ABORDAGEM SOBRE Salmonella sp.

COM ENFOQUE NA CARACTERIZAO, PATOGNESE E MTODOS DE DIAGNSTICO EM AVES Eliete Souza Santana1, Fbio Henrique de Oliveira1, Tatiane Martins Rocha1, Robson Rodrigues Santana2, Maria Auxiliadora Andrade3 Ps-graduandos em Cincia Animal da Universidade Federal de Gois, elietessouza@yahoo.com.br; 2Aluno do Curso de Engenharia Agrcola da Universidade Estadual de Gois. 3Orientadora e Professora da Universidade Federal de Gois, Goinia, Gois, Brasil.
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Data de recebimento: 02/05/2011 - Data de aprovao: 31/05/2011

RESUMO Atualmente, tem-se registrado um aumento mundial de casos de infeces por Salmonella, tanto em humanos, como em aves comerciais, provocando grandes perdas econmicas, principalmente para a indstria avcola e preocupaes sade pblica. Considerando a fisiologia de cada indivduo, a carga gentica e os fatores que interferem nos mecanismos de defesa, principalmente na defesa inata, frente s agresses por micro-organismos, props-se o presente trabalho. Buscou-se fazer uma reviso, com o objetivo de elucidar aspectos, que envolvem a caraterizao, a patognese e os principais mtodos de diagnstico da Salmonella sp., e assim aprimorar medidas de controle nos plantis de criao e minimizar os riscos de toxinfeces nos seres humanos. PALAVRAS-CHAVE : diagnstico, infeces, patognese, salmoneloses. APPROACH ON Salmonella sp. FOCUSING ON CHARACTERIZATION, PATHOGENESIS AND DIAGNOSTIC METHODS IN POULTRY ABSTRACT Currently, we have registered an increase of worldwide cases of Salmonella infections in both humans, as in commercial poultry, causing great economic losses, especially for the poultry industry and public health concerns. Considering the physiology of each individual, and the genetic factors that interfere in defense mechanisms, especially in the innate defense in face of assaults by microorganisms, it was proposed in this work. We tried to do a review with the aim of elucidating aspects, in volving the characterization, pathogenesis and the main methods for diagnosis of Salmonella sp., and thus improve control measures in herds for breeding and minimize the risk of poisoning in humans humans. KEYWORDS: diagnosis, infections, pathogenesis, salmonellosis.

1. INTRODUO Salmonella uma das bactrias mais extensivamente estudada em termos de fisiologia, gentica, estrutura celular e fatores de virulncia, mesmo assim continua causando preocupaes a autoridades nacionais e internacionais dado sua complexidade e patogenicidade (DICKEL, 2004). O estudo de salmonelose, sua patognese e a utilizao de diferentes mtodos de diagnstico, serve como instrumento de avaliao do grau de contaminao dos plantis avcolas por estas bactrias nos plantis avcolas, sendo que sua presena uma barreira sanitria que restringe o comrcio de aves e seus produtos (GAMBIRAGI et al., 2003). A segurana e o controle de qualidade dos alimentos esto alicerados nas exigncias do mercado internacional e nos sistemas de gesto da qualidade da cadeia avcola que apontam para cuidados com matrias-primas, produtos e subprodutos (SILVA, 2006). A qualidade sanitria do frango fator relevante para sade pblica. A veiculao de doenas entre animais e homens tema atual e de preocupao global do ponto de vista tcnico-cientfico e comercial. Enquadra-se neste contexto todo um complexo agroindustrial de criao de aves e de comercializao nacional e internacional de carnes (REZENDE, 2006). Dentro deste enfoque, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e do Abastecimento (MAPA) atravs da portaria de nmero 193 de 19 de setembro de 1994, reforou a legislao de controle de Salmonella nas granjas avcolas, instituindo o Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA). E a partir do ano de 2003, o MAPA passou tambm a realizar um monitoramento contnuo do nvel de contaminao por Salmonella em abatedouros de aves. A implementao deste programa nos estabelecimentos sob Inspeo Federal se deu em razo das exigncias em relao segurana alimentar, aliada necessidade de que o sistema de inspeo seja realizado com base nos princpios de Boas Prticas de Fabricao (BPF) e na Anlise de Riscos e Pontos Crticos de Controle (APPCC). A construo deste sistema poder tambm, ajudar no rastreamento de surtos epidemiolgicos causados por Salmonella e na construo de um sistema de informaes para avaliao da contaminao dos produtos (BRASIL, 2003). A situao tem se agravado com a identificao de alguns sorovares que so patognicos para as aves e muito patognicos para o homem, podendo se envolver na cadeia alimentar do homem, determinando quadros de toxinfeces. 2. REVISO DE LITERATURA 2.1 Salmoneloses avirias As salmoneloses avirias so doenas agudas ou crnicas, provocadas por bactrias do gnero Salmonella. Essas bactrias infectam as aves e podem causar trs doenas distintas: (1) pulorose, cujo agente a Salmonella Pullorum, (2) tifo avirio, causado por S. Gallinarum e (3) paratifo avirio, causado por qualquer outra salmonela que no seja S. Pullorum ou S. Gallinarum (BERCHIERI JR. & OLIVEIRA, 2007).
