2 escolhidas para anlises dos constituintes qumicos. A frao A2 foi submetida CC de gel de slica, utilizando-se um gradiente de eluio de polaridade crescente com hexano e ter etlico, fornecendo 65 sub-fraes. A sub-frao A2-27 (134 mg), eluda com hexano:ter etlico (2:1), foi recromatografada em coluna de Sephadex LH-20, fornecendo 33 sub-fraes. A sub-frao A2-27-28 (3 mg), eluda com diclorometano:acetona (3:2), foi identificada como cido isomangiferlico (1). A frao B2 foi fracionada por CC de gel de slica, eluda com hexano e acetato de etila em um gradiente de eluio de polaridade crescente, originando 100 sub-fraes. Na sub-frao B2-27 (134 mg), eluda com hexano:acetato de etila (95:5), foi identificada a presena do 24-metileno-cicloartano-3,26-diol (4) e na sub-frao B2-46 (11 mg), eluda com hexano:acetato de etila (8:2), o cido mangiferlico (2). A frao C2 foi submetida CC de gel de slica, eluda com hexano e acetato de etila em um gradiente de eluio de polaridade crescente, resultando em 107 sub-fraes. A sub-frao C2-54 (151 mg) eluda com hexano:acetato de etila (8:2), e a sub-frao C2-70 (150 mg), eluda com hexano:acetato de etila (7:3), foram recromatogradas em coluna de Sephadex LH-20 e forneceram 32

sub-fraes cada. As sub-fraes C2-54-24 (13 mg) e C2-70-23 (16 mg) foram eludas com diclorometano:acetona (3:2), sendo a primeira constituda pelos cidos mangifernico (3) e ambnico (6) e a segunda, pelo cido amblico (5). RESULTADOS E DISCUSSO As anlises preliminares em CCD das sub-fraes, resultantes dos fracionamentos cromatogrficos das fraes etreas de prpolis, mostraram que algumas destas apresentavam natureza terpnica evidenciada pela colorao roxa, obtida aps revelao das cromatoplacas com sulfato crico. A identificao dos triterpenides foi realizada atravs da anlise dos espectros de RMN 1H, 13C e DEPT 135 e foi feita a comparao com dados da literatura. Em alguns casos, utilizou-se, tambm, os espectros de COSY 1H-1H, HMQC e HMBC. Os deslocamentos qumicos dos carbonos dos triterpenides identificados neste trabalho esto listados na Tabela 1. As fraes em ter etlico, obtidas das parties dos extratos metanlicos de prpolis, forneceram aps fracionamentos em coluna de gel de slica e Sephadex LH-20 seis triterpenides: cido isomangiferlico (1), cido mangiferlico (2), cido mangifernico (3), 24-metileno-cicloartano-3,26-diol (4), cido amblico (5) e cido ambnico (6). Estes triterpenides possuem como esqueleto base o cicloartano, so caractersticos da espcie Mangifera indica19,23-26 e inditos em prpolis. O triterpenide 1 apresenta em seu espectro de RMN 1H dois dubletos blindados, em 0,37 (J=4,0 Hz) e 0,55 (J=4,0 Hz), caTabela 1. Dados de RMN 13C de 1 a 6 [CDCl3, *125 e **75 MHz] C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1* 27,7 28,8 77,4 39,8 41,3 21,3 25,8 48,3 20,0 26,7 26,5 33,1 45,5 49,1 35,7 28,4 52,4 18,3 30,2 36,2 18,2 35,0 26,1 145,9 126,6 172,1 12,2 19,5 21,4 26,1 2* 31,9 30,3 78,8 40,5 47,1 21,1 26,4 47,9 19,9 26,1 25,9 32,9 45,3 48,8 35,5 28,1 52,2 18,0 29,9 35,9 18,1 34,8 25,9 145,7 126,6 173,0 11,9 19,3 25,4 14,0 3** 33,4 37,4 216,7 50,2 48,4 21,5 28,1 47,9 21,1 25,9 25,9 32,8 45,5 48,7 35,5 26,9 52,2 18,1 29,5 35,9 18,3 34,7 25,9 145,8 126,5 173,0 11,9 18,1 22,2 20,8 4** 31,9 30,3 78,9 40,5 47,1 21,1 28,2 47,8 20,0 26,1 26,0 32,9 45,3 48,8 35,5 26,5 52,2 19,3 29,9 36,1 18,0 34,9 31,2 152,0 36,1 65,9 16,4 18,3 25,5 14,0 109,5 5** 31,9 30,3 78,9 40,4 47,1 21,1 28,1 48,0 20,0 26,0 26,1 32,9 45,3 48,8 35,5 26,5 52,2 19,3 29,9 36,0 18,3 34,5 31,6 148,6 45,5 179,2 16,3 18,0 25,4 14,0 111,1 6** 33,4 37,4 216,7 50,2 48,4 21,5 28,1 47,9 21,1 25,9 25,9 32,8 45,4 48,7 35,5 26,9 52,3 18,1 29,5 36,0 18,3 34,7 31,6 148,6 45,6 179,0 16,3 18,3 22,2 20,8 111,1

