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Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Farmcia

Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas

PREPARAO DE FILTROS SOLARES EM NANOSISTEMA VISANDO MAIOR AO PROTETORA

Vincius Machado Santos

2007

PREPARAO DE FILTROS SOLARES EM NANOSISTEMA VISANDO MAIOR AO PROTETORA

Vincius Machado Santos

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas. Orientadora: Profa. Dra. Sheila Garcia

Rio de Janeiro Maio / 2007

Santos, Vincius Machado. Preparao de filtros solares em nanosistema visando ao prolongada / Vincius Machado Santos. - Rio de Janeiro: UFRJ/ FF, 2007. xxii, 106f.: il.; 31 cm. Orientadora: Sheila Garcia Dissertao (mestrado) UFRJ / FF / Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, 2007. Referncias Bibliogrficas: f. 115-124. 1. Filtros solares. 2. Lipossomas. 3. Benzofenona-3. I. Garcia, Sheila. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Psgraduao em Cincias Farmacuticas. III. Preparao de filtros solares em nanosistema visando ao prolongada.

PREPARAO DE FILTROS SOLARES EM NANOSISTEMA VISANDO MAIOR AO PROTETORA

Vincius Machado Santos Orientadora: Profa. Dra. Sheila Garcia Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

Aprovada por: _______________________________ Presidente, Profa. Dra. Sheila Garcia _______________________________ Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues _______________________________ Prof. Dr. Davi Pereira de Santana _______________________________ Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos

Rio de Janeiro Maio / 2007

Aos meus Pais, Raymundo e Dalva que sempre me mostraram a Educao como o maior presente que poderiam me dar.

AGRADECIMENTOS Antes de tudo quero agradecer a Deus pelo enorme privilgio de poder viver e realizar meus sonhos. E agradecer a So Francisco de Assis por todo apoio e ensinamento. Agradeo aos meus pais por todo carinho, educao e suporte para que eu pudesse chegar a mais esta etapa. Ao meu Tio Elair, minha Tia Zita e minha madrinha Lila que sempre me acompanharam bem de pertinho ajudando e incentivando, sem eles tudo seria muito mais difcil. E a toda minha famlia, tios, tias, primos e primas por toda ajuda e torcida. Mariana por todo companheirismo (at na hora de digitar as referncias!!), carinhos, beijos, ajuda e por todos estes anos que est ao meu lado me incentivando e superando juntos os problemas que surgem. E aos seus pais, seu irmo, seus avs e sua famlia que sempre torcem, incentivam e acompanham. minha orientadora, Sheila, minha CHEFE!!! A quem eu atormento desde de maro de 2002 (e espero atormentar por muito tempo ainda!) que nunca negou ajuda ou uma conversa num dia ruim. Por todo estmulo, amizade e confiana e por sempre me dar a chance de tentar, de arriscar. Renatinha, minha Padauan! Agradeo por seu companheirismo e incentivo e pela sorte que tive no dia em que a chamei para fazer iniciao cientfica. Ao invs de ganhar uma aluna de iniciao, ganhei uma amiga. queles que, como eu, tiveram a sorte de serem alunos da Sheila: Bianca, Emeli, Mariana, Renata Pietsch, Mrcio Robert e Mrcio Miranda. Aos professores Maurcio, Valria e Ndia por toda colaborao e pelo suporte para que tudo no LabCQ esteja funcionando e quando possvel, evoluindo. Tenho que destacar a Eliane que conhece tudo do laboratrio e desde o meu 1o dia no LabCQ estava pronta para me ajudar. Coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Professora Gisela Dellamora, por toda sua dedicao e abnegao para colocar nosso curso em uma linha crescente de qualidade. Aos professores que sempre me acompanharam de perto e incentivaram desde a graduao, Prof. Carla, Prof. Mirian, Prof. Maria Isabel, Prof. Jorge Teixeira, Prof. Marcelo e a todos os professores da Ps-Graduao.

Ao Prof. Carlos Rangel,

gostaria de agradecer primeiro, como Diretor da

Faculdade de Farmcia, pelo suporte a Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas e segundo como professor da minha banca de acompanhamento, contribuindo para que o trabalho se torne mais forte e sustentado. Prof. Elisabete por todo o suporte dado ao meu trabalho no LADEG e pelas amostras doadas e por fazer parte da minha banca de acompanhamento, contribuindo com seu vasto conhecimento na rea para enriquecer este trabalho. Ao Dr. Andr Vergnanini e toda sua equipe da ALLERGISA, pela simpatia e pelo esprito de colaborao, realizando os testes in vivo das amostras, contribuindo de forma decisiva para o sucesso deste trabalho. Ao Vencio Feo da Veiga e ao Instituto de Microbiologia Paulo Ges da UFRJ, por todo apoio para a realizao das observaes por microscopia que puderam comprovar a formao dos lipossomas. Ana Maria Travalloni e ao CENPES-PETROBRS por toda colaborao nas anlises para determinao do tamanho dos lipossomas, fundamental para a avaliao de todo o processo de preparo. Indstria Farmacutica Spectrum Qumica, pela doao das amostras de filtros utilizadas como padres de trabalho. Ao pessoal da minha turma do Mestrado: Brbara, Juliana, Fbio, e em especial pra Las por toda ajuda no Lab, pelas muitas conversas e por conseguir me encontrar na sexta, vspera do carnaval, para avisar que nossas inscries no concurso para o Mestrado tinham sido indeferidas (J pensou?). meus amigos do LabCQ pelos vrios momentos engraados: Adriana, Clara, Fernanda, Guilherme, Joana, Maria, Monique, Raquel, Socorro, Tailane, Viviane e claro, a minha amiga de almoo e sorvete, Yara! Vivian, que junto comigo faz parte da velha guarda do LabCQ, agradeo muito por sua ajuda e sua amizade , Ah! E tambm por ser uma Chefe nota 10! A todos os meus alunos que me incentivam e que so o combustvel para que eu esteja sempre melhorando meus conhecimentos e formas de transmiti-los. Agradeo aos meus amigos e amigas que mesmo longe torcem por mim, meu agradecimento especial aos outros 3 vrtices do quarteto (Antonio, Glauber e Luis), Barbara e ao Paulo Jos (B!!) CNPq pela bolsa de estudos fornecida.

Senhoras e senhores, Filtro Solar! Nunca deixem de usar filtro solar Se eu pudesse dar uma s dica sobre o futuro, seria esta: use filtro solar. Os benefcios a longo prazo do uso de filtro solar esto provados e comprovados pela cincia; j o resto dos meus conselhos no tem outra base confivel alm de minha prpria experincia errante. Mary Schmich

RESUMO PREPARAO DE FILTROS SOLARES EM NANOSISTEMA VISANDO MAIOR AO PROTETORA Vincius Machado Santos Orientadora: Profa. Dra. Sheila Garcia Resumo da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas. A benzofenona-3 (BZ-3) um dos filtros solares mais utilizados nos EUA e no Brasil. Pode causar srios problemas dermatolgicos e algumas pesquisas tm levantado a hiptese de ter atividade hormonal, porm outras pesquisas indicam que tais aes no ocorrem nas concentraes de BZ-3 liberadas para uso. Os lipossomas so vesculas formadas por uma membrana fosfolipdica. O uso de preparaes lipossomais est associado a uma concentrao maior de ativos na pele e a uma absoro sistmica menor que as formulaes convencionais. Esse trabalho tem como objetivos: caracterizar a incluso da BZ-3 em lipossomas e desenvolver uma formulao fotoprotetora utilizando a BZ-3 inclusa em lipossomas com fator de proteo solar (FPS) 20. Dessa forma, foram comparados dois mtodos de preparo dos lipossomas. Para obter vesculas de mesmo tamanho, as suspenses lipossomais foram filtradas sob presso e o material no incluso foi separado. Os lipossomas foram analisados quanto ao teor dos constituintes e anlise estrutural. Para obter uma formulao com FPS 20 foi necessria a presena de mais um filtro solar, o p-metoxicinamato de octila (MCO), que j teve sua incluso em lipossomas descrita. Os geles preparados continham MCO e BZ-3, inclusos ou no em lipossomas e para todos os geles foram determinados o FPS por mtodo in vitro e in vivo. A melhor incluso da BZ-3 foi com o mtodo de hidratao de filme fosfolipdico com 96h de hidratao e 7,0 mM de BZ-3. O gel com a BZ-3 e o MCO, inclusos nos lipossomas, obteve resultados semelhantes a formulao contendo os filtros e os fosfolipdios dispersos e ambas se mostraram superior a formulao contendo apenas os filtros, por no apresentarem degradao dos filtros durante o armazenamento. Palavras-chave: Filtros solares, lipossomas, benzofenona-3

ABSTRACT PREPARATION OF SUNSCREENS ON NANOSYSTEM AIMING AT BETTER PROTECTION ACTION Vincius Machado Santos Orientadora: Profa. Dra. Sheila Garcia Abstract da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-graduao em Qumica Biolgica, Instituto de Cincias Biomdicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Qumica Biolgica. Benzophenone-3 (BZ-3) is one of the most used sunscreens in USA and Brazil. It may cause severe dermatologic damages and some researches indicate that BZ-3 could have a hormonal activity, but others insist that these actions couldnt happen using legal concentrations of BZ-3. Liposomes are vesicles composed by a phospholipids bilayer. The use of lipossomal preparations is associated to higher concentrations of the active substance on epidermis and dermis and a lower systemic absorption compared to conventional formulations. Objectives: characterization of the encapsulation process and liposomes containing BZ-3 and development of a sunscreen formulation containing BZ-3 encapsulated with high sun protection factor (SPF). Two methods were used to prepare the liposomes. The lipossomal suspensions were filtered under pressure to normalize particle size and then, the material not encapsulated was discarded. Liposomes were analyzed to determine the concentration of the components and structural analysis. To obtain a SPF 20 was necessary to use another sunscreen octyl methoxycinnamate (MCO) whose encapsulation process had already described. The best conditions to the encapsulation process of BZ-3 were hydratation of phospholipid method by 96h and 7,0mM BZ-3. The product containing BZ-3 and MCO included on the liposomes and the formulation containing the sunscreens and dispersed phospholipids had similar performances and much better than product containing only the sunscreens, because it wasnt observed any degradation of the sunscreen combination. This protection probably is due to the phospholipids presence. Kew-words: Liposomes, sunscreens, benzophenone-3

LISTA DE FIGURAS Pg. FIGURA 1: Classificao da radiao solar no-ionizante. FIGURA 2: Estrutura da pele. FIGURA 3: Camadas anatmicas da epiderme. FIGURA 4: Funo barreira do estrato crneo. FIGURA 5: Estrutura do cido urocnico. FIGURA 6: Estrutura de ressonncia do cido p-aminobenzico. FIGURA 7: Estrutura geral dos filtros solares orgnicos. FIGURA 8: Estrutura da benzofenona-3 . FIGURA 9: Estruturas de ressonncia das benzofenonas. FIGURA 10: Estrutura do p-metoxicinamato de octila. FIGURA 11: Estrutura tridimensional dos lipossomas . FIGURA 12: Localizao de ativos lipoflicos e hidroflicos nos lipossomas. FIGURA 13: Estrutura da fosfatidilcolina. FIGURA 14: Processo de formao das vesculas lipossomais. FIGURA 15: Estrutura do colesterol. FIGURA 16: Comparao entre formulaes lipossomais e convencionais. FIGURA 17: Formao de lipossomas por hidratao de filme lipdico. FIGURA 18: Formao de lipossomas pelo mtodo de agitao mecnica utilizando um pr-lipossoma. FIGURA 19: Processo de normalizao do tamanho dos lipossomas. FIGURA 20: Passagem dos lipossomas por coluna de gel de Sephadex G-50. FIGURA 21: Mtodo de Bartlett para determinao do teor de fsforo. FIGURA 22: Preparo das amostras para MET. FIGURA 23: Apresenta o espectro no infravermelho da BZ-3. 24 29 29 31 32 33 35 44 45 48 50 50 52 52 53 55 69 70 71 72 74 75 87

FIGURA 24: Apresenta o espectro no infravermelho do MCO. FIGURA 25: Curva de Ringbom para a BZ-3. FIGURA 26: Curva-padro da BZ-3. FIGURA 27: curva-padro do MCO. FIGURA 28: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao sem filtrar. FIGURA 29: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps membrana de 0,2 m. FIGURA 30: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps Sephadex coluna G-50. FIGURA 31: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps Sephadex coluna G-50. FIGURA 32: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna Sephadex G-50. FIGURA 33: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna Sephadex G-50. FIGURA 34: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao sem filtrar. FIGURA 35: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps filtrar em membrana de 0,2 m. FIGURA 36: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna Sephadex G-50. FIGURA 37: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao sem filtrar. FIGURA 38: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao aps filtrar em membrana de 0,2 m. FIGURA 39: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao aps coluna Sephadex G-50.

Pg. 88 90 91 92 98 99 99 100 101 101 103 103 104 105 106 106

LISTA DE QUADROS Pg. QUADRO 1: Percentual aproximado de radiao UV ambiente recebida durante dia de vero. QUADRO 2: Classes de filtros solares qumicos e seus representantes. QUADRO 3: Categorias em que se enquadram os produtos para proteo solar. QUADRO 4: Relao entre o efeito eritematognico e a intensidade da radiao em cada comprimento de onda. 26 35 40 43

LISTA DE EQUAES Pg. EQUAO 1: Fator de Proteo Solar. EQUAO 2: Clculo do FPS segundo Mansur. EQUAO 3: Clculo do intervalo de confiana de 95% para o FPS mdio. 40 42 82

LISTA DE TABELAS Pg. TABELA 1: Classificao dos lipossomas. TABELA 2: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres. TABELA 3: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO inclusos em lipossomas. TABELA 4: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres e fosfolipdios dispersos. TABELA 5: Avaliao do fototipo da pele atravs do histrico. TABELA 6: Determinao da dose mnima eritematognica (DME) na pele. TABELA 7: Valores de Ponto de Fuso da BZ-3. TABELA 8: Valores de ndice de refrao do MCO. 51 77

78

79 81 82 84 85

TABELA 9: Parmetros observados na anlise por ultravioleta dos filtros solares. 86 TABELA 10: Comparao das principais bandas de absoro do espectro infravermelho da BZ-3. TABELA 11: Comparao das principais bandas de absoro do espectro infravermelho do MCO. TABELA 12: Valores utilizados para a construo da curva de Ringbom. TABELA 13: Valores de teor das amostras de BZ-3 e MCO recebidas como matrias-primas para as formulaes. TABELA 14: Valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas preparados com 48 h de hidratao do filme lipdico. TABELA 15: Comparao entre os valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas preparados com 48h e 96h de hidratao. TABELA 16: Comparao entre os valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas obtidos pelo mtodo de hidratao do filme lipdico e pelo mtodo do pr-lipossoma.