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A pulorose uma doena septicmica, que acomete mais aves jovens, altamente especfica de galinhas e perus, que determina quadros de diarria branca, com alta mortalidade. Pode ser transmitida de diferentes formas, porm as aves portadoras inaparentes so a fonte mais importante de transmisso, tanto horizontal como vertical (REVOLLEDO, 2009). O tifo avirio uma enfermidade que acomete mais as aves adultas, mas pode afetar aves jovens com um quadro semelhante pulorose, cuja transmisso tambm pode ocorrer por diversas vias. Os animais apresentam diarria esverdeada e taxa de letalidade alta, com morbidade baixa, entretanto, por longos perodos (BERCHIERI JR., 2000; DICKEL, 2004). BERCHIERI JR. (2000) e DICKEL (2004) relataram que o paratifo avirio, acomete aves e mamferos, jovens ou adultos. A forma clnica mais freqente em aves jovens e a doena se manifesta por quadro entrico e sistmico nos casos graves que podero tornar adultas assintomticas. Os mesmos autores ressaltam ainda, que as salmonelas so responsveis por doenas veiculadas por alimentos nos seres humanos devido ingesto de produtos de origem avcola contaminado. De acordo com FRIEDMAN et al. (2003), aves jovens so mais susceptveis a infeces paratficas e pulorose do que aves mais velhas pois, embora o trato gastrointestinal (TGI) esteja completo anatomicamente ecloso, possui ainda desenvolvimento ps ecloso, pois a superfcie e a proliferao de entercitos aumentam nas duas primeiras semanas. Outro fato sobre as salmoneloses que merece ser destacado a contaminao de ovos, que ocorre como resultado da infeco do tecido reprodutivo da galinha durante a formao do folculo da gema e/ou formao do albume no oviduto e antes da formao da casca, resultando em transmisso vertical. Os ovos contaminam-se tambm aps a formao da casca, durante a passagem pela cloaca ou pelo contato com as fezes na cama, no material de ninho, mos do tratador, gua, bandejas, cama e piso, at mesmo pelo carrapato das aves Argas persicus ou em qualquer local contaminado, inclusive incubatrios, caracterizando-se a transmisso horizontal (MIYAMOTO et al., 1997; COX et al., 2000). As manifestaes clnicas e alteraes anatomopatolgicas em aves so bastante variveis e parece ser afetada por fatores relacionados ao: a) patgeno: dose infectante, virulncia da cepa, sorovar, habilidade de multiplicar e sobreviver no organismo do hospedeiro; b) hospedeiro: idade, espcie, status do sistema imune; c) ambiente: contedo gastrintestinal, pH, composio do alimento e micro-organismos competitivos (SAVAGE, 1980). Alm da doena clnica, ocorrem as infeces subclnicas, que so mais preocupantes do ponto de vista da sade pblica, pois as aves aparentemente sadias agem como reservatrios ao micro-organismo e podem introduzi-lo na cadeia alimentar do homem (BACK, 2002). Foi demonstrado em inoculaes experimentais de frangos de corte, que a Salmonella causa infeces assintomticas, com considervel colonizao intestinal (ANDRADE, 2005). Segundo RODRIGUES (2005), o estado de animal portador um fator epidemiolgico determinante, aliada s dificuldades tcnicas para sua deteco, convertem as aves em fonte contnua de contaminao do meio ambiente e, portanto, dos produtos de origem animal.

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2.2 Caractersticas da Salmonella 2.2.1 Gnero O gnero Salmonella foi caracterizado em 1885, sendo a sua denominao, uma homenagem ao patologista Daniel Salmon (RODRIGUES, 2005). Bactrias do gnero Salmonella so bacilos Gram - negativos que compem o grupo mais complexo das Enterobacteriaceae, com 2.541 sorovares descritos (CDC 2005). Esto amplamente distribudo na natureza, podendo infectar alm das aves, o homem, insetos, peixes, rpteis e mamferos em geral. De acordo com BACK et al. (2006) a Salmonella um micro-organismo de fcil adaptao no ambiente, tornando-se muito difcil a erradicao dos ambientes criatrios De acordo com o Centro de Colaborao para Referncia e Pesquisa sobre Salmonella, da Organizao Mundial da Sade (Instituto Pasteur, Paris), o gnero apresenta duas espcies, S. enterica e S. bongori, que incluem atualmente 2.519 e 22 sorovares (SPOLAORE, 2007), respectivamente. A espcie enterica possui seis subespcies (Enterica, Salamae, Arizonae, Diarizonae, Houtenae e Indica) (TOZETTO, 2006), conforme est indicado no Quadro 1. SHELOBOLINA et al. (2004) identificaram uma cepa de Salmonella que nominou Salmonella subterrnea. Essa cepa foi descrita como uma terceira espcie, isolada de sedimento coletado de regio aqfera em Oak Ridge, EUA. Entretanto, pelo diagnstico molecular demonstrou-se que, pela seqncia de DNA ribossomal, essa bactria apresentava similaridade gentica de 96,4% com Salmonella bongori. QUADRO 1. Espcies, subespcies e sorovares de Salmonella, conforme esquema de classificao de Le Minnor. Espcies N de Habitat comum sorovares Salmonella enterica subsp.enterica 1504 Animais de sangue quente subsp. salamae 502 Animais de sangue frio e meio ambiente subsp. arizonae 95 Animais de sangue frio e meio ambiente subsp. diarizonae 333 Animais de sangue frio e meio ambiente subsp. houtenae 72 Animais de sangue frio e meio ambiente subsp. indica 13 Animais de sangue frio e meio ambiente Salmonella bongori 22 Animais de sangue frio e meio ambiente Fonte: adaptado de SPOLAORE (2007). Como mencionado anteriormente, a Salmonella Entrica subespcie Enterica possui um grande nmero de sorovares, merecendo destaque em sade pblica, a S. ParaTyphi A, S. Typhimurium, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. ParaTyphi B, S. Cholerasuis, S. Infantis, S. Virchow, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Typhi e S. Anatum (TOZETTO, 2006). 2.2.2 Estrutura antignica As clulas so Gram - negativas, no capsuladas, bastonetes curtos (2-4 X 0,5-1 m), aerbias ou facultativamente anaerbicas. Possuem flagelos peritrquios e freqentemente possuem fmbrias (GOMES, 2008).
