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ELETROFORESE
Eletroforese
Parte1
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1. Caractersticas bsicas;
2. O fluxo determinante;
3. Fatores envolvidos;
4. O ponto isoeltrico;
5. Tipos de eletroforese:
Eletroforese livre,
Eletroforese em suporte semi-slido, Eletroforese em
suporte slido,
Eletroforese capilar,
Focalizao isoeltrica,
Eletroforese com SDS,
Eletroforese bidimensional,
Eletroforese de alta voltagem,
Immunobloting,
Iontoforese.
6. Revelao;
7. Analise qualitativa e quantitativa;
8. Aplicaes e procedimentos experimentais
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OBJETIVOS:
ELETROFORESE
DEFINIO:
Processo de separao e/ou caracterizao dos componentes de um sistema,
baseado na carga eltrica livre das partculas, onde ocorre a migrao
diferencial das mesmas quando submetidas a um campo eltrico.


PRINCPIO:
Para que uma partcula se mova no campo eltrico necessrio que possua
carga, isto , excesso ou deficincia de eltrons, resultando em carga eltrica
livre.
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ELETROFORESE
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A eletroforese especialmente til como mtodo analtico. Sua vantagem
que as molculas podem ser separadas e visualizadas, permitindo determinar os
componentes presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma
preparao particular de protenas.

A eletroforese permite tambm a determinao de propriedades cruciais de
uma protena, tais como o seu ponto isoeltrico e sua massa relativa.

Tcnicas especializadas de eletroforese como Western blotting, eletroforese bi-
dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadas para detectar produtos
gnicos extremamente escassos, encontrar similaridades entre eles e detectar e
separar isoenzimas.
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ELETROFORESE
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Fracionamento e caracterizao
Aminocidos
Peptdeos
Protenas (lipo e glico)
Nucleotdeos
cidos carboxlicos
Adoantes
Vitaminas
Corticoides
Pesticidas
Outras partculas que apresentem cargas em
funo do pH do meio.
ELETROFORESE
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Componentes que possuem carga eltrica livre migram para plo de carga oposta a
sua. Portanto, partculas carregadas negativamente migram para o plo positivo
(anodo) e partculas carregadas positivamente migram para o plo negativo (catodo).

Na eletroforese a fora eltrica, F
e
que move a macromolcula o potencial
eltrico (A) , vezes a carga lquida da molcula (q).

A fora que pra a migrao da macromolcula a frico, F
f
, que proporcional a
velocidade da partcula, V, vezes o coeficiente de frico, f
fr
:
No caso do campo eltrico constante, as duas foras se balanceiam e a molcula migra
com a velocidade constante.
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ELETROFORESE
Eletroforese o fluxo de partculas carregadas = o fluxo migracional.
A forca que atua sobre as molculas com cargas eltricas proporcional ao valor da
carga e o potencial eltrico.
O fluxo, J, proporcional a:

a carga pontual (q),
a concentrao da molcula (C),
a rea que o fluxo atravessa (A),
a mobilidade da molcula (u)
o potencial eltrico

|
.
|

\
|
A
A
=
x
qCAu J

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ELETROFORESE
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A velocidade com que uma partcula se movimenta no campo eltrico depende
de vrios fatores:
- densidade de carga eltrica livre:
principal fator, diretamente proporcional ao fluxo.

- potencial eltrico aplicado:
diretamente proporcional ao fluxo. A voltagem aplicada deve ser adequada para
separar o mais rapidamente possvel, antes que a difuso espalhe os
componentes. Voltagem muito alta aquece o sistema e prejudica a separao;

- raio da partcula: inversamente proporcional;
- viscosidade do meio: inversamente proporcional.
FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAO
ELETROFORTICA:
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ELETROFORESE
Outros fatores tambm influenciam na velocidade de migrao:

- pH do meio (tampo);
- fora inica do tampo;
- interao com a fase fixa;
- tipo de suporte;
- grau de embebio (adsoro) do suporte;
- temperatura;