87 88 89 93 94 96

97

Pg. TABELA 17: Valores de FPS in vitro das trs formulaes em gel preparadas. TABELA 18: Resultados do Teste t utilizado para comparar o FPS inicial com o FPS aps 3 meses das formulaes. TABELA 19: Valores de FPS in vivo a seco das trs formulaes em gel preparadas. 108 109 110

TABELA 20: Comparao dos valores de FPS in vivo e in vitro das formulaes. 111 TABELA 21: Valores de FPS in vivo das trs formulaes em gel preparadas aps imerso na gua. TABELA 22: Comparao entre o FPS in vivo a seco e aps imerso na gua para avaliao da resistncia gua. 112 112

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS Abs. Anti-UVA Anti-UVB ANVISA BZ-3


o

Absorbncia Ao contra a radiao ultravioleta A Ao contra a radiao ultravioleta B Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Benzofenona-3 Graus celsius Centmetro(s) Centmetro(s) quadrado(s) Conselho Nacional de Sade Comitee de la Liasion des Associations Europeans de LIndustries de la Parfumerie, de Produits Cosmetiques et de Toilette (Comit das Associaes Europias das Indstrias de Perfumaria, Cosmticos e produtos de Toucador)

cm cm2 CNS COLIPA

conc. DEET DL 50 DME DNA EC EE EUA FDA FPS g g/Kg h IC LADEG MCO m M mM

Concentrao N-N-dietil-m-toluamida Dose letal para 50% da populao testada Dose mnima eritematosa cido desoxirribonuclico Estrato crneo Efeito eritematognico Estados Unidos da Amrica Food and Drug Administration (Administrao de Drogas e Alimentos) Fator de Proteo Solar Grama(s) Gramas / quiilograma Hora(s) Intervalo de confiana Laboratrio de Desenvolvimento Galnico p-Metoxicinamato de octila Metro(s) Molar (moles / litro) Milimolar (milimoles / litro)

g/mL L/mg L/mL m M g mg/cm2 mg/L mg/mL mg/Kg mL mm min. n N nm nM OTC p P P.A. PABA PC PF pH PTK q.s.p r r2 t TRIS UV UVA

Microgramas / mililitro Microlitros / miligrama Microlitros / mililitro micrmetro(s) Micromolar (micromoles / litro) Micrograma(s) Miligramas / centmetro quadrado Miligramas / litro Miligramas / mililitro Miligramas / quilograma Mililitro(s) Milmetro(s) Minuto(s) tamanho da amostra Normal Nanmetro(s) Nanomolar (nanomoles / Litro) Over The Counter (denominao para medicamentos de venda livre) nvel de probabilidade Fsforo Pr-Anlise cido p-aminobenzico Fosfatidilcolina Ponto de fuso Potencial de Hidrognio inico Fosfotungstato de potssio Quantidade suficiente para Coeficiente de correlao Coeficiente de determinao valor obtido no teste t de Student Tris[hidroximetil]aminometano Ultravioleta Ultravioleta A

UVB UVC UFRJ VML VUG VUP W WHO % % (v/v) % (p/v)

Ultravioleta B Ultravioleta C Universidade Federal do Rio de Janeiro Vesculas multilamelares Vesculas unilamelares grandes Vesculas unilamelares pequenas Watts World Health Organization (Organizao Mundial da Sade) Percentual Percentual volume / volume Percentual peso / volume Coeficiente de extino molar Comprimento de onda Comprimento de onda em que ocorre a maior absorbncia

mx

SUMRIO

1 INTRODUO ...................................................................................................... 23 2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................ 24 2.1 RADIAO SOLAR ........................................................................................ 24 2.1.1 Efeitos da radiao ultravioleta sobre o ser humano ..................... 27 2.1.1.1 Pele ......................................................................................... 27 2.1.1.2 Olhos ....................................................................................... 27 2.1.1.3 Sistema imunolgico ............................................................... 28 2.2 PELE .............................................................................................................. 28 2.2.1 Estrato crneo ..................................................................................... 30 2.3 SISTEMAS NATURAIS DE PROTEO RADIAO UV .......................... 31 2.4 FILTROS SOLARES ...................................................................................... 32 2.4.1 Histrico .............................................................................................. 32 2.4.2 Classificao ....................................................................................... 34 2.4.3 Mecanismo de ao dos filtros solares ............................................ 36 2.4.4 Efeitos biolgicos da ao dos filtros solares ................................. 36 2.4.5 Eficcia das formulaes protetoras solares .................................. 37 2.4.5.1 Eficcia contra a radiao UVB o fator de proteo solar ..... 39 2.4.5.1.1 Mtodos in vivo de determinao do FPS ................. 40 2.4.5.1.2 Mtodos in vitro de determinao do FPS ................ 40 2.4.5.2 Eficcia contra a radiao UVA ............................................... 43 2.5 BENZOFENONA-3 ......................................................................................... 44 2.6 p-METOXICINAMATO DE OCTILA ................................................................ 47 2.7 LIPOSSOMAS ................................................................................................ 49 2.7.1 Aplicao dos lipossomas em formulaes de uso tpico............. 54

3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 58 3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 58 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .......................................................................... 58 4 MATERIAL E MTODOS...................................................................................... 60 4.1 MATERIAL ...................................................................................................... 60 4.1.1 Equipamentos ..................................................................................... 60 4.1.2 Outros materiais ................................................................................. 61 4.1.3 Reagentes ............................................................................................ 61 4.1.4 Filtros solares Padres de trabalho ............................................... 62 4.1.5 Matrias-primas .................................................................................. 62 4.2 MTODOS ..................................................................................................... 63 4.2.1 Preparo das solues utilizadas na pesquisa ................................. 63 4.2.1.1 Preparo da soluo tampo TRIS pH 6,8 ............................... 63 4.2.1.2 Preparo da soluo reagente de molibdato de amnio .......... 63 4.2.1.3 Preparo da soluo de H s SO 4 10N ......................................... 64 4.2.1.4 Preparo da soluo de H 2 O 2 10% (v/v) ................................... 64 4.2.1.5 Preparo da soluo de cido ascrbico 10% (p/v) .................. 64 4.2.1.6 Preparo da soluo de fosfotungstato de potssio 2% (p/v) ... 64 4.2.2 Anlise dos filtros solares utilizados como padres de trabalho .. 65 4.2.2.1 Determinao do ponto de fuso (PF) da BZ-3 ...................... 65 4.2.2.2 Determinao do ndice de refrao do MCO ......................... 65 4.2.2.3 Anlise do espectro de absoro na regio ultravioleta ......... 65 4.2.2.4 Anlise do espectro de absoro na regio do infravermelho 66 4.2.3 Construo da Curva de Ringbom para a BZ-3 ............................... 66

4.2.4 Construo da curva-padro para a determinao da equao da reta da BZ-3 .................................................................................. 67 4.2.5 Construo da curva-padro para a determinao da equao da reta do MCO ............................................................................................ 67 4.2.6 Preparao dos lipossomas contendo a Benzofenona-3 ............... 67 4.2.7 Preparao dos lipossomas contendo o p-Metoxinamato de octila ............................................................................................... 69 4.2.8 Normalizao dos lipossomas .......................................................... 70 4.2.9 Avaliao percentual de filtro incorporado no lipossoma .............. 71 4.2.10 Determinao da quantidade de filtro solar incorporado nas fraes da suspenso lipossomal ...................................................... 72 4.2.11 Determinao da quantidade de fosfolipdio nas fraes pelo mtodo de Bartlett ................................................................. 73 4.2.12 Visualizao dos lipossomas por microscopia ptica .................. 74 4.2.13 Visualizao dos lipossomas por microscopia eletrnica de transmisso (MET) ....................................................................... 75 4.2.14 Determinao do tamanho dos lipossomas por espalhamento da luz laser .......................................................................... 76 4.2.15 Determinao do teor dos filtros recebidos como matrias-primas ........................................................................................... 76 4.2.16 Formulao do gel contendo os filtros no incorporados em lipossomas ............................................................................................. 76 4.2.17 Desenvolvimento da formulao em gel contendo os filtros solares inclusos nos lipossomas .............................................. 77 4.2.18 Formulao do gel contendo os filtros no incorporados e com os fosfolipdios dispersos ............................................................... 79 4.2.19 Determinao in vitro do FPS das formulaes ............................ 80 4.2.20 Determinao do FPS in vivo das formulaes ............................. 80 4.2.21 Determinao do FPS in vivo aps imerso em gua Resistncia gua ................................................................................ 83

5 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 84 5.1 CARACTERIZAO FSICO-QUMICA DOS PADRES DE TRABALHO (BZ-3 E MCO) ................................................................................................ 84 5.1.1 Determinao do ponto de fuso (PF) da BZ-3 ................................ 84 5.1.2 Determinao do ndice de refrao do MCO .................................. 85 5.1.3 Determinao dos parmetros de absoro na regio ultravioleta .................................................................................................... 85 5.1.4 Espectro da BZ-3 e MCO na regio do infravermelho ..................... 86 5.2 CONSTRUO DA CURVA DE RINGBOM PARA A BZ-3 ............................ 89 5.3 CONSTRUO DA CURVA-PADRO E DETERMINAO DA EQUAO DA RETA PARA A BZ-3 ........................................................... 90 5.4 CONSTRUO DA CURVA PADRO E DETERMINAO DA EQUAO DA RETA PARA O MCO ............................................................ 91 5.5 DETERMINAO DE TEOR DE BZ-3 E MCO (MATRIAS-PRIMAS) .......... 92 5.6 RELAO DOS TEORES DE BZ-3 E DE FOSFOLIPDIOS NOS LIPOSSOMAS COM AS QUANTIDADES INICIAIS ...................................... 93 5.7 RELAO ENTRE O TEMPO DE HIDRATAO E A QUANTIDADE DE BZ-3 ENCAPSULADA ............................................................................. 95 5.8 RELAO ENTRE O MTODO DE PREPARO DOS LIPOSSOMAS E A QUANTIDADE DE BZ-3 ENCAPSULADA .............................................. 97 5.9 VISUALIZAO DOS LIPOSSOMAS POR MICROSCOPIA PTICA ........... 98 5.10 VISUALIZAO DOS LIPOSSOMAS POR MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO ............................................................. 100 5.11 DETERMINAO DO TAMANHO DOS LIPOSSOMAS POR ESPALHAMENTO DA LUZ LASER ............................................................ 102 5.12 AVALIAO DAS FORMULAES PREPARADAS ..................................107 5.13 DETERMINAO DO FPS in vitro DAS FORMULAES ........................ 107 5.14 DETERMINAO DO FPS in vivo DAS FORMULAES ......................... 109 5.15 COMPARAO DO FPS in vitro COM O FPS in vivo A SECO .................. 110

5.16 DETERMINAO DO FPS in vivo APS IMERSO EM GUA ................ 111 6 CONCLUSO ..................................................................................................... 113 7 REFERNCIAS ................................................................................................... 115

1 INTRODUO

Devido constatao dos efeitos danosos causados pela radiao ultravioleta (UV) emitida pelo Sol, a fotoproteo tem se tornado um tpico essencial no dia a dia das pessoas. As formulaes protetoras solares so utilizadas regularmente por milhes de pessoas. Considerando o uso freqente e a longo prazo, tem se dado ateno particular a eficincia e segurana destas molculas (MLLER; WISSING, 2002). Muitos produtos contem filtros como a benzofenona-3 (BZ-3) e seus derivados (KODA et al., 2005). Alguns estudos tm indicado que a BZ-3 aplicada na pele pode ter uma absoro sistmica indesejvel (LEWERENZ et al., 1972; NTP, 1991; OKEREKE et al., 1995; HAYDEN et al., 1997; NEDOROST, 2003; JANJUA et al., 2004; KODA et al., 2005; SUZUKI et al., 2005). Diversos estudos utilizaram os lipossomas como veculos para filtros solares tendo diversos benefcios como o aumento da permanncia do filtro no estrato crneo (WOLF et al., 1995; GARCIA, 1998; TRAN et al., 2002). Os lipossomas so vesculas nas quais um volume aquoso est totalmente envolto por uma membrana fosfolipdica. Um ponto importante a possibilidade dos lipossomas serem compostos naturais conferindo grande similaridade com as membranas celulares, tornando-os um veculo eficaz e seguro (NEW, 1997). Este trabalho prope-se a determinar os parmetros necessrios para a incluso da BZ-3, filtro anti-UVA, em lipossomas. Desenvolver uma formulao fotoprotetora associando lipossomas contendo p-metoxicinamato de octila (MCO), filtro anti-UVB, em uma formulao em gel com objetivo de aumentar a proteo dada pelo filtro, conferindo resistncia gua e evitando uma possvel absoro sistmica indesejvel.

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 RADIAO SOLAR

O Sol emite um amplo espectro de radiao eletromagntica que desviado ou atenuado pelas camadas atmosfricas da Terra (ROY et al., 1998). As radiaes que chegam superfcie so classificadas como no-ionizantes (FIGURA 1) e subdivididas em infravermelho, visvel e ultravioleta (UV) (KIRCHOFF, 1995).

Radiao ionizante

Radiao no-ionizante
Faixa Faixa visvel invisvel invisvel Faixa

Infravermelho

400 (alta energia)

FIGURA 1: Classificao da radiao solar no-ionizante

Ultravioleta

Vermelho

Amarelo

Laranja

Violeta
425

Verde

Azul

490 575 585 Comprimento de onda (nm)

650

800 (baixa energia)

A exposio excessiva aos raios solares pode desencadear diversos processos patolgicos nos seres humanos. Tais efeitos so atribudos radiao UV emitida pelo Sol (GASPARRO, 2000; ARMSTRONG; KRICKER, 2001). Os efeitos danosos dos raios UV ao ser humano incluem queimadura solar, conjuntivite, cncer de pele, envelhecimento precoce, entre outros. Em contraste, o processo de sntese de vitamina K e vitamina D nos seres humanos e o fenmeno vital da fotossntese nos vegetais, so exemplos dos efeitos benficos dos raios solares (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). A radiao UV pode ser subdividida de acordo com o comprimento de onda (), sendo seus efeitos abaixo apresentados: a) UVA: comprimento de onda de 320 a 400 nm. Bronzeamento direto, porm seu acmulo, ao longo dos anos, provoca efeitos crnicos como: alteraes das fibras colgenas e elsticas, favorecendo o envelhecimento precoce (BILLHIMER, 1989), imunossupresso e carcinognese (HAYWOOD, 2006). b) UVB: comprimento de onda de 280 a 320 nm. Eritematosa, sendo uma reao de defesa do organismo que aumenta a formao de melanina bronzeando a pele (RIEGER, 1989), causa inflamao cutnea e possui capacidade carcinognica (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). c) UVC: comprimento de onda de 200 a 280 nm. Germicida, por sua ao esterilizante, prejudicial ao tecido cutneo sendo, porm bloqueada pela camada de oznio (KIRCHOFF, 1995).

A quantidade de radiao UV que atinge a superfcie terrestre alterada pela latitude, altitude, estao do ano, hora do dia (QUADRO 1), nuvens e pela camada

de oznio. A maior irradiao ocorre na linha do equador em elevadas altitudes. Na superfcie a proporo entre UVA e UVB de 20:1. A radiao UVB mais forte entre 10:00 h e 16:00 h. Como a radiao UVA possui maior comprimento de onda, menos afetada pela altitude e condies atmosfricas (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). QUADRO 1: Percentual aproximado de radiao UV ambiente recebida durante um dia claro de vero das latitudes tropicais (20) at temperadas (60) (DIFFEY, 2002). Intervalo do dia Radiao UV (%)
Antes de 8:30 8:30 at 9:30 9:30 at 10:30 10:30 at 11:30 11:30 at 12:30 12:30 at 13:30 13:30 at 14:30 14:30 at 15:30 15:30 at 16:30 16:30 at 17:30 Aps 17:30 6 8 12 15 17 15 12 8 4 2 1

Nos seres humanos, a absoro de ftons por molculas endgenas fotosensibilizantes acarreta reaes subseqentes com o oxignio resultando na formao de diferentes espcies de oxignio reativas incluindo o radical nion superxido (O 2 -), o perxido de hidrognio (H 2 O 2 ), o radical hidroxil (HO) e o oxignio singlete (1O 2 ). Altos nveis dessas espcies reativas no organismo, atravs de um estresse oxidativo elevado nas clulas da pele, resultaro em danos genticos temporrios e permanentes e na ativao de processos citoplasmticos referentes ao crescimento, diferenciao, replicao sem controle e degradao do tecido conectivo (PODDA et al., 1998; MANCEK; PECAR, 2001).

2.1.1 Efeitos da radiao ultravioleta sobre o ser humano

2.1.1.1 Pele

Os efeitos agudos na pele ocorrem principalmente devido radiao UVB e incluem o eritema, edemas e o escurecimento dos pigmentos seguidos de bronzeamento (mais relacionado radiao UVA) e espessamento da epiderme e da derme (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). A exposio excessiva radiao UV resulta em inmeras alteraes crnicas na pele. Essas alteraes incluem vrios tipos de cncer de pele entre eles o melanoma, tido como o mais agressivo. O Programa das Naes Unidas para o meio ambiente (UNEP) estima que mais de 2 milhes de casos de cncer de pele no-melanoma e 200 mil casos melanomas malignos ocorrem no mundo a cada ano. Um decrscimo de 10% da camada de oznio estratosfrica levaria a mais 300 mil casos de cncer no-melanoma e 4,5 mil de melanomas por ano. A ocorrncia mundial de melanomas malignos est fortemente relacionada exposio ao sol durante o lazer e ao histrico de queimaduras solares. Existem ainda algumas evidncias de que o risco de desenvolvimento de melanoma est relacionado tambm a exposio intermitente aos raios UV especialmente durante a infncia (WHO, 2002).

2.1.1.2 Olhos

A exposio dos olhos a radicao UV depende de vrios fatores: reflexo do solo, a claridade do cu e o uso de culos. Os efeitos agudos dos raios UV incluem

o desenvolvimento de fotoceratite e fotoconjuntivite. Embora dolorosos, eles so reversveis, facilmente prevenidos pelo uso de culos escuros. Os efeitos crnicos incluem o desenvolvimento de ptergio, cncer das clulas da conjuntiva e catarata (WHO, 2002).

2.1.1.3 Sistema imunolgico

A maioria dos efeitos imunossupressores causados pela radiao UV foi associada radiao UVB. Estudos recentes indicaram que a radiao UVA muito mais imunossupressora que a UVB (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). A radiao UV parece alterar a resposta imunolgica atravs da modificao da atividade e da distribuio das clulas responsveis por organizar tais respostas (WHO, 2002).

2.2 PELE

A pele (FIGURA 2) essencialmente composta de duas camadas principais: a epiderme, camada externa e no vascularizada, e a derme, camada interna muito vascularizada, com terminaes nervosas, glndulas sudorparas e sebceas e folculos capilares, tendo a estrutura mantida por tecido conectivo (ODLAND, 1983).

FIGURA 2: Estrutura da pele (BEAR et al., 2002).

A epiderme pode ainda ser dividida em diversas camadas anatmicas (FIGURA 3) que representam diferentes estgios da diferenciao das clulas (SUHONEN et al, 1999).

FIGURA 3: Camadas anatmicas da epiderme (LPORI, 2002).

