Bastos Reinaldo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

REA DE CONCENTRAO:
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLGICOS

TRANSFERNCIA DE OXIGNIO NO CULTIVO EM ESTADO
SLIDO DE Drechslera (Helminthosporium) monoceras

Reinaldo Gaspar Bastos
Autor

Prof
a
Dr
a
Maria Helena Andrade Santana
Orientadora

Tese de doutorado apresentada Faculdade de Engenharia Qumica da
Universidade Estadual de Campinas como requisito final para obteno do ttulo de
Doutor em Engenharia Qumica

Campinas, 2006

ii

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA REA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

B297t

Bastos, Reinaldo Gaspar
Transferncia de oxignio no cultivo em estado
slido de Drechslera (Helminthosporium) monoceras /
Reinaldo Gaspar Bastos.--Campinas, SP: [s.n.], 2006.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana.
Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Engenharia Qumica.

1. Engenharia bioqumica. 2. Oxignio -
Transferncia. 3. Fungos - Crescimento. I. Santana,
Maria Helena Andrade. II. Universidade Estadual de
Campinas. Faculdade de Engenharia Qumica. III.
Ttulo.

Titulo em Ingls: Oxygen transfer in solid state cultivation of Drechslera
(Helminthosporium) monoceras
Palavras-chave em Ingls: Solid state cultivation, Oxygen transfer,
Drechslera
rea de concentrao: Desenvolvimento de Processos Biotecnolgicos
Titulao: Doutor em Engenharia Qumica
Banca examinadora: Leda dos Reis Castilho, Ranulfo Monte Alegre, Silvio
Roberto Andrietta e Salah Din Mahmud Hasan.
Data da defesa: 18/12/2006
Tesede Doutorado defendida por Reinaldo Gaspar Bastos e aprovada em 18 de
dezembrode 2006 pela banca examinadora constituda pelos doutores:
JUUi,1.!'l1 )Qjffio,
Prof DraMaria Helena Andrade Santana (orientadora)
~
Prof D~ Leda dos Reis Castilho
~rLdkJ
Profo DroSilvio Roberto Andrietta
~~
. Profo DroSalah Din Mahmud Hasan
+
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jjj

iv

v

Este exemplar corresponde a verso final da tese de doutorado em
Engenharia Qumica.

____________________________________

Prof
a
Dr
a
Maria Helena Andrade Santana
.

vi
AGRADECIMENTOS

Agradeo professora Maria Helena Andrade Santana pela sua
orientao sempre eficiente e pela amizade sincera que cultivamos durante estes
anos de convivncia harmoniosa.
Aos colegas do Laboratrio de Desenvolvimento Processos
Biotecnolgicos (DPB/FEQ/UNICAMP) Adriano, Aline, Amanda, Ana Paula, Andr,
Beatriz, Christiane, Christine, Classius, Cludia, Elaine, Fernanda, Fernando,
Giuliana, Humberto, Luciana, Lucimara, Pablo, Patrcia, Rafaela, Raquel, Salah,
Tatiana e Thas, pelos momentos que passamos juntos e pelo aprendizado que
tive com eles.
Aos amigos do laboratrio Ams e Gilson, pela amizade, companheirismo
e por todos os momentos de descontrao que passamos.
Kelly, Andra e Aline do Laboratrio de Recursos Analticos e de
Calibrao (LRAC/FEQ/UNICAMP) pelas micrografias, pela anlise de
fisioadsoro e granulometria no Mastersizer S (Malvern).
Ao Laboratrio de Interao Molecular e Bioengenharia
(LIMBio/FEQ/UNICAMP), em particular ao colega Igor pela sua ajuda no SDS-
Page.
Ao Prof. Dr. Walderez Gamabale (ICB/USP), pelo fornecimento da cepa
de D. monoceras.
Ao Departamento de Processos Biotecnolgicos da Faculdade de
Engenharia Qumica da UNICAMP.
Ao pessoal de Guarapuava/PR, em especial ao Departamento de
Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste
(DEALI/UNICENTRO), pelo incentivo qualificao do seu quadro docente.
A todos que participaram e de alguma forma contriburam no
desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus familiares, pelo incentivo.
Mariana pelo seu amor, carinho e companheirismo durante todos esses
anos, e ao Murilo, por ter surgido na minha vida.
A Aquele, responsvel por tudo.

vii
RESUMO

O cultivo em estado slido tem merecido expressiva ateno nos ltimos anos
pelas vantagens oferecidas principalmente nos processos que envolvem fungos
filamentosos. Entretanto, o interesse pelos fenmenos de transferncia de massa
e pelo desempenho de biorreatores objeto de estudos mais recentes, motivado
pelo escalonamento dos processos. Nesse contexto, o presente trabalho tem
como objetivo estudar a transferncia de oxignio no processo de produo de
protenas alergnicas obtidas da biomassa de Drechslera (Helminthosporium)
monoceras por cultivo em estado slido em colunas de leito fixo com farelo de
trigo e espuma de poliuretano. Os resultados indicam que vazes de ar da ordem
de 1L/min e 30mm de altura de leito de partculas mantm a umidade inicial do
meio slido praticamente constante para farelo de trigo. Essas condies
asseguram os melhores valores de K
L
as, alm de minimizar a compactao do
leito, permitir o crescimento na fase area e assegurar a ausncia de gua livre
durante o processo. O cultivo em espuma de poliuretano apresenta produo de
protenas superior aos ensaios com farelo de trigo devido manuteno das
propriedades fsicas da matriz slida inerte. Foram identificadas protenas na faixa
de 15 a 139kDa para ensaios em farelo de trigo e 11 a 244kDa sobre espuma de
poliuretano, sendo que as fraes indicadas como mais alergnicas 14,4, 36 e
60kDa foram encontradas para os dois tipos de suportes. Estes resultados
mostram que condies selecionadas de vazo de ar, altura de leito e suporte
slido preservam a ausncia de gua livre no cultivo em estado slido,
aumentando a produo das protenas alergnicas e facilitando o controle do
processo.

Palavras-chave: cultivo em estado slido, transferncia de oxignio, Drechslera
(Helminthosporium) monoceras

viii
ABSTRACT

In recent years, a resurgence of interest in solid-state cultivation has been
observed due to its numerous advantages, mainly concerning the growth of
filamentous fungi. However, studies on the oxygen transfer and performance of
bioreactors are still scarce. The main difficulties faced by process scale-up are the
control of parameters and limiting oxygen transfer. The aim of this research was to
study the oxygen transfer for the production of allergenic proteins from the biomass
of Drechslera (Helminthosporium) monoceras cultured on wheat bran and
polyurethane foam. Results indicated that flow rates about 1L/min and 30mm of
bed height lead to the best values of overall oxygen transfer coefficient (K
L
a) on
wheat bran, showing no substrate bed packing and formation of aerial hyphae,
maintaining the characteristics of solid state cultivation. Evaluation of polyurethane
foam showed high protein production, without changing the physical properties of
support. SDS-Page assays identified proteins from crude extract in an approximate
range of 15 to 139kDa and 11to 244kDa for polyurethane foam and for wheat bran,
respectively. The pool of proteins obtained includes the molecular masses,
identified in previous works, as the most allergenic fractions (14,4, 36 and 60kDa)
These results show that selected conditions of air-flow rate, bed height and solid
support preserve the absence of free water in solid state cultivation, increasing the
production of allergenic proteins and facilitating the control of the process.

Key-words: solid state cultivation, oxygen transfer, Drechslera (Helminthosporium)
monoceras

ix
SUMRIO

AGRADECIMENTOS......................................................................................................... II
RESUMO......................................................................................................................... VII
ABSTRACT .................................................................................................................... VIII
SUMRIO......................................................................................................................... IX
NDICE DE FIGURAS...................................................................................................... XII
NDICE DE TABELAS....................................................................................................XVII
NOMENCLATURA........................................................................................................XVIII
1 INTRODUO................................................................................................................ 1
2 OBJETIVO...................................................................................................................... 5
3 REVISO BIBLIOGRFICA............................................................................................ 7
3.1 Cultivo em estado slido........................................................................................... 7
3.2 Transferncia de massa nos cultivos em estado slido............................................. 9
3.3 Transferncia de oxignio....................................................................................... 15
3.3.1 Caracterizao da transferncia de oxignio .......................................................... 18
3.4 Tipos de biorreatores .............................................................................................. 21
3.5 Suportes para processos em estado slido............................................................. 27
3.6 Determinao da concentrao celular no cultivo em estado slido........................ 32
3.6 Extratos alergnicos................................................................................................ 35
3.7 Extratos alergnicos de Drechslera (Helminthosporium) monoceras ...................... 36
4 MATERIAIS E MTODOS............................................................................................ 37
4.1 Materiais ................................................................................................................. 37
4.2 Caracterizao dos suportes................................................................................... 37
4.2.1 Densidade e porosidade dos suportes .............................................................. 37
4.2.2 rea superficial dos suportes ............................................................................ 38
4.2.3 Anlise granulomtrica...................................................................................... 38
4.3 Preparo do inculo.................................................................................................. 39
4.3.1 Manuteno das culturas .................................................................................. 39
4.3.2 Pr-cultivo................................................................................................................. 39
4.4 Caracterizao dos cultivos em estado slido em colunas de Raimbault ................ 41

x
4.5 Cultivos em estado slido com farelo de trigo......................................................... 42
4.6 Cultivos sobre suporte inerte................................................................................... 44
4.7 Obteno do extrato fngico bruto..................................................................... 45
4.8 Anlises.......................................................................................................... 45
4.8.1 Contedo de umidade do suporte slido ......................................................... 45
4.8.2 pH do meio slido ......................................................................................... 46
4.8.3 Teor de protena no extrato bruto fngico........................................................ 46
4.8.4 Teor de acares redutores no extrato bruto fngico........................................ 46
4.8.5 Rendimento de glicose em protenas.............................................................. 47
4.8.6 Caracterizao das protenas por SDS-PAGE................................................. 47
4.9 Determinao do coeficiente global de transferncia de oxignio........................... 48
4.10 Estimativas da concentrao celular ..................................................................... 52
4.10.1 Demanda de oxignio.................................................................................. 52
4.10.2 Grau de empacotamento do meio slido ....................................................... 53
4.10.3 Balano do grau de reduo ........................................................................ 53
4.10.4 Balano do contedo de gua no meio slido................................................ 54
5 RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................................... 57
5.1 Caracterizao dos suportes slidos e dos seus leitos ........................................... 57
5.1.1 Densidade aparente e porosidade dos leitos ................................................... 57
5.1.2 rea superficial, tamanho e volume de poros dos suportes .................................... 66
5.1.3 Dimetro mdio do farelo de trigo........................................................................... 67
5.2 Inculo.................................................................................................................... 70
5.3 Cultivo em estado slido em colunas de leito fixo ................................................... 71
5.4 Estabelecimento dos nveis de vazo de ar e altura de leito - Ensaios na ausncia
de microrganismos................................................................................................ 76
5.4.1 Cultivo em estado slido................................................................................ 77
5.4.1.1 Influncia da altura do leito e vazo de ar..................................................... 77
5.4.1.2 Influncia da altura de leito vazo de ar 1L/min.......................................... 83
5.4.1.3 Influncia da vazo de ar para altura de leito 30 mm........................................ 86
5.5 Influncia da umidade inicial do meio slido e tamanho de partcula .................... 93
5.6 Avaliao da transferncia de oxignio em coluna de leito fixo com maiores
dimenses .................................................................................................................. 106
5.7 Avaliao da transferncia de oxignio em cultivos sobre suporte inerte.............. 112

xi
5.8 Caracterizao das protenas produzidas por eletroforese SDS-PAGE ................ 123
5.9 Estimativa da biomassa celular.................................................................. 127
6 CONCLUSES........................................................................................................... 135
7 SUGESTES ............................................................................................................. 137
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................ 139
ANEXOS........................................................................................................................ 148
ANEXO I Perfil de concentrao de oxignio no filme lquido ..................................... 148
ANEXO II Curvas-padro e de calibrao................................................................... 151
ANEXO III Correlaes............................................................................................... 154
ANEXO IV Isotermas de BET para os suportes inertes............................................... 156
ANEXO V Distribuio de tamanho de partculas ....................................................... 159
ANEXO VI Perfis de umidade do meio slido, protena e glicose do extrato fngico,
rendimento de glicose em protenas e taxa de transferncia de oxignio para diferentes
alturas de leito ............................................................................................................... 162

xii
NDICE DE FIGURAS

Figura 3.1II Fenmenos macroscpicos que ocorrem nos biorreatores durante o
crescimento fngico sobre suportes slidos..................................................................... 10
Figura 3.2 Fenmenos microscpicos que ocorrem nos biorreatores durante o cultivo
sobre suportes slidos..................................................................................................... 11
Figura 3.3 Etapas para a adeso de clulas aplicadas na fermentao em estado slido e
crescimento de biofilmes ................................................................................................. 13
Figura 3.4 Modelo de crescimento de fungos filamentosos ............................................. 14
Figura 3.5 Modelo de reao-difuso............................................................................... 15
Figura 3.6 Resistncia ao transporte de oxignio nos cultivos em estado slido ............. 19
Figura 3.7 Biorreatores de mistura e aerao forada.......................................................23
Figura 3.8 Esquema das colunas de leito fixo em escala de laboratrio (colunas de
raimbault)......................................................................................................................... 24
Figura 3.9 Esquema de coluna esterilizvel para escala de laboratrio........................... 24
Figura 3.10 Sistemas em leito fixo e nas condies mnimas de fluidizao.................... 26
Figura 3.11 Representao da perda de matria seca..................................................... 34
Figura 4.1 Sistema de colunas de raimbault apresentando doze colunas em banho
termostatizado ................................................................................................................. 41
Figura 4.2 Sistema de colunas para avaliao da transferncia de oxignio em diferentes
alturas de leito fixo........................................................................................................... 43
Figura 4.3 Unidade experimental para biorreator de coluna (50mm x 320 mm) ............... 43
Figura 4.4 Sistema de coluna com leito de espuma de poliuretano.................................. 44
Figura 4.5 Representao dos mecanismos de transferncia de oxignio nos cultivos em
estado slido ................................................................................................................... 49
Figura 5.1 Fotografias das partculas de 0,35mm do farelo de
trigo.....................................................................................................................................62
Figura 5.2 Fotografias das partculas de 0,59mm do farelo de trigo................................. 63
Figura 5.3 Fotografias da espuma de poliuretano............................................................ 64