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAO
ELETROFORTICA:
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ELETROFORESE
A adsoro a caracterstica que certos suportes, principalmente o papel, agar e
alguns tipos de agarose apresentam interagindo fisico-quimicamente com os anfolitos,
como por exemplo, protenas carregadas positivamente. Para eliminar este problema,
devemos trabalhar com solues-tampo cujo pH seja superior ao pI dos anflitos, de
modo que a carga dos anfolitos seja negativa e repulse a carga negativa presente
nestes meios.
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PONTO ISOELTRICO de uma protena o valor do pH no qual as cargas
positivas e negativas (da protena) se equivalem. No tendo carga eltrica
efetiva, e portando, no migrando na presena do campo eltrico.
Existem aminocidos que alm da carboxila e do grupo amina possuem outros grupos
dissociveis:
Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cistena (grupo sulfidrila, pK=8,3),
Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil, pK=12,5).
As protenas so poliaminocidos e, portanto, possuem o comportamento mltiplo
dos aminocidos componentes.
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ELETROFORESE
Protenas pI
Pepsina
Ovalbumina
Soroalbumina
Urease
|-Lactoglobulina
Hemoglobina
Mioglobina
Quimotripsinognio
Citocromo C
Lisozima
-1.0
4.6
4.9
5.0
5.2
6.8
7.0
9.5
10.7
11.0
PONTO ISOELTRICO
Quase todas as protenas possuem o ponto isoeltrico exato, por
exemplo:
Observe o ponto isoeltrico da pepsina que est apresentado na tabela.
H alguma coisa errada?
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ELETROFORESE
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As imunoglobulinas possuem pontos isoeltricos diferentes.
Faa uma pesquisa e descubra o porqu.
DISTRIBUIO DAS PROTEINAS SRICAS PELOS PONTOS
ISOELETRICOS
pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3
Albumina
Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina
Alfa 2- globulina Beta - lipoprotena
Alfa lipoprotena
Observe os pontos isoeltricos das protenas sricas.
Para quais polos eltricos elas vo migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?

O ponto isoeltrico da Gama-globulina est na faixa de 6.3-8.3.
H alguma coisa errada?
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ELETROFORESE
TIPOS DE SUPORTES ELETROFORTICOS:
ELETROFORESE LIVRE:
Nesse sistema as substncias so separadas em meio totalmente lquido, em tubo em forma de
U. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a maioria das
protenas tenha a mesma carga, porm com densidade de carga e mobilidade diversas. O ndice
de refrao nessa fronteira muda pela passagem das protenas. Os movimentos de conveco
provocados pela dissipao do calor exigem aparelhos e instalaes especiais. um mtodo em
desuso.
Diagrama esquemtico da clula de Tiselius para
medir a mobilidade eletrofortica pelo mtodo do
movimento de fronteiras.
No exemplo mostrada duas diferentes espcies de
protenas carregadas negativamente, com diferentes
mobilidades eletroforticas, dissolvidas em soluo
tampo. Neste caso todas as protenas migram para o
nodo. As mais rpidas assumem as fronteiras (1) tanto
ascendente quanto descendente, ultrapassando, as
mais lentas (2). Como resultado formam-se duas
fronteiras em movimento ascendente e duas fronteiras
em movimento descendente.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO
ELETROFORESE EM SUPORTE:
A soluo aquosa de protenas imobilizada em uma matriz solida ou semi-slida
(material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecnica) eliminando a conveco e
os distrbios de vibrao. Diminui a difuso das substncias, o que facilita a sua
completa separao. Metodologia mais simples, de maior resoluo e que necessita de
menores quantidades de amostra em relao a eletroforese livre.

ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO:
Os suportes slidos mais usados so papel de filtro (EPF) e acetato de celulose (EAC),
por serem materiais relativamente inertes que no interagem com as protenas
migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato de celulose tem a vantagem
sobre o papel de filtro proporcionando melhor fracionamento, inclusive na separao
de beta-globulina e beta-lipoprotena, o que no possvel em papel, e maior rapidez
na separao. O processo de eletroforese mantido at que os componentes tenham
sido separados em zonas ntidas. A posio e quantidade das protenas podem ser
avaliadas por um densitmetro.

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ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SLIDO
(a) Diagrama do instrumental utilizado. A amostra aplicada no centro do papel
previamente umedecida pela prpria soluo tampo. As extremidades do papel so
mergulhadas na soluo tampo, na qual os eletrodos esto imersos e aonde ser
aplicado o campo eltrico.
(b) Representao esquemtica do eletroforetograma completo. Veja que os ons
positivos (cations) migram em direo ao ctodo e os ons negativos em direo ao
nodo. Molculas com carga resultante nula, permanecem no ponto de aplicao da
amostra.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SLIDO
Os suportes semi-slidos mais usados so os gis de agarose e poliacrilamida. possvel maior
resoluo eletrofortica quando o suporte ou material da matriz pode retardar ou excluir
molculas proticas em funo dos seus tamanhos moleculares.

ELETROFORESE EM GEL GAR OU AGAROSE (EA): o processo semelhante ao descrito para
eletroforese em acetato de celulose. Uma variao dessa tcnica, bastante utilizada a
IMUNOELETROFORESE.