2.2.1 Estrato crneo

A camada mais superficial da epiderme o estgio final da diferenciao celular, denominada de estrato crneo (EC). uma camada formada por clulas mortas conectadas por uma matriz lipdica. Na avaliao do peso seco do EC, 75% a 80% composto de protenas, sendo a -queratina a mais abundante e tendo uma poro menor de -queratina (SUHONEN et al., 1999). A funo de barreira da pele atribuda ao EC. Este possui uma permeabilidade a gua aproximadamente 1000 vezes menor que a maioria das outras membranas biolgicas o que atribudo composio lipdica nica do EC e ao arranjo estrutural da matriz lipdica intercelular (POTTS; FRANCOCEUR, 1991; SQUIER et al., 1991). A composio lipdica do EC formada por 41% de fosfolipdios, 27% de colesterol, 10% de steres de colesterol, 9% de cidos graxos e 2% de sulfatos de colesterol (WERTZ; DOWNING, 1989). O grande contedo de fosfolipdios com cadeias alifticas saturadas longas e sem ramificaes ideal para a organizao de membranas impermeveis e resistentes variao de temperatura, exposio radiao UV e oxidao pelo ar (SCHURER; ELIAS, 1991). Os lipdios extracelulares do EC so organizados em estruturas lamelares formando fases lipdicas contnuas que ocupam aproximadamente 20% do volume total do EC (ELIAS et al., 1977; ELIAS; LEVENTHAL, 1979). A estrutura lamelar tambm mantida pela presena de compostos anfipticos no EC como os sulfatos de colesterol (WILLIAMS; ELIAS, 1987).

2.3 SISTEMAS NATURAIS DE PROTEO RADIAO UV

A evoluo dos seres humanos permitiu que pudssemos contar com sistemas prprios de proteo contra os raios UV. A barreira formada pelo EC (FIGURA 4) tambm impede a penetrao da radiao e de 5 a 10% da luz refletida. As reas em que o EC mais fino so muito mais susceptveis e se lesionam mais facilmente (LPORI, 2002).

FIGURA 4: Funo barreira do estrato crneo. A estrato crneo, B Transformao: mitose induzida por radiao UV (LPORI, 2002). A secreo sudorpara possui um componente capaz de absorver a radiao UV, o cido urocnico (cido 4-imidazoilacrlico) (FIGURA 5) que tem mxima absoro em 277 nm (BARTH, 2000). Com a absoro de ftons, o cido transurocnico isomerizado a cis-urocnico, que est envolvido com os efeitos imunossupressor e carcinognico (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005).

H N N O
FIGURA 5: Estrutura do cido urocnico.

OH

A melanina (eumelanina) o pigmento natural presente nos seres humanos. capaz de absorver em uma ampla faixa de comprimento de onda, desde o ultravioleta at o infravermelho prximo. Ela capaz de neutralizar radicais livres presentes nas clulas, sendo finalmente desprendida com o EC. Nas clulas, a melanina tende a cobrir o ncleo para proteger o DNA celular do dano que possa ser causado pela radiao UV (LPORI, 2002).

2.4 FILTROS SOLARES

2.4.1 Histrico

Em 1891, Hammer publicou uma reviso em que ele descreve a influncia da luz sobre a pele. Ele reuniu diversas evidncias de que a queimadura solar era devida radiao UV e foi o primeiro a recomendar o uso de filtros solares qumicos: Materiais que impedem a radiao UV de atingir a pele protegendo-a contra os eritemas solares (URBACH, 2001). O primeiro uso popular de filtros solares no mundo ocorreu em 1928, nos Estados Unidos, com o uso comercial de uma emulso contendo dois compostos

capazes de absorver a energia da radiao UV, o salicilato de benzila e o cinamato de benzila (SHAATH, 1997). O protetor solar mais famoso do incio do sculo XX foi o Ambre Solaire lanado em 1935 por Eugene Schueller, contendo o salicilato de benzila como filtro UV em um veculo oleoso. A partir da Schueller fundou a companhia atualmente conhecida como LOreal (URBACH, 2001). O cido p-aminobenzico (PABA) (FIGURA 6) foi o primeiro filtro a ser patenteado, em 1943, abrindo caminho para utilizao de diversos derivados do PABA. Durante a 2 Guerra Mundial o exrcito norte-americano desenvolveu algumas formulaes com protetores solar para utilizao em suas tropas, o que trouxe bastante desenvolvimento para a rea de fotoproteo (SHAATH, 1997).

H .. N H

C O OH

H + N H

C O OH

FIGURA 6: Estrutura de ressonncia do cido p-aminobenzico (SHAATH, 1997).

Em 1958, Knox e colaboradores introduziram o uso da benzofenona (cido 3benzil-4-hidroxi-6-methoxi-benzenosulfnico) que absorve fortemente na regio UVA (KNOX et al., 1958). Com o aumento das evidncias de que a radiao UVA pode causar danos crnicos pele, as pesquisas de novos compostos capazes de absorver na regio UVA foram muito aceleradas (URBACH, 2001). Atualmente, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), a Administrao de Drogas e Alimentos Food and Druq Administration (FDA) e o Comit das Associaes Europias das Indstrias de Perfumaria, Cosmticos e

produtos de Toucador Comitte de la Liaison des Associations Europeans de LIndustries de la Parfumerie, de Produits Cosmetiques et de Toilette (COLIPA) possuem listagens das substncias qumicas orgnicas e inorgnicas que podem ser utilizadas como filtros solares (URBACH, 2001; KULLAVANIJAYA; LIM 2005; ANVISA, 2006).

2.4.2 Classificao

Os primeiros filtros solares a serem utilizados protegiam a pele da radiao UVB, capaz de causar os eritemas. Com os avanos na rea da bioqumica e fotobiologia observou-se a necessidade da utilizao de compostos capazes de absorver na regio do UVA. As formulaes utilizadas atualmente contm combinaes de filtros para aumentar o espectro de absoro (ROSEN, 2003). Alm da diviso pela faixa de absoro, os filtros solares tambm so classificados em dois grandes grupos: filtros qumicos e filtros fsicos. Os filtros qumicos atuam absorvendo a radiao UV e emitindo-a geralmente na regio do infravermelho dando a sensao de calor. Os filtros fsicos so compostos inorgnicos capazes de refletir ou absorver a radiao UV. Atualmente na categoria de filtros fsicos existem dois representantes: o dixido de titnio e o xido de zinco, ambos sendo fabricados em partculas microfinas para que possam ser utilizados com boa aceitao dos consumidores (SHAATH, 1997; ROSEN, 2003). A classe dos filtros qumicos formada por inmeros compostos reunidos em famlias de acordo com suas naturezas qumicas. O QUADRO 2 apresenta as famlias com seus representantes mais comuns e regies de absoro

correspondentes.

QUADRO 2: Classes de filtros solares qumicos e seus representantes (Adaptado de ROSEN, 2003). Derivados do PABA Octil dimetil PABA (UVB) Cinamatos p-Metoxicinamato de octila (UVB) Octocrileno (UVA/UVB) Salicilatos Salicilato de octila (UVB) Antranilatos Antranilato de Metila (UVA) Benzofenonas Benzofenona-3 (UVA/UVB) Dibenzoilmetanos Avobenzona (UVA) Derivados da Benzilideno cnfora cido tereftalideno dicnfora sulfnico (UVA) Trisiloxano de drometrizol (UVA/UVB) Outros Metileno-bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol (Tinosorb M) (UVA/UVB) Bis-etilhexiloxifenol metoxifenil (Anizotriazina) (UVA/UVB)

A maioria dos filtros solares orgnicos formada por compostos aromticos dissubstitudos que apresentam um grupamento carbonila, cetona ou ster, e um substituinte com par de eltrons livres (amina ou metoxila) doadores de eltrons (FIGURA 7), usualmente em posio orto ou para ao grupamento carbonila (SHAATH, 1997).

FIGURA 7: Estrutura geral dos filtros solares orgnicos (Adaptado de SHAATH, 1987).

2.4.3 Mecanismo de ao dos filtros solares Clculos de mecnica quntica demonstraram que a energia contida nas radiaes UVA e UVB so da mesma magnitude da energia de ressonncia para deslocalizao de eltrons. Portanto, a energia absorvida da radiao UV corresponde energia necessria a excitao fotoqumica. Ou seja, a radiao UV absorvida corresponde energia necessria para transio eletrnica (passagem dos eltrons do orbital molecular do estado fundamental para o orbital molecular no estado excitado *). A seguir, a molcula excitada retorna ao seu estado fundamental atravs da emisso de radiao com comprimento de onda maior e energia mais baixa que a absorvida (RIEGER, 1997). A radiao de comprimento de onda maior pode ser emitida de vrias maneiras. Se a perda de energia for grande o suficiente para o seu comprimento de onda recair na regio do infravermelho, ela ser percebida como uma radiao calorfica na pele, imperceptvel diante do calor recebido pela exposio ao sol. Se a energia emitida recair na regio do visvel, ela poder ser percebida atravs do efeito fluorescente ou fosforescente. Em alguns casos, a radiao emitida pode ser to energtica, que provocar reaes fotoqumicas na molcula do filtro solar, levando a isomerizaes ou degradaes (BARTH, 2000).

2.4.4 Efeitos biolgicos da ao dos filtros solares

Em estudos utilizando camundongos sem plo, o uso de filtros solares reduziu significativamente a incidncia de casos de cncer induzidos pela radiao UV e preveniu eritemas, edemas e alteraes crnicas da pele (KLIGMAN et al., 1982; PLASTOW et al., 1988). A formao de dmeros de pirimidina-ciclobutano no DNA

de clulas da pele diminui, assim como, o nmero de mutaes p53 em camundongos tratados com filtros solares antes da exposio radiao UV (WOLF et al., 1993; ANANTHASWAMY et al., 1997). Pesquisa em humanos indicou que o uso de filtros solares levou a uma diminuio de casos de queratoses actnicas (NAYLOR et al., 1995). Um estudo controlado randomizado com humanos indicou uma reduo de 46% de carcinomas de clulas escamosas em pessoas que utilizaram filtros solares por 4 anos e 6 meses (GREEN et al., 1999). Outro estudo controlado randomizado demonstrou que o uso de formulaes protetoras solares com amplo espectro de absoro diminuiu o nmero de casos de nevus em crianas brancas (GALLAGHER et al., 2000). O uso de filtros solares tambm diminuiu o nmero de casos de reativao de herpes labial ativada pelo Sol (ROONEY et al., 1991). A possvel ao dos filtros solares na preveno da supresso imunolgica induzida pela radiao UV ainda no est esclarecida (ROSEN, 2003).

2.4.5 Eficcia das formulaes protetoras solares

As formulaes com filtros solares geralmente so aplicadas superficialmente em grandes reas da pele. A eficcia ir depender da adeso dos filtros solares na pele formando um filme protetor. Os filtros solares so desenvolvidos para permanecerem nas camadas mais externas da pele tendo uma grande afinidade pelo EC. Uma formulao fotoprotetora ideal deve permitir grande acmulo dos filtros solares na pele com uma permeao mnima para a corrente sangnea (JIMNEZ et al., 2004).

Um dos fatores mais importantes para uma boa ao dos protetores solares a quantidade aplicada na pele. Atualmente, a maioria das pessoas aplica uma quantidade menor que a utilizada nos testes (2,0 mg/cm2) (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). A tcnica de aplicao das formulaes ir afetar na uniformidade da camada protetora, dessa forma algumas reas sero menos protegidas que outras levando a uma perda de eficcia (LOTT, 2003). A composio das formulaes tambm um fator muito importante. Se o produto considerado cosmeticamente inaceitvel pelos consumidores, ele ficar na embalagem. A polaridade e pH podero interferir na capacidade de absoro dos filtros (ROSEN, 2003). Alm disso, pode-se prever, atravs de estudos de estabilidade, quais interaes podem ocorrer entre os componentes ativos e os demais constituintes de forma a garantir a eficcia e segurana do produto. As formulaes fotoprotetoras devem ser desenvolvidas para serem resistentes permanecendo na pele sob condies desfavorveis. Atualmente, a maioria das formulaes comerciais so resistentes gua enquanto algumas j anunciam resistncia a areia (DIFFEY, 2002). A ANVISA no descreve um mtodo para determinao de Resistncia gua ou Muito resistente gua mas indica o mtodo que deve ser seguido: Federal Register - Norma FDA - Department of Health and Human Services- Wednesday May 12, 1993 - Sunscreen Drug Products for Over the Counter Human Use; Final Monograph; Final Rule - Subparte D Testing Procedure , seo 352.76 (ANVISA, 2002). A reaplicao da formulao ir contribuir para a eficincia da proteo. As razes para a reaplicao so: compensar a aplicao inicial geralmente inferior ao ideal, mantendo uma proteo mais regular durante a exposio ao Sol e aumentar

a quantidade de filtros solares que podem ser removidos pela gua, suor, toalhas, roupas, frico ou areia (DIFFEY, 2002). Um modelo matemtico sugere que a reaplicao a cada 20 minutos durante um perodo de 6 horas de exposio ao sol, resulta em uma exposio menor radiao que uma reaplicao a cada 2 ou 4 horas (ROSEN, 2003). Um filtro solar ideal deve ter estabilidade fotoqumica. Quanto mais lbil for um filtro, mais rapidamente ele degradado pela radiao UV. A fotoestabilidade de uma formulao ir depender dos filtros solares que a compem e dos excipientes. Todos os filtros solares so fotolbeis, uns mais que outros. Como exemplo, o pmetoxicinamato de octila (MCO) e a avobenzona so muito lbeis enquanto filtros como, o octocrileno e os salicilatos so utilizados para aumentar a fotoestabilidade da formulao final (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). Outra razo para desenvolver filtros solares fotoestveis que os produtos de degradao dos filtros entram em contato direto com a pele e podem se tornar foto-oxidantes, ou promover

fototoxicidade ou dermatite de contato fotoalrgica. A interao de produtos de fotodegradao com os demais excipientes ou com componentes da pele pode levar a formao de novas molculas com propriedades toxicolgicas desconhecidas (GASPAR; MAIA CAMPOS, 2006).

2.4.5.1 Eficcia contra a radiao UVB o fator de proteo solar (FPS)

O fator de proteo solar uma medida da capacidade de um filtro solar de proteger contra o eritema que causado principalmente pela radiao UVB, sendo ento uma medida de eficcia do filtro contra a radiao UVB. Diversas agncias reguladoras esto envolvidas na normatizao sobre filtros solares, como a FDA e o

COLIPA. Nos Estados Unidos (EUA), a FDA publicou, em 1999, sua ltima monografia sobre os filtros solares. Nela, os filtros solares so enquadrados na categoria de drogas OTC (over the counter, denominao para medicamentos de venda livre) (ROSEN, 2003). No Brasil, a ANVISA considera os filtros solares como cosmticos e enquadra os produtos para proteo solar nas categorias apresentadas (QUADRO 3). QUADRO 3: Categorias em que se enquadram os produtos para proteo solar (ANVISA, 2002). Fotipos de Pele
Pouco Sensvel Sensvel Muito Sensvel Extremamente Sensvel

Comportamento da Pele Radiao Solar


Raramente Apresenta Eritema Ocasionalmente Apresenta Eritema Freqentemente Apresenta Eritema Sempre Apresenta Eritema

Proteo Recomendada
Baixa Moderada Alta Muito Alta

FPS Recomendado
>2<6 > 6 < 12 > 12 < 20 > 20

A ANVISA define fator de proteo solar como sendo a razo entre a dose mnima eritematosa (DME) na pele protegida, dividida pela dose mnima eritematosa na pele no protegida (EQUAO 1). A DME definida como a dose mnima de radiao ultravioleta requerida para produzir a primeira reao eritematosa perceptvel com bordas claramente definidas, observadas entre 16 e 24 horas (h) aps a exposio radiao ultravioleta (ANVISA, 2002). FPS = DME (pele protegida) DME (pele no protegida) EQUAO 1: Fator de Proteo Solar (ANVISA, 2002). A ANVISA no descreve um mtodo para determinao do FPS, mas indica que dever ser realizada pela aplicao estrita de uma das seguintes normas de testes in vivo: (a) Federal Register - Norma FDA- Department of Health and Human Services - Wednesday May 12, 1993 - Sunscreen Drug Product for Over the Counter

Human Use; Final Monograph; Final Rule; Subparte D Testing Procedure, seo 352.70 a 352.73, (b) Norma Colipa- Colipa Sun Protection Factor Test Method- The European Cosmetic Toiletry and Perfumary Association ref. 94/289 October 1994 (ANVISA, 2002).

2.4.5.1.1 Mtodos in vivo de determinao do FPS

Em linhas gerais, os mtodos de determinao de FPS in vivo utilizam 20 indivduos sadios, homens e mulheres com sensibilidade mediana a radiao UV. demarcada uma rea nas costas do voluntrio (0,3 m x 0,3 m) aplica-se a amostra formando um filme de 2,0 mg/cm2 e mantm-se uma regio desprotegida que separada por uma fita de 1,0 cm de largura. A irradiao realizada com uma lmpada UV de 300 W, 20 minutos aps a aplicao do produto. Mede-se o tempo de formao de eritema e atravs dos clculos determina-se o FPS (JANOUSEK, 1997). O padro utilizado pela FDA uma formulao contendo 8,0% de homosalato que resulta em um FPS de 4,47 (RIBEIRO, 2004).

2.4.5.1.2 Mtodos in vitro de determinao do FPS

Como alternativa aos mtodos in vivo, existem mtodos in vitro que foram desenvolvidos com o objetivo de acelerar o resultado e diminuir o custo dos testes in vivo. Atualmente, estes mtodos podem ser utilizados para avaliar o FPS durante o desenvolvimento de novas formulaes e para o controle de qualidade de rotina, lote a lote (RIBEIRO et al., 2004).