xiii
Figura 5.4 Fotografias dos suportes saturados com gua................................................ 65
Figura 5.6 Fotografia do inculo de Drechslera produzido em frascos erlenmeyers
contendo meio gar-czapeck........................................................................................... 70
Figura 5.7 Comportamento da fermentao para a produo de biomassa de D.
monoceras conduzida em colunas de Raimbault com farelo de trigo como substrato para
200 mm de altura de leito ................................................................................................ 72
Figura 5.8 Umidade do meio slido estimada pelo balano de massa e pela medida
experimental .................................................................................................................... 75
Figura 5.9 Perfis axiais de umidade do leito de partculas com vazo de ar de 0,03 e 1
L/min ................................................................................................................................. 76
Figura 5.10 Perfis de umidade do meio slido para diferentes vazes e alturas de leito
(farelo de trigo 0,59mm)................................................................................................... 77
Figura 5.11 Perfis de protena no extrato bruto obtido para diferentes vazes e alturas de
leito (farelo de trigo 0,59mm) ........................................................................................... 78
Figura 5.12 Perfil de glicose no extrato bruto obtido para diferentes vazes e alturas de
leito (farelo de trigo 0,59mm) ........................................................................................... 78
Figura 5.13 Perfis de Y
p/s
nas diferentes condies de vazo de ar e altura de leito (farelo
de trigo 0,59mm).............................................................................................................. 80
Figura 5.14 Perfis das taxas de transferncia de oxignio (N) por volume de slidos no
meio em funo da vazo e altura do leito (farelo de trigo 0,59mm) ................................ 82
Figura 5.15 Perfis das taxas de consumo de oxignio por volume de biofilme nas em
funo da vazo e altura do leito (farelo de trigo 0,59mm) )............................................. 82
Figura 5.16 Perfis de umidade em diferentes alturas de leito (vazo de ar 1l/min; farelo de
trigo 0,59mm)................................................................................................................... 84
Figura 5.17 Perfis de protena no extrato bruto (vazo de ar 1L/min; farelo de trigo
0,59mm) .....................................................................................................................84
Figura 5.18 Perfis de glicose no extrato bruto.................................................................. 84
Figura 5.19 Perfis do rendimento protena/glicose........................................................... 85
Figura 5.20 Perfis da taxa N (vazo de ar 1L/min; farelo de trigo 0,59mm)...................... 86

Figura 5.21 Perfis radiais da concentrao de oxignio dissolvido no filme lquido (altura
de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm) .............................................................................88

xiv
Figura 5.22 Perfis de umidade para diferentes vazes de ar ........................................... 89
Figura 5.23 Perfis da taxa de transferncia de oxignio obtidos para diferentes vazes de
ar ..................................................................................................................................... 89
Figura 5.24 Perfis da taxa de consumo de oxignio por volume de biofilme nas diferentes
vazes de ar (altura de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm)............................................ 90
figura 5.25 Perfis de umidade do substrato slido e protena obtidas a partir do extrato
fngico para cultivos a 0,4 L/min (altura de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm) ............. 91
Figura 5.26 Rendimento de glicose em protena para cultivos a 0,4 L/min (altura de leito
30mm; farelo de trigo 0,59mm) ........................................................................................ 92
Figura 5.27 Perfis de umidade do meio slido com farelo de trigo 0,59mm para diferentes
umidades iniciais ............................................................................................................. 93
Figura 5.28 Perfis de protena no extrato bruto para os cultivos com farelo de trigo
0,59mm a diferentes umidades iniciais ............................................................................ 94
Figura 5.29 Perfis radiais de oxignio dissolvido no biofilme para as diferentes umidades
iniciais do meio slido com farelo de trigo 0,59 mm......................................................... 95
Figura 5.30 Perfis da taxa de transferncia de oxignio para cultivos sobre farelo de trigo
0,59 mm com diferentes umidades iniciais....................................................................... 96
Figura 5.31 Perfil do K
L
a para leito de farelo de trigo 0,59mm com 25% de umidade inicial
........................................................................................................................................ 96
L
a para leito de farelo de trigo 0,59 mm com 35% de umidade inicial
........................................................................................................................................ 97
L
a para leito de farelo de trigo 0,59 mm com 45% de umidade inicial
........................................................................................................................................ 97
Figura 5.34 Fotografias das partculas de farelo de trigo 0,59mm com 11 dias de cultivo a
35% de umidade inicial .................................................................................................... 98
Figura 5.35 Perfis de umidade do meio slido com farelo de trigo 0,35mm para diferentes
umidades iniciais ............................................................................................................. 98
Figura 5.36 Perfis de protenas solveis no extrato bruto para diferentes umidades iniciais
em leitos de farelo de trigo 0,35mm................................................................................. 99
Figura 5.38 Perfis da taxa de transferncia de oxignio para cultivos sobre farelo de trigo
0,35 mm com diferentes umidades iniciais..................................................................... 102

xv
L
a ao longo do biofilme com 25% de umidade inicial do meio slido
de farelo de trigo 0,35 mm............................................................................................. 104
L
a com 35% de umidade inicial do meio slido de farelo de trigo
0,35mm.......................................................................................................................... 104
L
a com 45% de umidade inicial do meio slido de farelo de trigo
0,35 mm......................................................................................................................... 105
Figura 5.50 Fotografias da espuma de poliuretano com 11 dias de cultivo a 45% de
umidade inicial e 0,4L/min de vazo de ar ..................................................................... 112
Figura 5.51 Taxa de transferncia de oxignio ao longo do cultivo em espuma de
poliuretano para todas as condies de umidades iniciais com 0,4L/min de vazo de
ar.......................................................................................................................................113
Figura 5.52 Perfis de K
L
a no cultivo com espuma de poliuretano com 0,4l/min de vazo de
ar em diferentes umidades
iniciais...............................................................................................................................114
Figura 5.53 Perfil de umidade do suporte inerte durante o cultivo com 0,4L/min de vazo
de ar .............................................................................................................................. 115
Figura 5.54 Umidade do meio slido estimada pelo balano de massa e pela medida
experimental para vazo de ar 0,4L/min........................................................................ 116
Figura 5.55 Perfil de protenas no extrato bruto durante o cultivo em suporte inerte
com 0,4L/min de vazo de
ar...........................................................................................................................116
Figura 5.56 Perfil da glicose no extrato bruto durante o cultivo em suporte inerte
com 0,4L/min de vazo de ar................................................................................117
Figura 5.57 Perfil do rendimento no cultivo em suporte inerte com 0,4 L/min de
vazo de ar............................... .........................................................................117
Figura 5.58 Perfil de umidade do meio slido durante o cultivo em espuma de
poliuretano com 1L/min de vazo de ar.................. .........................................118
Figura 5.59 Umidade do meio slido estimada pelo balano de massa e pela
medida experimental para vazo de ar 1L/min............. ..............................119

xvi
Figura 5.60 Perfil de protenas no extrato bruto durante o cultivo com espuma de
poliuretano a 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial ...................................... 119
Figura 5.61 Perfil da glicose no extrato bruto durante o cultivo em espuma de poliuretano
com 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial.................................................... 120
Figura 5.62 Perfil do rendimento do cultivo em espuma de poliuretano com 1l/min de
vazo de ar e 45% de umidade inicial............................................................................ 120
Figura 5.63 Taxa de transferncia de oxignio ao longo do cultivo em espuma de
poliuretano para 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial................................. 121
L
a no cultivo com espuma de poliuretano com 1L/min de vazo de
ar e 45% de umidade inicial ........................................................................................... 122
Figura 5.67 Perfis de oxignio dissolvido para as diferentes concentraes de inculo. 127
Figura 5.68 Relao entre a taxa de consumo de oxignio e concentrao de biomassa
...................................................................................................................................... 129
Figura 5.70 Curva de crescimento em espuma de poliuretano estimada pela demanda de
oxignio (condies de cultivo: umidade inicial 45%, altura de leito 30mm, vazo de ar
0,4L/min)........................................................................................................................ 130
Figura 5.71 Perfil de gs carbnico produzido nos cultivos com suporte inerte e natural131
Figura 5.72 Estimativa da concentrao celular para cultivo com suporte inerte e natural
atravs do balano do grau de reduo......................................................................... 132
Fig. 5.73 Matriz de correlaes das estimativas de biomassa para farelo de trigo......... 133
Fig. 5.74 Matriz de correlaes das estimativas de biomassa para espuma de poliuretano
...................................................................................................................................... 134

xvii
NDICE DE TABELAS

Tabela 5.1 Densidade aparente e porosidade dos leitos formados por partculas de farelo
de trigo e cilindro de espuma de poliuretano de dimetro
30mm..................................................................................................................................59
Tabela 5.2 Caracterizao do farelo de trigo 0,35mm com diferentes umidades e da
porosidade do leito de
partculas............................................................................................................................59
Tabela 5.3 Caracterizao do farelo de trigo 0,59mm com diferentes umidades e da
porosidade do leito de
partculas............................................................................................................................59
Tabela 5.4 Caracterizao do filme lquido em espuma de poliuretano com diferentes
umidades............................................................................................................................61
Tabela 5.5 Caracterizao dos suportes saturados com gua...........................................61
Tabela 5.6 rea superficial, tamanho mdio e volume de poros para os farelos de trigo e
espuma de poliuretano determinados atravs das isotermas de
BET.....................................................................................................................................67
Tabela 5.7 Dados dos rendimentos de glicose em clulas para farelo de trigo 0,59mm
para diferentes condies de vazo e altura de leito..........................................................80
Tabela 5.8 Dados dos rendimentos de glicose em clulas para farelo de trigo 0,59mm nas
diferentes alturas de leito....................................................................................................85
Tabela 5.9 Estimativa da produo de gua a partir da taxa de produo de gs
carbnico..........................................................................................................................132

xviii
NOMENCLATURA

a rea interfacial por volume m
2
/m
3
BSA Albumina do soro bovino
G , O
D
2
Difusividade de oxignio na fase gasosa m
2
/s
L , O
D
2

Difusividade de oxignio na fase lquida m
2
/s
C
G
Concentrao de oxignio na fase gasosa mol/m
3
C
L
Concentrao de oxignio na fase lquida mol/m
3
C
L
*
Concentrao de oxignio na saturao mol/m
3

dp Dimetro das partculas m
E Taxa de evaporao de gua g/g.h
FEQ Faculdade de Engenharia Qumica
F
W
Quantidade de gua adicionada por meio slido g/h
k
G
Coeficiente convectivo de transferncia de massa m/s
K
L
a Coeficiente global de transferncia de oxignio s
-1
k
w
Fator de converso de gua/CO
2
produzidos

g/g
LDPB Laboratrio de desenvolvimento de processos
biotecnolgicos

LIMBio Laboratrio de Interao Molecular e Bioengenharia
LRAC Laboratrio de Recursos Analticos e de Calibrao

M
S
Massa de slidos g
m
X
Concentrao celular (base seca) mg/g
N Taxa de transferncia de oxignio mol/m
3
.s
n
p
Nmero de partculas ou poros
p Presso parcial de oxignio no gs atm
Q Vazo volumtrica de ar L/min
q
o
Taxa especfica de consumo de oxignio mg/g.h
r Dimenso radial m
R Constante universal dos gases atm.L/(gmol.K)
R
1
Raio da partcula slida m
R
2
Raio da partcula slida mais biofilme m

xix
R
CO2
Taxa de produo de gs carbnico mol/m
3
.s
Re Nmero de Reynolds
R
O2
Taxa de consumo de oxignio mol/m
3
.s
RQ Quociente respiratrio gCO
2
/gO
2
R
W
Taxa de produo de gua g/g.h
SDS-Page Sodium dodecyl sulfate Plyacrilamide Gel Electrophoresis
T temperatura K
t tempo h
UFC Unidades formadoras de colnias
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
V
biofilme
Volume do biofilme m
3

V
leito
Volume do leito m
3

V
m
Volume de clulas no leito m
3

V
S
Volume de meio slido m
3
V
X
Volume disponvel para o crescimento microbiano m
3

W
p
Quantidade de gua perdida por meio slido g/h
X
W
Umidade mdia do leito g/g
Y
P/S
Rendimento de glicose em protena mg/mg

LETRAS GREGAS

Porosidade do leito %
Espessura de biofilme m
Grau de empacotamento do leito
ap
Densidade aparente g/cm
3
real
Densidade real g/cm
3