IMUNOELETROFORESE: aps a separao eletrofortica da amostra, faz-se uma reao antgeno-
anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparao para retirar as protenas solveis, restando os complexos
Ag-Ac insolveis (precipitados no gel), que so visualizados atravs de colorao especfica. A
analise imunoeletrofortica permite definir ou caracterizar uma substncia atravs de suas
propriedades eletroforticas (mobilidade), diferenas na velocidade de difuso (coeficiente de
difuso) e pelas propriedades imunolgicas (especificidade).

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ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SLIDO

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA):

A eletroforese realizada em gis feitos de polmeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de
poliacrilamida um suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtrao da
amostra pela rede do gel, reduzindo a velocidade de migrao das protenas em proporo
aproximada massa de cada uma delas. Nesse caso h associao da separao por carga e por
massa relativa. Nesse sistema as protenas so separadas por suas massas relativas.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
Aparelhos e peas para eletroforese vertical
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ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
FORMAO DO GEL DE POLIACRILAMIDA polimerizao
Gel de poliacrilamida
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
Procedimento esquemtico
As amostras (misturas das
protenas a ser analisadas
esto colocadas com ajuda
das micropipetas, nos poos
do gel (1-3). O campo eltrico
est aplicado (4) e as
protenas migram com
velocidades diferente (5, 6)
dependendo das cargas
eltricas livres e tamanhos.
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ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
EM GEL GAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA
Slab-eletroforese eletroforese em camada fina do gel
H dois tipos de gis: no topo o gel com poros
grandes e serve para concentrar as amostras; no
baixo o gel com poros menores e serve para
separao as protenas ou outros componentes do
analise.
Esquema do gel em camada fina entre
duasplacas de vidro. Aplicao das
amostras e resoluo das protenas aps
revelao.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SLIDO
Revelao
A) corante Coomassie blue; B) colorao por prata
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A) brometo de etdio; B) nitrato de prata; C) marcao radioativa;
D) quimiluminescncia; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.
ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
Revelao
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
Revelao
Com Luz UV Com corantes fluorescentes
Visualizao dos cidos nuclicos
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ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SLIDO
Revelao
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Eletroforese cidos nuclicos
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ELETROFORESE
Eletroforese na presena do SDS
Um mtodo eletrofortico comumente utilizado para a determinao da pureza e da massa relativa
de protenas faz uso de detergente dodecilsulfato de sdio (SDS). O SDS liga-se maioria das
protenas, provavelmente por interaes hidrofbicas em quantidades grosseiramente proporcionais
ao peso molecular de cada protena e, em geral, na proporo de uma molcula de SDS para cada
dois resduos de aminocidos. O SDS ligado adiciona uma grande carga negativa molcula de
protena, tornando insignificantes as cargas intrnsecas da mesma.

[CH
3
-(CH
2
)
n
-CH
2
-O-SO
3
-
] Na
+

Dodecilsulfato de sdio (SDS)

A conformao nativa das protenas alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria adquire,
ento, uma mesma forma geomtrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e, por esta razo,
passam a ter uma mesma relao entre a carga eltrica e a massa. Assim, a eletroforese na presena
de SDS separa as protenas quase exclusivamente com base na sua massa, com os polipeptdios
menores migrando mais rapidamente. Protenas tratadas com SDS, perdem a carga intrnseca e
adquirem carga negativa constante em relao a massa relativa. Sendo negativas, so atradas para o
nodo e a separao ocorre segundo a massa relativa. As protenas menores migram na frente, o
inverso da cromatografica por gel-filtrao.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
NA PRESENA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).
Exemplo do grfico padro para
determinao da massa relativa
Eletroforetograma
Etapas:
1. medida das distancias percorridas (todas as protenas e corante Lider);
2. Calculo de Rf (migrao relativa = D
p
/D
L
);
3. construo do grfico Padro, onde eixo Y migrao relativa e eixo X Logaritmo da massa
relativa das protenas padro;
4. Utilizando valor do Rf da protena desconhecida, determine o Logaritmo da massa molecular .
Descubra a massa relativa da
protena desconhecida, no
Eletroforetograma ao lado.
29
L
o
g

d
a

M
a
s
s
a

R
e
l
a
t
i
v
a

Migrao Relativa
ELETROFORESE
FOCALIZAO ISOELTRICA OU ELETROFOCALIZAO
A focalizao isoeltrica um procedimento usado para determinar o ponto
isoeltrico (pI) de uma protena. Talvez seja o mtodo mais eficiente de eletroforese.
Nesse mtodo, inicialmente, os anflitos (uma mistura de cidos e bases orgnicos,
de pequena massa) so aplicados no suporte (um gel), aps aplicarmos um campo
eltrico num tempo curto (pr-corrida) para distribuir os anflitos ao longo do gel e
estabelecer um gradiente linear de pH no gel de poliacrilamida ou agarose.
Uma mistura de molculas com
pontos isoeltricos diferentes
aplicada (1). As molculas
migram (2) at cada uma delas
chegar ao local com o valor do pH
igual ao seu pI (3).