Os principais empregam solues diludas dos produtos testados que so levadas para leitura por espectrofotometria no UV. Os mtodos podem explorar a absorbncia (MANSUR et al., 1986) ou a reflectncia (DIFFEY, 1997) dos filtros solares. O mtodo descrito por Mansur (MANSUR et al., 1986) o mais difundido. um mtodo simples no qual preparada uma soluo com solvente apropriado para a formulao e filtro solar a ser avaliado, com concentrao conhecida, para que possa ser avaliada por espectrofotometria no ultravioleta. Mede-se a absorbncia (Abs.) em comprimentos de onda definidos e atravs da frmula matemtica desenvolvida (EQUAO 2) e de valores para correo (TABELA 3), possvel relacionar os valores de absorbncia obtidos com o FPS da amostra (SANTOS et al., 1999).

FPS = FC . 320 . EE . I . Abs

290

(conc. = 0,2L/mL ou 0,2mg/mL)

EQUAO 2: Clculo do FPS segundo Mansur (MANSUR et al., 1986). Onde, FC = fator de correo (igual a 10). EE = efeito eritematognico da radiao de comprimento de onda definido pelo QUADRO 4. I = intensidade da luz solar no comprimento de onda definido pelo QUADRO 4. Abs = absorbncia da soluo no comprimento de onda definido pelo QUADRO 4.

QUADRO 4: Relao entre o efeito eritematognico e a intensidade da radiao em cada comprimento de onda (MANSUR et al., 1986). (nm) 290 295 300 305 310 315 320 EE () x I () 0,0150 0,0817 0,2874 0,3278 0,1864 0,0839 0,0180 1,0000

2.4.5.2 Eficcia contra a radiao UVA

Atualmente, no existem mtodos padronizados aceitos para a medida da proteo UVA. A ANVISA apenas indica que a quantificao da proteo UVA dever ser realizada atravs de mtodos reconhecidos devidamente validados (ANVISA, 2002). Uma vez que a radiao UVA 1000 vezes menos eritematosa que a UVB, usar o eritema como marcador nos testes, torna-se invivel pelo tempo muito longo em que os voluntrios deveriam permanecer imveis. Os mtodos in vivo mais comuns so os baseados em: pigmentao imediata, pigmentao persistente e fator de proteo no UVA. Este ltimo no mais utilizado, pois necessria a aplicao tpica de psoralen seguida pela exposio UVA, possuindo um potencial carcinognico. Entre os mtodos in vivo, o de pigmentao persistente o mais empregado porque a pigmentao permanece estvel entre 2 e 24 horas e sensvel a todos os filtros UVA permitidos. A proteo UVA pode ser medida por espectrofotometria onde determinado o comprimento de onda principal que definido como sendo o comprimento de onda, entre 290nm e 400nm, em que ocorre pelo menos 90% da absoro do filtro. Os consumidores devem ser orientados a

procurar nos rtulos dos produtos comerciais as expresses: amplo espectro de proteo e/ou proteo UVA e UVB, e verificar a presena de filtros anti-UVA na lista de composio (KULLAVANAJAYA; LIM, 2005; ROSEN, 2003).

2.5 BENZOFENONA-3

As benzofenonas comearam a ser utilizadas como filtros solares no final da dcada de 50. A benzofenona-3 (BZ-3) (2-hidroxi-4-metoxibenzofenona) ou oxibenzona, um composto lipoflico, o mais utilizado dessa categoria nos Estados Unidos (NEDOROST, 2003). A BZ-3 (FIGURA 8) um congnere monometoxilado da 2-hidroxibenzofenona que encontrada em pigmentos de plantas. Ela pode ser sintetizada pela reao entre o 2-hidroxianisol e cloreto de benzola (STECHER, 1958).

FIGURA 8: Estrutura da benzofenona-3 (SHAATH, 1997). As hidroxibenzofenonas e seus derivados tm a habilidade de absorver e dissipar a radiao UVA, porm absorvendo em menor intensidade, na regio UVB (SUZUKI et al., 2004). As benzofenonas so a nica classe de filtros solares formada por cetonas aromticas. A deslocalizao por ressonncia acrescida pela presena de um grupamento doador de eltrons nas posies orto e/ou para. O grupamento carbonila participa deste processo, sendo o grupamento receptor de

eltrons (SHAATH, 1997). A BZ-3 possui dois picos de absoro com mximos em 288 nm e 325nm, fotolbil e pode ser oxidada rapidamente (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). Quando comparadas a outros filtros, as benzofenonas fazem ressonncia mais facilmente requerendo menor energia quntica para a transio eletrnica (FIGURA 9). E como a energia inversamente proporcional ao comprimento de onda (E = hc/), os compostos desta classe absorvero a energia com valores correspondentes de comprimento de onda acima de 320 nm (SKOOG; LEARY, 1992; SHAATH, 1997).
O H O C O H O C

R .. R + O O .. FIGURA 9: Estruturas de ressonncia das benzofenonas (SHAATH, 1997).

A FDA aprova o uso da BZ-3 como filtro solar e nas funes de aditivo alimentar indireto (componente das embalagens) e fotoestabilizante em filmes usados na agricultura e em tintas (OKEREKE et al, 1995). A ANVISA aprova o uso da BZ-3 como filtro solar em produtos para higiene pessoal, cosmticos e perfumes na concentrao mxima de 10% e ressalta que para concentraes maiores que 0,5% deve-se incluir a seguinte advertncia na rotulagem: contm oxibenzona (ANVISA, 2006). Estudo de farmacocintica da BZ-3 aps administrao drmica em ratos apontou um modelo de eliminao bicompartimental. A eliminao ocorre atravs de um padro bifsico e , com meias-vidas de 1,3 h e 15,1 h, respectivamente. A absoro drmica foi muito rpida com meia-vida de 0,87 h (OKEREKE et al., 1994).

Alm disso, a BZ-3 no possui potencial txico agudo (DL 50 > 12,8g/Kg em ratos) (LEWERENZ et al., 1972). A metabolizao da BZ-3 produz compostos, atravs de reaes catalisadas pelo sistema enzimtico do citocromo P-450, que tambm so utilizados como filtros solares. A BZ-3 produz trs metablitos: 2,4-dihidroxibenzofenona, 2,3,4-

trihidroxibenzofenona e 2,2-dihidroxi-4-metoxibenzofenona (OKEREKE et al., 1993). Embora seja um filtro amplamente utilizado, a BZ-3 pode causar reaes adversas. A BZ-3 pode causar eritemas faciais em pessoas alrgicas a este composto (NEDOROST, 2003), podendo causar tambm urticria logo aps aplicao e uma dermatite tardia (COLLINS; FERGUSON, 1994). Alm dos problemas dermatolgicos associados BZ-3, algumas pesquisas tm levantado a possibilidade de aes adversas sistmicas da BZ-3. Hayden e colaboradores quantificaram a absoro sistmica da BZ-3 em voluntrios humanos. Aps 12 horas de ensaio, 1% a 2%, da quantidade de BZ-3 aplicada na pele, foi detectado na urina. Nesta pesquisa foram utilizadas quantidades de filtro seis vezes maiores que as utilizadas para determinao do fator de proteo solar (HAYDEN et al., 1997). Em um estudo de segurana da BZ-3, aps administrao drmica em ratos, a BZ-3 formulada em uma base oleosa foi aplicada na dose de 100 mg/Kg de peso corpreo, duas vezes ao dia, por quatro semanas. Baseando-se nos seus resultados bioqumicos, hematolgicos e patolgicos sugeriu que a BZ-3 no txica nas condies da pesquisa (OKEREKE et al., 1995). Um estudo de mutagenicidade em bactrias teve resultado positivo para a 2,2-dihidroxi-4-metoxibenzofenona, metablito da BZ-3 (MORTELMANS et al., 1986). A BZ-3 obteve resultado positivo como uterotrfico em ensaio utilizando ratas

jovens (NAKAGAWA; TAYAMA, 2001). Ma e colaboradores indicou que a BZ-3 um antagonista fraco para o receptor de hormnios andrognicos no ensaio com clulas MDA-kb2 (MA et al., 2003). Outro estudo sobre a atividade estrognica de derivados da BZ-3 utilizou o ensaio para uterotrficos com ratas ovrioctomizadas. Como resultado, a 2,4dihidroxibenzofenona (metablito da BZ-3) foi indicada como composto estrognico fraco (KODA et al., 2005). Suzuki e colaboradores avaliaram as atividades estrognicas e

antiandrognicas de 17 derivados da benzofenona. Neste estudo, as benzofenonas hidroxiladas, como a BZ-3, mostraram atividade estrognica em clulas MCF-7 de cncer de mama humanas. Alguns derivados tambm mostraram efeitos inibitrios significantes na atividade andrognica da dihidrotestosterona em clulas NIH3T3 de fibroblastos de ratos. Como concluso, indicaram que o grupamento hidroxil na posio quatro do anel fenlico dos derivados, essencial para atividades hormonais elevadas (SUZUKI et al., 2005). A atividade estrognica da BZ-3, utilizando clulas MCF-7, foi confirmada por Schlumpf e colaboradores (SCHLUMPF et al., 2004).

2.6 p-METOXICINAMATO DE OCTILA

O p-metoxicinamato de octila (MCO) (octinoxato, p-metoxicinamato de etilhexila) (FIGURA 10) capaz de absorver a radiao na regio UVB, pertence classe dos cinamatos, sendo esta uma das classes mais utilizadas na proteo da poro UVB do espectro eletromagntico (SHAATH, 1997). atualmente o filtro anti-UVB mais utilizado nos Estados Unidos (KULLAVANIJAYA; LIM, 2005). A

concentrao mxima de uso do MCO 10% na Europa e 7,5% nos EUA (HUONG, 2006). A ANVISA aprova o uso do MCO como filtro solar em produtos para higiene pessoal, cosmticos e perfumes na concentrao mxima de 10% (ANVISA, 2006).

FIGURA 10: Estrutura do p-metoxicinamato de octila (SHAATH, 1997).

Na estrutura molecular dos cinamatos h uma insaturao extra conjugada com o anel aromtico e o grupamento carbonila que permite a maior distribuio eletrnica. A energia capaz de gerar essa transio eletrnica corresponde ao comprimento de onda nas proximidades de 305nm. A presena do grupamento 2etilhexil no carbono 8 do MCO diminui drasticamente sua solubilidade em gua aumentando a resistncia das formulaes fotoprotetoras que o contem (SHAATH, 1997). Estudos com modelos animais mostraram que o MCO no txico por administrao oral (DL 50 > 5g/Kg em ratos), no irrita a pele e mucosas, no causa sensibilizao e no mutagnico pelo teste de Ames (SCHNEIDER et al., 2005). O primeiro problema relacionado ao uso do MCO sua capacidade de sofrer fotoisomerizao, quando o ismero E (utilizado como filtro solar) irradiado sofre degradao por dimerizao da estrutura molecular do cinamato, levando a perda de ao. Como esse fenmeno ocorre rapidamente, pode-se sugerir que ocorra na superfcie da pele o que diminuiria a proteo dada pelo MCO. A extenso dessa perda ir depender dos outros constituintes da formulao e do ambiente em que o MCO ser posto. A taxa mnima de isomerizao, se for de 20%, ir acarretar numa

diminuio de aproximadamente 10% do FPS. Para uma taxa de isomerizao de 60% a queda no FPS pode variar entre 29% e 38% (HUONG, 2006). Em relao a aes hormonais, o MCO apresentou atividade antiandrognica nas concentraes de 1,0 nM at 10,0 M, quando testados em receptores de clulas MDA-kb2 de carcinoma de mama humana (MA et al., 2003). Outro estudo demonstrou o aumento da produo de vitelogenina, um marcador clssico de atividade estrognica, em peixes Medaka machos (INUI et al., 2003). O MCO foi capaz de estimular a proliferao in vitro de clulas MCF-7 (clulas sensveis a estrognio) e apresentou atividade estrognica no teste uterotrfico com ratas LongEvans jovens (SCHLUMPF et al., 2004). Quando este mesmo teste foi realizado com ratas Wistar jovens, o MCO teve resultado negativo com doses semelhantes aquelas j utilizadas. Alm disso, no foi observada ligao in vitro do MCO a receptores estrognicos de teros de porcos ou a protenas recombinantes RE e RE. No houve indicao de atividade antiandrognica no teste de Hershberger usando ratos castrados e no houve evidncias da influncia do MCO, administrado por via oral, na reproduo de ratos Wistar (SCHNEIDER et al., 2005).

2.7 LIPOSSOMAS

Os lipossomas (FIGURA 11) tm sido investigados como um sistema de liberao de substncias em locais especficos do corpo desde os anos 60 (ZHU et al., 2005). So vesculas nas quais um volume aquoso est totalmente envolto por uma membrana lipdica. Quando lipdios anfipticos, contendo uma cabea polar e uma cauda hidrocarbnica hidrofbica, so suspensos em um meio aquoso,

associaram-se espontaneamente, criando uma populao de vesculas que podem variar em tamanho de dezenas de nanmetros at dezenas de mcrons de dimetro. A estrutura bsica em bicamada dos lipossomas similar a das membranas celulares. As vesculas possuem uma ou mais bicamadas lipdicas que aprisionam compartimentos aquosos (NEW, 1997; GMEZ-HENZ; FERNANDEZ-ROMERO, 2006).

FIGURA 11: Estrutura tridimensional dos lipossomas (Acessado em 10/12/2006 de http://www.avantilipidis.com/images/liposomes/vesicle.jpg) Podem ser construdos de forma a armazenar compostos hidroflicos no compartimento aquoso ou compostos lipoflicos na membrana lipdica (FIGURA 12).

FIGURA 12: Localizao de ativos lipoflicos e hidroflicos nos lipossomas (http://www2.cristalia.com.br:8080/cristalia/site/images/empresa/parceiros_unicamp_l ipossoma.gif, acessado em 05/02/2007).

A forma e o tamanho dos lipossomas depende do mtodo de preparao, da composio lipdica, da fora inica do meio e do pH (ANSEL, 1999). Segundo a estrutura podem ser classificados conforme explicitado na TABELA 1.

TABELA 1: Classificao dos lipossomas (Adaptado de NEW, 1997). Vesculas Vesculas Vesculas Parmetros multilamelares unilamelares unilamelares (VML) pequenas (VUP) grandes (VUG) Forma Dimetro (nm) Volume Aquoso (L/mg) % de encapsulao 400 3500 4,1 5 15 20 50 0,5 0,5 1,0 200 1000 13,7 35 65

Um dos pontos importantes do emprego de lipossomas a possibilidade de serem constitudos de componentes naturais conferindo grande similaridade com as membranas celulares, tornando-os um veculo eficaz e seguro. Alternativamente, os lipossomas podem ser compostos por constituintes inteiramente artificiais, escolhidos por suas propriedades qumicas (NEW, 1997). Dentre os diferentes lipdios que podem ser empregados na formao dos lipossomas podemos citar: fosfatidilcolina (de ovo e de soja), fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina hidrogenada, 1,2 dioleoil-glicero-3-fosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoil-snglicero-3-fosfocolina, diestearoilfosfatidiletanolamina, colesterol e 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (MELO et al., 2003). O mais empregado a fosfatidilcolina (PC) (FIGURA 13), presente em grandes quantidades nas membranas celulares (NACHT, 1995; IMBERT; WICKETT, 1995; NEW, 1997).

FIGURA 13: Estrutura da fosfatidilcolina.

As molculas de PC se alinham em meio aquoso e formam folhas de bicamadas planares, minimizando as interaes desfavorveis entre o meio e as cadeias hidrofbicas. Essas interaes so completamente eliminadas, quando estas folhas fecham em si prprias formando vesculas seladas (FIGURA 14). As molculas de PC podem ser obtidas de origem natural ou sinttica. Elas podem ser prontamente extradas da soja, tendo um alto grau de polinsaturao nas cadeias graxas. A PC obtida de fontes naturais constituda por uma mistura de fosfatidilcolinas, cada uma com cadeias de tamanhos diferentes e com vrios graus de insaturao (NEW, 1997).

FIGURA 14: Processo de formao das vesculas lipossomais.

Na formao dos lipossomas podem ser adicionados esteris, como o colesterol e agentes indutores de carga com o objetivo de facilitar a interao com as bicamadas e/ou estabilizar os lipossomas, evitando processos de fuso e agregao das vesculas e o esvaziamento do material incorporado. O colesterol (FIGURA 15) um componente importante na maioria das membranas naturais e sua incorporao nas membranas lipossomais tem o objetivo de aumentar a estabilidade desta, tornando-a mais semelhante s membranas biolgicas, e contribuindo para o aumento da resistncia pela diminuio da fluidez da membrana lipossomal (TALSMA; CROMELLIN, 1992).

FIGURA 15: Estrutura do colesterol.

A natureza e caractersticas dos lipossomas, assim como os mtodos utilizados para sua formao, esto amplamente documentados na literatura. A escolha correta do tipo de lipossoma a ser utilizado no sistema de liberao ir depender de alguns critrios (GMEZ-HENS; FERNANDEZ-ROMERO, 2006): a) caractersticas fsico-qumicas da substncia que ser incorporada e dos constituintes do lipossoma; b) natureza do meio em que o lipossoma disperso; c) a concentrao de ativo que efetivamente incorporada e sua toxicidade potencial;

d) processos adicionais envolvidos na liberao do lipossoma; e) modificaes nas caractersticas dos lipossomas no stio de ao.