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A taxonomia do gnero Salmonella baseada na composio de seus antgenos de superfcie, que so os antgenos somticos (O), flagelares (H) e de virulncia (Vi). Existem vrias formas de classificao da Salmonella, o que torna bastante confusa a sua compreenso. O esquema de Kauffmann-White divide o gnero em tipos sorolgicos em funo dos antgenos O, H e Vi que apresentam (BRENNER et al., 2000). O antgeno somtico O um carboidrato, componente mais externo do lipopolissacardeo da (LPS) da parede celular. um polmero de subunidades O; cada subunidade composta tipicamente de quatro a seis acares dependendo do antgeno. Variaes no antgeno O resultam da variao nos componentes acares da subunidade O, nos tipos de ligao covalente entre os acares da subunidade e nos tipos da ligao entre as subunidades O que formam o polmero antgeno O (CDC, 2004). O antgeno H a poro filamentosa do flagelo bacteriano. Constitui-se por subunidades de flagelina, cuja poro antigenicamente varivel a regio central da protena. Salmonella pode expressar dois antgenos H diferentes, codificados por 2 genes distintos. A expresso desses genes coordenada de modo que somente um antgeno flagelar expresso num dado momento na clula bacteriana. O antgeno H, ao contrrio do antgeno O lbil ao calor e pode existir tanto na forma simples (monomrica) ou em duas formas separadas (difsica), um dos quais somente expresso a um dado momento. Estes antgenos flagelares distintos so referidos como Fase 1 e Fase 2 e este fenmeno conhecido como variao de fase de Andrewes. Isolados monofsicos expressam somente um tipo de flagelina, o que ocorre naturalmente em alguns sorovares (CDC, 2004; GOMES, 2008). Antgenos da fase 1 so assinalados com letras minsculas (exemplo a, b) e aqueles de fase dois so dados em nmeros arbicos ou letras minsculas. Os antgenos flagelares da fase 1 e fase 2 so determinados por dois genes, H1 e H2 que codificam para a protena denominada flagelina. Portanto, a frmula antignica designa um sorotipo que compreende a subespcie, antgenos O, antgeno H fase 1, antgeno H fase 2. Por exemplo: I 4,12:i:1,2 ( Salmonella Typhimurium); I 9,12:g,m:(Salmonella Enteritidis); II 47:b:1,5; IV 48:g,z51:- (CDC, 2004). A sntese da flagelina H2 controlada pelo evento recombinante que inverte a seo do cromossomo contendo o gene H2. Quando o gene H2 ativado, um outro gene prximo sintetiza uma substncia repressora que inibe a expresso do gene H1(GOMES, 2008). O antgeno Vi, um antgeno capsular termolbil, comumente encontrado em Salmonella Typhi, a qual causa a febre tifide no homem, sendo muito til para a identificao desse sorotipo. Tambm pode ser ocasionalmente detectado em Salmonella Dublin e Salmonella Paratyphi C (BOPP, 1999). 2.2.3 Caracterizao molecular Devido dificuldade de classificar Salmonella somente pelos antgenos de superfcie que apresentam, outras formas de classificao tm sido propostas e empregadas, sendo estas divididas em fenotpicas e genotpicas. Entre as tcnicas de caracterizao moleculares fenotpicas mais importantes destaca-se a biotipagem, que se baseia em reaes bioqumicas; a fagotipagem, baseada na
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sensibilidade a bacterifagos especficos e ainda, a sorotipagem, que consiste nas reaes antgeno-anticorpos. J a tcnica de caracterizao molecular genotpica que se destaca a do perfil plasmidial, no qual o micro-organismo classificado de acordo com os plasmdios, que so os segmentos de cido desoxirribonuclico extracromossmico (FRANCO & LANDGRAF, 1996). As tcnicas clssicas de tipagem como a biotipagem, determinao do padro de suscetibilidade a antimicrobianos, sorotipagem e fagotipagem, baseiamse na presena ou ausncia de atividades metablicas ou biolgicas expressas pelos micro-organismos (ARBEIT, 1999). A biotipagem determinada atravs dos bitipos, que so diferentes padres de fermentao de acares apresentados por um nico sorotipo. As caractersticas utilizadas so geneticamente estveis e incluem, por exemplo, no caso da S. Typhimurium, a fermentao da ramnose de Bitter, meso inositol, Lramnose, d-tartarato, e meso-tartarato, considerado o mais antigo e difuso sorovar com o maior nmero de bitipos. A perda de bitipos variantes tem mostrado que a S. Agona quando comparado com a S. Typhimurium evidenciou que S. Typhimurium de origem mais antiga (GOMES, 2008). A fagotipagem est baseada na sensibilidade da cepa a diferentes bacterifagos em apropriadas diluies. A tcnica foi utilizada, pela primeira vez, com a S. Typhi e tem sido aplicada a S. Typhimurium e a outras salmonelas. Essa tcnica possui grande valor em estudos epidemiolgicos e existem diferentes esquemas de fagotipagem (GUINEE & VAN LEEUWEN, 1978). Tem-se ainda, a tcnica da sorotipagem, que como j descrito anteriormente, baseia-se em reaes antgeno-anticorpo, na qual os carboidratos da superfcie celular, conhecidos como antgenos somticos O, e protenas flagelares, denominadas antgenos flagelares ou H (TOZETTO, 2006). Embora os mtodos fenotpicos sejam valiosos para a caracterizao de estirpes e ainda sejam utilizados, eles apresentam vrias dificuldades. Para executlos, cada amostra requer o uso de um conjunto adequado de reagentes e procedimentos. Por exemplo, para realizar a sorotipagem, necessita-se de grande volume de anti-soros. Para a execuo da fagotipagem requer-se o uso de reagentes especializados como fagos e estirpes bacterianas para propagar os fagos, disponveis somente em laboratrios de referncia (SWAMINATHAN & MATAR, 1993). Ressalta-se ainda que os sistemas de fagotipagem em bacteriocinatipagem no so disponveis para todas as espcies bacterianas. Alm disso, os marcadores fenotpicos podem no ser expressos de forma estvel em certas condies ambientais ou de cultivo (FARBER, 1996). Com a disseminao dos mtodos para anlise de DNA, tcnicas genotpicas tm sido aplicadas tipagem de estirpes bacterianas (ARBEIT, 1999). Esses mtodos de tipagem moleculares apresentam muitas vantagens sobre as tcnicas convencionais. De acordo com FARBER (1996), uma das mais importantes que o DNA sempre pode ser extrado das bactrias, pois todas as bactrias so tipveis; outra que o poder discriminatrio dos mtodos baseados em anlise de DNA maior que o dos procedimentos fenotpicos. Entre os mtodos de tipagem baseados na reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) destacam-se a (Repetitive Extragenic Palindromic) REP-PCR e a Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR). A REP-PCR utiliza iniciadores baseados em seqncias cromossomais curtas repetitivas j