B
Grau de reduo da biomassa
S
Grau de reduo do substrato
Gradiente mol/m
3

1 INTRODUO
O cultivo em estado slido caracterizado pelo crescimento de
microrganismos na ausncia ou prximo da ausncia de gua livre, sendo que o
meio slido deve apresentar umidade suficiente para manter o metabolismo
microbiano (Pandey, 1992; Rahardjo et al., 2006). Estes processos vm
recebendo ateno especial devido s suas vantagens quando comparados aos
cultivos submersos. At os anos 90, as principais vantagens citadas para os
processos em estado slido estavam ligadas limitao de gua no sistema, que
conduz maiores produtividades e obteno de produtos mais concentrados
quando comparadas aos processos de fermentao submersa. A essas vantagens
adiciona-se a diversidade de suportes naturais que podem ser usados nos cultivos
em estado slido. Atualmente, dois outros aspectos tambm tm sido
evidenciados tais como a adeso de fungos filamentosos na superfcie das
matrizes slidas e a importncia do seu crescimento areo, ambos ausentes no
crescimento submerso. A adeso de clulas em superfcies slidas produz
diferenas no comportamento fisiolgico dos fungos, evidenciadas por mudanas
na expresso gnica, secreo de enzimas e morfologia (Gutirrez-Correa &
Villena, 2003). O crescimento areo tem sido citado na literatura de modo
qualitativo como um detalhamento das fases do crescimento fngico (Mitchell,
1991), e poucos trabalhos tm estudado esse aspecto, como reportado por
Rahardjo et al. (2006) em seu artigo de reviso. Com essas novas abordagens, a
anlise do comportamento dos cultivos em estado slido deve contemplar
adicionalmente todo um conjunto de conceitos relacionados com a formao de
biofilmes, imobilizao de clulas e crescimento microbiano sobre superfcies
slidas.
Os processos em estado slido possuem um potencial econmico
considervel na obteno de produtos para as indstrias qumica, alimentcia,
farmacutica e agrcola. Em geral, estes cultivos so atrativos pela sua
simplicidade e semelhana com o habitat natural de muitos microrganismos.
Diversos suportes naturais e inertes vm sendo utilizados nestes
processos. Os suportes naturais servem como matriz slida para o crescimento
Introduo

2
fngico, sendo a principal fonte de energia para os microrganismos. O uso de
materiais nutricionalmente inertes como suporte em cultivos em estado slido visa
facilitar o projeto do meio nutriente e o monitoramento dos parmetros de
processo (Sabu et al., 2000). Durante o crescimento nos suportes naturais, os
microrganismos penetram e ligam-se fortemente s partculas slidas, as quais
vo sendo degradadas, alterando as caractersticas fsico-qumicas do meio
(Lareo et al., 2005). Assim, o uso de suportes inertes impregnados com lquido
nutriente permite a manuteno da estrutura fsica da matriz, facilitando o controle
dos processos.
Apesar de a tecnologia ser conhecida h vrios sculos, somente nas
ltimas dcadas que tem havido avanos significativos no entendimento dos
fenmenos que ocorrem nos cultivos em estado slido, motivados pela
necessidade de escalonamento dos processos. Na literatura isso evidenciado
pela escassez de trabalhos abordando esses aspectos e pela natureza qualitativa
dos trabalhos de reviso (Raghavarao et al., 2003).
A principal dificuldade no escalonamento o controle das variveis do
processo. Para contornar essas dificuldades, novas configuraes de biorreatores
tm sido usadas tais como tambores rotativos e colunas de leito fixo e fluidizado.
Alm disso, tm sido utilizados suportes inertes os quais no interagem com a
fase bitica do processo, mantendo sua estrutura fsica praticamente constante.
Do ponto de vista dos fenmenos de transporte, os estudos na ltima
dcada tm sido mais voltados para a transferncia de calor (Mitchell et al., 2000;
Durand, 2003; Pandey, 2003; Lekanda & Prez-Correa, 2004), enquanto que os
estudos dos fenmenos de transferncia de massa ainda so muito escassos.
As limitaes de transferncia de oxignio so inevitveis nestes
processos. A principal resistncia ao transporte ocorre no biofilme celular formado
na superfcie e/ou interior das partculas slidas, onde ocorre difuso e consumo
de oxignio (Gowthaman et al., 1995). A transferncia de oxignio o parmetro
mais importante no estudo do escalonamento e controle destes processos uma
vez que a produo de calor proporcional ao consumo de oxignio. Alm disso,
Introduo

3
o suprimento do oxignio para o miclio que cresce na superfcie ou no interior
das partculas pode ser prejudicado pela difuso ineficiente (Rahardjo et al., 2002).
Outro aspecto importante dos processos em estado slido a diversidade
de produtos que podem ser obtidos, os quais atualmente compreendem enzimas e
protenas para aplicaes mdico-farmacuticas (Hasan et al., 2003). O miclio e
os esporos de fungos contm componentes bioqumicos os quais podem
apresentar propriedades alergnicas (Menezes, 1995). Este conhecimento abriu
novas perspectivas de produo de antgenos para o tratamento de doenas
respiratrias como a rinite alrgica. Reaes alrgicas de significativa intensidade
foram obtidas com Drechslera (Helminthosporium) monoceras (DHm) e o
tratamento com o extrato alergnico obtido da biomassa fngica apresentou
resultados promissores. DHm encontrado na natureza como parasita de cereais
e a sua presena pode ser identificada no solo e no ar. A caracterstica do seu
habitat natural motivou o estudo do crescimento da sua biomassa em estado
slido e a caracterizao do produto obtido foi objeto de pesquisa em trabalhos
recentes do nosso grupo. Nesse sentido, Saraiva (2001) estudou a extrao das
protenas alergnicas da biomassa de DHm obtida por fermentao em estado
slido. Hasan (2002) avaliou o cultivo deste fungo em estado slido utilizando um
sistema de colunas de leito fixo (colunas de Raimbault) atravs de uma anlise
estatstica de variveis. Estudou ainda a produo do extrato alergnico (protenas
semi-purificadas) e caracterizao do produto obtido quanto alergenicidade das
protenas do extrato. Os resultados obtidos atravs de dot blotting e
immunoblotting foram positivos, indicando que os antgenos fngicos podem ser
produzidos por cultivo em estado slido. A transferncia de oxignio foi um fator
limitante para o crescimento da biomassa fngica e produo das protenas
alergnicas. Outros trabalhos do nosso grupo de pesquisa destacaram a
perspectiva de utilizao desses antgenos no tratamento de rinite alrgica,
envolvendo a encapsulao dessas protenas em lipossomas para aplicao em
terapia de alergia por dessensibilizao (Cabral et al., 2004).
Nesse contexto, o presente trabalho visa contribuir para o desenvolvimento
da produo de protenas alergnicas obtidas da biomassa de DHm, com vistas
ao escalonamento do processo, estudando aspectos macroscpicos da
Introduo

4
transferncia de oxignio nos cultivos em estado slido conduzidos em biorreator
de leito fixo e analisando os resultados luz dos novos conceitos microscpicos
envolvidos no crescimento de fungos sobre superfcies slidas. Assim, essa
pesquisa foi focada no estudo da influncia da altura de leito, vazo de ar e
umidade inicial na transferncia de oxignio usando inicialmente o farelo de trigo
como suporte natural. Adicionalmente, a transferncia de oxignio tambm foi
estudada em espuma de poliuretano como suporte inerte. Em ambos os casos o
desempenho da transferncia de oxignio foi analisada em termos do coeficiente
global de transferncia de massa gs-lquido (K
L
a), perfis de protenas e
coeficientes de rendimento protena/glicose ao longo dos cultivos.

2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi estudar a transferncia de oxignio no cultivo
em estado slido de Drechslera (Helminthosporium) monoceras (DHm) em
suportes natural e inerte.
O estudo abordou os seguintes aspectos:
Em suporte natural:
- Influncia de diferentes alturas de leito e vazo de ar;
- Influncia do nvel de umidade do meio slido sob condies
controladas;
- Influncia do tamanho de partcula
- Comparao do comportamento dos cultivos conduzidos em biorreator
do tipo coluna de maiores dimenses;
- Caracterizao da transferncia de oxignio em cultivo de Drechslera
(Helminthosporium) monoceras em suporte inerte em condies de vazo de ar e
umidade previamente selecionadas para o suporte natural.
- Estimativa da biomassa nos cultivos com suporte natural e inerte;
- Identificao das protenas produzidas nos cultivos sobre os suportes
natural e inerte.
Para todos os aspectos foram determinadas a quantidade total de
protenas produzidas, os perfis de umidade do meio slido, consumos de glicose e
oxignio e determinado o coeficiente global de transferncia de oxignio gs-
lquido (K
L
a) durante as fermentaes.

3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Cultivo em estado slido
O cultivo em estado slido tem apresentado grande potencial tecnolgico
para produo de alimentos, produtos qumicos e farmacuticos (Guitirrez-Correa
& Villena, 2003; Pandey, 2003). O processo caracteriza-se pelo crescimento de
microrganismos sobre uma matriz slida, ou seja, substrato insolvel, na ausncia
ou perto da ausncia de gua livre (Lonsane et al., 1992; Pandey, 1992; Viccini &
Mitchell, 2003). Estes processos, portanto, diferenciam-se dos cultivos submersos
e das reaes com clulas imobilizadas pela quantidade de gua livre presente
(Guitirrez-Correa & Villena, 2003). Comparado com as fermentaes submersas,
o meio slido apresenta baixa quantidade de gua e uma fase gasosa importante
entre as partculas (Durand, 2003). Mais recentemente, o cultivo de
microrganismos em estado slido vem sendo tambm caracterizado e definido
como fermentao por biofilme ou por adeso em superfcies, por envolver
conceitos comuns a esses processos (Gutirrez-Correa & Villena, 2003). A adeso
dos fungos filamentosos ocorre devido a uma classe de protenas de massas
molares baixas chamadas hidrofobinas, podendo ser produzidas por ascomicetos,
basidiomicetos e zigomicetos (Wessels, 1996; Wsten & De Vocht, 2000; Linder et
al., 2005). Estas protenas estabilizam a adeso das clulas em suportes naturais
e inertes. Entretanto, outras molculas como glicoprotenas, podem participar do
processo de adeso.
A matriz slida pode ser substrato natural contendo fonte de carbono ou
um suporte inerte impregnado de soluo nutriente (Ooijkaas et al., 2000a). As
matrizes usadas como suportes nos processos em estado slido podem variar na
sua composio, tamanho, resistncia mecnica, porosidade e capacidade de
reteno de gua (Durand, 2003).
Recentes estudos tm buscado aplicar esta tecnologia para produo de
enzimas, metablitos e esporos (Hlker et al., 2004). Nesse sentido, resduos
agroindustriais como farelo de trigo e milho servem como fonte de nutrientes e
Reviso bibliogrfica

8
suporte para estes processos na medida em que possuem caractersticas
polimricas e so insolveis em gua. Como suportes inertes usados nestes
cultivos podemos citar poliuretano, poliestireno, nylon, alumina, amberlite, dentre
outros (Ooijkaas et al., 2000a; Sabu et al., 2001). O preparo e pr-tratamento do
substrato slido consistem em etapas que visam transformar o substrato bruto em
uma forma utilizvel para fermentao. Estas etapas compreendem a diminuio
do tamanho das partculas; hidrlise fsico-qumico ou enzimtica dos polmeros
para aumentar a disponibilidade do substrato ao microrganismo; suplementao
de nutrientes do meio de cultivo; ajuste do pH e umidade; cozimento ou tratamento
a vapor para pr-degradao da estrutura macromolecular e eliminao dos
contaminantes (Lonsane et al., 1992). Zhao et al. (2001), trataram palha de trigo
por secagem a 50C por 4 horas, seguido de tratamento trmico em autoclave a
121
o
C por 60 min. Hoogschagem et al. (2001) avaliaram a influncia do tipo de
gro de trigo e do pr-tratamento no cultivo de Aspergillus oryzae. Foram testados
seis tipos de gros de trigo comerciais e dois tratamentos: gros encharcados em
gua destilada a 50
o
C por 4 horas e a 20
o
C por 16 horas. De acordo com os
autores, a variedade do trigo e o pr-tratamento afetam o desempenho dos
cultivos em estado slido.
O cultivo em estado slido considerado o mais antigo processo
fermentativo, sendo utilizado pelos egpcios para produo de po desde 2600
a.C. As aplicaes mais recentes consistem no enriquecimento de resduos
agroindustriais, produo de enzimas, cidos orgnicos e outros metablitos
fngicos (Ooijkaas et al., 2000a).
Diversos microrganismos podem ser cultivados a partir de substratos
slidos. No entanto, os fungos filamentosos possuem a melhor capacidade de
crescer nestas condies devido s suas caractersticas fisiolgicas e
bioqumicas. Sendo assim, dentre as classes mais estudadas podemos citar
Phycomycetes (Mucor e Rhizopus), Ascomycetes (Aspergillus e Penicillium) e
Basidiomycetes (Polysporus) (Pandey, 1992) e Hyphomycetes (Drechslera
monoceras) (Menezes et al., 1995; Hasan et al, 2003).
Reviso bibliogrfica

9
Os sistemas em estado slido apresentam diversas vantagens sobre os
cultivos submersos. Como vantagens biolgicas podemos citar a baixa demanda
de gua, utilizao de substratos insolveis em gua e fontes de carbono pouco
usuais e a similaridade com o ambiente natural de muitos fungos filamentosos.
Podemos citar como vantagens de processo a alta produtividade volumtrica,
facilitada recuperao de produtos e reduzidas exigncias energticas. No
entanto, estes sistemas podem apresentar alguns problemas como o surgimento
de gradientes de temperatura, umidade, oxignio e nutrientes. Alm disso, estes
processos apresentam desvantagens tais como a utilizao apenas de
microrganismos que se desenvolvam em baixos nveis de umidade e atividade de
gua, dificuldades na medida e controle dos parmetros, necessidade de elevadas
concentraes de inculo, pr-tratamento do substrato e dificuldades no
escalonamento do processo (Ooijkaas et al., 2000b; Hlker et al., 2004). Mais
recentemente, estudos do comportamento dos fungos no cultivo em estado slido
mostraram diferenciaes marcantes na expresso gnica, fisiologia e morfologia
ligadas muito mais ao crescimento adesivo das clulas do que limitao de gua
no meio (Gutirrez-Correa & Villena, 2003).

