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Instituto Superior de Ciências da Saúde- Sul Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 5

Controlo dos microrganismos por agentes químicos. Estudo da


susceptibilidade bacteriana aos antibióticos e desinfectantes

5.1 - Introdução

5.1.1 - Algumas definições

Anti-sépticos – Substâncias químicas com propriedades antimicrobianas com


mecanismos de acção inespecíficos e que podem ser utilizadas sobre os tecidos vivos
(pele e membranas mucosas).

Desinfectantes – Substâncias químicas com propriedades antimicrobianas utilizadas


sobre materiais inertes, normalmente tóxicas para a pele e membranas mucosas.

Compostos antimicrobianos – Substâncias de origem natural, sintética, ou semi-


sintética, que destroem ou inibem os microrganismos exercendo a sua acção a nível
molecular, num processo metabólico ou numa estrutura celular concreta dos
microrganismos.

Durante muito tempo foram denominados antibióticos todos os compostos


antimicrobianos produzidos por fungos (ex. Géneros Penicillium e Cephalosporium) ou
bactérias (ex. Géneros Bacillus e Streptomyces) que inibiam o crescimento ou destruíam
outros microrganismos. Esta definição é hoje muito restritiva e deve ser abandonada
porque as moléculas obtidas por síntese, ou por modificação química de uma molécula
natural, podem originar as mesmas propriedades. Um antibiótico é actualmente
definido como uma substância de origem biológica ou sintética que actua
especificamente sobre uma etapa essencial do metabolismo das bactérias (agentes
antibacterianos que podem ser classificados de acordo com a sua estrutura química ou
modo de acção sobre as bactérias) ou dos fungos (agentes antifúngicos). Esta definição
abrange todos os compostos antimicrobianos com excepção dos anti-sépticos e
desinfectantes, qualquer que seja a sua origem.

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Os antibióticos são utilizados na terapêutica de numerosas doenças infecciosas, daí


serem também designados por agentes quimioterapêuticos antimicrobianos.
O espectro de acção antimicrobiano dos antibióticos é o seu grau de eficácia
antimicrobiana. No caso de antibióticos de largo espectro significa que são activos
contra um grande número de bactérias Gram (+) e Gram (-). Os de baixo espectro são
activos unicamente contra certas bactérias Gram (+) ou Gram (-)

5.1.2 - Mecanismos de acção dos antibióticos


Com excepção das polimixinas os antibióticos actuam sobre uma etapa essencial do
metabolismo bacteriano principalmente sobre as reacções de síntese de:
• Proteínas (ex. tetraciclina)
• Peptidoglicano (ex. ampicilina)
• Ácidos nucleicos (ex. rifampicina)
• Folatos (ex. sulfonamidas)

5.1.3 - Estudo da actividade de um antibiótico in vitro


As definições de efeito bacteriostático e de efeito bactericida de um antibiótico baseiam-
se em estudos experimentais. Coloca-se a bactéria em contacto com o antimicrobiano e
estuda-se a sua sobrevivência em função do tempo, fazendo variar a concentração de
antibiótico (Fig. 5.1).

Figura 5.1 – Efeito de um antibiótico


no crescimento bacteriano.

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Efeito bacteriostático de um antibiótico - Os antibióticos bacteriostáticos induzem


bloqueios reversíveis da síntese proteica dos microrganismos. Este fenómeno impede a
multiplicação normal das bactérias no organismo e este depois encarrega-se de eliminar
as bactérias por intermédio de mecanismos imunológicos.