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identificadas para muitas bactrias; reprodutvel e tem poder discriminatrio moderado (ARBEIT, 1999). Outro mtodo considerado simples e rpido e tem vrias vantagens o Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR), tambm referida como Arbitrarily Primed-PCR (AP-PCR). De acordo com ARBEIT (1999), difere da PCR convencional em dois pontos essenciais, pois os iniciadores utilizados so curtos, geralmente 10 pb, e as seqncias so escolhidas aleatoriamente. Outra tcnica que pode ser utilizada a eletroforese em campo pulsado (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) uma tcnica altamente efetiva para muitas espcies bacterianas. O genoma digerido com uma enzima de restrio para a qual contm poucos stios de reconhecimento, gerando cerca de 10 a 30 fragmentos de 10 a 800 pb. Esses fragmentos podem ser resolvidos como um padro de bandas distinto, usando uma cuba especialmente projetada que posiciona o gel de agarose entre trs conjuntos de eletrodos que formam um hexgono ao redor do gel. O campo eltrico fornecido em pulsos que se alternam a partir de cada conjunto de ele trodos, permitindo um alto nvel de resoluo. Todas as espcies so tipveis por PFGE e atualmente o mtodo de escolha para a tipagem de muitas espcies (ARBEIT, 1999). Para sorovares comuns como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhi, vrios mtodos de subtipagem alm da sorotipagem so freqentemente utilizados. Mtodos fenotpicos como a fagotipagem, determinao do padro de susceptibilidades a antimicrobianos e biotipagem tm sido usados para subtipar estirpes de Salmonella. Mais recentemente mtodos de genotipagem como perfil plasmidial, PFGE e RAPD-PCR foram aplicados subtipagem dos sorovares de Salmonella (BOPP, 1999). Entre os mtodos genotpicos destaca-se o do perfil plasmidial, que apesar de bastante utilizado, apresenta limitao inerente ao fato de que plasmdeos so elementos extra-cromossomais, no fazendo parte do gentipo cromossomal que define a estirpe hospedeira. Plasmdeos podem ser espontaneamente perdidos ou prontamente adquiridos, conseqentemente isolados e epidemiologicamente relacionados, podendo apresentar perfis plasmidiais diferentes (ARBEIT, 1999). Tem-se ainda, o mtodo da tipagem de Salmonella Enteritidis pelo SERE (Salmonella Enteritidis Repeat Element) (RAJASHEKARA, 1998) que consiste em uma seqncia de oligonucleotdeos localizada na regio promotora do operon sefABCD do genoma de Salmonella Enteritidis. De acordo com o mesmo autor, esta seqncia tambm aparece repetidas vezes no DNA cromossomal de Salmonella Enteritidis e em outros sorovares de Salmonella e com grande similaridade em outras espcies de bactrias. 2.3 Patognese Os eventos envolvidos na patognese da salmonelose aviria so determinados por diversos fatores. A habilidade da bactria em colonizar o trato gastrointestinal (TGI) parece estar relacionada com a imunidade inata da espcie hospedeira e a diversidade de genes de virulncia codificados pelo patgeno (BARROW et al., 1994). Alm disso, CHARLES & NAGARAJA (1994) relataram que

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a severidade de infeces por Salmonella em aves pode ser influenciada pelas condies ambientais, grau de exposio e presena de infeces concomitantes. Os quadros septicmicos atribudos salmonela esto intimamente relacionados aos efeitos da endotoxina liberada da parede celular bacteriana. A atividade endotxica est associada com o componente do lipdio A do lipopolissacardeo da parede celular. Muitos sinais da septicemia pelo patgeno so similares quelas produzidas pela inoculao experimental de endotoxinas purificada. H evidncias de que uma enterotoxina semelhante enterotoxina termolbel (LT) da E. coli produzida por algumas cepas de Salmonella sp. Tanto as enterotoxinas LT e a termoestvel (ST) tem sido observadas em extratos livres de clulas de S. Enteritidis (GOMES, 2008). As infeces causadas por Salmonella apresentam uma patognese complexa. O primeiro passo no processo da doena a transmisso da bactria para um hospedeiro suscetvel, que ocorre geralmente, pela ingesto do micro-organismo, que atravessa o trato alimentar (KRAMER, 2001). De acordo com GOMES (2008) a patogenia da enterite por salmonela pode ser dividida em: Fase 1 - a colonizao intestinal; Fase 2 - a invaso do epitlio intestinal e Fase 3 - a diarria ou estmulo exsoro de fluidos, sendo cada uma das fases descritas a seguir. a) Fase 1: Colonizao do intestino Aps a infeco oral, as clulas bacterianas podem interagir com a superfcie da mucosa, alcanar a lmina prpria, camada na qual as clulas epiteliais esto ancoradas, constituindo o primeiro passo para se estabelecer a infeco, pois o local do organismo onde se proliferam (VAN IMMERSEEL et al., 2005). Aps isso, os organismos invadem rapidamente os tecidos dos hospedeiros, atravs do tecido linfide, inclusive as placas de Peyer e, no caso das galinhas, a amgdala cecal e possivelmente tambm, os entercitos da mucosa intestinal (BARROW, 1999). DESMIDT et al. (1998) acrescentaram que o primeiro passo para o desencadeamento da infeco a aderncia da salmonela na mucosa intestinal. De acordo com ANDRADE (2005) aps colonizar o intestino, as bactrias so capazes de estabelecer uma infeco sistmica e simultaneamente a esse processo, os fagcitos iniciam a eliminao do micro-organismo. Elas podem, tambm, provocar dano citotxico superfcie da mucosa. J os sorovares responsveis por gastroenterite, como S. Typhimurium e S. Enteritidis, normalmente no penetram alm da membrana basal da camada epitelial intestinal e a doena auto-limitante. Todavia, em vrios casos, como em indivduos imunossuprimidos, estas bactrias podem atingir o sistema retculo-endotelial, provocando quadro clnico sistmico (BARROW et al., 1987). A colonizao da poro distal do intestino delgado e do clon passo inicial e necessrio na patogenia da salmonelose entrica. Bactrias fusiformes nativas, que ocupam a mucosa do epitlio intestinal geralmente inibem o crescimento das salmonelas pela produo de cidos orgnicos volteis. A microbiota normal tambm bloqueia o acesso aos stios de ligao necessrios pelas salmonelas. Sendo que fatores que rompam a microbiota normal, tais como terapia com antimicrobianos; dietas e privao de gua aumentam a susceptibilidade do hospedeiro salmonela entrica e septicmica (GOMES, 2008). A importncia das fmbrias na ligao e colonizao intestinal das