3.2 Transferncia de massa nos cultivos em estado slido
Os cultivos em estado slido possuem algumas limitaes ligadas
heterogeneidade dos sistemas, especialmente quanto ao transporte de massa e
calor, o que pode comprometer a produtividade do processo (Gowthaman et al,
1993). As caractersticas de transferncia de calor e massa dependem da
natureza do substrato e do microrganismo, condutividade trmica, difusividade
efetiva, porosidade e teor de umidade do substrato slido.
Os fenmenos que ocorrem nos biorreatores so conceitualmente
classificados como fenmenos macro e microscpicos (Raghavarao et al., 2002).
A Figura 3.1 ilustra os fenmenos macroscpicos que ocorrem nos biorreatores
em estado slido, sendo que podemos destacar o fluxo de ar no biorreator com
conseqentes mudanas na temperatura e nas concentraes de oxignio, gs
Reviso bibliogrfica

10
carbnico e gua; conveco, difuso e conduo que ocorrem na direo normal
ao fluxo de ar durante a aerao forada; efeitos de cisalhamento devido
mistura, incluindo a manuteno da integridade das partculas slidas; conduo
de calor atravs da parede do biorreator. Esses fenmenos representam
contribuies importantes para os balanos de massa e energia, porm no
necessariamente possuem a mesma intensidade em todos os tipos de
biorreatores (Mitchell et al., 2000).

Figura 3.1. Fenmenos macroscpicos que ocorrem nos biorreatores durante o
crescimento fngico sobre suportes slidos (Adaptado de Mitchell et al., 2000)

Reviso bibliogrfica

11
Na Figura 3.2, esto esquematizados os fenmenos microscpicos que
ocorrem nos biorreatores durante o crescimento fngico sobre substratos
slidos.

Figura 3.2 Fenmenos microscpicos que ocorrem nos biorreatores durante o
cultivo sobre suportes slidos (Adaptado de Mitchell et al., 2000)

Os microrganismos crescem na regio mida na superfcie do substrato
formando um biofilme. Durante o crescimento, as hifas penetram na partcula em
busca dos nutrientes havendo a difuso de solutos no interior da partcula (Mitchell
Reviso bibliogrfica

12
et al., 2000). A transferncia de massa intrapartcula refere-se ao transporte de
nutrientes e enzimas para o interior dos substratos slidos. Assim, o fator de
efetividade um conceito muito utilizado para caracterizar estes fenmenos,
sendo definido como a relao entre a taxa de reao observada pela taxa de
reao na ausncia de qualquer gradiente de concentrao de substratos
(Raghavarao et al., 2003). Estes conceitos auxiliam os estudos das limitaes
difusionais na catlise heterognea, sendo tambm aplicados nos processos em
estado slido. Mitchell et al. (1991) avaliaram as limitaes difusionais da
glucoamilase produzida por Rhizopus oligosporus por FES, constatando que,
devido difuso, a concentrao da enzima tende a ser maior na superfcie,
resultando em rpido consumo de amido nesta regio.
Os estgios da adeso dos fungos na superfcie de partculas,
caracterstico da fermentao por biofilmes ou fermentao por adeso, esto
esquematizados na Fig. 3.3. A formao do biofilme dividida em trs partes:
adeso nas partculas; crescimento inicial a partir da geminao de esporos; e
fase de maturao com aumento da densidade celular. Os estgios da adeso de
fungos incluem a diferenciao na expresso gnica, caractersticas nos cultivos
em estado slido ou na fermentao por biofilmes (Gutirrez-Correa & Villena,
2003).
A formao e manuteno dos biofilmes so processos dinmicos que
envolvem complexas interaes fsicas e biolgicas. As propriedades fsicas do
suporte como a hidrofobicidade, carga eletrosttica e superfcie rugosa devem
permitir uma etapa inicial de adeso dos microrganismos. A adeso de fungos
filamentosos mediada principalmente por uma classe de protenas de massa
molar baixa (por volta de 10kDa) chamadas hidrofobinas (Gutirrez & Villena,
2003; Linder et al., 2005). De acordo com Wsten & Vocht (2000), as hidrofobinas
so protenas excretadas por fungos durante o seu desenvolvimento, estando
diretamente envolvidas nos diferentes estgios de crescimento fngico, desde a
formao de estruturas areas hidrofbicas como hifas, esporos e corpos de
frutificao. Alm disso, estas protenas apresentam diversas funes durante o
crescimento fngico, sendo que a mais importante diz respeito sua habilidade
Reviso bibliogrfica

13
em diminuir a tenso superficial, permitindo a adeso das hifas em superfcies
orgnicas e inertes (Wessels, 1996; Linder et al., 2005).

Figura 3.3 Etapas para a adeso de clulas aplicadas na fermentao em estado
slido e crescimento de biofilmes (Adaptado de Gutirrez & Villena, 2003)

A Fig. 3.4 apresenta um esquema que ilustra as diferentes camadas
fngicas sobre um substrato slido. As hifas fngicas formam uma rede
tridimensional porosa conhecida como miclio. Inicialmente, o miclio se
desenvolve dentro da matriz slida, na superfcie do substrato e no ar. A
penetrao dentro do substrato depender da disponibilidade de oxignio para
desenvolvimento dos filamentos penetrantes (Rahardjo et al., 2002). Como o
miclio continua crescendo, no decorrer do processo a camada area pode tornar-
Imobilizao
Contato com a superfcie
Adeso dos esporos
Produo de adesivos
Diferenciao
Etapa passiva e
reversvel
Ativao dos
genes

Produo de
Adesivos

Desenvolvimento de estruturas
para penetrao no substrato ou
formao de biofilmes
Caractersticas
da superfcie
Diferenciao na
expresso gnica e
produo de enzimas
e metablitos
Reviso bibliogrfica

14
se to densa que os poros ficam cheios de gua, aumentando assim a camada de
miclio mido. Com o aumento da espessura do filme lquido ou da densidade de
empacotamento, as regies mais profundas desta camada tornam-se anaerbias,
retardando o crescimento ou levando ao metabolismo endgeno. Se os poros da
fase area so preenchidos com ar, h uma rpida difuso de oxignio, mas um
lento transporte dos demais nutrientes, como fonte de carbono, e de enzimas. Por
outro lado, se os poros so preenchidos com gua, o suprimento dos nutrientes
para o biofilme prejudicado pela difuso lenta.

Figura 3.4 Modelo de crescimento de fungos filamentosos (Adaptado de Rahardjo
et al., 2006)

Modelos de reao-difuso so utilizados para descrever a transferncia
de massa em sistemas com biofilmes microbianos, sendo que a difuso do
oxignio assumida numa nica direo (Fig. 3.5). Oostra et al. (2001)
determinaram os gradientes de concentrao de oxignio no cultivo de Rhizopus
oligosporium em um meio nutriente definido usando microeletrodos. Estes autores
constataram que aps 36h no havia disponibilidade de oxignio em camadas
superiores a 100m. Analisando da mesma forma, Rahardjo et al. (2002)
reportaram observaes similares para biofilme de Aspergilus oryzae. Neste caso,
foi demonstrada a ausncia de gradientes de concentrao no miclio areo.
Estes autores verificaram que este fungo forma miclio areo abundante, sendo
importante no consumo de oxignio durante o cultivo. A contribuio da fase area
Reviso bibliogrfica

15
chega prximo a 75% da taxa de consumo global de oxignio. Alm disso, no foi
verificado um fluxo constante de oxignio, o qual era atribudo a uma penetrao
de oxignio constante na camada mida de substrato. Sendo assim, as limitaes
difusionais so menos importantes para fungos que formam hifas areas
abundantes.

Figura 3.5 Modelo de reao-difuso (Adaptado de Rahardjo et al., 2006)

3.3 Transferncia de oxignio
Nos processos aerbios, a transferncia de oxignio para os fungos um
dos fenmenos mais importantes e sustenta o crescimento dos microrganismos
(Gowthaman et al, 1995). Assim, o coeficiente global de transferncia de massa
gs-lquido (K
L
a) uma varivel importante a ser considerada nestes processos
(Poughon et al., 2003). Nos cultivos submersos, a transferncia de oxignio
depende da forma e tamanho do biorreator e do sistema de agitao e aerao
(Durand, 2003). Nestes casos, o K
L
a tem sido bem definido para avaliar o
transporte de massa, sendo usado para expressar a capacidade do equipamento
Reviso bibliogrfica

16
de transferir oxignio independente do volume do reator. Nos cultivos em estado
slido so raros os trabalhos que abordam este tema de maneira quantitativa
(Gowthaman et al., 1995; Thibault et al., 2000), embora a transferncia de
oxignio possa ser um fator limitante em alguns reatores, sendo afetada
principalmente pelo controle da temperatura e contedo de gua do meio slido.
Nestes processos, os microrganismos crescem no interior de uma estrutura
porosa ou na superfcie de partculas slidas, as quais so envolvidas por um filme
estagnado de lquido (biofilme). O oxignio transferido por conveco da fase
gasosa para o filme e por difuso molecular atravs do filme e nos poros do
substrato slido (Thibault et al., 2000). Assim, a maior resistncia transferncia
de oxignio nos cultivos em estado slido ocorre devido difuso no biofilme.
De fato, os resultados de Thibault et al. (2000) comprovaram que o
coeficiente de transferncia de massa convectivo (k
G
) no influencia na
transferncia de oxignio em cultivos sobre substratos slidos. No entanto, para
fungos que formam hifas areas abundantes, a transferncia de oxignio
depender da composio dos poros da fase area preenchidos com gua ou ar
(Rahardjo et al., 2002; Rahardjo et al., 2006).
De acordo com os resultados obtidos por Oostra et al. (2001), a taxa de
transferncia de oxignio limitada devido resistncia ao transporte de oxignio
atravs do biofilme mido. O crescimento aerbio ocorre na fina camada
(aproximadamente 60 m) prxima interface gs-lquido, enquanto nas regies
mais profundas ocorre crescimento e converso anaerbia (Tanaka et al., 1986).
As limitaes de oxignio so inevitveis e ocorrem em maior proporo
na fase aquosa no interior do biofilme, comparada com a transferncia atravs da
interface gs-lquido, a qual a etapa limitante na fermentao submersa. Como
resultado, o coeficiente global de transferncia de massa gs-lquido (K
L
a) nos
cultivos em estado slido possui contribuies diferentes em relao
fermentao submersa, e nesse caso torna-se importante a determinao da
difusividade do oxignio dentro da fase aquosa (Mitchell, et al., 2000). Alm disso,
Thibault et al. (2000) apontaram que o K
L
a nos cultivos em estado slido uma
Reviso bibliogrfica

17
constante fsica do sistema dependendo apenas da rea interfacial de
transferncia de massa, da difusividade de oxignio na fase lquida e da
espessura do filme, sendo independente da concentrao de oxignio. Assim, se a
espessura de biofilme aumentar com o tempo de cultivo, podem ocorrer mudanas
na difusividade fazendo com que o valor de K
L
a varie durante o processo. No
entanto, a interpretao do K
L
a deve ser usada com cuidado uma vez que devido
presena de microrganismos no filme lquido, os perfis da concentrao de
oxignio so resultado da difuso e consumo, diferentemente do que ocorre nos
cultivos submersos.
Oostra et al. (2001) constataram limitaes de transferncia de oxignio
na fermentao em estado slido com Rhizopus oligosporus em meio de cultivo
nutricionalmente definido. Segundo esses autores, a converso anaerbia da
glicose em etanol por R. oligosporus foi indicativo da resistncia ao transporte de
oxignio atravs do biofilme fngico, alterando o quociente respiromtrico. Alm
disso, outra constatao das condies anaerbias foi reduo do rendimento
em biomassa por glicose consumida ao longo da fermentao. Nesse sentido,
segundo Hasan (2002), o perfil do rendimento (Y
X/S
) e concentrao de acares
no final do cultivo de D. monoceras em biorreator de leito fixo (colunas de
Raimbault) podem ser indicativos da limitao de oxignio na fermentao em
estado slido. Isto ocorre tanto pela resistncia no biofilme quanto pela
distribuio de ar ineficiente atravs do leito de partculas, com a formao de
caminhos preferenciais devido ao acmulo de gua proveniente das reaes
metablicas. A forma mais prtica de aumentar o metabolismo aerbio facilitar a
transferncia de oxignio da fase gasosa para os microrganismos via aumento da
rea de interface entre a fase gasosa e o biofilme fngico. A rea interfacial pode
ser aumentada atravs da reduo do tamanho das partculas ou pr-tratamento
do substrato (Oostra et al., 2001).