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ractersticos de hidrognios metilnicos de ciclopropano; apresenta tambm um dubleto em 0,94 (J=6,6 Hz) e cinco singletos em 0,91; 0,93; 0,98; 0,99 e 1,88, atribudos a hidrognios de grupos metilcos. O espectro de RMN 1H apresenta ainda um singleto largo em 3,49, cuja aparncia e deslocamento qumico so caractersticos em triterpenides, de H-3 em carbono cabinlico com configurao -equatorial indicando a presena de um triterpenide tipo cicloartano-3-ol25,27. Em contraste, se a configurao de H-3 fosse -axial (OH -equatorial) o sinal seria um duplo dubleto em aproximadamente 3,2 com Jax-ax=11 Hz e Jax-eq=4,2 Hz28,29. O tripleto em 6,92 (J=7,0 Hz) refere-se a hidrognio olefnico em ligao dupla com configurao E e em posio a um grupo retirador de eltrons23,25,30. O espectro de RMN 13C apresenta vinte e nove sinais, entre os quais encontram-se um grupo oximetnico em 77,4 (C-3), que tambm indicativo de configurao 3hidroxi25,31, uma carboxila ,-insaturada em 172,1 (C-26) e dois carbonos olefnicos, em 126,6 (C-25) e 145,9 (C-24). A localizao da carboxila em C-26 foi atribuda existncia de um carbono metlico em 12,2 (C-27), bastante blindado, decorrente da interao deste com C-2325, reforando a sugesto da configurao E para a ligao dupla. Pelo espectro de HMBC observaram-se as correlaes do hidrognio olefnico com C-27 e C-26, bem como dos hidrognios metlicos do C-27 com C-24, C-25 e C-26, confirmando a posio da carboxila na cadeia lateral do triterpenide. exceo de C-7, C-16 e C-23, todos os dados de RMN 13C da substncia 1 esto consistentes com os registrados na literatura para o cido isomangiferlico25,27. Os valores de C-7 e C-16 apresentamse invertidos em relao aos da literatura25; isto foi comprovado atravs das anlises no COSY 1H-1H, HMBC e HMQC. No HMBC observam-se as correlaes entre os sinais em 1,32 (H-16) com 35,7 (C-15) e de 1,18 (H-7) com 21,3 (C-6); no COSY 1H-1H o sinal em 0,82 (H-6) correlaciona-se com 1,18 (H-7), comprovando-se a permuta entre os valores dos deslocamentos de C-7 e C-16. A anlise dos espectros RMN 13C-BB, HMQC e HMBC possibilitou uma reatribuio do valor de C-23, que na literatura apresenta um valor de 21,025 para 26,1; no HMQC observa-se que o sinal em 26,1 (CH2) se correlaciona com os hidrognios em 2,16 e 2,28 (H-23) e no HMBC, estes se correlacionam com o sinal de 145,9 (C-24), comprovando que o sinal em 26,1 relativo a C-23. O espectro de RMN 1H de 2, semelhante a 1, apresenta sinais de triterpenides derivados do cicloartano, sendo que o sinal de H3, em 2, um duplo dubleto em 3,30 (J=4,4 e 11,1 Hz) caracterstico de hidrognio -axial em triterpenides 3-OH28,29,31, conforme discutido para a elucidao da substncia 1. O espectro de RMN 13C possui trinta sinais, incluindo um grupo oximetino em 78,8 (C-3) consistente com a configurao 3-hidroxi25,31, uma carboxila em 173,0 (C-26) e dois carbonos olefnicos, em 126,6 (C-25) e 145,7(C-24). Observou-se para a substncia 2 que os carbonos C-1 a C-5, C-29 e C-30 apresentam uma diferena em seus deslocamentos qumicos se comparados aos do cido isomangiferlico (1) e semelhantes aos do cicloartenol25, confirmando a configurao 3-hidroxi. A posio da carboxila em C-26 e a estereoqumica da ligao dupla, E, foram confirmadas pelo deslocamento de C-27 ( 11,9). Os dados observados para a substncia 2 esto coerentes com os existentes na literatura para o cido mangiferlico (2)19,23. No espectro de RMN 1H do triterpenide 5 observaram-se sinais caractersticos de triterpenide com esqueleto cicloartano, juntamente com um duplo-dubleto em 3,30 (J=4,4 e 11 Hz), caractersticos de uma configurao -hidroxi, um quarteto em 3,17 (J=7,1 Hz) e dois singletos largos em 4,93 e 4,97, referentes a hidrognios metilnicos em ligao dupla geminal dissubstituda.