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salmonelas durante a fase inicial da patognese da enterite tem sido demonstrada em camundongos. A fmbria adere melhor na mucosa intestinal que as cepas isognicas sem fmbrias e, portanto so mais infectantes (GOMES, 2008). De acordo com o mesmo autor, o peristaltismo tambm influencia a colonizao por salmonela, pois permite um supercrescimento temporrio, especialmente no intestino delgado. De modo geral, o peristaltismo estimulado por uma microbiota ativa nativa ou indgena e a supresso destas, aumentam a susceptibilidade colonizao por esse micro-organismo. Outro fator importante que com o pH gstrico mais elevado, os indivduos se tornam so mais suscetveis infeco (DARWIN & MILLER, 1999). Pois para sobreviver no intestino delgado e ceco, a Salmonella tambm deve ser capaz de resistir aos efeitos da bile; este processo parece ser mediado por protenas (VENKINBURGH & GUNN, 1999). Alm desses fatores, a Salmonella possui tambm, outros elementos que interferem no processo da instalao da infeco, conhecidos como fatores de virulncia. Os fatores de virulncia so produtos bacterianos requeridos pelo microorganismo para produzir doena. A deleo de qualquer um deles pode resultar em reduo na virulncia ou na sua perda. Alguns tm sido identificados nas espcies de Salmonella sp., atuando em diferentes estgios da infeco (FINLAY & FALKOW, 1988). So necessrios, tanto para a bactria invadir, como para colonizar, sobreviver e multiplicar nas clulas do hospedeiro (SUZUKI, 1994). A maioria dos fatores de virulncia de Salmonella so determinados por genes cromossomais, muitos destes localizados dentro de ilhas de patogenicidade (SPI). As ilhas de patogenicidade so regies grandes do cromossoma (10 a 200pb) que carreiam um ou mais genes de virulncia. Esto presentes no genoma de bactrias patognicas, mas ausentes do genoma de representantes no patognicos da mesma espcie ou espcie intimamente relacionada e freqentemente esto localizadas adjacentes a genes de tRNA (SCHMIDT & HENSEL, 2004). b) Fase 2: Invaso do epitlio intestinal No intestino, os processos de aderncia e invaso so fundamentais para o estabelecimento das infeces causadas por Salmonella. Antes de invadir qualquer tipo de clula, as bactrias devem encontrar e aderir a um ou mais tipos de clulas do intestino. Em Salmonella Typhimurium esse tropismo pode envolver vrios tipos de fmbrias, quatro das quais foram geneticamente definidas: fmbrias tipo 1 (Fim), fmbrias codificadas por plasmdeos (PE), long polar fimbriae (LP) e fmbrias finas agregativas (curli). Foi sugerido que cada fmbria apresenta tropismo especfico para certos tipos celulares e que desempenham uma funo no recrutamento de leuccitos para o stio de infeco (DARWIN & MILLER, 1999). Depois da invaso da Salmonella no epitlio intestinal, esta passa a se multiplicar intracelularmente e devido inflamao da parede intestinal, macrfagos migram dos vasos sangneos para a lmina prpria. Leuccitos realizam a fagocitose, mas diferentemente de outros patgenos, este processo no elimina a Salmonella pela presena de substncias antimicrobianas. Posteriormente, os macrfagos retornam ao vaso sangneo e dissemina a bactria pelos rgos internos, estabelecendo um quadro de infeco sistmica, decorrente da hiperatividade do sistema retculoendotelial (VAN IMMERSEEL et al., 2005).

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A resposta inflamatria est relacionada tambm com a liberao de prostaglandinas, que so estimuladoras de adenilciclase, o que resulta em um aumento de secreo de gua e eletrlitos, provocando diarria aquosa (MIMS et al.; 2005). A adeso de Salmonella Typhimurium ou Salmonella Choleraesuis em culturas de clulas provoca uma alterao na superfcie da clula hospedeira, promovendo um aspecto franzido ou pregueado (ruffling), que resulta na internalizao da bactria no interior de uma vescula endoctica. Esse processo acompanhado por extensivo rearranjo da actina prximo ao local de invaso da bactria. Aps o engolfamento, a superfcie celular e a organizao da actina retornam ao normal. O processo de internalizao mediado por um grupo de genes designados inv que so altamente conservados em Salmonella (DARWIN & MILLER, 1999). Os genes necessrios para o fentipo de invaso esto agrupados em uma regio definida do cromossoma denominada ilha de patogenicidade de Salmonella 1 (SPI-1), que est presente em Salmonella bongori e em todas as subespcies e sorovares de Salmonella enterica j analisados. SPI-1 codifica um sistema de secreo tipo III que media a translocao de um conjunto complexo de protenas efetoras para o interior das clulas eucariticas. Um subgrupo das protenas efetoras media a invaso de clulas no-fagocticas, um processo que resulta na reorganizao temporal do citoesqueleto de actina da clula hospedeira (HENSEL, 2004; SCHMIDT & HENSEL, 2004). Tem sido demonstrado que a capacidade de invaso aumentada de algumas cepas de S. Typhimurium seria devido a gene codificado por plasmdio de 6-70 megadalton, entretanto, a base biolgica da virulncia aumentada desconhecida (GOMES, 2008). De acordo com GOMES (2008) a invaso das salmonelas tambm, em parte, determinado pelo nmero e tipo de monossacardio especiais na cadeia de polissacardio. O 3,6 -dideoxihexose so encontrados somente nas salmonelas virulentas e invasivas. Sugerindo que o 3,6-dideoxihexose, de algum modo, mascara determinantes na superfcie da clula que se ligam ao complemento e a ativam por meio da via alternativa. A falha na ativao do complemento seria claramente uma forma de sobrevivncia das salmonelas, uma vez que reduz a chance de fagocitose. c) Fase 3: Estmulo a exsoro de fludos A resposta inflamatria na mucosa intestinal importante fator no extravasamento de fludo intestinal. Prostaglandinas so liberadas como resultado a essa resposta ativa a adenilatociclase que resulta na grande secreo de gua, bicarbonatos e cloretos no lmen intestinal. A resposta inflamatria tambm dispara a liberao de substncias vaso ativas que por sua vez, aumentam a permeabilidade dos vasos da mucosa intestinal levando-os a exsoro de fludo (TOZETTO, 2006). A invaso da mucosa necessria, mas no suficiente para o acmulo de lquido para causar a diarria. possvel que enterotoxinas sejam responsveis ou contribuam para a diarria associada com Salmonella (FASANO, 1997; DARWIN & MILLER, 1999). Outra possibilidade que a interao de Salmonella com o epitlio resulta no somente na invaso das clulas epiteliais, mas tambm na produo de uma variedade de molculas sinalizadoras nas clulas epiteliais. A produo de interleucina-8 (IL-8) e do quimioatrator epitelial induzido por patgeno (PEEC) pelas clulas epiteliais estimula a inflamao e a transmigrao de leuccitos atravs do epitlio. A produo de prostaglandinas pelos leuccitos induz um aumento na ativiENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer - Goinia, vol.7, N.12; 2011 Pg. 10