Reviso bibliogrfica

18
3.3.1 Caracterizao da transferncia de oxignio
Embora o coeficiente global de transferncia de oxignio gs-liquido (K
L
a)
seja um parmetro muito bem estudado na fermentao submersa, a sua
determinao nos cultivos em estado slido tem sido objeto de estudos mais
recentes (Gowthaman et al., 1995 Thibault et al., 2000). O balano gasoso no
biorreator e a variao com o tempo da concentrao de oxignio dissolvida na
fase lquida (mtodo dinmico) so os mtodos convencionais de determinao do
K
L
a na fermentao submersa. No entanto, o mtodo dinmico no pode ser
empregado para estimar K
L
a

nos processos em estado slido uma vez que a
concentrao de oxignio na fase liquida no facilmente determinada por tratar-
se de um biofilme estagnado que est em contato direto com a superfcie do
slido. Desta forma, estima-se o K
L
a somente pelo balano gasoso nos
biorreatores (Thibault et al., 2000). O mecanismo de transferncia de oxignio da
fase gasosa para os microrganismos controlado pela resistncia no filme lquido
estagnado. A taxa global de transferncia de oxignio pode ser expressa
matematicamente de acordo com a Eq. 3.1:
( )
L L
C C a K N =

(Equao 3.1)
onde N a taxa volumtrica de transferncia de oxignio; K
L
o
coeficiente de transferncia de oxignio da fase lquida; a a rea interfacial
por volume para transferncia de oxignio; C
*
a concentrao de oxignio no
gs em equilbrio com o lquido (concentrao de saturao na temperatura e
presso considerada); C
L
a concentrao de oxignio no filme lquido.
A Figura 3.6 apresenta as resistncias transferncia de oxignio em
um sistema de fermentao em estado slido, sendo que a teoria clssica do
filme pode ser aplicada. A transferncia de oxignio da fase gasosa para a fase
lquida esttica envolve as seguintes etapas: transferncia da fase gasosa para
a interface gs-lquido e transferncia atravs do filme lquido, tornando-se
disponvel aos microrganismos. Estes crescem e formam produtos no filme
lquido sobre as partculas slidas de substrato. Desde que o fluxo de ar seja
suficiente para permitir turbulncia, a resistncia do filme gasoso pode ser
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19
desprezada e a resistncia no biofilme controla o processo (Gowthaman et al.,
1995).

Figura 3.6 Resistncia ao transporte de oxignio nos cultivos em estado slido
(Adaptado de Gowthaman et al., 1995)

Andr et al (1981) adaptaram o mtodo dinmico de medida do K
L
a
atravs da medida contnua de gs carbnico (CO
2
)

na entrada e sada de um
reator de coluna, para aplicao em sistemas gs-lquido-slido. Este mtodo
baseou-se na absoro e dessoro de gs carbnico em um sistema semi-
contnuo, com medida da composio do gs na sada com avariao de CO
2
no
gs de entrada. De acordo com os autores, a determinao de K
L
a usando este
indicador no gs vivel, uma vez que foram obtidos valores normalmente
encontrados na literatura para sistemas envolvendo gs, lquido e slido.
Gowthaman et al (1995) estimaram K
L
a na fermentao em estado slido
usando biorreator de leito fixo atravs da medida direta da composio do gs na
entrada e sada do reator. Neste trabalho, os autores usaram como hiptese, com
base em dados da literatura em que a concentrao de oxignio decresce, devido
resistncia difusional, em aproximadamente 10% no filme lquido, ou seja, C
L
=
(C* - C
L
) = 0,9C
*
. Sendo assim, K
L
a foi calculado pela Equao 3.1. Segundo os
autores, esta aproximao para clculo do coeficiente de transferncia de massa
pareceu razovel para processos em estado slido, uma vez que

a

concentrao
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20
de oxignio no filme lquido (C
L
) de difcil medida experimental, diferente da
fermentao submersa onde determina-se a concentrao de oxignio dissolvido
diretamente no seio do lquido. No entanto, Thibault et al. (2000) indicaram que
estas consideraes no foram apropriadas para os sistemas em estado slido.
Com base na Equao 1, quando assumida constante a diferena de
concentrao de oxignio em 10% atravs do filme lquido, isto reflete em uma
variao considervel no K
L
a, conforme demonstrado por Gowthaman et al (1995).
K
L
a uma constante do sistema, e geralmente assume-se como independente da
concentrao de oxignio (Thibault et al., 2000). Segundo estes autores, K
L
a
proporcional relao entre a difusividade de oxignio e a espessura do biofilme.
Desta forma, espera-se que o K
L
a varie ao longo da fermentao na medida que
ocorre crescimento da biomassa e pequenas variaes da difusividade de
oxignio no filme lquido, mas no da forma apresentada por Gowthaman et al.
(1995).
Nesse contexto, Thibault et al. (2000), reavaliaram a estimativa do K
L
a
proposta por Gowthaman et al., 1995, desenvolvendo um modelo matemtico de
crescimento uniforme de fungos na superfcie de partculas esfricas em leito fixo.
Considerando hiptese de estado pseudo-estacionrio, ou seja, os perfis de
concentrao de oxignio no gs e no lquido so constantes e resultado do
consumo de oxignio, e assumindo espessura de biofilme constante de 25m, os
autores encontraram valores de K
L
a prximos a 0,344s
-1
para todas as condies
de vazo de ar e em diferentes posies axiais da coluna de leito fixo. Estes
resultados indicaram que o gradiente de concentrao de oxignio no filme lquido
no constante ao longo dos cultivos, no entanto o K
L
a depende apenas da
espessura do filme e da difusividade de oxignio.
Diversos modelos tm sido propostos para explicar como o crescimento
fngico pode ser afetado pela difuso intrapartcula de oxignio, enzimas,
produtos de hidrlise e outros nutrientes e a importncia de fenmenos como o
encolhimento das partculas e a distribuio espacial da biomassa (Mitchell et al.,
2003). Georgiou & Shuler (1986) descreveram o crescimento microbiano na
superfcie de uma fina camada de substrato contendo glicose. No entanto, a
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21
geometria esfrica considerada uma aproximao de forma de partcula mais
conveniente para os cultivos em estado slido. Rajagopalan & Modak (1995)
desenvolveram um modelo matemtico para avaliar a difuso de oxignio em
partculas esfricas considerando a formao de um biofilme mido de densidade
constante. O modelo descreve vrias etapas, como a liberao da enzima na
interface biomassa/substrato; a difuso da enzima na partcula slida; a hidrlise
de polisssacardeos; liberao da glicose e difuso dentro da partcula slida;
difuso da glicose atravs do biofilme e consumo pela biomassa; difuso do
oxignio atravs do biofilme e consumo pela biomassa; e expanso do biofilme em
virtude do crescimento fngico. De acordo com estes autores, o crescimento da
biomassa (dX/dt) causa uma expanso no biofilme. Considerando que as
partculas mantm a sua estrutura fsica como se fosse uma matriz inerte, os
resultados demonstraram que a limitao de oxignio um problema mais srio
que a limitao por glicose, podendo haver condies anaerbias em 70-80% da
espessura do biofilme durante o crescimento microbiano exponencial.

3.4 Tipos de biorreatores
Os fatores a serem considerados no projeto de reatores para o cultivo em
estado slido e controle de parmetros diferem dos cultivos com clulas em
suspenso. A fase gasosa existente entre as partculas do meio slido de
grande importncia uma vez que o ar apresenta uma condutividade trmica bem
inferior da gua. Outro ponto importante a variedade de matrizes usadas
nestes cultivos, as quais variam de composio, granulometria, resistncia
mecnica, porosidade e capacidade de reteno de gua.
Os biorreatores geralmente utilizados para os processos em estado slido
so do tipo bandeja, leito fixo, agitados e de leito fluidizado gs-slido (Durand et
al., 1997; Mitchell et al., 2000).
Os biorreatores de bandeja caracterizam-se por sua simplicidade, uma vez
que o substrato disposto em bandejas normalmente perfuradas, facilitando a
conveco do ar. Neste tipo de biorreator no h aerao forada nem agitao
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22
mecnica. Desta forma, para evitar o aquecimento metablico e para manter as
condies aerbias so utilizadas camadas finas de substrato.
Nos biorreatores de leito fixo ocorre a aerao forada atravs da camada
de substrato. Muitas variaes de projeto so possveis, sendo que para uso em
laboratrios esses reatores so tipicamente colunas cilndricas de vidro ou
plstico. O controle da temperatura feito atravs de imerso em banho trmico
termostatizado ou atravs do uso de colunas encamisadas. A prpria aerao
permite o controle da temperatura ao forar a evaporao da gua presente no
substrato (Durand et al., 1997).
Os biorreatores agitados compreendem tambores rotativos e os estticos,
onde outros sistemas de agitao tais como agitadores mecnicos promovem a
mistura do meio slido (Figura 3.7), sendo classificados como de mistura e
aerao forada (Michell et al., 2000). Nesses casos, quando a mistura contnua,
assume-se mistura perfeita dentro do biorreator, e as contribuies mais
importantes para o balano de energia dentro do leito de substrato so a gerao
de calor; a remoo de calor por conveco; e a evaporao da gua na corrente
de ar do sistema. No caso de mistura intermitente o comportamento de leito
empacotado deve ser considerado no perodo esttico.
Nos reatores de leito fluidizado gs-slido, o gs soprado
ascendentemente atravs da base perfurada a uma velocidade suficiente para
fluidizar as partculas do substrato, podendo ser utilizados dispositivos que
quebrem possveis aglomerados. A coluna alta o bastante para promover a
expanso do leito e a velocidade do fluxo de ar deve permitir uma eficiente
transferncia de calor e massa atravs das partculas de substrato e a fase
gasosa (Mitchell, et al., 2000). Para contornar as limitaes de transferncia de
massa devido presena de aglomerados, Tanaka et al., 1986, avaliaram o cultivo
de leveduras em fermentador de leito fluidizado gs-slido com agitadores.
Segundo estes autores, o leito fluidizado permite a manuteno das
caractersticas timas de crescimento dos microrganismos, melhor suprimento de
gua e nutrientes e remoo do calor metablico e gs carbnico produzidos.
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23
A Figura 3.8 apresenta o esquema tpico de colunas de leito fixo (colunas
de Raimbault). Este sistema possibilita a aerao das culturas e anlise da
respirao microbiana (Durand, 2003). Alm disso, a pequena quantidade de meio
slido e a geometria das colunas permitem a manuteno da temperatura dos
reatores. Nesse sentido, a Figura 3.9 apresenta esquema de coluna de leito fixo
com volume de aproximadamente 1L, onde a temperatura e a quantidade de gua
do meio podem ser monitoradas, havendo controle da umidade relativa e vazo de
ar de alimentao.

Figura 3.7 Biorreatores de mistura e aerao forada (Adaptado de Mitchell, et al.,
2000)
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24

Figura 3.8 Esquema das colunas de leito fixo em escala de laboratrio (Colunas
de Raimbault) (Adaptado de Durand, 2003)

Figura 3.9 Esquema de coluna esterilizvel para escala de laboratrio (1) colunas
(2) termopar; (3) coluna de vidro; (4) termopar para ar de entrada da coluna, (5)
termohigrmetro, (6) aquecedor, (7) termopar para temperatura da gua, (8)
rotmetro (9) medidor de nvel (10) jaqueta trmica (Adaptado de Durand, 2003)

algodo
substrato
ar
gua fria
gua fria
gua estril
ar estril
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25
Modelos de desempenho dos reatores de leito fluidizado tm
desconsiderado o balano de energia devido eficincia da transferncia de calor
interpartculas. No entanto, muita ateno vem sendo dada aos processos de
difuso intrapartcula. O volume de ar ocupado dentro do substrato compreende a
frao de vazios na partcula e depende da porosidade e umidade do substrato.
Teores de umidade elevados fazem com que a frao de vazios do leito de slidos
seja ocupada pela gua, limitando a transferncia de oxignio e criando condies
anaerbias. Por outro lado, teores de umidade baixos limitam a formao de
biofilme, inibindo o crescimento dos microrganismos (Ramana Murthy et al., 1993).
A transferncia de massa intrapartcula refere-se tambm ao transporte de
nutrientes e enzimas no interior do substrato slido. Assim, devem ser
considerados aspectos como a degradao do substrato slido pelas enzimas
secretadas no meio de fermentao. A relao entre o crescimento fngico e os
fenmenos de transferncia de massa bastante complexa e os modelos
matemticos auxiliam a descrio desse comportamento e o entendimento dos
processos.
A Figura 3.10 apresenta de uma maneira geral um sistema de leito fixo e
nas condies mnimas de fluidizao. Os slidos sero suspensos quando a
queda de presso exceder a sua massa, quando a velocidade do gs atinge a
velocidade mnima de fluidizao (Kunii & Levenspiel, 1997). De acordo com a
classificao de slidos proposta por Geldart, materiais agrcolas tais como farelo
de trigo, milho ou soja so partculas coesivas, de difcil fluidizao devido a
formao de aglomerados e caminhos preferenciais no leito.
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26

Figura 3.10 Sistemas em leito fixo e nas condies mnimas de fluidizao
(Adaptado de Kunii & Levenspiel, 1997)

Estes biorreatores de leito fluidizado ou seus variantes tm sido utilizados
para produo de biomassa e enzimas fngicas por leveduras. Nesse sentido,
Tanaka et al. (1986), utilizaram um reator de leito fluidizado com agitadores para
produo de biomassa de Saccharomyces cereviseae e enzimas por Eupenicillium
javanicum. Estes autores constataram que as clulas de leveduras tiveram uma
taxa de consumo de oxignio alta e um consumo de glicose baixo, indicando
aerobiose, resultado do excessivo suprimento de oxignio com elevada vazo de
ar durante a fluidizao do leito. A produtividade de enzimas por leito fluidizado foi
duas vezes superior aos cultivos em leito fixo, considerando massa seca das
clulas e atividade enzimtica.