Exemplos de antibióticos bacteriostáticos:


- Tetraciclinas
- Cloranfenicol
- Macrólidos (ex. eritromicina)
- Rifamicinas

Efeito bactericida de um antibiótico – Os antibióticos bactericidas podem inibir a


síntese proteica dos microrganismos ou podem destruir a membrana citoplasmática
provocando lesões profundas e irreversíveis nas células bacterianas. Verifica-se ao
longo do tempo uma redução do número de microrganismos que será tanto mais
marcada quanto maior for a concentração do antibiótico.
Exemplos de antibióticos bactericidas:
- Penicilinas e cefalosporinas
- Aminoglicosidos (ex. gentamicina)
- Polimixinas

Por vezes a acção antimicrobiana é parcial e depois de uma diminuição precoce do


número de bactérias observa-se crescimento bacteriano. Este fenómeno pode ser devido
à instabilidade do antibiótico in vitro, à heterogeneidade da população bacteriana, que
pode comportar um número de bactérias genotipicamente mais resistentes que a maioria
da população ou à indução da produção de enzimas que conferem resistência ao
antibiótico.
A acção de um antimicrobiano sobre uma estirpe bacteriana pode ser caracterizada por
dois parâmetros:
• CMI (Concentração Mínima Inibitória) – A mais baixa concentração de
antibiótico que inibe a multiplicação das bactérias (bacteriostase), em 18-24h. A CMI
exprime-se em µg/ml.

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• CMB (Concentração Mínima Bactericida) – A mais baixa concentração de


antibiótico capaz de matar, após 18 horas de contacto a 37ºC, uma população
bacteriana. A CMB exprime-se em µg/ml.

Se a CMB de um antibiótico sobre uma estirpe bacteriana é próxima da CMI


(CMB/CMI = 1 ou 2), o antibiótico é considerado bactericida.
Se a CMB de um antibiótico é muito elevada em relação à CMI (CMB/CMI = 4 a 16), o
antibiótico é considerado bacteriostático.

5.1.4 - Métodos de determinação da susceptibilidade bacteriana aos antibióticos – o


antibiograma
O estudo do comportamento de uma bactéria face aos antibióticos, pelo crescimento de
uma população bacteriana em presença de gradientes de concentração de diferentes de
antibióticos, permite determinar a sua sensibilidade ou resistência a esses antibióticos.
Este teste designa-se por antibiograma. Para realizar um antibiograma podem usar-se
os seguintes métodos:
1) Métodos de diluição (em meio de cultura líquido ou sólido) – São métodos
quantitativos, considerados de referência, para determinar a sensibilidade das bactérias
aos antibióticos. Baseiam-se no emprego de diluições progressivas do antimicrobiano
que é adicionado ao meio de cultura onde se irá inocular a bactéria a estudar. Podem
realizar-se em meio líquido ou sólido. Estes métodos permitem determinar a CMI e a
CMB.

2) Métodos de difusão (em meio sólido) - O método de difusão em agar é uma prova
qualitativa adequada para estudar a sensibilidade das bactérias de crescimento rápido.
Não é adequada para as bactérias de crescimento lento e baterias anaeróbias nem para os
antibióticos que difundem com dificuldade. É uma técnica sensível e flexível no que diz
respeito às substâncias que podem ser estudadas. Permite classificar o microrganismo
em sensível, intermédio ou resistente a determinado conjunto de antibióticos.

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5.1.5 - Técnicas de determinação da CMI de um antibiótico

Método de diluição em meio líquido (Fig. 5.2):


1) Colocar em tubos de ensaio concentrações crescentes de antibiótico.
2) Adicionar a cada um dos tubos uma cultura de bactérias em fase exponencial de
crescimento diluída de forma a obter uma concentração final de 106 cél./ml (0.5 ml de
suspensão após 18 horas de incubação).
3) Incubar durante 18 horas ao fim das quais se verifica qual a concentração de
antibiótico que inibe a multiplicação bacteriana visível.

Figura 5.2.
Representação
esquemática da
determinação da
CMI de um
antibiótico pelo
método de
diluição em meio
líquido.