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dade da adenilatociclase nas clulas intestinais, inibindo a absoro do Na+, o au mento na secreo do Cl-, provoca a secreo de fluido que se manifesta como diar ria no hospedeiro (DARWIN & MILLER, 1999). Estudos in vitro mostraram que a Salmonella induz o seu engolfamento pela clula epitelial, em um processo ativo que requer gasto de energia pela clula hospedeira (CAMPOS, 2002). O processo da infeco por salmonelas inicia-se quando estas bactrias atingem o tecido linfide associado ao trato digestivo (gut-associated lymphoid tissue - GALT) e invadem as clulas M da placa de Peyer (RAUPACH & KAUFMANN, 2001). Como estas bactrias no possuem mecanismo de escape, permanecem restritas ao fagolisossomo, no interior da clula hospedeira (GORVEL & MRESSE, 2001). Outra caracterstica importante de Salmonella a capacidade de sobreviver no interior de fagcitos. A sobrevivncia dentro de fagcitos aumenta devido bactria tornar-se resistente degradao pelas enzimas lisossomiais, podendo sobreviver e multiplicar-se no ambiente cido dos fagolisossomos (GOMES, 2008). Estudos realizados com Salmonella Typhimurium mostraram que esse um processo complexo, requerendo o envolvimento de cerca de 200 genes que incluem aqueles que auxiliam a bactria a sobreviver exposio s formas reativas de oxignio, baixo pH e defensinas. A funo da SPI-2 essencial para a habilidade de Salmonella causar infeces sistmicas e a proliferao nos rgos do hospedeiro. Este fentipo de virulncia est ligado habilidade de Salmonella enterica em sobreviver no interior de clulas fagocticas e de se replicar dentro de vesculas que contm a bactria em uma variedade de clulas eucariticas (SCHMIDT & HENSEL, 2004). 2.3.1 Resposta imune A eliminao do agente depende da resposta humoral e da resposta imune local no intestino, que se desenvolvem aps o nascimento, sendo que a imunidade local parece ser mais efetiva na salmonelose sistmica (DESMIDT et al., 1998). O trato intestinal das aves o rgo de maior responsabilidade no desenvolvimento da imunidade geral inespecfica. Diferentemente de todas as outras espcies animais, as aves no apresentam linfonodos. Seus rgos linfides, espalhados ao longo do trato intestinal, so as placas de Peyer, tonsilas cecais e Bolsa de Fabricius que uma invaginao da parte final do trato digestivo. Estes tecidos captam antgenos disponibilizados no trato digestivo que estimulam as clulas B, precursoras de IgA e clulas T, presentes nas placas de Peyer, para o desenvolvimento de imunidade geral e inespecfica. Atravs do estmulo imunolgico da mucosa, h produo de anticorpos tipo IgA que bloqueiam os receptores e reduzem o nmero de bactrias patognicas na luz do trato intestinal (JIN et al., 1998). Alm de estudos dos mecanismos de defesa resultantes de infeco natural, estudos tm sido desenvolvidos com a utilizao de vacinas contra salmonelas, que foram inicialmente utilizadas para controle dos quadros de pulorose ( S. Pullorum) e tifo avirio (S. Gallinarum), com vacinas vivas feitas a partir de uma cepa ruENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer - Goinia, vol.7, N.12; 2011 Pg. 11

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gosa de Salmonella Gallinarum, de baixa patogenicidade (CARDOSO & ROCHA, 2006). HOPKINS et al. (1995) demonstraram que Salmonella Typhimurium capaz de induzir resposta sistmica e de mucosa aps nica imunizao por quatro diferentes vias: oral, nasal, retal ou vaginal. Alm disso, as salmonelas so capazes de estimular resposta imunolgica via complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II, aps atravessarem as clulas M da mucosa intestinal (WEISS & KRUSCH, 2001). Os antgenos apresentados por estas duas classes de MHC so reconhecidos respectivamente por clulas T CD8+ e CD4+ (YRLID et al., 2001). Desde o seu desenvolvimento, as linhagens atenuadas de Salmonella tm sido caracterizadas como organismos para expresso de antgenos heterlogos (GARMORY et al., 2002). Isso permitiu que a utilizao de imungenos vivos atenuados extrapolasse o problema das salmoneloses, uma vez que se tornou possvel o uso destas bactrias como carreadoras de antgenos vacinais (ALMEIDA et al., 2002). O mecanismo de defesa do lipopolissacardeo (LPS) mostrou ser capaz de elicitar uma resposta de hipersensibilidade retardada semelhante aquela elicitada pela imunizao com doses subletais de organismos vivos. Entretanto, o antgeno deve ser incorporado em lipossomas para o efeito de hipersensibilidade retardada ocorrer. Como exemplo, estudos da principal protena da membrana externa da S. Typhimurium mostrou que ela deve ser misturada com o LPS para induzir a sntese de anticorpos protetores (GOMES, 2008). Desta maneira, segundo o mesmo autor, os anticorpos humorais so direcionados contra o antgeno da cadeia O do LPS e contra a protena da membrana externa. Anticorpos O so aglutinantes se eles so do isotipo IgM. Eles podem instigar bacterilise pela fixao do complemento protetores. Anticorpos para a protena de membrana embora no sorovar especfico podem atuar como opsoninas (ao protetora). Anticorpos para o core de glicolipidio (2 ceto-3 deoxioctonato-lipidio A) do LPS so efetivos na neutralizao do efeito endotxico do LPS da salmonela. Este efeito pode ser expresso em todas as infeces por bactrias Gram negativas no qual o mesmo core glicolipdio esteja envolvido protetores (GOMES, 2008). Uma observao importante no estudo de respostas imunes do organismo das aves Salmonella, que no caso das infeces por Salmonella Enteritidis que, quando este sorovar est presente num lote de aves, outros normalmente encontrados, desaparecem. Podendo postular que a infeco por Salmonella Enteritidis possui um excelente mecanismo de resistncia s outras salmonelas em aves (CARLI, 2006). Embora no dominado para efeitos prticos, sabe-se que as aves apresentam mecanismo de resistncia gentica s salmonelas. Linhagens resistentes a Salmonella Enteritidis tambm o so S. Gallinarum, S. Pullorum e S. Typhimurium (BARROW, 2000). 2.4 Mtodos de diagnstico Um diagnstico definitivo e eficaz para pulorose, tifo avirio e paratifo avirio est baseado no isolamento, identificao e tipificao sorolgica da Salmonel-