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27
3.5 Suportes para processos em estado slido
O uso de materiais nutricionalmente inertes como suporte para processos
em estado slido visa facilitar o projeto do meio nutriente, o monitoramento dos
parmetros de processo e o estudo das estratgias de escalonamento e aspectos
de engenharia difceis de serem avaliados quando so utilizados substratos
slidos orgnicos (Nagendra & Chandrasekaran, 1997; Sabu et al., 2001). Os
materiais inertes, quando impregnados com soluo nutriente adequada,
promovem condio de aerobiose homognea nos reatores e minimizam as
impurezas no produto de interesse. Nos cultivos que utilizam substratos naturais, a
matriz slida serve tanto como suporte para crescimento microbiano como fonte
de carbono. Estes materiais so tipicamente polissacardeos de origem agrcola,
de fontes tais como cereais, mandioca, batata, feijo e bagao de cana. J os
suportes inertes podem ser naturais ou sintticos, no entanto servem apenas
como matriz para o crescimento do microrganismo. Espuma de poliuretano,
poliestireno, nylon, vermiculite, alumina e amberlite tm sido utilizados como
suportes inertes nos cultivos em estado slido (Rodrguez et al., 1997; Ooijkaas et
al., 2000a; Sabu et al., 2001; Lareo et al., 2005).
Os substratos naturais apresentam como desvantagem o fato de que so
degradados ao longo dos cultivos, resultando em alteraes nas suas
caractersticas fsicas e na sua geometria. Conseqentemente, os mecanismos de
transporte de calor e massa podem ser afetados. Este problema contornado
utilizando suportes inertes que no interagem com a fase bitica do processo
(microrganismos), mantendo sua estrutura fsica praticamente constante. So
citadas ainda como vantagens do uso de suportes inertes a facilitada recuperao
e purificao de produtos e uma adequada avaliao dos balanos de massa, uma
vez que tratar-se de meios de cultura definidos.
Espumas de polipropileno foram selecionadas como suportes inertes por
apresentarem considervel rea para adeso das clulas, difuso eficiente de
nutrientes e oxignio, por no serem degradadas durante os cultivos e por serem
disponveis e de baixo custo (Rodrguez Couto et al., 2001).
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28
Weber et al. (1999) props a escolha de suportes para coluna de leito fixo
baseando-se em dados da literatura e em balanos de massa e energia. Nesse
sentido, avaliaram linho, bagao de cana-de-acar e perlite como suporte para
produo de esporos de C. minitans. Os ensaios utilizando linho apresentaram um
maior rendimento, uma vez que este suporte mostrou-se mais eficiente no controle
da atividade de gua devido melhor absoro de gua, no havendo
encolhimento ao longo do cultivo.
Lareo et al. (2005) estudaram o efeito da umidade na produo de gs
carbnico por Mucor bacilliformis cultivado sobre espuma de poliuretano
impregnada de soluo de nutrientes concentrados. A produo de gs carbnico
e a biomassa foram mximas em 96 horas de cultivo, com 90% de umidade do
meio slido.
Poliestireno comercial pode ser usado como suporte slido inerte para
produo de L-glutaminase por Beauveria sp. (Sabu et al. 2001). Estes autores
citaram que o poliestireno comercializado na forma de esferas expandidas
(dimetro 4 5 mm), sendo que devem ser inicialmente submetidas a um pr-
tratamento em autoclave a 121
o
C por 15 min, quando entram em colapso,
atingindo um tero do tamanho original. Aps, o material deve ser repetidamente
lavado com gua destilada e seco por algumas horas a 110
o
C. Assim, as esferas
de poliestireno ficam preparadas para serem utilizadas como suportes inertes na
produo de enzimas extracelulares por Beauveria sp.

A produo de mangans-peroxidase e lignina-peroxidase foi estudada
em biorreator preenchido com cubos de nylon contendo Phanerochaete
chrysosporium imobilizado (Rivela et al., 2000). Os cubos de 5 mm de nylon
fibroso, foram pr-tratados em gua fervente por 10 min, seguido de lavagem com
gua destilada, secagem temperatura ambiente e esterilizao a 121
o
C por 20
mim. Este sistema mostrou-se adequado para produo das enzimas lignolticas
por cultivo em estado slido, sendo conduzido continuamente por at 20 dias sem
problemas operacionais.
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29
Rodrguez Couto et al. (2001) estudaram a produo de enzimas
lignolticas por Phanerochaete chrysosporium em coluna de leito fixo e biorreator
de imerso, operando com esponjas de polipropileno como suporte. O biorreator
de imerso utilizado foi preenchido por polipropileno e apresentava um sistema
pneumtico, o qual realizava a imerso do suporte slida numa soluo de
nutrientes a uma freqncia de 0,5s
-1
. Os resultados indicaram que este sistema
mostrou-se adequado para a produo de enzimas lignolticas e que os
microrganismos mantiveram-se aderidos a superfcie do polipropileno, uma vez
que o meio lquido manteve a colorao original. Os autores concluram que a
escolha do reator adequado e a seleo do suporte apropriado definem a
eficincia de produo de enzimas lignolticas por cultivos em estado slido.
Culturas de Phanerochaete chrysosporium em suportes inertes (esponja
de nylon) e no inertes (palha de cevada) foram empregadas para a produo da
enzima lacase por cultivo em estado slido (Cabaleiro et al., 2002). Foram
utilizadas palhas de cevada de aproximadamente 3 mm e cubos de nylon fibroso
de 5 mm. O nylon foi tratado em gua fervente por 10 min, seguido de lavagem
com gua destilada. Posteriormente, os cubos foram secos a 60
o
C. Tanto nylon
como palha de cevada foram esterilizados antes dos cultivos. Os autores
verificaram que a produo da lacase foi superior nos cultivos em palha de
cevada, provavelmente devido adio de lignina no suporte que serviu de
ativador e estabilizou a atividade enzimtica. No entanto, trabalhos anteriores
mencionavam que fungos crescem de maneira satisfatria em esponjas de nylon
motivado pela alta porosidade e rigidez. Nesse sentido, a produo de enzimas
por fungos depende da natureza qumica do suporte, alm das suas
caractersticas fsicas.
Amberlite foi utilizado como suporte para cultivo em estado slido de
Giberella fujikuroi (Gelmi et al., 2000). Segundo estes autores, o uso de amberlite
facilita a avaliao da cintica de consumo de nutrientes e no influencia na
medida dos componentes do meio. O preparo do suporte consistiu na secagem a
50
o
C at 10% de umidade, sendo ento misturado com nutriente e soluo
contendo miclio. As velocidades especficas de crescimento elevadas e as
Reviso bibliogrfica

30
concentraes celulares mximas obtidas sugerem o uso de amberlite como
suporte inerte nos cultivos de G. fujikuroi.
Gelmi et al. (2002) desenvolveram um modelo matemtico para cultivo em
estado slido de Giberella fujikuroi em colunas, representando as variaes da
concentrao de biomassa ativa e produo de metablitos secundrios em
diferentes condies de temperatura e atividade de gua. Os autores utilizaram
amberlite com o objetivo de simplificar a modelagem, uma vez que a degradao
do suporte slido foi desconsiderada e os efeitos da transferncia de massa
minimizados. Este modelo reproduziu satisfatoriamente as medidas de biomassa,
uria, oxignio, gs carbnico e cido gibelrico. Alm disso, o modelo sugere que
Giberella fujikuroi no assimila diretamente uria, sendo necessria a
quantificao em laboratrio para identificar os compostos nitrogenados
intermedirios.
A produo de enzimas lignolticas sobre cubos de esponja fibrosa de
nylon em biorreator de tambor rotatrio por Phanerochaete chrysosporium
(Domnguez et al., 2001). Este sistema permitiu a produo contnua de lignina
peroxidase por at 18 dias, sem a ocorrncia de problemas operacionais.
O cultivo de Phanerochete chrysosporium e Phlebia radiata foi conduzido
sobre suporte inerte (esponja de nylon) e natural (cubos de sabugo de milho). De
acordo com Cabaleiro et al. (2002), o meio de cultivo adequado foi escolhido
atravs da produo de enzimas lignolticas. Os resultados no indicaram
influncia significativa do tipo de suporte na produo de enzimas.
Zhao et al. (2001) compararam palha de trigo e carvo vegetal como
suportes inertes para o cultivo de Rhizobium leguminosarum em coluna de 18 cm
de altura por 12 cm de dimetro. Os autores no detectaram diferenas
significativas nas clulas viveis em 24, 48 e 72 horas entre os dois modelos de
suporte.
Esferas de poliestireno foram utilizadas como suporte inerte para
produo de L-glutaminase em estado slido por Vibrio costicola (Nagendra &
Chandrasekaran, 1997). As esferas com 2-3 mm de dimetro foram autoclavadas
Reviso bibliogrfica

31
a 121
o
C por 15 minutos, o que causou um colapso na estrutura e reduziu o
tamanho das partculas para 1-1,5mm. De acordo com os resultados, os autores
sugerem o uso de suportes slidos nutricionalmente inertes nestes cultivos
visando contornar os problemas operacionais na obteno de bioprodutos teis
tais como enzimas, cidos orgnicos e antibiticos.
Rinzema et al. (1997) utilizaram esferas de gar com cido olico e
glicose como meio de cultura definido para cultivo de Rhizopus oligosporium. Os
autores verificaram que nas colunas de leito fixo o meio de cultura contendo
glicose apresentou perodos de metabolismo anaerbio. No entanto, a utilizao
de esferas de gar com cido olico em colunas rotatrias mostrou ser uma
perspectiva interessante para estes processos, uma vez que nesta situao no
houve converso anaerbia.
A produo de enzimas ligninolticas por Phanerochaete chrysosporium
foi estudada em biorreator de tambor rotatrio (Dominguez et al., 2001). Os fungos
foram cultivados sobre cubos de esponja de nylon. O nylon foi preferido como
suporte devido principalmente sua natureza inerte, o que permite avaliar a
eficincia do biorreator sem as interaes de uma srie de variveis com um
suporte no inerte. Alm disso, a alta aspereza, natureza hidrofbica e alta
porosidade permitem a aderncia do fungo ao suporte e uma difuso de nutrientes
e oxignio eficiente no leito do reator. O suporte foi preparado por aquecimento e
lavagem com gua destilada, secagem temperatura ambiente e foi autoclavado
a 121
o
C por 20 minutos. Os resultados obtidos foram satisfatrios para produo
de enzimas lignolticas para esta configurao de biorreator.
Mariano et al. (1995) desenvolveram um modelo matemtico para o
crescimento de fungos filamentosos em leito fixo usando amberlite como suporte
inerte. Este sistema composto de poros heterogneos de um material
biologicamente inativo impregnado de meio de cultura definido e inculo. O
modelo matemtico mostrou-se eficiente na estimativa de parmetros biolgicos
de difcil medida experimental.
Reviso bibliogrfica

32
Demirci & Pometto (1995) conduziram fermentao lctica por
Lactobacillus casei em suportes inertes plsticos. Os suportes foram obtidos a
partir da mistura de polipropileno, casca de gros, albumina bovina e extrato de
leveduras. Ho et al. (1997) avaliaram os efeitos de diferentes componentes
agrcolas nas propriedades de suportes plsticos usados na produo de cido
lctico por cultivo em biofilmes. Foram usados 50% de componentes de origem
agrcola e 50% de polipropileno. Segundo esses autores, os resultados indicaram
que a formulao usando 35% de cascas, 5% de farinha de soja, 5% de extrato de
leveduras e 5% de albumina bovina apresentou grande potencial para ser utilizado
como meio nutricional e suporte para desenvolvimento do biofilme e produo de
cido lctico.
Segundo Ooijkaas et al. (2000a), os suportes inertes com meios de
cultura definidos devem continuar sendo avaliados uma vez que permitem
reprodutibilidade dos experimentos e estudos de cintica em cultivos em estado
slido.

3.6 Determinao da concentrao celular no cultivo em estado slido
A determinao da biomassa constitui um parmetro fundamental na
caracterizao do cultivo microbiano. Nos processos em estado slido
geralmente impossvel obter medidas diretas da biomassa j que, como os
microrganismos crescem aderidos superfcie e esto intimamente ligados
matriz slida, a biomassa no pode ser separada quantitativamente (Durand et al.,
1997; Viccini & Mitchell, 2003). Desta forma, estes estudos baseiam-se em
mtodos indiretos de estimativa de biomassa, tais como medidas de componentes
celulares, taxas de consumo de oxignio ou produo de gs carbnico.
Nos processos em estado slido existem trs fases, ou seja, uma matriz
slida (orgnica, mineral ou sinttica), uma fase lquida que circunda a matriz e a
fase gasosa. Como os microrganismos podem estar presentes nas trs fases,
difcil a determinao direta da biomassa. Na fermentao submersa os
microrganismos so facilmente separados do meio de cultivo, uma vez que
Reviso bibliogrfica

33
envolve formas esporuladas ou unicelulares. No entanto, quando os fungos
crescem em estado slido na forma de miclio, as hifas penetram na matriz slida,
tornando impossvel a separao da biomassa (Durand et al, 1997).
Em geral, os mtodos de anlise de constituintes celulares baseiam-se na
medida de glucosamina, ergosterol, quitina, cidos nuclicos, acares totais e
protena (Sharma et al., 1977; Desgranges et al., 1991; Scotti et al, 2001).
De acordo com Durand et al. (1997) alguns metablitos esto associados
ao crescimento e podem ser usados como indicadores da biomassa, tais como
enzimas extracelulares, ATP e consumo de substrato. Por exemplo, a atividade de
-amilase diretamente proporcional massa de miclio de Aspergillus oryzae. O
teor de ATP pode ser usado como indicador de biomassa, embora no seja
preciso na fase de crescimento estacionrio. Alm disso, o consumo de substratos
pelo microrganismo nos cultivos em estado slido resulta em uma seqncia
metablica complexa srie de passos. (Viccini & Mitchell, 2003). Se a fonte de
carbono um polmero, incluir a liberao de enzimas hidrolticas e sua difuso
dentro das partculas do substrato, a reao com o polmero para liberar
compostos solveis, a difuso destes compostos dentro da matriz slida e o
consumo pela biomassa (Mitchell et al, 1991).
Zhao et al. (2001) trabalhando com Rhizobium leguminosarum, estimaram
a biomassa pelo nmero de clulas viveis. Aproximadamente 1g da massa
fermentada foi misturada com 10mL de gua destilada estril e agitado
vigorosamente por 10min. O extrato foi ento diludo e plaqueado. Os resultados
foram expressos em unidades formadoras de colnias (UFC).
Os mtodos de estimativa de biomassa em linha compreendem a medida
de evoluo de gs carbnico ou consumo de oxignio (Durand et al, 1997).
Pouca ateno tem sido dada aos sistemas de medida utilizados nos
cultivos em estado slido. Viccini & Mitchell (2003) desenvolveram um modelo
matemtico para converter os dados obtidos em termos de concentrao absoluta
(massa de biomassa seca por massa de substrato seco inicial) e concentrao
relativa (massa de biomassa seca por massa de matria seca na amostra no
Reviso bibliogrfica

34
momento da amostragem). Devido ao fato da maioria dos biorreatores
apresentarem gradientes em macroescala, cujos efeitos so descritos por
equaes diferenciais parciais, os pesquisadores costumam usar equaes
empricas para descrever a cintica de crescimento. No entanto, nos ajustes com
equaes empricas simples, existe uma complicao pelo fato da matria seca do
leito do substrato diminuir durante a fermentao, devido liberao de gs
carbnico (Figura 3.11).