Comparado a outros sistemas de liberao, os lipossomas tem propriedades em termos de biocompatibilidade, biodegradao, baixa toxicidade, facilidade de incorporao de compostos, variabilidade de estruturas e caractersticas fsicoqumicas que os destacam. Contudo, existem alguns problemas limitantes no desenvolvimento e industrializao de sistemas utilizando lipossomas: estabilidade, irreprodutibilidade lote a lote, cuidados para esterilizao, baixa taxa de incorporao, dificuldades no controle dos tamanhos dos lipossomas e

irregularidade na produo em grande escala (GMEZ-HENS; FERNANDEZROMERO, 2006).

2.7.1 Aplicao dos lipossomas em formulaes de uso tpico

Muitos fatores governam a liberao de frmacos e outros compostos na pele a parir de formulaes de uso tpico. Estes fatores incluem o tamanho da molcula, lipofilicidade do ativo, tipo de formulao, presena de promotores de penetrao e estado do EC. Os lipossomas vm sendo usados por anos para liberarem ativos dentro da pele. Caractersticas como nmero de lamelas, composio lipdica, carga na superfcie lipossomal, modo de aplicao e a concentrao de lipdios total tiveram influncia comprovada na liberao de ativos pelos lipossomas nas camadas internas da pele (VERMA et al., 2003). Entre os primeiros estudos que indicaram o potencial dos lipossomas nas aplicaes tpicas na pele, existem dois realizados com coelhos que fizeram uma

comparao entre formulaes convencionais e lipossomais de triancinolona. Em ambos, as aplicaes de preparaes lipossomais foram associadas a

concentraes maiores de esteride na epiderme e derme e uma absoro sistmica menor que as formulaes convencionais (FIGURA 16) (MEZEI; GULASEKHARAM, 1980, 1982).
Formulao com ativo incluso nos lipossomas Ativo em formulao convencional

Maior permeao e menor irritao Maior dose de ativo presente Efeito reservatrio na epiderme e na derme Proteo do ativo encapsulado de degradao metablica

Estrato crneo Epiderme

Derme

REDUO DA ABSORO SISTMICA

Corrente sangne

FIGURA 16: Comparao entre formulaes lipossomais e convencionais (Adaptado do Catlogo Lipo Chemicals INC. and Biozone Laboratories INC.). J foi descrito que a maior elasticidade das vesculas pode aumentar o transporte de ativos pela pele em comparao com vesculas de membrana rgida (CEVC et al., 1998). Lipossomas com uma composio lipdica heterognea aumentam a penetrao na pele dos ativos aprisionados. Supe-se que, uma vez em contato com a pele, deva ocorrer uma ecloso do lipossoma. Isso poderia causar uma mistura da bicamada do lipossoma com os lipdios intracelulares do EC, levando a uma mudana na hidratao e na estrutura lamelar. Tal efeito aumenta a

penetrao de compostos lipoflicos no EC e facilita a difuso de compostos hidroflicos pelos espaos interlamelares (VERMA et al., 2003). Por outro lado, possvel que algumas vesculas mais deformveis passem intactas pelo EC ou se acumulem em regies semelhantes a canais dependendo de sua composio (HONEYWELL-NGUYEN, 2000). A forma de aplicao dos lipossomas outro ponto de discusso. Vesculas flexveis so mais eficientes em aplicaes no oclusivas. Isto seria a chave para criar um gradiente osmtico transepidermal. Este seria a fora motriz do transporte dos lipossomas para dentro da pele (CEVC; BLUME, 1992). Puglia e colaboradores realizaram testes de estmulo ao eritematosa por radiaes UV com voluntrios. Aplicou-se um gel para uso tpico contendo indometacina incorporada ao lipossoma e o mesmo gel sem lipossoma. Os resultados concluram que o gel com lipossomas obteve um tempo de ao prolongado e que isto estaria relacionado s interaes das vesculas com os lipdios do EC (PUGLIA et al., 2004). Um estudo de permeao em clulas de difuso de Franz utilizou mucosa vaginal de coelhas e mostrou que h um aumento da concentrao do antifngico veiculado em lipossomas no local de aplicao (NING et al., 2005). A N,N-dietil-m-toluamida (DEET) usada como repelente de mosquito, teve sua ao comparada entre uma formulao convencional e uma formulao em gel no qual tinha-se o DEET incluso em lipossomas. A incluso nos lipossomas levou a um aumento do tempo de ao por um perodo de 12 horas (MIRANDA, 2005). Devido a suas propriedades lipoflicas, os filtros solares podem ser incorporados entre os fosfolipdios das membranas dos lipossomas (TRAN et al., 2002). Existem na literatura estudos que caracterizaram a incorporao de filtros

solares e demonstraram um efeito reservatrio na pele (WOLF et al., 1995; GARCIA, 1998).

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

- Desenvolver uma formulao protetora solar contendo os filtros BZ-3 e MCO inclusos em lipossomas visando maior ao protetora quando comparado a uma formulao convencional.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

- Desenvolver um mtodo de incorporao da BZ-3 em lipossomas;

- Comparar o mtodo de hidratao do filme fosfolipdico com o de agitao do prlipossoma para o preparo dos lipossomas;

- Realizar a avaliao ultraestrutural dos lipossomas;

- Determinar os tamanhos dos lipossomas preparados;

- Desenvolver as seguintes formulaes: gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres; gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO inclusos nos lipossomas e gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres e fosfolipdios dispersos. Na formulao com lipossomas devero ser adicionados ambos os filtros solares livres para obter o mesmo FPS das demais formulaes;

- Determinar durante 3 meses e comparar estatisticamente o FPS de todas as formulaes determinado por mtodo in vitro;

- Determinar o FPS de todas as formulaes por mtodo in vivo e comparar estatisticamente com os valores obtidos in vitro;

- Comparar a permanncia da formulao contendo os filtros solares inclusos nos lipossomas, frente as outras formulaes quando aplicadas na pele, atravs de testes de resistncia gua (in vivo) das formulaes.

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Equipamentos

Espectrofotmetro UV-VIS SHIMADZU CORPORATION mod. UV-2401 PC com software UVPC;

Espectrofotmetro de infravermelho FTIR - 8300 PERKIN ELMER com software Hyper - IR;

Aparelho para determinao de ponto de fuso BCHI B-540; Refratmetro CARL ZEISS 120540; Potencimetro METTLER TOLEDO MPC227; Microscpio eletrnico de transmisso AXIOPLAN2 ZEICE; Microscpio ptico MORGAGNI mod. 268 FEI; Aparelho ZETASEIZER; Agitador de tubos PHOENIX AP56; Rota-evaporador BCHI R-114; Balana analtica METTLER TOLEDO AB204; Balana de preciso METTLER TOLEDO PB3002; Aparelho de ultra-som THORNTRON 14; Placa de aquecimento com agitao magntica CORNING; Destilador QUIMIS Q. 341-210

4.1.2 Outros materiais

Suporte para filtrao SWINEX em polipropileno com 25 mm de dimetro; Colunas PD-10 vazias PHARMACIA BIOTECH; Sephadex G-50 SIGMA-ALDRICH; Seringas descartveis de 5,0 mL BECKTON & DICKSON; Membranas de policarbonato ISOPORE com poros de 0,4 m e 0,2 m;

4.1.3 Reagentes

cido ascrbico (ROCHE); cido clordrico P.A. (VETEC); cido fosfotungstico (SIGMA); cido sulfrico P.A. (VETEC); Clorofrmio P.A. (VETEC); Etanol P.A. (VETEC); Metanol P.A. (VETEC); Molibdato de amnio (MERCK); Perxido de hidrognio (VETEC); Soluo padro de fsforo a 20 g P / mL (SIGMA); TRIS Tris[hidroximetil]aminometano (SIGMA).

4.1.4 Filtros solares Padres de trabalho

Benzofenona-3 teor declarado: 102,7% (SPECTRUM); p-Metoxicinamato de octila teor declarado: 100% (SPECTRUM).

4.1.5 Matrias-primas

Benzofenona-3 (VETEC); Colesterol (SIGMA); Eumulgin VL 75 (lauril glucsido, poligliceril 2-dipolihidroxiestearato e glicerina);

Hidroxietil celulose (natrosol); Metilparabeno (ROCHE); p-Metoxicinamato de octila (MERCK); Phosal 75 AS (GmbH); Phospholipon 90NG (GmbH).

4.2 MTODOS

4.2.1 Preparo das solues utilizadas na pesquisa

4.2.1.1 Preparo da soluo tampo TRIS pH 6,8

Pesar 2,42g de Tris[hidroximetil]aminometano, transferir quantitativamente para balo volumtrico de 100,0 mL e completar o volume com gua destilada. Ajustar o pH da soluo para 6,8 utilizando HCl concentrado e monitorando com o potencimetro. A soluo deve ser armazenada em frasco de vidro mbar sob refrigerao.

4.2.1.2 Preparo da soluo reagente de molibdato de amnio

Pesar 2,2g de molibdato de amnio, transferir quantitativamente para balo volumtrico de 1000,0 mL, adicionar cerca de 300 mL de gua destilada. Colocar o balo em banho de gelo e adicionar lentamente a soluo de H s SO 4 preparada (7,0 mL de H 2 SO 4 concentrado em 400,0 mL de gua destilada). Retirar o balo volumtrico do gelo, aguardar o retorno temperatura ambiente e completar o volume do balo com gua destilada (MORITA; ASSUMPO, 2001). A soluo foi armazenada em frasco de vidro mbar.

4.2.1.3 Preparo da soluo de H s SO 4 10N

Em um balo volumtrico de 100,0 mL, adicionar 50 mL de gua destilada. Colocar o balo em banho de gelo e adicionar lentamente 30 mL de H 2 SO 4 concentrado. Retirar o balo volumtrico do gelo, aguardar o retorno temperatura ambiente e completar o volume do balo com gua destilada (MORITA; ASSUMPO, 2001).

4.2.1.4 Preparo da soluo de H 2 O 2 10% (v/v)

Pipetar 3,4 mL de H 2 O 2 P.A., transferir para balo volumtrico de 10,0 mL e completar com gua destilada. Esta soluo deve ser preparada no momento do uso (MORITA; ASSUMPO, 2001).

4.2.1.5 Preparo da soluo de cido ascrbico 10% (p/v)

Pesar 1,0g de cido ascrbico, transferir quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e completar com gua destilada. Esta soluo deve ser preparada no momento do uso (MORITA: ASSUMPO, 2001).

4.2.1.6 Preparo da soluo de fosfotungstato de potssio 2% (p/v)

Pesar 0,57g de cido fosfotungstico em um becher de 50 mL, adicionar cerca de 5 mL de gua destilada. Neutralizar at pH 7,0 com soluo aquosa de KOH 1 M.

Transferir a soluo para balo volumtrico de 10,0 mL e completar o volume com gua destilada (MORITA; ASSUMPO, 2001).

4.2.2 Anlise dos filtros solares utilizados como padres de trabalho

4.2.2.1 Determinao do ponto de fuso (PF) da BZ-3

Uma pequena quantidade do filtro foi colocada em um capilar de vidro fechado em uma das pontas e este colocado no suporte da amostra do aparelho Bchi B-540 para a determinao do PF.

4.2.2.2 Determinao do ndice de refrao do MCO

Uma gota do filtro solar MCO, lquido oleoso, foi aplicada no local apropriado do refratmetro Carl Zeiss 120540, este ndice mede quanto h de desvio da luz polarizada que passa pela substncia opticamente ativa, sendo um valor nico para cada substncia.

4.2.2.3 Anlise do espectro de absoro na regio ultravioleta

Utilizando o espectrofotmetro SHIMADZU UV-2401PC, os espectros no ultravioleta foram obtidos realizando a leitura em triplicata de solues etanlicas de 5mg/L e 6mg/L, para determinao do comprimento de onda mximo ( mx) e clculo do coeficiente de extino molar (). Os parmetros utilizados foram: varredura de 450 a 220 nm, fenda 2,0 cm e intervalo de amostragem 1,0 nm.

4.2.2.4 Anlise do espectro de absoro na regio infravermelha

Foi realizada a comparao entre os espectros existentes na literatura e aqueles obtidos no aparelho SHIMADZU FTIR-8300, utilizando a BZ-3 a 1% em pastilhas de KBr. Para o MCO, uma gota foi espalhada entre placas de cristal de cloreto de sdio.

4.2.3 Construo da Curva de Ringbom para a BZ-3

A curva de Ringbom permite determinar qual faixa de concentrao da BZ-3 produzir uma resposta linear em relao absorbncia (Abs.), ou seja, qual faixa de concentrao da BZ-3 ir responder a lei de Lambert-Beer (Ringbom, 1939; Yakabe et al., 2005). Para sua construo foram preparadas 12 solues com

concentraes crescentes na faixa de 0,4g/mL a 60,0g/mL, etanol P.A. foi escolhido como solvente. Foi registrado o espectro de absoro na faixa de 220,0nm a 450,0nm de cada uma das solues. Os valores de absoro mximos serviram de base para a determinao do comprimento de onda mximo ( mx) e para os clculos dos percentuais de transmitncia que formam os valores do eixo Y no grfico. Os valores de logaritmo das concentraes foram calculados e fazem parte do eixo X do grfico.

4.2.4 Construo da curva-padro para a determinao da equao da reta da BZ-3

Com as concentraes escolhidas (05 pontos) a partir da curva de Ringbom, foram construdas trs curvas-padro (Abs. x Concentrao.) para a BZ-3. Essas anlises permitiram a construo da curva-padro mdia e o clculo da equao da reta com a determinao do coeficiente de correlao (r). (ANVISA, 2003)

4.2.5 Construo da curva-padro para a determinao da equao da reta do MCO

Para o MCO, estudos anteriores j determinaram os valores de concentrao que respondem linearmente a lei de Beer e o mx, tendo o etanol como solvente. Utilizando esses valores, foram construdas 3 curvas padro e calculada a equao da reta.

4.2.6 Preparao dos lipossomas contendo a Benzofenona-3

De forma a obter vesculas multilamelares que possuem uma maior capacidade de incorporar substncias lipoflicas, como a BZ-3, foram avaliados dois mtodos: o de hidratao do filme fosfolipdico (Phospholipon 90NG) e o que utiliza o pr-lipossoma (Phosal 75 AS). Pesquisa anterior j demonstrou que para um outro ativo slido lipoflico o mtodo de preparo utilizando o pr-lipossoma demonstrou menor percentual de incluso, quando comparado ao da hidratao do filme lipdico (HENRIQUES et al., 2005). Portanto, iniciaram-se os clculos

envolvidos para a obteno dos lipossomas pelo mtodo de hidratao do filme lipdico. O melhor percentual de incorporao encontra-se entre 10 e 20% de ativo em relao aos constituintes lipdicos do lipossoma (NEW, 1997). Assim sendo, foram escolhidos os valores de 10% e 15% de BZ-3 como guias para alcanar a melhor quantidade de BZ-3 a ser incorporada. Foi utilizada a mesma proporo dos constituintes j descritas como tendo um bom rendimento e fcil manipulao, formada por: 42,0 mM de fosfatidilcolina (PC); 12,0mM de colesterol e 5,4 mM para BZ-3 (10% em relao ao total de lipdios) ou 8,1 mM para BZ-3 (15% em relao ao total de lipdios). Para os ensaios preliminares foi preparado 25 mL da suspenso de lipossoma. Dessa forma foram calculadas as massas dos constituintes, sendo a PC e o colesterol pesado diretamente no balo de fundo redondo de 1,0 litro. A BZ-3 foi pesada separadamente e transferida quantitativamente para o balo com o auxlio de at 20 mL de clorofrmio P.A.. Agitou-se a mistura at completa solubilizao dos constituintes, quando ento o balo foi levado ao evaporador rotatrio, onde permaneceu sob aquecimento at 40 C, rotao lenta por 2 horas e inclinao do balo de forma a obter um filme fino e homogneo na parede interna. Para garantir que todo solvente foi retirado, o balo permaneceu 24 horas no dessecador a vcuo. Aps este tempo, adicionaram-se algumas prolas de vidro e 25 mL de tampo TRIS pH 6,8 para realizar a hidratao do filme fosfolipdico. A mistura foi levada a um agitador de tubos at observar o completo desprendimento do filme. Com a hidratao do filme fosfolipdico, as vesculas desprendidas iro se fechar, formando as primeiras vesculas (FIGURA 17). Este processo demorado, portanto

em publicaes anteriores o balo era deixado em repouso por 48 ou 96 horas sob refrigerao (4 C) (GARCIA, 1998).
Colesterol BZ-3 20mL CHCl 3

Fosfatidilcolina Rota-evaporador (2 horas) Dessecador a vcuo (24 horas)

25mL tampo TRIS pH 6,8 Agitao

48 / 96 horas a 5 oC Agitao

FIGURA 17: Formao de lipossomas por hidratao de filme lipdico.

4.2.7 Preparao dos lipossomas contendo o p-Metoxinamato de octila

Por ser um filtro lquido oleoso, o MCO pde ser incorporado nos lipossomas pelo mtodo do pr-lipossoma. A concentrao de 8,4 mM de MCO (20% em relao ao total de lipdios) foi utilizada por j ter sido eleita a melhor em pesquisa anterior (GARCIA, 1998). Neste procedimento, o lipossoma formado a partir de uma mistura comercial de PC com outros adjuvantes (Phosal 75 AS) utilizada na concentrao de 42 mM. Foram calculadas as massas de Phosal e de MCO a serem utilizadas para obter 25 mL da suspenso lipossomal. Os dois constituintes

foram pesados diretamente em um becher de 100 mL, misturados por 15 minutos com o auxlio de um basto de vidro, e por fim adicionou-se 25 mL do tampo TRIS pH 6,8. A mistura foi deixada sob agitao mecnica por 2 horas (FIGURA 18).