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la. Contudo, ele deve ser complementado pelo histrico, sinais clnicos, leses e dados epidemiolgicos (MACHADO, 2000; OLIVEIRA, 2004). Alm dos mtodos para diagnosticar a doena clnica, so utilizados mtodos para detectar aves portadoras inaparentes. Merecem destaque, os testes sorolgicos que tm sido desenvolvidos para detectar anticorpos para Salmonella e os que identificam e isolam o agente atravs das tcnicas de microbiologia convencional, diagnstico molecular e imunoistoqumica (REVOLLEDO, 2009). A escolha do procedimento laboratorial adequado um pr-requisito essencial para o isolamento de qualquer micro-organismo, pois sabe-se que h diversos fatores que podem afetar os resultados no isolamento e identificao de agentes infecciosos (ALBUQUERQUE et al., 2000). a) Testes sorolgicos: Entre os exames laboratoriais mais utilizados para isolar Salmonella, pode-se citar os testes sorolgicos: hemoaglutinao ou soroaglutinao rpida em placas (SAR), teste de soroaglutinao lenta e ensaio imunoenzimtico (EIE ou ELISA) (OLIVEIRA, 2004). Esses testes permitem avaliar tanto ttulos para antgenos somticos como flagelares. Entretanto, eles apresentam limitaes, pois muitos animais infectados no desenvolvem os anticorpos, pois o soro foi colhido muito cedo ou a infeco no foi severa o suficiente para estimular uma resposta imune ou ainda, o animal no respondeu ao estmulo (ALVAREZ et al., 2004). Isto tambm possvel quando os animais transferem passivamente os organismos ao longo do intestino sem desenvolver resposta imune, gerando assim, a necessidade de estudar outras tcnicas de diagnstico mais precisas (FAKHR et al, 2005). Para o diagnstico de portadores da pulorose, usa-se o teste de hemoaglutinao efetuado no prprio avirio, usando antgeno de laboratrio idneo controlado com soros positivos e negativos no momento da execuo da prova. Entretanto, ressalta-se, que esse teste pode apresentar resultados falso-positivos, devido ser um teste de baixa especificidade e falso-negativos em conseqncia, tambm, da baixa sensibilidade (GAST & BEARD, 1990). Do mesmo modo, pode-se realizar entre estas tcnicas a soroaglutinao rpida (SAR), em que se utiliza o soro sanguneo para deteco de soroaglutininas, tanto em tubo quanto em lmina ou pela aglutinao de sangue total em lmina. O teste de lmina positivo oferece a mesma interpretao. O antgeno nesse teste uma suspenso pesada e corada de Salmonella. Para deteco de anticorpos existe tambm, o teste de microaglutinao, sendo este teste mais eficaz na deteco de ttulos baixos de anticorpos. Sendo que anticorpos podem ser detectados na gema do ovo das aves infectadas (BAUDART et al., 2000; RASSCHAERT et al., 2005). Outro teste sorolgico bastante utilizado o ELISA, no qual a deteco de IgG anti-Salmonella em monitoramentos sorolgicos de infeces naturais ou experimentais (HASSAN et al., 1990) tambm tem sido amplamente empregado devido sua sensibilidade e simplicidade na sua utilizao (BARROW, 2000). Na tcnica imunolgica de ELISA, empregam-se anticorpos policlonais ou monoclonais marcados com uma enzima, normalmente cromognica. Essa enzima funciona como um revelador da ocorrncia da ligao do antgeno com o anticorpo especfico. Pois, ao se adicionar ao sistema o substrato dessa enzima, h o desenvolvimento de cor. Nos vrios trabalhos conduzidos para investigar a possibilidade
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do emprego da tcnica imunoenzimtica para detectar Salmonella em aves, verificou-se que essa tcnica, apresentou alta especificidade e/ou sensibilidade (FELDSINE, 1993). b) Bacteriologia convencional A tcnica microbiolgica convencional recomendada pelo MAPA (BRASIL, 2003). Sendo que, aps a identificao da bactria pelos testes bioqumicos e sorolgicos, a cepa deve ser determinada em laboratrio de referncia para proceder a sorotipagem (BOPP et al., 1999). As tcnicas convencionais para deteco de Salmonella envolvem um grande nmero de etapas e o tempo para obteno de resultados muito longo, da a principal explicao de muitas pesquisas estarem sendo realizadas visando a introduzir metodologias rpidas e sensveis para enfrentarem a agilidade que o mercado atual exige (REIS, 2001). c) Imunoistoqumica Os exames imunoistoqumicos tambm esto sendo cada vez mais utilizados na rotina diagnstica de enfermidades em vrias espcies de animais domsticos, inclusive nas aves (SUSTER et al., 2000). Esse crescimento pode ser evidenciado pelo crescente nmero de laboratrios de patologia que utilizam essa tcnica em suas rotinas diagnsticas, bem como pelo crescente volume de trabalho desses laboratrios com o passar dos anos (ALVES et al., 1999). O uso de imunoistoqumica, como mtodo de diagnstico, se deve a alguns fatores, entre eles, a necessidade, cada vez mais presente de diagnsticos precisos para determinar tratamento e prognstico; um nmero crescente de anticorpos disponveis para o uso em tecidos fixados em formalina e includos em parafina; a disseminao da tcnica, com vrios avanos, um deles de fundamental importncia, a assim chamada tcnica de recuperao antignica (sistemas de recuperao de eptopos atravs do calor radiao ou calor mido) e principalmente, a disseminao da idia de que o exame imunoistoqumico poder resolver possveis dvidas diagnsticas (GOWN & BACH, 2005). A imunoistoqumica considerada um recurso diagnstico seguro e eficiente para a identificao de constituintes teciduais ou celulares atravs da interao antgeno-anticorpo. Tais anticorpos marcados atravs de sua conjugao com enzimas ou substncias fluorescentes permitem localizar determinantes antignicos em tecidos fixados e processados por mtodos convencionais (AVRAMEAS, 1970). HAANWINCKEL et al. (2004) confirmaram a sensibilidade, especificidade, a praticidade no processamento, bem como elevada estabilidade dos reagentes utilizados na tcnica de imunoistoqumica. Credenciaram ento, como um mtodo de fcil execuo e que demanda pouco tempo de preparao, portanto, com possibilidade de introduo na rotina diagnstica. d) Testes moleculares A partir da dcada de 70, estudos de hibridizao de DNA demonstraram que as estirpes de Salmonella formam um nico grupo de hibridizao de DNA, com sete subgrupos (EUZBY, 1999). Posteriormente, anlises de eletroforese de enzimas multilocus confirmaram a existncia de subgrupos consistentes com aqueles
