UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS BIOQUMICA DE ALIMENTOS

RELATRIO DA AULA PRTICA UTILIZAAO DA COLORIMETRIA NA DETERMINACAO DE PROTEINAS

Manaus AM Junho /2013

ANA CAMILA DOS SANTOS SOUSA 21205148 LETCIA COUTINHO 21201255 RAYSSA LAMANIERE 21203555

RELATRIO DA AULA PRTICA UTILIZAAO DA COLORIMETRIA NA DETERMINACAO DE PROTEINAS

Relatrio solicitado pela professora Ila Maria, para obteno de notas parciais para o 3 perodo.

Manaus AM Junho / 2013

SUMRIO 1 INTRODUO __________________________________________________ 4 1.1 Mtodo de biureto ____________________________________________ 4 1.2 Mtodo de Kjeldhal (1880) ______________________________________ 4 1.3 Mtodo turbidimtrico _________________________________________ 4 1.4 Mtodo de Folin Ciocalteau (1969)______________________________ 5 1.5 Mtodo de Lowry (1951) _______________________________________ 5 1.6 Mtodo de Bradford (1976) ____________________________________ 5 2 OBJETIVOS ___________________________________________________ 5 3 RESULTADOS E DISCUSSES _____________________________________ 6 4 CONSIDERAES FINAIS ________________________________________ 8 5 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ___________________________________ 9

1 INTRODUO A colorimetria visa determinar a concentrao de uma substncia, em condies bem definidas, pela medida da absoro de luz, tomando como referncia a absoro da substncia numa concentrao conhecida. A principal vantagem desse mtodo de proporcionar um meio simples para determinar pequenas quantidades de substncias. Entre os mtodos colorimtricos destaca-se a espectrofotometria, um processo analtico sensvel, rpido, e cujos resultados so mais precisos, comumente utilizado na determinao da concentrao de constituintes biolgicos. 1.1 Mtodo do biureto: Peptdeos reagem com o biureto em soluo alcalina e em presena de soluo de sulfato de cobre diluda, formando um composto de cor prpura-violeta. A cor deve-se ligao do tomo de Cu a quatro tomos de N das cadeias peptdicas. Este mtodo simples para a quantificao da protena total, mas requer de 20 a 40 mg de protenas. 1.2 Mtodo de Kjeldhal (1880): Consiste na queima total do material orgnico das amostras pela adio de cidos oxidantes fortes, sob temperaturas relativamente elevadas. Aps completa transformao dos compostos nitrogenados em sais de amnio, a mistura fortemente alcalinizada com NaOH, sendo a amnia recolhida com um volume conhecido de cido brico (NH4H2BO3) e titulada com cido clordrico (HCl). A quantidade calculada de nitrognio encontrada por essa titulao multiplicada por um fator mdio de 6,25 para fornecer a quantidade de protena total presente na amostra. 1.3 Mtodo turbidimtrico: Baseia-se na precipitao de protenas em presena de um cido. o mais rpido, levando em torno de 10-15 minutos. Porm nem todas as protenas precipitam

da mesma forma em presena de cidos e substncias como cidos nuclicos tambm podem precipitar. 1.4 Mtodo de Folin Ciocalteau (1969): Este mtodo uma modificao do mtodo de biureto, onde o cobre em meio alcalino reage com a protena formando um complexo (reao de Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta aminocidos fenlicos que reduz o reagente de Folin-Ciocalteau, dando uma cor azul. A intensidade da cor mxima em pH 10 e medida espectrofotomtricamente a 660 nm, aps 30-120 minutos. Trata-se de um mtodo muito sensvel, podendo analisar amostras de 5 mg de protenas, mas a amostra no pode ter a presena de fenis. 1.5 Mtodo de Lowry (1951): Este mtodo utiliza o soro humano diludo entre 100 a 1000 vezes, como padro. Em baixas concentraes a leitura efetuada a 750 nm. Sua utilizao sugerida como forma de eliminar fontes de erro pela desnaturao superficial que ocorre com o BSA. 1.6 Mtodo de Bradford (1976): O mtodo baseado na ligao da protena ao corante. O corante utilizado o Coomassie Brilliant Blue G-250, onde este reagente existe em duas formas coloridas diferentes, vermelha e azul. A forma vermelha do reagente convertida em azul aps a ligao do corante com a protena, esta colorao ocorre em dois minutos aps o reagente ser adicionado e estvel por at uma hora (Bradford, 1976). 2 OBJETIVOS Determinao da curva padro de uma soluo de albumina bovina, utilizando