Phosal + MCO

25 mL tampo TRIS pH 6,8

Agitao com basto (15 min) FIGURA 18: Formao de lipossomas pelo mtodo de agitao mecnica utilizando um pr-lipossoma.

4.2.8 Normalizao dos lipossomas

Para normalizao do tamanho, os lipossomas preparados foram filtrados utilizando seringa descartvel de 5,0 mL Beckton & Dickson acoplada em suporte de filtrao Swinex em polipropileno com 25 mm de dimetro, contendo membrana de policarbonato (Isopore) com poros de 0,4 m ou de 0,2 m. Aps a passagem pela membrana de 0,2 m, uma frao do lipossoma era separada para anlise (FIGURA 19). A filtrao em cada membrana deveria ser realizada duas vezes, porm como esse processo era manual, preparaes mais concentradas exerciam uma presso muito grande no sistema impedindo que se fizesse a filtrao duas vezes.

Encaixe da seringa no suporte

Suco dos lipossomas

Filtrao dos lipossomas pelas membranas: 0,4 m (2x) e 0,2 m (1 ou 2x)

Lipossomas com tamanhos normalizados

FIGURA 19: Processo de normalizao do tamanho dos lipossomas.

4.2.9 Avaliao do percentual de filtro incorporado no lipossoma

Nesta etapa final, separou-se 3,5 mL da frao aps filtrao na membrana de 0,2 m, para que fossem passados em uma coluna PD-10 contendo Sephadex G-50. Desta forma, o material que no estava incorporado no lipossoma ficaria retido na coluna, e a frao que passava por toda coluna era recolhida para anlise (FIGURA 20). Ao final de todo processo, para cada lipossoma preparado, tinham-se trs fraes da suspenso lipossomal para anlise: inicial, aps filtrao na membrana de 0,2 m e aps passagem pela coluna Sephadex G-50.

3,5 mL de lipossoma filtrado

Coluna PD-10 com gel

Lipossomas apenas com material incluso

FIGURA 20: Passagem dos lipossomas por coluna de gel de Sephadex G-50.

4.2.10 Determinao da quantidade de filtro solar incorporado nas fraes da suspenso lipossomal

Utilizando a massa de filtro inicialmente pesada para o preparo do lipossoma, calculou-se a diluio necessria das amostras para obter solues com concentraes prximas a do ponto central da curva-padro. Para cada frao eram preparadas trs diluies. Estas foram lidas no espectrofotmetro e seus valores de absorbncia determinados no mx caracterstico de cada filtro solar. A concentrao do filtro solar em cada frao foi determinado pela equao da reta obtida da curva-padro correspondente.

4.2.11 Determinao da quantidade de fosfolipdio nas fraes pelo mtodo de Bartlett

Foi realizada a determinao indireta da concentrao de fosfolipdios, avaliando-se o contedo de fsforo (P) em cada amostra. Por se tratar de um mtodo com muitas variveis, sempre que era realizado, havia a necessidade da construo de uma curva-padro de fsforo. As amostras foram diludas, baseandose na massa inicial de fosfolipdio presente, para obter as solues finais com concentrao de aproximadamente 2 g de fsforo / mL. Foi pipetado 1,0 mL de cada soluo diluda para um tubo de ensaio, em trs tubos foram pipetados 1,0 mL de gua destilada que serviram de brancos e quatro tubos continham volumes crescentes de soluo padro de fsforo para construo da curva-padro. Neste mtodo (FIGURA 21), primeiro as amostras sofrem uma hidrlise cida, os fosfolipdios passam a fosfato inorgnico. Adiciona-se soluo de molibdato de amnio que reage com o fosfato inorgnico formando o cido fosfomolbdico. Este por sua vez forma um complexo azul, na presena de cido ascrbico como agente redutor. A intensidade da cor azul diretamente proporcional quantidade de fsforo presente e medida espectrofotometricamente (BARTLETT, 1959; GARCIA, 1998). A quantidade de fsforo encontrada diretamente proporcional a quantidade de PC presente na amostra (1,0 mg de P ---- 25,0 mg de PC).

Amostra diluda 2 g P / mL

Alquota de 1,0 mL

0,4 mL H2SO4 10 N Aquecimento 180 oC (30 min)

0,1 mL H2O2 10% Aquecimento 180 oC (30 min)

4,6 mL Molibdato de amnio 0,5 mL c. ascrbico 10% Aquecimento 90 oC (20 min) Leitura no espectro UV, plotar as Abs. na curva-padro

TEOR DE FSFORO

FIGURA 21: Mtodo de Bartlett para determinao do teor de fsforo.

4.2.12 Visualizao dos lipossomas por microscopia ptica

As diferentes fraes dos lipossomas preparadas com BZ-3 a 5,4 mM e a 7,0 mM foram observadas em microscpio ptico para verificar a formao das vesculas, seus tamanhos, formas e verificar a existncia de cristais insolveis do filtro. Cada frao foi diluda no momento da visualizao com gua destilada, conforme necessrio. Uma gota foi colocada sobre lmina e coberta com lamnula,

aplicando uma pequena presso para imobilizar o maior nmero possvel de vesculas e assim permitir a visualizao.

4.2.13 Visualizao dos lipossomas por microscopia eletrnica de transmisso (MET)

Amostras dos lipossomas preparados com BZ-3 a 7,0 mM foram feitas por colorao negativa pelo mtodo da gota utilizando soluo de fosfotungstato de potssio (PTK) a 2% como corante. O mtodo utilizado est representado no esquema da FIGURA 22.
Telas com filme suporte Lmina de vidro ou pina (para apoio) Secar com papel de filtro (ngulo de 45 o)

1 gota sol. Bacitracina (2min)

1 gota sol. de lipossomas (2min)

Secar com papel de filtro Secar com papel de filtro Manter em dessecador

1 gota corante PTK 2% (2min)

Secagem por 40 min ou mais

Observao no MET

FIGURA 22: Preparo das amostras para MET.

4.2.14 Determinao do tamanho dos lipossomas por espalhamento da luz laser Amostras dos lipossomas preparados com BZ-3 a 7,0 mM. Foram preparadas por diluio com gua destilada para leitura no aparelho ZETASEIZER, o mtodo de leitura utilizado foi o multimodal.

4.2.15 Determinao do teor dos filtros recebidos como matrias-primas

Para a formulao dos geles, a BZ-3 e o MCO foram doados pelo Laboratrio de Desenvolvimento Galnico (LADEG) da Faculdade de Farmcia - UFRJ. Antes de serem utilizados, foi necessrio determinar seus teores, fazendo-se a diluio de cada filtro na concentrao prxima ao ponto central da curva-padro

correspondente. As curvas-padro utilizadas foram aquelas construdas a partir das amostras utilizadas como padro de trabalho.

4.2.16 Formulao do gel contendo os filtros no incorporados em lipossomas

Para comparao dos resultados das anlises do gel contendo os lipossomas, foi necessrio preparar uma formulao contendo os filtros solares no inclusos, o mais prximo possvel da formulao contendo os lipossomas. A formulao escolhida foi o gel de natrosol, por ser compatvel com os lipossomas. A formulao preparada encontra-se na TABELA 2.

TABELA 2: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres. Componentes Quantidade (g) Natrosol Fase A Metilparabeno gua destilada p-metoxinamato de octila Fase B Benzofenona-3 Eumulgin VL 75 * 1,0 0,2 q.s.p. --- 100 8,0 5,0 0,5 (gotejar)

* Emulgin VL 75: lauril glucsido, poligliceril 2-dipolihidroxiestearato e glicerina.

O metilparabeno foi dissolvido completamente na metade da quantidade de gua previamente aquecida, adicionou-se o restante da gua fria e a seguir o natrosol, sob agitao. Separadamente, foi preparada a fase B, solubilizando a BZ-3 no MCO com o auxlio de gotas de Eumulgin VL75. A fase A foi vertida na fase B e mantida sob vigorosa agitao at formao da rede do polmero e homogeneizao das fases.

4.2.17 Desenvolvimento da formulao em gel contendo os filtros solares inclusos nos lipossomas

Para a formulao, os lipossomas contendo o MCO e os lipossomas com BZ3 foram preparados utilizando uma concentrao de 168mM de PC e com aumento proporcional da concentrao dos filtros em relao aos fosfolipdios. Esse aumento na concentrao dos fosfolipdios teve por objetivo aumentar a quantidade na

formulao de lipossomas com os filtros solares inclusos, diminuindo a necessidade da adio de filtros solares externos aos lipossomas. Para atingir um FPS 20, foi formulado um gel de natrosol a 1% contendo 8% de MCO e 5% de BZ-3 (TABELA 3), onde parte desses filtros solares estavam inclusos no lipossomas.

TABELA 3: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO inclusos em lipossomas. Componentes Quantidade Natrosol Fase A Metilparabeno gua destilada Suspenso lipossomal com MCO a 43,2 mM Suspenso lipossomal Fase B com BZ-3 a 28 mM p-metoxinamato de octila Benzofenona-3 1,0g 0,2g q.s.p. --- 100g 40,0 mL 40,0 mL 7,5g 4,75g

O metilparabeno foi dissolvido completamente em 10 mL de gua previamente aquecida, adicionou-se o restante da gua fria e depois o natrosol, sob agitao. A fase B foi preparada adicionando o filtro solar no incluso em sua suspenso lipossomal correspondente e por fim misturando-se as suspenses. A fase A foi vertida na fase B e mantida sob vigorosa agitao at formao da rede do polmero e homogeneizao das fases.

4.2.18 Formulao do gel contendo os filtros no incorporados e com os fosfolipdios dispersos

Para comparao dos resultados principalmente nas anlises in vivo do gel contendo os lipossomas, foi necessrio preparar uma formulao contendo os filtros solares no inclusos e os fosfolipdios dispersos no meio. A formulao preparada encontra-se descrita na TABELA 4. TABELA 4: Formulao em gel contendo os filtros solares BZ-3 e MCO livres e fosfolipdios dispersos. Componentes Quantidade (g) Natrosol Fase A Metilparabeno gua destilada Fosfatidilcolina Colesterol Fase B p-metoxinamato de octila Benzofenona-3 1,0 0,2 q.s.p. --- 100 13,0 2,0 8,0 5,0

O metilparabeno foi dissolvido completamente na metade da quantidade de gua previamente aquecida, adicionou-se o restante da gua fria e a seguir o natrosol, sob agitao. Separadamente, foi preparada a fase B, solubilizando a BZ-3 no MCO e com a adio da fosfatidilcolina e do colesterol. A fase A foi vertida na fase B e mantida sob vigorosa agitao at formao da rede do polmero e homogeneizao das fases.

4.2.19 Determinao in vitro do FPS das formulaes

O FPS das formulaes preparadas foi medido pelo mtodo de Mansur (MANSUR, 1986). um mtodo in vitro simples no qual a formulao foi diluda em etanol P.A. de forma a obter uma concentrao de 0,2 mg/mL da formulao e no do ativo, condio esta estabelecida pelo autor de forma a criar uma correlao com o mtodo in vivo. Atravs da frmula matemtica desenvolvida com valores de correo, possvel relacionar os valores de Abs. obtidos com o FPS da amostra (MANSUR et al, 1986; SANTOS et al, 1999; RIBEIRO et al, 2004).

FPS = FC 10 . 320 290 . EE . I . Abs

(conc = 0,2L/mL ou 0,2mg/mL)

EQUAO 2: Clculo do FPS segundo Mansur

4.2.20 Determinao do FPS in vivo das formulaes

As formulaes tiveram seu FPS in vivo determinados usando o protocolo da FDA 99 DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, FOOD AND DRUG ADMINISTRATION Sunscreen Drug Products for Over the Counter Human Use; Final Monograph; Final Rule; Subpart D Testing Procedure, section 352.70 a 352.72, May 21, 1999 (FDA, 1999). Foi realizado ensaio clnico mono-cego, aleatorizado, com controle paralelo. Foram avaliados voluntrios, do sexo feminino, de fototipos I, II e III, (TABELA 5) com idades de 18 a 60 anos.

TABELA 5: Avaliao do fototipo da pele atravs do histrico. Adaptado de FDA, 1999. Fototipo Histrico de resposta exposio solar I II III Sempre queima facilmente, nunca bronzeia Sempre queima facilmente, bronzeia ao mnimo Queima moderadamente, bronzeia gradualmente

Foram critrios de excluso: gravidez ou aleitamento; indivduos com histria anterior de reaes fototxicas ou fotoalrgicas; indivduos em uso de

medicamentos passveis de produzir resposta cutnea anormal; presena de queimadura solar, bronzeado, tom de pele desigual, manchas, nevos, queratose seborrica ou excesso de plos no local do teste. Os voluntrios foram submetidos entrevista (ANEXO A) e exame dermatolgico (ANEXO B). Todos foram esclarecidos e orientados sobre os objetivos e mtodos da pesquisa, receberam instrues (ANEXO C) e assinaram um termo de consentimento de participao (ANEXO D) elaborado segundo a declarao de Helsinque e aprovado por um comit de tica em Pesquisa (CNS, 1996). Antes da fase de teste, a DME de cada voluntrio foi determinada por uma seqncia de progresso geomtrica de exposio luz ultravioleta (DME / minuto), sendo cada uma graduada com um aumento aproximado de 25% acima do anterior. 24 horas aps a irradiao, os locais de teste foram avaliados pelo eritema de acordo com a TABELA 6.

TABELA 6: Determinao da DME na pele. Adaptado de FDA, 1999. Reao Resultado 0 ausente 1 eritema mnimo 2 eritema definido 3 eritema moderado 4 eritema intenso negativo (-) duvidoso (+/-) positivo (+) positivo (++) positivo (+++)

Aps a demarcao de reas medindo 50 cm2 no dorso (regio infraescapular), aplicou-se a preparao controle (octildimetil PABA 7,0% e BZ-3 3,0%) e a formulao a ser avaliada em reas adjacentes, na quantidade de 0,1g (equivalente a 2mg/cm2), de maneira uniforme com o uso de dedeira. Aps 15 minutos da aplicao, iniciou-se a irradiao. Os tempos de exposio foram calculados para cada rea individualmente, baseados na DME previamente determinada da pele no protegida e no FPS estimado da formulao avaliada. O FPS foi calculado pela razo entre o tempo necessrio para produzir uma DME na pele protegida (com a formulao) e o tempo necessrio para produzir uma DME na pele no protegida. Para cada um dos voluntrios foi calculado o valor do FPS, para a amostra total dos voluntrios foi calculado o FPS mdio e o desvio padro. Na tabela de distribuio de t de Student, verificou-se o valor de (t) com n-1 graus de liberdade e nvel de probabilidade p = 0,05. O intervalo de confiana de 95% para o FPS mdio baseado na distribuio t de Student foi calculado atravs da seguinte frmula: IC 95% FPS mdio = x + A EQUAO 3: Clculo do intervalo de confiana de 95% para o FPS mdio.

Onde, x = valor mdio do FPS A=


t _s__

t = valor de t da tabela de distribuio bilateral t de Student com p = 0,05 s = desvio padro n = nmero de voluntrios utilizados

4.2.21 Determinao do FPS in vivo aps imerso em gua Resistncia gua

Aps a irradiao da radiao ultravioleta nos locais de ensaio, tanto para a formulao testada como para o controle, aplicou-se o produto novamente em rea intacta, aguardou-se 15 minutos e cada voluntrio entrou em banheira de hidromassagem, com gua na temperatura entre 23 oC e 32 oC por um perodo inicial de 20 minutos de agitao moderada da gua. A seguir, 20 minutos de repouso fora da banheira. Repetiu-se, a seguir o procedimento de agitao por mais 20 minutos. Os voluntrios foram acompanhados durante a imerso para assegurar que as reas de testes no fossem tocadas. Aps totalizar 40 minutos em contato com a gua, o voluntrio foi seco com secador eltrico nas reas de teste e com toalha macia nas demais reas. Os locais de teste foram expostos luz ultravioleta, utilizando-se o mesmo mtodo aplicado antes da imerso.

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 CARACTERIZAO FSICO-QUMICA DOS PADRES DE TRABALHO (BZ-3 E MCO)

Amostras de BZ-3 e MCO foram doadas pela empresa SPECTRUM, com os respectivos laudos de anlise constando o teor de cada filtro solar. Como no existe padro farmacopeico dos filtros solares, foi necessrio comprovar a identidade e pureza permitindo o uso das amostras como padres de trabalho. A seguir esto os testes executados para estas avaliaes:

5.1.1 Determinao do ponto de fuso (PF) da BZ-3

O ponto de fuso caracterstico para uma substncia e variaes no seu valor podem indicar a presena de impurezas e/ou degradao da amostra. A sua determinao foi realizada em triplicata e o resultado mdio est apresentado na TABELA 7. A amostra apresentou uma faixa prxima daquela apresentada na literatura.