1


2


3
3
Separao das molculas em acordo com pontos isoeltricos
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FOCALIZAO ISOELTRICA OU ELETROFOCALIZAO
Resultado
Quando uma mistura protica colocada no gel
de poliacrilamida ou agarose cada protena migra
para o ctodo ou anodo at atingir o pH, que
corresponde ao seu pI (ponto isoeltrico),
formado uma rea estacionria. Assim, protenas
com diferentes pontos isoeltricos distribuem-se
de forma diferente ao longo do gel, formado uma
rea estacionria.
O processo da revelao similar ao processo
utilizado na nossa aula pratica com papel da
celulose como suporte slido: corante revelador
e soluo descorante.
A separao das molculas de
acordo com seus pontos
isoeltricos.
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ELETROFORESE
Combinao de dois mtodos
eletroforticos :
1. focalizao isoeltrica (IEF) e
2. eletroforese na presena de SDS
Em gis bidimensionais consegue-se a
resoluo de misturas mais complexas de
protenas. Este mtodo composto mais
sensvel do que a focalizao isoeltrica ou
a eletroforese em SDS sozinhos. A
eletroforese bidimensional separa as
protenas de massa relativa idnticas, que
diferem em ponto isoeltrico, ou protenas
com pI similar, porm massas relativas
diferentes.
Eletroforese bidimensional
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Combinando os dois mtodos:
1. focalizao isoeltrica (IEF) e
2. eletroforese na presena de SDS
A eletroforese bidimensional separa as
protenas de mesma massa relativa que
diferem em pontos isoeltricos, ou protenas
com pI similares, porm massas diferentes.
Revelado com o corante Coomassie.
Eletroforese bidimensional
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ELETROFORESE
Colorao por prata Corantes fluorescentes
Eletroforese bidimensional - Revelao
Cada pontinho representa um protena diferente. A intensidade da
colorao indica a quantidade da protena.
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ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM
Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema para separao de
pequenas molculas com rapidez, antes que elas possam se difundir.
Utilizada para aminocidos e pequenos polipeptdios.
Fonte externo para eletroforese
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ELETROFORESE
IMMUNOBLOTING um poderoso mtodo de diagnostico.
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IMMUNOBLOTING um poderoso mtodo do diagnostico.
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ELETROFORESE
Analise dos eletroforetogramas. Densitometros so fotocolormetros especficos.
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Eletroforese das protenas sricas: correlaes clnico-patolgicas.
Densitogramas = curvas de absorbncia
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ELETROFORESE
Eletroforese das protenas sricas: correlaes clnico-patolgicas.
Densitogramas = curvas de absorbncia
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Determinao as quantidades relativas de cada protena nas analises
eletroforticas
Como podemos calcular as quantidades relativas de cada protena na amostra analisada, baseados apenas nos
densitogramas? Isto pode ser resolvido de duas formas:

1. Baseado na rea do grfico. Primeiro traamos uma linha na base do grfico ligando os pontos iniciais e finais.
Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivao de funes, mas podemos utilizar um artifcio
geomtrico para resolver nosso problema: basta traarmos retas paralelas aos eixos x e y, cobrindo todo o grfico
(formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como se usssemos um papel milimetrado (quanto
mais prximas essas linhas umas das outras, mais exata ser a medida obtida). Para descobrir as reas
aproximadas das curvas do grfico, devemos ento contar o nmero de quadrados contidos no grfico. Quando o
quadrado estiver apenas parcialmente contido no grfico, a ele ser atribudo valor 0,5. Quando o quadrado
estiver totalmente contido no grfico, a ele ser atribudo valor 1. Aps a contagem, soma-se os valores, obtendo
as reas relativas das curvas.

2. Com uma balana analtica. Primeiro traamos uma linha na base do grfico e com uma tesoura podemos
simplesmente recortar o grfico e obter um pedao de papel na forma dele. Em seguida pesa-se esse recorte e
anota-se a o peso obtido (P
G
=peso total), referente a todo grfico. Depois, recorta-se cada Gaussiana (picos) do
grfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa das protenas, basta estabelecer relaes
matemticas entre os pesos anotados e o peso total, P
G
.

Usar essa noo para analisar a frao relativa das protenas sricas a partir dos densitogramas de eletroforese
apresentados na pagina anterior.
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Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.
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