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Método de diluição em meio sólido (Fig. 5.3):


1) Incorporar no meio de Mueller - Hinton concentrações crescentes de antibiótico.
2) Deixar secar e semear uma cultura de bactérias em fase exponencial de crescimento,
diluída de forma a obter uma concentração final de 106 cél./ml.
3) Incubar durante 18 horas, ao fim das quais se observa qual a concentração antibiótica
que inibe a multiplicação bacteriana visível.

Este método tem a vantagem de possibilitar o estudo de um grande número de espécies


bacterianas em simultâneo.

Figura 5.3 –
Representação
esquemática da
determinação da CMI
de um antibiótico
para seis espécies
bacterianas (A, B, C,
D, E, F) pelo método
de diluição em meio
sólido.

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Método de difusão em gelose ou método dos discos (Fig. 5.4):

Nesta técnica, discos de papel impregnados com uma quantidade definida de antibiótico
são dispostos à superfície de um meio gelosado de Mueller-Hinton previamente
semeado com zaragatoa com uma suspensão de bactérias em fase exponencial de
crescimento. A partir do disco, o antibiótico difunde na gelose. Após a incubação do
meio de cultura 18 h a 37 ºC, verifica-se se existe inibição do crescimento bacteriano ao
redor dos discos. A sensibilidade ou a resistência de cada estirpe bacteriana é função do
diâmetro do halo de inibição do crescimento formado à volta dos discos de antibióticos.

Figura 5.4 – Representação esquemática da determinação da CMI de um antibiótico


pelo método dos discos.

Para cada antibiótico, mede-se o diâmetro do halo de inibição do crescimento bacteriano


e deduz-se o valor (aproximado) da CMI do agente antimicrobiano em função da
espécie estudada (fig. 5.5). Com efeito, para um determinado antibiótico, existe uma
relação entre o valor do diâmetro do halo de inibição de crescimento e a CMI. Este é
estabelecido por estudos comparativos previamente estabelecidos sobre um grande
número de espécies bacterianas.

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Figura 5.5 -
Relação entre
a CMI e os
diâmetros dos
halos de
inibição.

Hoje em dia, o método dos discos é o mais utilizado e o mais rigoroso se forem
respeitados três parâmetros:

1) Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar deve ter de espessura 4 mm e de diâmetro 9 cm. O pH deve
ser igual a 7.3. Geralmente usa-se o meio de Mueller-Hinton que apresenta as seguintes
vantagens:
• Não é antagonista dos principais agentes antibacterianos.
• Não é sujeito a grandes variações de pH.
• É aproximadamente isotónico com o sangue podendo ser adicionado de 5% de
sangue para bactérias mais exigentes.

2) Densidade do inóculo
O inoculo tem de ser estandardizado pois uma má estandardização deste leva a uma
grande variabilidade dos diâmetros das zonas de inibição.

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O inoculo é estandardizado com base na escala de McFarland. A escala de McFarland


mede o grau de turvação da suspensão bacteriana por comparação com uma solução de
cloreto de bário. Os valores da escala de McFarland variam entre 0 e 5 unidades. Para o
antibiograma de Enterobactérias deve usar-se um inóculo com 0.5 unidades McFarland.
Para o antibiograma de Estafilococos deve usar-se um inóculo com 1.0 unidades
McFarland.
Se a concentração do inóculo for elevada a sementeira é muito densa e pode ocorrer má
difusão do antibiótico na gelose. Se a concentração do inóculo for baixa o antibiótico
difunde-se sem restrições aparecendo uma zona de actuação que é demasiado grande. Se
a concentração do inóculo for ideal a difusão do antibiótico é correcta e o disco fica
envolvido por uma zona de inibição bem definida.

3) Concentração de antibiótico
A concentração de antibiótico deve ser sempre a mesma para que possam ser usadas as
tabelas de resultados. A conservação dos discos de antibiótico deve ser feita no
frigorífico e o seu controlo de qualidade deve ser realizado com estirpes padrão de E.
coli, S. aureus e P. aeruginosa.