TABELA 7: Valores de Ponto de Fuso da BZ-3. Ponto de Fuso Anlise (n = 3) (C) 64,4 + 0,26 - 65,3 + 0,36 *(SHAAT, 1995) Literatura* (C) 62 - 64

5.1.2 Determinao do ndice de refrao do MCO

A refratometria um mtodo empregado para identificao de substncias e deteco de impurezas. A lei da refrao de Snell-Descartes relaciona os ndices de refrao de dois meios e foi empregada no refratmetro CARL ZEISS onde a amostra colocada entre os prismas que o compe. A alterao do ngulo de incidncia dos raios de luz que passam pela amostra e pelos prismas traduzida no ndice de refrao. Este valor especfico para cada substncia. A TABELA 8 apresenta os resultados referentes ao ndice de refrao do MCO, mdia de trs determinaes. O valor encontrado para amostra ficou dentro da faixa indicada pela literatura. TABELA 8: Valores de ndice de refrao do MCO. ndice de refrao Anlise Literatura* (n = 3) 1,543 + 0,001 1,542 - 1,548 *(SHAAT, 1995) 5.1.3 Determinao dos parmetros de absoro na regio ultravioleta

O espectro de absoro na regio do UV muito rico para a avaliao dos filtros solares. possvel determinar diversos parmetros que identifica a substncia e a sua pureza. Na avaliao de cada espectro pde-se determinar o mximo e a absorbncia mxima, valores que contribuem para a identificao dos filtros utilizados. Tambm foi possvel calcular o coeficiente de extino molar (), valor indicativo do poder de absoro da radiao UV pela molcula. A TABELA 9

apresenta os parmetros utilizados e os valores encontrados na anlise da BZ-3 e do MCO. Os resultados obtidos esto em concordncia com os valores da literatura. TABELA 9: Parmetros observados na anlise por ultravioleta dos filtros solares. BZ-3 Teor Solvente Concentrao mximo mximo literatura* Abs. mx. 102,7% Etanol P.A 4,99 mg/L 287 nm 288 nm 0,3095 14460 14000 MCO 100% Etanol P.A 8,22 mg/L 311 nm 311 nm 0,7033 24810 23300

literatura*
*(SHAAT, 1995)

5.1.4 Espectro da BZ-3 e MCO na regio do infravermelho

Os espectros de infravermelho so provocados pelos diferentes modos de interao da radiao eletromagntica com a molcula (vibrao e rotao). Pode ser considerado como uma impresso digital do composto. Nas FIGURAS 23 e 24 apresentam-se os espectros na regio do infravermelho obtidos com as amostras de BZ-3 e MCO, respectivamente. De cada espectro foram selecionadas as principais bandas de absoro e comparadas com os valores encontrados na literatura (TABELAS 10 e 11). Como visto, ambas amostras tiveram bandas de absoro com valores bem prximos aos seus padres da literatura, sendo um indicativo da similaridade entre as estruturas qumicas de cada amostra e seus respectivos padres.

FIGURA 23: Espectro no infravermelho da BZ-3 (1% em KBr)

TABELA 10: Comparao das principais bandas de absoro do espectro infravermelho da BZ-3. Principais bandas de absoro Amostra 2950 cm-1 1636 cm-1 1595 cm-1 1260 cm-1 Literatura (CTFA, 1990) 2900 cm-1 1650 cm-1 1600 cm-1 1270 cm-1

FIGURA 24: Espectro no infravermelho do MCO (filme entre cristais de NaCl).

TABELA 11: Comparao das principais bandas de absoro do espectro infravermelho do MCO. Principais bandas de absoro Amostra 1710 cm-1 1604 cm-1 1254 cm-1 Literatura (BP, 2004) 1700 cm-1 1610 cm-1 1200 cm-1

A dificuldade em se obter padres farmacopeicos e a pouca literatura existente indicando especificaes para as caractersticas fsico-qumicas dos filtros solares dificulta sua padronizao. Contudo, a realizao dos testes descritos e a anlise dos resultados permitiram a utilizao dos filtros doados como padres de trabalho nas etapas seguintes.

5.2 CONSTRUO DA CURVA DE RINGBOM PARA A BZ-3

A determinao da curva de Ringbom para uma substncia permite observar a faixa total de concentrao que possui uma resposta linear a absorbncia. Como no foi encontrada tal curva na literatura para a BZ-3, mostrou-se necessria a sua construo. A faixa lida foi de 0,4 a 50 g/mL. O uso de concentraes menores que 0,4 g/mL no era indicado pelo fabricante do aparelho espectrofotmetro e concentraes acima de 60 g/mL causaram distores na leitura ocorrendo o estouro dos picos de absorbncia. Para a construo da curva de Ringbom (FIGURA 25) os valores de absorbncia foram utilizados para o clculo dos percentuais de transmitncia (%T) pela relao: %T = 1/10Abs x 100, tambm foram calculados os logaritmos de cada concentrao(logC). Os valores esto

apresentados na TABELA 12.

TABELA 12: Valores utilizados para a construo da curva de Ringbom. LogC %T Concentrao (g/mL) Absorbncia 0,4 0,0313 -0,3979 93,0 0,8 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0,0587 0,1391 0,2744 0,4086 0,5450 0,6803 1,3482 2,0271 2,6983 3,4557 -0,0969 0,3010 0,6021 0,7782 0,9031 1,000 1,3010 1,4771 1,6021 1,6990 87,4 72,59 53,16 39,03 28,51 20,88 4,4854 0,93951 0,20031 0,035019

100 90 80

Curva de Ringbom Benzofenona-3

%T

70 60 50 40 30 20 10 0

-0,5

-0,3

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

Log Conc. (g/mL)

FIGURA 25: Curva de Ringbom para a BZ-3, eixo X: Log das concentraes (g/mL) e eixo Y: % de transmitncia. O retngulo na FIGURA 25 indica a regio onde se observa a linearidade, correspondendo ao intervalo de 2,0 a 10 g/mL Desta forma, escolheu-se trabalhar com os cinco pontos a seguir: 2,0 g/mL, 4,0 g/mL, 6,0 g/mL, 8,0 g/mL e 10,0 g/mL, que foram utilizadas para a construo da curva-padro da BZ-3.

5.3 CONSTRUO DA CURVA-PADRO E DETERMINAO DA EQUAO DA RETA PARA A BZ-3

Para a anlise do teor de BZ-3 presente nos lipossomas e nas formulaes preparadas, foi construda uma curva-padro em triplicata de pesadas para cada ponto e calculada a equao da reta (FIGURA 26). A utilizao de solues da BZ-3 nas concentraes estabelecidas pela curva de Ringbom permitiu a obteno de uma curva com tima linearidade possuindo um coeficiente de correlao (r) de 0,9998. O coeficiente de determinao (r2) de 0,9996 demonstra uma relao linear

para as concentraes escolhidas e que a proposta feita foi verificada com 99,96% de confiana (NETO et al., 2002).
0,800 0,700 0,600 0,500

Abs.

0,400 0,300

y = 0,0653x + 0,0082 r = 0,9996


2

r = 0,9998
0,200 0,100 0,000 0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

C onc. ( g/ml)

FIGURA 26: Curva-padro da BZ-3. Eixo X: concentrao de BZ-3 em g/mL; eixo Y: Absorbncia.

5.4 CONSTRUO DA CURVA PADRO E DETERMINAO DA EQUAO DA RETA PARA O MCO

Para

construo

da

curva-padro

do

MCO

foram

utilizadas

as

concentraes determinadas pela curva de Ringbom do MCO em um estudo anterior (GARCIA, 1998). As concentraes foram: 2,0 g/mL, 4,0 g/mL, 6,0 g/mL, 8,0 g/mL e 10,0 g/mL. Com estes valores foram construdas trs curvas-padro e delas resultou a curva-padro mdia (FIGURA 27) da qual foi calculada a equao da reta. O coeficiente de correlao (r) de 0,9995 indica uma tima linearidade. O coeficiente de determinao (r2) de 0,9989 demonstra uma relao linear para as

concentraes escolhidas e que a proposta feita foi verificada com 99,89% de confiana (NETO et al., 2002).
1 0,9 0,8 0,7 0,6

Abs.

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,00 2,00 4,00 6,00

y = 0,087x + 0,0023 2 r = 0,9989


r = 0,9995

Conc. (g/ml)

8,00

10,00

12,00

FIGURA 27: curva-padro mdia do MCO. Eixo X: concentrao de MCO em g/mL; eixo Y: Absorbncia.

5.5 DETERMINAO DOS TEORES DE BZ-3 E MCO (MATRIAS-PRIMAS)

Para o preparo das formulaes fotoprotetoras, foi necessria a utilizao de grandes quantidades de filtros solares. As amostras doadas pela Spectrum que foram padronizadas no eram suficientes. O LADEG UFRJ forneceu amostras de BZ-3 e MCO para o preparo das formulaes. Como tais amostras no possuam teor declarado, a determinao foi realizada baseando-se nas curvas-padro j determinadas. As anlises foram realizadas em triplicata, os filtros tiveram teor prximo a 100% (TABELA 13), permitindo a utilizao como matrias-primas no preparo das formulaes.

TABELA 13: Valores de teor das amostras de BZ-3 e MCO recebidas como matrias-primas para as formulaes. BZ-3 MCO Teor 100,1% + 3,7 96,8% + 1,8

5.6 RELAO DOS TEORES DE BZ-3 E DE FOSFOLIPDIOS NOS LIPOSSOMAS COM AS QUANTIDADES INICIAIS

Os lipossomas do tipo VML possuem a capacidade de incorporao de substncias lipoflicas entre 5 e 20% em relao ao total de lipdios (NEW, 1997). O primeiro passo foi descobrir a proporo de BZ-3 e fosfolipdios que permitisse o maior percentual de incluso do filtro solar. Assim sendo, os primeiros lipossomas preparados possuam 8,1mM de BZ-3. Aps a retirada do material no encapsulado, ocorreu uma queda em torno de 42% do total de filtro adicionado e uma queda de 15% dos fosfolipdios que indica uma perda do material de formao das lamelas dos lipossomas ou uma diluio do material recolhido da coluna (TABELA 14). A partir da, optou-se pelo preparo dos lipossomas com duas concentraes de BZ-3: 5,4mM e 10,8mM. Analisando os lipossomas com 10,8mM de BZ-3, a queda da quantidade de BZ-3 inicial ficou em torno de 62% e de fosfolipdios 13%. Os resultados para a concentrao de 5,4mM de BZ-3 apontaram uma queda menor de BZ-3 em torno de 30% e uma queda de 54% dos fosfolipdios. Estes resultados indicaram que a quantidade ideal de BZ-3 a ser incorporada nos lipossomas estava entre 5,4mM e 8,1mM. Assim sendo, foi preparado um lipossoma com 7,0mM de BZ3. Os resultados para esta preparao indicaram uma queda de 45% na quantidade

de BZ-3 e sem alteraes na quantidade de fosfolipdios. Comparando os lipossomas produzidos com 5,4; 7,0 e 8,1mM, os lipossomas com 5,4mM de BZ-3 tiveram o maior percentual final de filtro em torno de 70% encapsulado, porm transformando o percentual em mg de BZ-3, obtm-se uma quantidade menor de filtro presente que a encontrada para os lipossomas preparados com 7,0mM e com 8,1mM de BZ-3.

TABELA 14: Valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas preparados com 48 h de hidratao do filme lipdico. Fraes BZ-3 5,4mM BZ-3 7,0mM BZ-3 8,1mM BZ-3 10,8mM Ensaios separadas (%) (n = 3) (%) (n = 3) (%)(n = 3) (%) (n = 3) Sem filtrar Aps Teor de filtro membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 Sem filtrar Aps Teor de fosfolipdio membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 56,1 + 4,4 103 + 5,1 86,6 + 2,9 87,2 + 3,2 73,9 + 10,7 108 + 10,2 * 100 + 9,4 71,5 + 0,7 87,2 + 11,7 55,7 + 2,4 110 + 8,7 57,8 + 0,9 103 + 7,1 37,6 + 2,0 102 + 7,2 86,2 + 0,6 69,5 + 0,7 61,7 + 1,4 60,8 + 1,9 100 + 2,7 86,6 + 2,8 88,7 + 9,1 97,2 + 5,1

*Houve perda das amostras durante a anlise. Aps obteno dos resultados, verificou-se que os lipossomas preparados com 8,1mM de BZ-3 apresentaram os melhores resultados seguidos pelos preparados com 7,0mM de BZ-3. Porm, em ambos ocorreram quedas substanciais da quantidade de BZ-3 inicial em torno de 30% em relao a frao sem filtrar. Tal perda poderia inviabilizar a aplicao de lipossomas contendo a BZ-3 em novas

formulaes. A deciso sobre qual seria a melhor concentrao da BZ-3 ocorreu na relao entre tempo de hidratao do filme lipdico e quantidade de BZ-3 encapsulada. Quanto aos mtodos, a determinao do teor de BZ-3 nas diferentes fraes por espectrofotometria no UV e utilizando a curva-padro preparada, foi rpido, de fcil realizao e apresentou boa reprodutibilidade. O mtodo de Bartlett para determinao dos fosfolipdios foi muito mais complexo e susceptvel a contaminaes. Cada ensaio necessitou do preparo de uma curva-padro e de 3 amostras em branco para minimizar as variaes das condies do ensaio. Alm disso, cada frao foi analisada em triplicata. Todas estas precaues tinham o objetivo de tornar os resultados obtidos mais precisos e exatos.

5.7 RELAO ENTRE O TEMPO DE HIDRATAO E A QUANTIDADE DE BZ-3 ENCAPSULADA

No preparo dos lipossomas pelo mtodo de hidratao do filme fosfolipdico, a etapa de hidratao onde ocorre a formao das vesculas a etapa limitante do processo que definir a incorporao da BZ-3. No foi descrita at o momento uma comparao que indique qual a melhor maneira de realizar essa hidratao. No presente estudo, a hidratao por 48 horas a 4 oC foi utilizada seguindo estudo anterior de incorporao do MCO em lipossomas (GARCIA, 1998). Foi testado ento o aumento do tempo de hidratao passando para 96 horas a 4
o

C. Foram

preparados lipossomas com 7,0mM e 8,1mM de BZ-3, concentraes nas quais com 48h de hidratao do filme lipdico, se observou uma perda da BZ-3 j na frao sem

filtrao. Os resultados indicaram um aumento significativo do percentual de filtro encapsulado nos lipossomas preparados com 7,0mM de BZ-3, enquanto os resultados para 8,1mM se mantiveram (TABELA 15). A perda da quantidade inicial de BZ-3 passou para 10%, aps passagem pela coluna e com uma perda de 15% dos fosfolipdios. A preparao dos lipossomas com 7,0mM de BZ-3 foi realizada em triplicata e para cada uma delas os ensaios foram realizados em triplicata. O aumento do tempo de hidratao pode ter permitido uma formao de um maior nmero de vesculas, com liberao de todo filme fosfolipdico aderido no balo.

TABELA 15: Comparao entre os valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas preparados com 48h e 96h de hidratao do filme lipdico. Fraes BZ-3 7,0mM BZ-3 7,0mM BZ-3 8,1mM BZ-3 8,1mM Ensaios separadas 48h (n = 3) 96h (n = 9) 48h (n = 3) 96h (n = 3) Sem filtrar Aps Teor de filtro membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 Sem filtrar Aps Teor de fosfolipdio membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 103% + 5,1 74,4% + 3,8 86,6% + 2,9 77,5% + 0,7 108% + 10,2 80,3% + 0,3 * 83,9% + 10,2 55,7% + 2,4 110% + 8,7 91,6% + 4,4 89,2% + 0,9 57,8% + 0,9 103% + 7,1 54,7% + 0,7 109% + 10,7 69,5% + 0,7 95,2% + 4,8 61,7% + 1,4 61,3% + 0,7 86,6% + 2,8 103% + 5,2 88,7% + 9,1 99,0% + 0,7

*Houve perda das amostras durante a anlise.

5.8 RELAO ENTRE O MTODO DE PREPARO DOS LIPOSSOMAS E A QUANTIDADE DE BZ-3 ENCAPSULADA

O mtodo do pr-lipossoma se mostra inferior ao de hidratao do filme lipdico quando se trabalha com uma substncia slida lipoflica (HENRIQUES, 2005). Para confirmar se isto se aplica tambm a BZ-3, foi realizada a comparao dos dois mtodos para a incorporao da BZ-3. Os resultados obtidos (TABELA 16) confirmaram a indicao de que substncias slidas lipoflicas, no caso a BZ-3, possuem uma encapsulao superior com o mtodo de hidratao do filme fosfolipdico do que com o mtodo de pr-lipossoma.

TABELA 16: Comparao entre os valores de teor de BZ-3 e fosfolipdios nos lipossomas obtidos pelo mtodo de hidratao do filme lipdico e pelo mtodo do pr-lipossoma. BZ-3 7,0mM BZ-3 7,0mM Ensaios Fraes separadas Sem filtrar Teor de filtro Aps membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 Sem filtrar Teor de fosfolipdios Aps membrana de 0,2 m Aps coluna G-50 hidratao do filme lipdico (n = 9) (%) 103 + 5,2 95,2 + 4,8 91,6 + 4,4 89,2 + 0,9 80,3 + 0,3 74,4 + 3,8 pr-lipossoma (n = 3) (%) 75,2 + 5,5 72,5 + 1,7 65,0 + 1,3 94,4 + 2,6 89,3 + 3,5 77,1 + 0,6

5.9 VISUALIZAO DOS LIPOSSOMAS POR MICROSCOPIA PTICA

As diferentes fraes de lipossomas preparados com a BZ-3 a 7,0mM com 96h de hidratao foram observadas no microscpio ptico. A frao sem filtrar confirmou a formao e apresentou vesculas de tamanhos variados e de fcil identificao, o que era esperado j que nesta frao as vesculas ainda no passaram por processos de normalizao de tamanho. Foi evidente que as vesculas tendem a se agrupar formando grandes aglomerados e possuem uma grande mobilidade na lmina dificultando a visualizao da forma. Nas fraes aps membrana de 0,2 m e aps coluna G-50, ocorreu um aumento da populao de vesculas que passaram a apresentar um tamanho mais uniforme e muito menor comparando-se frao sem filtrar. A diminuio do tamanho dos lipossomas dificultou muito a visualizao pelo microscpio ptico mesmo em seu maior aumento (1000x com leo de imerso), alm disso os lipossomas passaram a se movimentar intensamente tornando-se difcil a fixao na lmina e a focalizao das imagens.