Figura 3.11 Representao da perda de matria seca (Adaptado de Viccini &
Mitchell, 2003)

Desgranges et al. (1991) avaliaram a variao de glucosamina, ergosterol
e acares totais durante o cultivo de Beauveria bassiana em estado slido, sendo
que glucosamina foi considerada como melhor indicador da biomassa.
Auria et al. (1993) propuseram a medida da queda de presso do leito de
fermentao para quantificar as mudanas macroscpicas nos processos em
estado slido. Segundo esses autores, um aumento na queda de presso est
correlacionado com as diferentes fases de crescimento fngico. Durante o
processo de esporulao, ocorre rpido crescimento dos fungos, o que reduz os
espaos interpartculas, causando um aumento na queda de presso.
Reviso bibliogrfica

35
3.6 Extratos alergnicos
Os extratos brutos contm substncias extradas da biomassa fngica
mediante processos simples em que se empregam lquidos extratores como gua
ou solues de Tris-HCl, Evans, Coca, Frugoni e solues bicarbonatadas. So
compostos de protenas, carboidratos e outros componentes em menor
concentrao. As protenas so os principais compostos alergnicos, sendo que
para sua utilizao em diagnstico e terapia de alergia torna-se imprescindvel o
fracionamento e padronizao destes extratos (Basomba, 1982; Menezes et al.,
1995). A maioria das pesquisas realizadas com alergia em fungos apontam a
atividade alergnica de protenas de massas moleculares entre 10 e 150 kDa.
Os extratos alergnicos utilizados para fins diagnsticos e de terapia so
preparados a partir de esporos e do miclio vegetativo de fungos (Yunginger,
1988), sendo que os mais importantes j estudados referem-se aos gneros
Alternaria, Aspergillus, Penicillium e Cladosporium. Yunginger (1980) isolaram um
alrgeno de Alternaria alternata, denominado-o de Alt-1, a partir de fermentao
submersa a 25
o
C em meio Czapeck suplementado com maltose, dextrose e
tripticase. Aspergillus sp. um importante fungo anemfilo, detectado em
praticamente todos os pases. Extratos fngicos deste gnero tm sido estudados
principalmente no que diz respeito produo de reagentes para diagnstico da
aspergilose broncopulmonar, para controle de produo de toxinas (Hoffman,
1984). Espcies de Penicillium sp. foram isoladas dos mais variados ambientes,
sendo que a maior fonte de alrgenos foi considerada no interior de residncias.
Fungos do gnero Cladosporium sp. so anemfilos mais freqentes em regies
com clima temperado (Bush, 1993).
De acordo com Marques (1997), para cada fungo, a quantidade e a
qualidade das fraes alergnicas esto associadas com os substratos, condies
de cultivo e lquido extrator. O estabelecimento criterioso destes parmetros de
processo representa uma condio bsica para a padronizao dos extratos
alergnicos de fungos.
Reviso bibliogrfica

36
3.7 Extratos alergnicos de Drechslera (Helminthosporium) monoceras
A literatura apresenta poucos estudos sobre os extratos alergnicos de
Drechslera (Helminthosporium) monoceras. Praticamente os trabalhos so de
Menezes et al. (1995) os quais realizaram um extenso estudo sobre a
alergenicidade do extrato obtido da sua biomassa cultivada em fermentao
submersa. As fraes proticas mais alergnicas foram identificadas como as de
massas moleculares 60, 36 e 14,4 kDa, designadas por Dre 1, 2 e 3,
respectivamente. Em trabalhos do nosso grupo, Saraiva (2001) estudou o
processo de extrao, por meio de diferentes lquidos, de componentes da
biomassa de Drechslera monoceras produzido por fermentao em estado slido
usando farelo de trigo e bagao de cana-de-acar. Obteve melhores resultados
de extrao de protenas usando gua como lquido extrator (relao 1:15 slido-
solvente), pH entre 8,3 e 9, a temperatura de 30
o
C. Hasan (2002) estudou a
produo de protenas alergnicas da biomassa de Drechslera
(Helminthosporium) monoceras obtida por fermentao em estado slido em
biorreator de leito fixo, do tipo colunas de Raimbault. Nesse trabalho, foram
otimizadas as condies operacionais atravs de planejamento e anlise
estatstica de experimentos. Para o farelo de trigo, substrato que apresentou maior
produtividade comparado ao bagao de cana e farelo de milho, as condies
otimizadas partindo-se de 0,4 mg/mL de inculo, temperatura 25
o
C e vazo de ar
2 L/h foram pH 9,5 e 45,8% de umidade. Na faixa de variveis estudadas, os
efeitos da vazo de ar no foram significativos ao nvel de 90%, porm a evoluo
dos perfis de biomassa e glicose ao longo dos cultivos indicou possveis limitaes
de transferncia de oxignio no sistema. Ainda nesse trabalho foi estudada a
obteno do extrato alergnico a partir da semi-purificao do extrato bruto com a
precipitao das protenas e remoo de polifenis. Como os resultados de Hasan
(2002) sugeriram limitaes de transferncia de oxignio e apontam para a
necessidade de um estudo particular a respeito desde aspecto especfico.

4 MATERIAIS E MTODOS
4.1 Materiais
Nos ensaios foram utilizados como suportes naturais farelo de trigo com
granulometria 0,35 e 0,59mm, classificados num conjunto de peneiras Tyler. O
farelo foi obtido no Moinho Paulista, S.A. e mantido no laboratrio com
aproximadamente 12% de umidade (base mida) a temperatura ambiente. A
espuma de poliuretano foi obtida no comrcio local na forma de cubos, sendo
confeccionados cilindros 30mm de dimetro por 30mm de altura para adaptao
nas colunas. Estes foram mantidos secos no laboratrio a temperatura ambiente
em dessecador. Os reagentes utilizados nas anlises e na composio dos meios
de cultura foram de qualidade p.a.

4.2 Caracterizao dos suportes
4.2.1 Densidade e porosidade dos suportes
A densidade real e aparente dos leitos formados por farelo de trigo foram
determinadas por picnometria, por meio da medio indireta da massa e do
volume do slido em picnmetro, utilizando gua. Pesou-se o picnmetro vazio e
aps, com gua. Atravs da massa, obteve-se o volume de gua usando a
densidade na temperatura considerada (densidade da gua Mili-Q a 23C 0,998
g/cm
3
). O picnmetro foi ento preenchido com os slidos e pesado, calculando-se
a densidade aparente que a razo entre a massa de slidos e o volume do
picnmetro, ou seja, o volume aparente que corresponde aos slidos e a frao de
vazios. O volume real de slidos foi calculado aps determinao da frao de
vazios, a qual obtida por preenchimento do picnmetro que contm os slidos
com gua Mili-Q a 23C, seguido de pesagem. Pela densidade da gua, calcula-
se o volume de vazios e o volume real de slidos. A metodologia desconsidera a
quantidade de gua que penetra nos poros do slido. A porosidade () do leito de
partculas foi calculada a partir da densidade real (
real
) e densidade aparente (
ap
)
atravs da equao 4.1 (Henderson & Perry, 1976).
Materiais e mtodos

38
|
|
\
|
=
real
ap
1 (Eq. 4.1)
A espuma de poliuretano foi caracterizada pela sua capacidade mxima
de absoro de gua conforme proposto Lareo et al. (2005). Aps a secagem a
105C por 24h, as amostras foram acondicionadas em dessecador, sendo
pesadas e posteriormente imersas em gua a temperatura ambiente (23C) em
um frasco posicionado no prato de uma balana analtica. A seguir, aps a
estabilidade da medida da massa do conjunto, a amostra foi retirada, sendo o
excesso de gua escorrido naturalmente e pesado separadamente. A capacidade
mxima de absoro de gua foi estimada pelo peso da amostra seca (A) e peso
da amostra mida (B), de acordo com a Eq. 4.2. Assim, sabendo-se a quantidade
de gua absorvida no suporte inerte tem-se o volume dos poros, permitindo a
estimativa do volume real de slido descontando o volume de gua absorvida do
volume aparente. Desta forma, pela caracterizao da absoro de gua
possvel estimar a densidade real e aparente e calcular a porosidade do suporte.
100 x
A
A B
(%) Absoro |
\
|
= (Eq. 4.2)

4.2.2 rea superficial dos suportes
As amostras foram previamente secas em estufa a 105
o
C por 24 horas e
pesadas em balana analtica. Em seguida, a rea superficial dos suportes foi
determinada por fisioadsoro com nitrognio no equipamento BET Surface Area
ASAP 2010, no Laboratrio de Recursos Analticos e de Calibrao (LRAC
/FEQ/UNICAMP)

4.2.3 Anlise granulomtrica
O tamanho das partculas de farelo de trigo ao longo dos cultivos foi
estimada por anlise granulomtrica em um conjunto de peneiras Tyler
intercaladas de MESH 12, 20, 28, 48 e 100. O dimetro mdio das partculas (dp)
Materiais e mtodos

39
foi calculado conforme Eq. 4.3 (Henderson & Perry, 1976), sendo que o ndice da
equao corresponde a uma relao entre frao em massa retida e a quantidade
de peneiras utilizadas.

dp= 0,1041(2)
ndice
(Eq. 4.3)

O dimetro mdio de partculas de farelo de trigo fermentadas foi
determinado por espalhamento de luz com laser de alta potncia no Mastersizer
S (Malvern), tendo como dispersante gua destilada, no Laboratrio de
Recursos Analticos e de Calibrao (LRAC /FEQ/UNICAMP).
As amostras de farelo de trigo e espuma de poliuretano foram
visualizadas em microscpio tico LEICA DML com aumento de dez vezes no
Laboratrio de Recursos Analticos e de Calibrao (LRAC/FEQ/UNICAMP),
utilizando software LEICA Quips e LEICA QFAB para realizar medidas de
espessura de filme lquido nas fotografias.

4.3 Preparo do inculo
4.3.1 Manuteno das culturas
A cepa do fungo Drechslera (Helminthosporium) monoceras (ICB USP K-
1-16 e CBS 154.26) foi cedida pelo Prof. Dr. Walderez Gambale do Departamento
de Microbiologia (Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo),
sendo mantida em tubo inclinado com gar-batata e leo mineral, a temperatura
ambiente (Hasan, 2002).
4.3.2 Pr-cultivo
A cultura foi propagada em frascos Erlenmeyer de 1000 mL contendo 600
mL de meio inclinado de gar-Czapeck. Aps um perodo de 14 dias, o miclio e
esporos foram suspensos em 200 mL gua destilada estril. Com a presena em
muito maior proporo do miclio vegetativo em relao aos esporos, conforme
observado no trabalho de Hasan (2002), a inoculao foi feita principalmente com
Materiais e mtodos

40
miclio, sendo a sua concentrao determinada atravs de curva-padro de
massa celular seca (em anexo), com leituras de absorbncias das diluies a 550
nm (Menezes et al., 1995).
O meio de cultura gar-Czapeck modificado por Yunginger et al. (1980) foi
composto por: NaNO
3
(2g), K
2
HPO
4
(1g), MgSO
4
(0,5g), KCl (0,5g), FeSO
4

(0,01g), maltose (15g), dextrose (15g), peptona bacteriolgica (10g), gar-gar
(15g) e gua destilada (1000mL). Neste meio de cultivo foram adicionados 40gL
-1

de substrato slido para adaptao prvia do microrganismo ao meio final de
fermentao. O meio de cultura foi autoclavado a 121
o
C por 20 minutos.

Materiais e mtodos

41
4.4 Caracterizao dos cultivos em estado slido em colunas de Raimbault
Inicialmente foram realizados ensaios em colunas de Raimbault nas
condies otimizadas por Hasan (2002), consideradas como ponto de partida para
os prximos experimentos (Fig. 4.1). Foi utilizado como substrato o farelo de trigo,
sendo autoclavado conforme descrito no item 4.2.2 e classificado por meio de
peneiramento nos diferentes nveis de umidade.