Causas de erro mais comuns:


1 -Alteração dos discos por conservação não adequada. Pode verificar-se um
decréscimo das zonas de inibição para estirpes de controlo.
2 -Inoculo demasiado concentrado ou diluído, originando assim, diminuição ou
aumento das zonas de inibição.
3 - Variação ou contaminação da estirpe bacteriana.
4 - Leitura incorrecta dos diâmetros dos halos de inibição.
5 - Transcrição errada dos resultados.

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Técnica de Kirby-Bauer de execução de um antibiograma


(Adaptada pela FDA e aconselhada pela OMS)

Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar é o meio sólido de Mueller-Hinton. O pH do meio deve ser
entre 7.2 e 7.4, verificado sempre para cada lote do meio. Nas placas, o meio deve ter
uma superfície plana e uma altura uniforme de 4mm aproximadamente. As placas de
meio devem ser conservadas no frigorífico. Quando vão ser inoculadas as placas não
devem apresentar gotas de água à superfície do meio nem na tampa, para o que são
postas a secar na estufa a 35 - 37ºC, geralmente 15 a 30 minutos.

Preparação do inóculo
A partir de uma cultura pura do microrganismo em estudo, em fase exponencial de
crescimento, escolhem-se 4 ou 5 colónias isoladas, morfologicamente semelhantes com
que se prepara uma suspensão em 5 ml de caldo nutritivo. Incubar 2 a 4h a 35 - 37º C
até obter turvação compatível à unidade 0.5 da escala de McFarland. Diluir em seguida
com soro fisiológico do seguinte modo:

Staphylococcus - 1 : 2
Enterobacteriaceae - 1 : 5

Inoculação das placas


Com uma zaragatoa previamente mergulhada na suspensão bacteriana, tendo tido o
cuidado de a apertar e rolar contra as paredes do tubo para expelir o líquido em excesso,
semeiam-se por estrias apertadas as placas de agar Mueller-Hinton em duas direcções
ou mais, por toda a superfície do meio e passando no final a zaragatoa a toda a volta da
placa. Deixa-se secar o inóculo durante 5 a 10 minutos.

Aplicação dos discos de antibióticos


Os discos devem ser conservados no frigorífico em embalagens bem fechadas. Estas
devem ser retiradas do frigorífico e aguardar à temperatura ambiente 1 a 2 horas, de tal
modo que quando seja necessário abri-las, os discos já tenham atingido a temperatura
ambiente. Os discos são aplicados sobre a superfície do meio inoculado com um
distribuidor mecânico ou com uma pinça, tendo o cuidado de exercer sobre cada um

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deles uma ligeira pressão para assegurar um perfeito contacto com o meio. Deixar pré-
difundir durante cerca de 15 minutos. Os discos devem ser colocados a mais de 15 mm
do bordo da placa e distanciados uns dos outros de modo a evitar sobreposição das
zonas de inibição. Colocar as placas a 37º C.

Leitura dos resultados


Após 16 - 18 horas de incubação a 37 ºC, medem-se os diâmetros das zonas de inibição,
com a ajuda de uma régua, craveira ou compasso. Deve observar-se a placa fechada
invertida debaixo de luz reflectida sob um fundo negro. De acordo com a inibição de
crescimento observada, a bactérias é classificada como Sensível, Intermédia ou
Resistente, de acordo com tabelas publicadas.

5.1.6 - Técnicas de determinação da CMB de um antibiótico

Método de diluição em meio líquido (Fig. 5.6):

1) Colocar em tubos de ensaio, concentrações crescentes de antibiótico.