FIGURA 28: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao sem filtrar. Aumento 1000x, leo de imerso, seta vermelha indica as vesculas.

FIGURA 29: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps membrana de 0,2 m. Aumento 1000x, leo de imerso, setas vermelhas indicam as vesculas.

FIGURA 30: Foto microscopia ptica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna G-50. Aumento 1000x, leo de imerso, setas vermelhas indicam as vesculas.

5.10 VISUALIZAO DOS LIPOSSOMAS POR MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO

Comparada microscopia ptica, a MET permite aumentos muito maiores e uma fixao superior do material. Essas caractersticas tornam a MET ideal para a visualizao dos lipossomas nas fraes aps normalizao dos tamanhos e passagem pela coluna G-50. O processo de preparo da amostra, pelo mtodo da gota e colorao negativa usando soluo de fosfotungstato de potssio (PTK) a 2% (p/v), foi rpido e de fcil realizao. O principal problema encontrado foi a baixa fixao das vesculas na tela de suporte e uma aglomerao das vesculas nas bordas da tela, possivelmente devido a tenso superficial da gota em cima da tela. As imagens demonstraram vesculas levemente deformadas possivelmente devido ao processo de preparo da amostra. Os aumentos maiores propiciaram imagens que demonstram nitidamente as vesculas formadas e uma regularidade nos seus tamanhos.

FIGURA 31: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna G-50. (Aumento 80000x)

FIGURA 32: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna G-50. (Aumento: 80000x)

FIGURA 33: Micrografia eletrnica dos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna G-50. (Aumento 25000x)

5.11 DETERMINAO DO TAMANHO DOS LIPOSSOMAS POR ESPALHAMENTO DA LUZ LASER

Os lipossomas preparados com a BZ-3 a 7,0mM e os preparados com MCO a 10,8mM tiveram seus tamanhos determinados utilizando espalhamento da luz laser. Avaliando os resultados para os lipossomas com a BZ-3 a 7,0mM (FIGURAS 34, 35 e 36), a frao sem filtrar demonstrou partculas com tamanho variando de 3512nm at 22807nm, 69,4% da populao com 6178,4nm + 2667,5 e 30,6% com 18390,7nm + 4198,2. Para a frao aps filtrao por membrana de 0,2 m a variao de dimetro ficou entre 165 nm e 1070 nm, bem abaixo da encontrada antes da filtrao, 61,5% da populao teve 237,2nm + 116,8 e 29,2% ficou com 447,2nm + 157,2. Estes valores indicam um bom processo de filtrao e colocam as vesculas dentro da faixa ideal de tamanho para lipossomas do tipo VML. Na frao aps coluna G-50, a variao de dimetro ficou entre 149 nm e 942 nm. Cerca de 100% da populao ficou com 367,5nm + 374,7 indicando que a passagem das vesculas pela coluna de Sephadex G-50 contribui para a normalizao do tamanho e no altera de maneira indesejvel os lipossomas.

25

20

% (populao)

15

10

0 3512 4163 4935 5850 6934 8220 9744 11551 13692 16231 19240 22807

Dimetro (nm)

FIGURA 34: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao sem filtrar.

16 14

% (populao)

12 10 8 6 4 2 0 165 195 231 274 325 386 457 542 642 761 902 1070

Dimetro (nm)
FIGURA 35: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps filtrar em membrana de 0,2 m.

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

% (populao)

149

188

237

298

375

472

594

748

942

Dimetro (nm)
FIGURA 36: Tamanho das partculas nos lipossomas com BZ-3 a 7,0mM - frao aps coluna Sephadex G-50 Para os lipossomas preparados com MCO a 10,8mM (FIGURAS 37, 38 e 39), a frao sem filtrar apresentou vesculas com dimetro variando de 112 nm a 1124 nm, 67,2% da populao teve um dimetro de 183,8nm + 114,7; um valor bem abaixo do encontrado para os lipossomas preparados com a BZ-3. Como os lipossomas com BZ-3 foram preparados pelo mtodo de hidratao do filme lipdico e os lipossomas contendo MCO foram preparados pelo mtodo do pr-lipossoma, talvez haja uma relao entre o mtodo de preparo e o tamanho dos lipossomas obtidos. O tamanho menor dos lipossomas formados pelo mtodo do pr-lipossoma poderia ainda explicar o motivo pelo qual a BZ-3 que slida teve uma encapsulao menor neste mtodo comparado ao de hidratao do filme lipdico. Novas pesquisas devem ser realizadas para elucidar esta relao. Na frao aps filtrao pela membrana de 0,2 m, o dimetro variou de 146 nm a 799 nm e 64,7% apresentou dimetro de 226,5nm + 111,4; indicando que o processo de filtrao foi

eficaz, porm no houve uma alterao muito grande comparando-se a frao sem filtrar, pois os lipossomas j estavam com dimetro bem reduzido. Na frao aps coluna, o dimetro variou entre 146 nm e 802 nm, quase idntico ao encontrado para a frao aps membrana, indicando que a passagem dos lipossomas pela coluna no causa alteraes indesejveis no formato das vesculas, 49,1% da populao apresentou dimetro de 222,2nm + 76,6 e 50,9% teve 426,7nm + 200,9; demonstrando que a grande maioria da populao estava com dimetro na faixa esperada.

30 25

% (populao)

20 15 10 5 0 112 141 178 224 282 355 447 563 709 893 1124

Dimetro (nm)
FIGURA 37: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao sem filtrar.

25 20

% (populao)

15 10 5 0

146 173 205 243 288 342 405 480 569 674 799

Dimetro (nm)
FIGURA 38: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao aps filtrar em membrana de 0,2 m.

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 146 173 206 244 289 342 406 481 570 676 802

% (populao)

Dimetro (nm)
FIGURA 39: Tamanho das partculas nos lipossomas com MCO a 10,8mM - frao aps coluna Sephadex G-50.

5.12 AVALIAO DAS FORMULAES PREPARADAS

A escolha de uma formulao em gel para incorporao dos lipossomas no foi ao acaso. A trama tridimensional do gel permite uma disperso melhor dos lipossomas evitando aglomeraes. A escolha de um gel aquoso permite equilibrar a constituio leo : gua, tendo uma formulao com menor capacidade oclusiva da pele e melhor espalhamento (ANSEL, 1999). Por no utilizar lipdios alm dos fornecidos pelos lipossomas, no haveria interferncias causadas por interao dos lipossomas com outros componentes lipdicos. A escolha da hidroxietilcelulose (natrosol) como polmero espessante, permitiu obter um gel no inico incapaz de interagir com os lipossomas. Durante 3 meses aps o preparo, todas as formulaes se demonstraram visualmente estveis.

5.13 DETERMINAO DO FPS in vitro DAS FORMULAES

O FPS in vitro das formulaes foi determinado pelo mtodo de Mansur. Este mtodo se mostrou rpido, de fcil execuo e apresentou resultados com pequeno desvio padro. Foi realizado um acompanhamento do FPS in vitro durante 3 meses (TABELA 17) para avaliar se ocorria alguma variao no FPS que pudesse ser relacionada com a estabilidade, principalmente relacionada ao MCO por ser muito lbil.

TABELA 17: Valores de FPS in vitro das trs formulaes em gel preparadas. FPS FPS FPS FPS Formulaes no preparo 1 ms 2 meses 3 meses Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios 18,5 + 0,3 19,0 + 0,02 18,5 + 0,2 18,0 + 0,3 19,2 + 0,9 19,0 + 0,4 15,5 + 0,6 18,9 + 0,1 18,8 + 0,8 15,3 + 0,7 18,7 + 0,5 19,0 + 0,3

Os valores de FPS logo aps o preparo foram iguais para os 3 geles, demonstrando que o mtodo empregado no detectou diferena entre a incorporao dos filtros nos lipossomas ou deix-los livres na formulao. Isto pode ser explicado pelo preparo da amostra para leitura no espectrofotmetro, em que a amostra diluda em etanol P.A. o que levar ao rompimento dos lipossomas. Alm disso, todos ficaram prximos de 20 que era o FPS esperado. Aps 1 ms do preparo no houve alteraes apreciveis nos valores de FPS das trs formulaes, indicando uma manuteno da estabilidade. Aps 2 meses de preparo foi observada uma queda no FPS do gel contendo os filtros livres de 16,2%, queda esta que no foi observada nas outras duas formulaes. Aps 3 meses do preparo, o FPS do gel contendo os filtros livres apresentou uma queda de 17,3% em relao ao inicial e no foi observada queda nos valores de FPS das outras duas formulaes, indicando que a presena dos fosfolipdios, mesmo no formando lipossomas, pode contribuir na manuteno da estabilidade da combinao de filtros utilizada. Estes resultados foram confirmados atravs do Teste t de Student (TABELA 18) utilizado para montar uma comparao entre o FPS no preparo e aps 3 meses de todas as formulaes (NETO et al., 2002).

TABELA 18: Resultados do Teste t utilizado para comparar o FPS inicial com o FPS aps 3 meses das formulaes. t calculado t tabelado (t tab ) Formulaes Situao Concluso (t calc ) (p = 0,05) Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios 7,098 0,842 |-2,525| 2,132 2,132 2,776 t calc > t tab t calc < t tab |t calc | < t tab
H diferena No h diferena No h diferena

5.14 DETERMINAO DO FPS in vivo DAS FORMULAES

A determinao do FPS in vivo das formulaes poderia demonstrar diferenas entre o gel com os filtros livres e aquele com os filtros inclusos nos lipossomas. Isto porque na determinao in vivo do FPS, no h o rompimento dos lipossomas e pode-se verificar a interao entre lipossomas e estrato crneo. Os valores de FPS a seco (TABELA 19) obtidos para os voluntrios no seguiram uma distribuio normal (p = 0,05) impedindo o uso do teste t de Student para comparao dos resultados. Para anlise estatstica foi utilizado o teste no paramtrico de Mann-Whitney (NETO et al., 2002). O FPS obtido para o gel com os filtros livres demonstrou ser estatisticamente diferente do FPS para o gel com os lipossomas (p = <0,001) e tambm para o gel com fosfolipdios dispersos (p = <0,001). Os valores de FPS a seco obtidos para as formulaes contendo fosfolipdios ficaram prximos do valor esperado (FPS 20) e no indicaram diferena estatstica entre a presena dos lipossomas e a simples disperso dos fosfolipdios na formulao (p = 0,05).

TABELA 19: Valores de FPS in vivo a seco das trs formulaes em gel preparadas. Produto Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios . FPS mdio 13,5 + 1,5 20 + 2,4 20,5 + 1,8 n 20 20 20 Intervalo de confiana Superior 14,2 21,1 21,4 Inferior 12,8 18,9 19,6

5.15 COMPARAO DO FPS in vitro COM O FPS in vivo A SECO

O FPS in vivo a seco igual a 13,5 obtido para o gel com os filtros solares livres demonstrou uma queda de 27% em relao ao FPS 18,5 obtido inicialmente pelo mtodo in vitro. Tambm representa uma queda de 11,8% em relao ao FPS 15,3 encontrado aps 3 meses de preparo pelo mtodo in vitro. Tal queda pode indicar uma degradao maior dos filtros no perodo entre o preparo da formulao e a realizao do teste in vivo (1 ms e 20 dias) ou uma degradao causada pela irradiao do mtodo in vivo. A comparao entre os FPS obtidos in vitro e in vivo a seco foi realizada pelo teste de Mann-Whitney por dois motivos: os valores de FPS in vivo no seguem uma distribuio normal de pontos e existe uma diferena muito grande entre o tamanho da amostra dos mtodos (n = 20, in vivo e n = 3, in vitro). Os resultados (TABELA 20) indicaram diferena significante apenas para a formulao com filtros livres, o que possa ser explicado pela rpida degradao dos filtros nesta formulao. Descartando a formulao com filtros livres, pode-se observar uma boa correlao entre os demais resultados in vitro e in vivo, indicando que o mtodo de determinao de FPS in vitro descrito por Mansur (MANSUR et al., 1986) pode ser

utilizado como um ensaio preliminar evitando os complexos procedimentos e custos mais altos do teste in vivo.

TABELA 20: Comparao dos valores de FPS in vivo e in vitro das trs formulaes. FPS in vitro FPS in vivo Teste de Produto 3 meses a seco Mann-Whitney Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios 15,3 + 0,7 18,7 + 0,5 19,5 + 0,1 13,5 + 1,5 20 + 2,4 20,5 + 1,8 H diferena No h diferena No h diferena

5.16 DETERMINAO DO FPS in vivo APS IMERSO EM GUA RESISTNCIA GUA

A determinao do FPS aps imerso em gua (TABELA 21) um dos ensaios que podem demonstrar diferenas entre o gel com os filtros livres, o gel contendo os lipossomas e o gel contendo fosfolipdios dispersos, isto porque esperase uma capacidade maior dos lipossomas de interagir e penetrar no estrato crneo. Outra informao que pode ser obtida deste ensaio a verificao de que os lipossomas e/ou fosfolipdios aumentam a resistncia gua dos filtros comparandose a uma formulao convencional.

TABELA 21: Valores de FPS in vivo das trs formulaes em gel preparadas aps imerso na gua. Produto Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios FPS mdio 12,1 + 1,1 17,9 + 1,9 17,7 + 1,1 n 20 20 20 Intervalo de confiana Superior 12,6 18,8 18,2 Inferior 11,5 17,0 17,2

Fazendo a comparao entre o FPS encontrado a seco e aps imerso em gua (TABELA 22), o gel com filtros livres teve uma queda de 10,4%. As formulaes contendo fosfolipdios tambm tiveram quedas prximas a este valor. Dessa forma, nas formulaes testadas a presena de fosfolipdios livres ou como lipossomas teve maior influncia na manuteno da estabilidade dos filtros solares do que na resistncia da formulao gua. A anlise estatstica pelo teste no paramtrico de Mann-Whitney indicou uma diferena significante entre o FPS a seco e o FPS aps imerso em gua nas 3 formulaes. Este teste indica se h ou no diferena, porm no mede esta diferena o que impede uma comparao sobre qual produto seria mais resistente gua.

TABELA 22: Comparao entre o FPS in vivo a seco e aps imerso na gua para avaliao da resistncia gua. Produto Gel + filtros livres Gel + filtros lipossomados Gel + filtros + fosfolipdios FPS a seco 13,5 + 1,5 20 + 2,4 20,5 + 1,8 FPS aps imerso 12,1 + 1,1 17,9 + 1,9 17,7 + 1,1 Queda (%) 10,4 10,5 13,6

6 CONCLUSO Os lipossomas preparados com BZ-3 a 7,0mM e a 8,1mM apresentaram resultados satisfatrios e semelhantes quando preparados com 48h de hidratao do filme fosfolipdico. Os lipossomas preparados com BZ-3 a 7,0mM e 96h de hidratao do filme fosfolipdico obtiveram os melhores resultados quando comparados aos demais. O mtodo de hidratao do filme lipdico se mostrou percentual de encapsulao superior ao de agitao do pr-lipossoma para o preparo dos lipossomas contendo BZ-3 a 7,0mM. A visualizao microscpica dos lipossomas confirmou a formao das vesculas, demonstrou a grande diferena de tamanho e forma das fraes antes e aps filtrao e indicou a ausncia de cristais insolveis de BZ-3. A determinao do tamanho dos lipossomas demonstrou que ao final dos processos de filtrao e retirada do material no incluso, os lipossomas obtidos estavam dentro da faixa pretendida (em torno de 300nm). As formulaes em gel escolhidas se mostraram compatveis com todos os componentes utilizados no havendo alterao do aspecto visual aps 3 meses do preparo. A formulao contendo os filtros solares livres teve uma queda confirmada estatisticamente entre o FPS in vitro inicial e o aps 3 meses, demonstrando uma degradao dos filtros solares. Esta queda no ocorreu nas formulaes contendo fosfolipdios dispersos ou lipossomas, indicando uma ao protetora bastante eficaz da PC contra a degradao dos filtros solares utilizados. Devido a esta degradao, as comparaes utilizando o gel com os filtros solares livres tornam-se incertas.

A comparao estatstica entre o FPS obtido pelo mtodo in vivo e pelo mtodo in vitro dos 2 produtos testados que continham fosfolipdios (dispersos ou lipossomas) indicou uma boa correlao entre eles. Desta forma, o emprego do mtodo in vitro mostra-se muito interessante principalmente como um ensaio preliminar do desenvolvimento galnico; A avaliao da resistncia gua (40 min de imerso) no indicou diferenas estatisticamente significativas entre as formulaes.

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