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baseados em hibridizao de DNA, com uma exceo, o que levou criao da espcie Salmonella bongori (BOYD et al., 1996). Apesar do sucesso na utilizao das tcnicas de hibridizao de DNA, aps o surgimento das tcnicas de amplificao do cido nuclico, sua utilizao na veterinria diminuiu e ficou restrita a laboratrios de pesquisa. As tcnicas de amplificao podem ser aplicadas em amostras clnicas, contendo pequenas quantidades de micro-organismos, com alta sensibilidade e especificidade, apresentam maior segurana e menor custo, uma vez que no utilizam radioistopos ou marcadores enzimticos (MORENO, 2009). De acordo com OYARZBAL (1996) a amplificao do DNA pela reao em cadeia pela polimerase (PCR) a tcnica de maior aceitao entre as demais tcnicas moleculares desenvolvidas recentemente (BAILEY & COX, 1996). Apresenta como vantagens, a velocidade e facilidade de sua utilizao; a sensibilidade, pois capaz de amplificar seqncias a partir de discretas quantidades do DNA-alvo e at mesmo do DNA de uma nica clula (LI et al., 1988); e robustez, ou seja, por permitir a amplificao de seqncias especficas a partir de material que est gravemente degradado em um meio onde o isolamento de DNA problemtico (READ, 2002). Outras vantagens das provas moleculares incluem a elevada especificidade e sua utilizao para detectar um gene ou seqncia de cidos nuclicos de um organismo particular ou de um grupo de organismos, o uso para detectar e identificar organismos sem a necessidade de cultivo e isolamento em cultura pura, descartando a subjetividade dos testes microbiolgicos; serem designadas e usadas para detectar organismos especficos ou grupos taxonmicos amplificados, como o caso de provas de regies alvo da molcula de RNA ribossmico (rRNA) com diferentes nveis de variabilidade (COUTINHO et al., 1999). Alm disso, a PCR permite a replicao in vitro de seqncias definidas de DNA, no sendo necessrio, para isto, conhecer a estrutura completa do DNA alvo, mas apenas aquelas que flanqueiam a regio a ser amplificada, definida como primers ou iniciadores, que hibridizam com estas regies (MULLIS et al., 1986). Segundo COHEN et al. (1994), devido ao fato da PCR detectar uma regio nica de um genoma bacteriano, a tcnica demonstra maior especificidade quando comparada com os mtodos microbiolgicos tradicionais. A seleo das seqncias que flanqueiam os segmentos de DNA que se pretende amplificar por PCR um ponto crtico da tcnica. A especificidade da PCR decorre da preciso com que os iniciadores desempenham esta tarefa, ou seja, hibridizam com o DNA alvo. Para a deteco de salmonelas, a regio escolhida deve ser comum a maioria das cepas, codificar para protenas com importncia na patogenicidade da bactria e no apresentar homologia com outros micro-organismos, o que poderia fornecer resultados falso-positivos (STONE et al., 1994). BAUMLER et al. (1997) relataram vrios iniciadores utilizados para deteco de salmonelas, como invA, agfA, IS200, hin, H-li, iagAB, spvR, viaB, mkfA, ompC, oriC, e cita como principal diferena entre eles a especificidade. Por exemplo, o gene invA estaria presente nas espcies enterica e bongori, enquanto iagAB identificaria apenas os sorovares enterica subespcie I. GALAN et al. (1992) efetuaram a caracterizao molecular de um dos genes de invaso de Salmonella e identificaram um lcus gentico, denominado inv, como o primeiro de um operon de genes arranjados na mesma unidade transcricioENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer - Goinia, vol.7, N.12; 2011 Pg. 15

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nal, que codificaria protenas relacionadas com penetrao celular, sendo considerado um componente essencial para a patognese da doena. Os grupos de genes inv, denominados A, B, C, D e E esto presentes na maioria das salmonelas e ausentes na regio correspondente de E. coli, sendo considerados hbeis para distinguir entre Salmonella e outras espcies bacterianas atravs de hibridizao com sondas especficas ou amplificao por PCR. 3. CONSIDERAES FINAIS Apesar das medidas de biossegurana empregadas na indstria avcola, essa enfermidade continua sendo responsvel por perdas econmicas tanto para a avicultura, por causar severos quadros septicmicos e entricos, com reduo da produo, como tambm, freqentes problemas de sade pblica. Embora sua ocorrncia tenha diminudo nos ltimos anos, ainda um dos patgenos bacterianos mais comuns, em doenas transmitidas por alimentos de origem avcola para os seres humanos. Alm do que, o controle e a preveno sanitria so requisitos fundamentais para garantir avicultura brasileira o mercado internacional para seus produtos, pois, a presena de bactrias, como a Salmonella sp. em produtos de origem animal pode representar barreira sanitria ao comrcio de produtos avcolas. O estudo da Salmonella permite uma melhor caracterizao do patgeno, pois a identificao e caracterizao molecular do micro-organismo so importantes ferramentas nos laboratrios de doenas de aves e de sade pblica. Alm disso, podem tambm, auxiliar na identificao da fonte de contaminao, no controle de surtos e levar a uma reduo nas taxas de transmisso. Sabe-se que, a atual posio mundial do Brasil na produo de frangos, no se deve somente ao preo, mas tambm a qualidade sanitria dos seus produtos, que atende um mercado consumidor cada vez mais exigente. REFERNCIAS ALBUQUERQUE, R; ITO, N. M. K.; MIYAJI, C.I . Estudo comparativo de diferentes meios de cultura para o isolamento de Salmonella em matrias-primas e raes. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 37, n.1, p. 5664, 2000. ALMEIDA, M. E. S. Salmonella vacinais. Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento, Braslia, DF, v. 25, p. 22-26, 2002. ALVAREZ, J.; SOTA, M.; VIVANCO, A. B.; PERALES, I.; CISTERNA, R.; REMENTERIA, A.; GARAIZAR, J. Development of a Multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of Salmonella in human. Journal Clinical Microbiology, v. 42, p. 1734-1738, 2004. ALVES, V. F. A.; BACCHI, C. E.; VASSALO, J. Editores. Manual de Imunoistoqumica. Sociedade Brasileira de Patologia , p.1-270, 1999.

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