O espectro de RMN 13C apresenta trinta e um sinais, entre eles de um grupo oximetino em 78,9 (C-3) que confirma a configurao 3-hidroxi29, dois de carbonos olefnicos em 111,1 (C-31) e 148,6 (C-24) e um de carboxila em 179,2 (C-26). Estes dados so compatveis com um triterpenide tipo cicloartano-3-ol, que possui um grupo metilnico e uma carboxila ligados a sua cadeia lateral26. No espectro de HMBC observaram-se as correlaes dos hidrognios olefnicos ( 4,93 e 4,97) com C-23 e C-25 e do quarteto em 3,17, atribudo ao hidrognio de C-25 com C-24 e C-26. Estes dados confirmam a localizao do grupo metilnico sobre C-24 e da carboxila em C-26. Os dados da substncia 5 esto consistentes com os citados na literatura para o cido amblico19,26. A anlise dos espectros de RMN da sub-frao B2-29 mostrou que esta possui uma mistura de substncias, da qual foram identificadas apenas o triterpenide 4. O espectro de RMN 1H da sub-frao B2-29 apresenta, para o constituinte majoritrio, sinais caractersticos de um triterpenide tipo cicloartano-3-ol. Alm destes, apresenta um sinal em 3,58, referente a hidrognios ligados a um segundo carbono carbinlico e dois singletos de hidrognios olefnicos, em 4,88 e 4,94. Estes dados so compatveis com um triterpenide tipo cicloartano-3-ol28,29, com a cadeia lateral com uma ligao dupla geminal dissubstituda e uma hidroxila em carbono primrio. O espectro de RMN 13C apresenta sinais de um grupo oximetinico em 78,9 (C-3) com configurao 3-hidroxi, um grupo oximetilnico em 65,9 (C-26) e dois carbonos olefnicos em 109,5 (C-31) e 152,0 (C-24) na cadeia lateral do triterpenide24,26. Os dados da substncia 4 so equivalentes aos citados na literatura para o 24-metileno-cicloartano-3,26-diol26. A mistura de substncias da sub-frao C2-54-25 apresenta em seu espectro de RMN 1H sinais que indicam a presena de triterpenide tipo cicloartano-3-oxo, pois no apresentou sinal de hidrognio em carbono carbinlico29,32. Observou-se, tambm, um tripleto em 6,92 (J=7,0 Hz), que sugere a existncia de um hidrognio olefnico -carboxlico em uma ligao dupla com configurao E23,25,30, caracterizando 3. Um quarteto em 3,18 (J=7,0 Hz) e dois singletos largos em 4,94 e 4,98 de hidrognios metilnicos em ligao dupla terminal caracterizam a substncia 6. O espectro de RMN 13C apresenta vrios sinais, destacando-se um sinal referente s carbonilas dos dois triterpenides em 216,7 (C-3), dois carbonos olefnicos em 145,8 (C-24) e 126,5 (C-25) referentes substncia 3, dois carbonos olefnicos em 111,1 (C-31) e 148,6 (C-24) da 6. Estes dados foram compatveis com os observados para os cidos mangifernico19,26 (3) e ambnico26 (6). Para a substncia 3, da mesma forma que em 1, foi atribudo a C-23 um novo valor para seu deslocamento qumico. Na literatura consta o valor 22,226, mas o espectro de RMN 13C da mistura de 3 e 6 no apresenta este sinal e, aps a atribuio dos deslocamentos qumicos dos demais carbonos, restou um sinal de CH2 em 25,9, que foi atribudo a C-23. Triterpenides pentacclicos tipo lupeol, e -amirinas e tetracciclicos tipo cicloartenol e 24-metilenocicloartanol apresentam atividade antiinflamatria significativa16,17. O isolamento deste tipo de substncia em prpolis piauiense poder contribuir para validao do seu uso como antitinflamatrio. Os estudos realizados mostram que existe uma correlao entre as diversas substncias presentes na prpolis e local e poca da sua coleta. Os seis triterpenides derivados do cicloartano, cido isomangiferlico (1), cido mangiferlico (2), cido mangifernico (3), 24-metileno-cicloartano-3,26-diol (4), cido amblico (5) e cido ambnico (6), relatados neste trabalho foram anteriormente isolados em cascas do caule de Mangifera indica, no existindo relatos na literatura sobre a identificao destes em prpolis. Considerando a presena destas substncias nas amostras da prpolis

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em estudo e o fato que a prpolis apresenta uma composio similar dos exsudatos de brotos de plantas visitadas pelas abelhas, podemos propor que a espcie Mangifera indica foi utilizada pelas abelhas, em diferentes pocas do ano, para coleta de materiais para elaborao da prpolis estudada e que houve um transporte direto destas substncias, pelas abelhas, para a colmia. Vale ressaltar que o apirio em estudo tem um mangueiral em sua vizinhana. AGRADECIMENTOS CAPES pela bolsa de Mestrado (M. S. S. Silva) e apoio financeiro (PROCAD N 0014/01-0), ao Prof. D. C. Souza e sua equipe pelo fornecimento das amostras de prpolis, ao CENAUREM/UFC e Profa. N. V. Gramosa pela obteno dos espectros de RMN. REFERNCIAS
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