o mtodo colorimtrico do Biureto. Determinar o teor de protenas da clara do ovo.

3 RESULTADOS E DISCUSSO
A partir do mtodo do Biureto para a determinao da curva padro, foi utilizada uma soluo de albumina bovina a 6% para o preparo das seguintes solues padres de uso: Concentrao das Solues Padro de Uso (%) 1% 2% 3% 4% 5% 6% Volume das Solues Padro Estoque de Albumina 6% (L) 50 L 100 L 150 L 200 L 250 L 300 L Volume de gua (L) 250 L 200 L 150 L 100 L 50L 0 L

Posteriormente foram adicionados 100 L da soluo padro e 5 ml do reativo de Biureto s solues preparadas para determinar o teor de protena nas mesmas. Aps a homogeneizao e repouso, tais solues foram analisadas em

espectrofotmetro a 550 nm. Foram observadas as seguintes absorbncias:

Concentrao Padro de Albumina 1% 2% 3% 4% 5% 6%

Absorbncia 0,046 0,1 0,154 0,206 0,266 0,309

A partir desses resultados, foi possvel construir um grfico com a curva padro da protena:

Curva Padro da Protena

0.35 0.3 Absorbncia (nm) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% Concentrao da Soluo Padro (%) y = 5.3286x - 0.0063 R = 0.9989

Como observado, quanto maior a concentrao de albumina bovina maior a absorbncia registrada pelo espectrofotmetro. A clara do ovo foi diluda em soluo de NaCl 0,9% na proporo de 1:3, devido a globulina, uma protena encontrada na clara do ovo, no ser solvel em gua e somente em soluo salina. Logo em seguida, o aparelho foi zerado e a anlise da amostra foi realizada, utilizando 5 mL de Reativo de Biureto e 100L da soluo da clara do ovo diluda em soluo salina, e a leitura gerada foi de 0,178 nm. Para a determinao do teor de protenas da amostra (clara do ovo), utilizou-se a equao de regresso obtida atravs da curva-padro de protena: y = 5,46x 0,0094 Onde y a absorbncia e x a concentrao de protena. 0.178 = 5,46x 0,0094 5,46x = 0,178 + 0,0094 5,46x = 0,18748 X = 0,1874 / 5,46 X= 0,03%

8 Com esse resultado baixo de teor protico, segundo Burton foi possvel analisar que a alimentao da ave em questo era pouco enriquecida, ou que a ave no era jovem.

4 CONSIDERAES FINAIS O mtodo do biureto bastante eficiente quando se deseja encontrar a concentrao de uma amostra de protena. Com o auxlio de um espectrofotmetro e a aplicao da lei de Lambert-Beer, observando a absorbncia, e tendo outras solues para ser possvel a produo da curva padro da protena ou possuir o coeficiente de extino molar (tambm chamado de coeficiente de absoro molar) que constante a um dado comprimento de onda. Podemos afirmar, a partir da prtica, que, levando-se em conta o mesmo comprimento de onda e o mesmo comprimento da cubeta, a absorbncia diretamente proporcional a concentrao.

5 REFERENCIAS BILIOGRFICAS MAGALHES JR., J. L.. Correlao e regresso nas calculadoras HP 12C e Casio fx 82 TL/ML. Universidade Salgado de Oliveira. s.d.. Disponvel em: <http://netknow.mat.br/atividades/CorreRegresCalc.pdf> Acesso em: 19 de maro de 2012.