2) Adicionar a cada um dos tubos uma cultura de bactérias em fase exponencial de
crescimento diluída de forma a obter uma concentração final de 106 cél./ml (0.5 ml de
suspensão após 18 horas de incubação).
3) Incubar durante 18 horas e verificar qual a concentração de antibiótico que inibe a
multiplicação bacteriana visível.
4) Fazer uma sementeira em gelose nutritiva do 1º tubo com antibiótico em que não se
verifica crescimento bacteriano visível.
5) Incubar 18h/37 ºC e verificar se há crescimento ou não.
6) Caso haja crescimento, deve-se fazer o mesmo teste no tubo de concentração
imediatamente a seguir, e assim sucessivamente, até encontrar o tubo para o qual não há
crescimento em sementeira. Essa é a concentração que dá a CMB.

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Figura 5.6 -
Representaçã
o esquemática
da
determinação
da CMB de
um antibiótico
pelo método
de diluição
em meio
líquido.

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5.2 - Protocolos experimentais

Pretende-se que os alunos executem um antibiograma utilizando uma técnica habitual


em laboratórios de Microbiologia Clínica e estudem o efeito de dois desinfectantes
sobre duas espécies bacterianas.

1) Execução de antibiograma segundo a técnica de Kirby-Bauer:

• A partir de culturas em fase exponencial de crescimento preparar suspensões em


soro fisiológico (SF) ou água destilada estéril (ADE) de:
Escherichia coli (5 colónias- 0.5U McFarland)
Staphylococcus aureus (10 colónias-1.0U McFarland)
Pseudomonas aeruginosa (10 colónias- 1.0U McFarland)

• Embeber uma zaragatoa na suspensão bacteriana e inocular uma placa de meio de


Mueller - Hinton por estrias apertadas (em duas direcções, ou mais) por toda a
superfície do meio.
• Deixar secar 2 ou 3 minutos ao bico de Bunsen.
• Colocar em cada placa um máximo de sete discos dos antibióticos com uma pinça ou
um aplicador mecânico.
• Incubar as placas a 37 ºC durante 24 horas.
• Medir o diâmetro do halo de inibição de crescimento existente ao redor de cada
antibiótico utilizando uma régua.

Antibióticos utilizados:

Escherichia coli:
AM (ampicilina), NET (netilmicina), NA (ácido nalidíxico), CXM (cefuroxima), AMX
(amoxicilina), NOR (norfloxacina), SXT (trimetroprim-sulfametoxazole), CPX
(ciprofloaxina), GM (gentamicina), F (nitrofurantoína).

Staphylococcus aureus:

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P (penicilina G), KN (canamicina), GM, E (eritromicina), NET, AMX (amoxacilina +


ác. clavulânico), AMC (augmentin), TRT, F, VN (vancomicina)

Pseudomonas aeruginosa:
TIC (ticarcilina), PIP (piperazina), IMI (imipenem), CAZ (cefatazidima), TBR
(tobramicina), GM, NET, CPX, OFX (ofloxacina)

2) Estudo do efeito de uma solução de desinfectante para bancadas e do hipoclorito


de sódio sobre duas espécies bacterianas
• Colocar 5 ml de desinfectante em dois tubos estéreis
• Adicionar a um dos tubos 500 µl de suspensão de P. aeruginosa
• Adicionar ao segundo tubo 500 µl de suspensão de S. aureus
• Marcar em cada tubo o nome do desinfectante e o nome da espécie bacteriana
utilizada
• Em intervalos de 5 minutos, aos 5, 10,e 15 minutos, transferir 100 µl para placas
de gelose tripticase-soja (gelose simples) e inocular por espalhamento
• Incubar 24h/37ºC.
• Verificar se houve ou não crescimento bacteriano nas placas contendo os
desinfectantes.

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5.3 – Resultados e discussão

5.3.1 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para Escherichia coli e o
resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
AMC
NET
NA
CXM
AMX
NOR
SXT
CPX
F
GM

5.3.2 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para o Staphylococcus aureus
e o resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
VN
F
TRT
AMC
AMX
NET
E
GM
KN
P

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5.3.3 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para a Pseudomonas aeruginosa
e o resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
TIC
IMI
CAZ
TBR
GM
NET
CL
CPX
PIP

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