Figura 4.1 Sistema de colunas de Raimbault apresentando doze colunas em
banho termostatizado

A inoculao das culturas de Dechslera (Helminthosporium) monoceras
foi realizada em cmara de fluxo laminar com bico de Bunsen. O substrato slido
foi inoculado e homogeneizado em sacos de polipropileno e autoclavado conforme
descrito no item 4.2.2. O pH inicial do meio foi ajustado utilizando soluo KOH
1N. A umidade inicial do meio slido foi corrigida em 45% pela soluo contendo o
inoculo, com posterior adio de gua Mili-Q esterilizada. Os ensaios foram
conduzidos por sete dias nas seguintes condies previamente otimizadas: farelo
de trigo com 0,59 mm de tamanho de partcula, 25
o
C, pH 9,5, 0,4 mg.mL
-1
de
inculo com 14 dias, umidade inicial de 45% (contedo em base mida) e vazo
Materiais e mtodos

42
de ar de 2 L/h. Os perfis de umidade do substrato slido, pH, teor de acares e
protena no extrato bruto foram determinados ao longo dos cultivos.

4.5 Cultivos em estado slido com farelo de trigo
Para os cultivos em estado slido nas diferentes condies de altura de
leito fixo, vazo de ar, dimetro das partculas de farelo de trigo e umidades
iniciais do meio slido foi considerado um sistema de biorreatores de coluna com
monitoramento da vazo de ar, umidade relativa, temperatura e oxignio,
conforme Figura 4.2. A unidade experimental incluiu trs sistemas bsicos:
monitoramento de gases na entrada e sada do biorreator, umidificao do ar e
reao. O sistema de alimentao de ar consiste num compressor de ar
odontolgico. O ar foi primeiramente distribudo para as colunas, sendo aps
umidificado em frascos erlenmeyers de 250 mL com 150 mL de gua destilada
previamente esterilizada. A vazo de ar na entrada e sada das colunas foi
monitorada durante os cultivos, sendo que a baixa vazo (2L/h) foi medida em
manmetro tipo U inclinado e as altas vazes de ar (0,2 a 1L/min) por rotmetros
OMEL
. A umidade relativa do ar da entrada das colunas foi monitorada por

Termohigrmetro Digi-Sense
. Inicialmente foram realizados ensaios com meio

slido nas diferentes alturas de meio para assegurar a ausncia de gradientes de
temperatura ao longo da coluna. Assim, a temperatura do meio slido durante os
cultivos foi monitorada por termopares IOPE SP-G 22C8. As colunas de vidro com
dimenses 20 cm de altura por 3 cm de dimetro foram preenchidas com o meio
slido at completar as diferentes alturas de leito. O preparo do meio slido
ocorreu conforme item 4.3, considerando as diferentes condies de dimetro das
partculas e umidades iniciais do meio slido. Assim, a umidade foi ajustada com a
soluo de inculo e gua Mili-Q esterilizada quando necessrio. As amostras de
meio slido foram retiradas durante os cultivos do topo do leito de partculas,
caracterizando desta forma um perfil axial. Foram realizados ensaios preliminares
utilizando termopares para verificar a ausncia de gradientes de temperatura ao
longo da coluna nas diferentes alturas de leito.
Materiais e mtodos

43
Os ensaios em coluna encamisada de dimenses maiores (50mm de
dimetro x 320mm de altura) foram conduzidos de acordo com o mesmo
procedimento apresentado anteriormente, conforme Fig. 4.3.

Figura 4.2 Sistema de colunas para avaliao da transferncia de oxignio em
diferentes alturas de leito fixo
Leito de substrato
slido
Umidificador
Compressor
odontolgico
Banho termostatizado
Rotmetro
Distribuidor de
ar
Medidor
umidade relativa
Sistema de
umidificao
Sistema de
alimentao
Sistema de
Reao
FI
Oxmetro

Figura 4.3 Unidade experimental para biorreator de coluna (50mm x 320 mm)
Materiais e mtodos

44
4.6 Cultivos sobre suporte inerte
Os ensaios utilizando espuma de poliuretano foram conduzidos nas
condies de vazo de ar e altura de leito selecionados nos experimentos
anteriores com suporte natural de farelo de trigo, em colunas de dimetro 30mm e
altura 200mm, de acordo com a Fig. 4.4.

Figura 4.4 Sistema de coluna com leito de espuma de poliuretano

Um cilindro de espuma de poliuretano com dimetro igual ao dimetro
interno das colunas (30mm) foi impregnado com soluo nutriente para obteno
da seguinte composio em base seca: NaNO
3
(8,87mg/g), K
2
HPO
4
(4,44mg/g),
MgSO
4
(2,22mg/g), KCl (2,22mg/g), FeSO
4
(0,205mg/g), ZnSO
4
(0,205mg/g) e
CuSO
4
(0,205mg/g). Estes nutrientes apresentaram a composio do meio
Czapeck, mantendo a mesma relao nutriente/meio slido utilizada nos ensaios
com farelo de trigo. O pH inicial da soluo nutriente foi ajustado com soluo
KOH 1N. Em seguida, os cilindros j contendo os nutrientes foram esterilizados
em sacos de polipropileno a 121
o
C por 20 minutos em autoclave, resfriados a
Materiais e mtodos

45
temperatura ambiente, sendo adicionado posteriormente glicose (66,58mg/g),
maltose (66,58mg/g), peptona (49,32mg/g) e CaCO
3
(24,66mg/g). Aps, a
umidade inicial foi ajustada, considerando a massa seca da espuma, com soluo
contendo inculo e gua Mili-Q esterilizada, quando necessrio.

4.7 Obteno do extrato fngico bruto
O extrato fngico bruto de Drechslera (Helminthosporium) monoceras foi
obtido conforme metodologia proposta por Menezes et al. (1995), adaptada para
fermentao em estado slido por Saraiva (2001). O meio slido obtido nos
diferentes tempos de cultivo foi seco a 37
o
C por 48 horas. O extrato foi ento
obtido por triturao do farelo de trigo fermentado seco com gua Mili-Q
(proporo 1:15) em almofariz, sendo aps transferido para frascos Erlenmeyer e
incubado por 16 horas a 30
o
C com agitao constante em incubadora tipo shaker
orbital (G24 Environmental Incubator Shaker). No caso dos ensaios com espuma
de poliuretano, o suporte slido contendo os microrganismos aderidos foi tratado
com gua Mili-Q, obtendo-se uma suspenso fngica.
Para ambos suportes o pH da extrao foi ajustado em 9 por adio de
NaOH 1N. O extrato foi filtrado, centrifugado a 10.000xg durante 15 minutos,
sendo que o sobrenadante obtido foi conservado a 4
o
C para posterior anlise.

4.8 Anlises
4.8.1 Contedo de umidade do suporte slido
A umidade do meio slido (base mida) foi determinado por gravimetria,
em estufa a 105
o
C at peso constante, utilizando dessecador e balana analtica
(Shojaosadati & Babaeipour, 2002).

Materiais e mtodos

46
4.8.2 pH do meio slido
O pH foi medido com pHmetro nos ensaios preliminares com farelo de
trigo a partir de suspenso de 2g meio slido fermentado em 50 mL de gua
deionizada.
4.8.3 Teor de protena no extrato bruto fngico
O teor de protenas obtido no extrato bruto foi quantificado atravs do
ensaio colorimtrico de Bradford (Bradford, 1976). O reagente de Bradford foi
preparado dissolvendo 0,1g de Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50mL de etanol
95%, com agitao, seguido de adio de 100mL de cido fosfrico 85%. Esta
soluo foi agitada por 2 horas, sendo completado o volume para 1L com gua
mili-Q. Aps 6 horas de agitao em shaker, o material foi filtrado, sempre
protegido com papel alumnio, e mantido em refrigerao por 24 horas antes de
ser utilizado. Assim, para medida da absorbncia, 1,5mL do reagente de Bradford
pronto foi misturado com 30L de amostra e agitado em tubos de ensaio. Aps 10
minutos, as leituras foram realizadas em espectrofotmetro a 595nm. Foi
preparada uma curva de calibrao (em anexo) com BSA (albumina do soro
bovino) como protena padro.

4.8.4 Teor de acares redutores no extrato bruto fngico
O teor de glicose do extrato fngico foi determinado pelo mtodo
enzimtico utilizando o Kit Glicose Oxidase da LABORLAB
. Inicialmente foi
preparada uma curva padro utilizando diferentes concentraes de glicose. Foi
utilizado 20L de amostra para cada 2mL do reativo de trabalho contendo glicose
oxidase, sendo incubado a 37
o
C por 10 minutos, seguido de leituras em
espectrofotmetro a 505 nm.

Materiais e mtodos

47
4.8.5 Rendimento de glicose em protenas
O rendimento de glicose em protenas Y
P/S
foi calculado pela relao das
taxas de produo de protena e consumo de glicose em cada tempo considerado,
conforme Eq. 4.4:
|
\
|
|
\
|
=
dt
d
dt
d
Y
glicose
protena
P/S
(Eq. 4.4)

4.8.6 Caracterizao das protenas por SDS-PAGE
A identificao das protenas nos extratos brutos obtidos foi feita pela
determinao das massas molares por eletroforese SDS-PAGE (Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), sendo utilizados gis de 7,5 e
12,5% de poliacrilamida, no Laboratrio de Interao Molecular e Bioengenharia
(LIMBio/FEQ/UNICAMP). Para o gel de 12,5% foi utilizado marcador de baixa
massa molar da GE Healthcare
, o qual contm as seguintes protenas e enzimas

padro: fosforilase b (97kDa), albumina (66kDa), ovalbumina (45kDa), anidrase
carbnica (30kDa), inibidor de tripsina (20,1kDa) e -lactalbumina (14,4kDa). Para
o gel de 7,5% foi usado marcador de alta massa molar da GE Healthcare

contendo as seguintes protenas padro: miosina (212kDa), 2-macroglobulina
(170kDa), -galactosidase (116kDa), transferrina (76kDa) e desidrogenase
glutmica (53kDa).
As protenas da amostra foram desnaturadas por aquecimento a 100C na
presena de SDS e reduzidas na presena de -mercaptoetanol. As eletroforeses
foram realizadas no sistema Mini-protean II da Biorad (1988), com fonte de 190V
por 45min. A revelao das protenas no gel foi feita com nitrato de prata
(Morrissey, 1981). A primeira raia de cada gel foi reservada para o marcador de
massa molar, sendo as demais para as amostras de extrato. Em cada raia foi
Materiais e mtodos

48
aplicado 10L de amostra previamente diluda, de modo a ter-se uma
concentrao de aproximadamente 0,2mg/mL.
A identificao das massas molares das protenas foi realizada a partir de
curva de calibrao, sendo graficados os logaritmos decimais das massas
moleculares das protenas do marcador com os valores da relao entre a
distncia percorrida pela protena aps o trmino da corrida eletrofortica e a
distncia total no gel, R
f
, apresentadas nas Figuras 7 e 8 dos Anexos.

4.9 Determinao do coeficiente global de transferncia de oxignio
A taxa global de transferncia de oxignio (N) e o coeficiente global de
transferncia de oxignio gs-lquido (K
L
a) foram determinados atravs do balano
de oxignio nas colunas e pela estimativa do perfil radial de oxignio dissolvido no
biofilme, respectivamente (Gowthaman et al., 1995). O perfil da concentrao de
oxignio no biofilme lquido formado na superfcie dos suportes slidos foi
calculado de acordo com Thibault et al. (2000), conforme Eq. 4.5, assumindo que:
(a) O consumo de oxignio igual demanda de oxignio na fase
gasosa em cada seo do leito fixo de partculas, ou seja, regime permanente;
(b) Os fungos so incapazes de penetrarem na matriz slida, crescendo
apenas na superfcie das partculas slidas, ou seja, no filme lquido que envolve
os suportes (Figura 4.5);
(c) A espessura do biofilme constante durante o cultivo, no entanto, h
possibilidade de considerar a transferncia de oxignio a diferentes espessuras;
(d) A densidade do biofilme constante e a taxa de consumo de
oxignio uniforme para espessura de biofilme considerada, sendo que h um
perfil de oxignio dissolvido ao longo do filme;
(e) A difusividade de oxignio na fase lquida constante, considerada
igual difusividade em gua a 25
o
C;
Materiais e mtodos

49
(f) A concentrao de oxignio no gs est em equilbrio com o lquido
na interface, podendo ser calculada pela Lei de Henry;
(g) Os suportes so homogneos; no caso de farelo de trigo, todas as
partculas so esfricas e apresentam o mesmo tamanho; no caso de espuma de
poliuretano, o suporte apresenta-se como cilindro contendo poros com volumes
iguais;
(h) A vazo volumtrica de ar constante ao longo do biorreator.

Figura 4.5 Representao dos mecanismos de transferncia de oxignio nos
cultivos em estado slido (Adaptado de Gowthaman et al., 1995)

A concentrao de oxignio foi medida na entrada e sada dos
biorreatores por oxmetro YSI
5301B. A espessura do biofilme foi considerada

constante de acordo com trabalhos anteriores (Thibault et al., 2000) e medida por
microscopia para diferentes condies de umidade do meio slido. A difusividade
de oxignio na fase lquida foi considerada para gua a 25C (2,5.10
-9
m
2
/s).
Sendo assim, fazendo o balano de oxignio no filme lquido (resoluo em
anexo) tem-se que:
2 2
2
2
2
O
L L
L , O
R
dr
dC
r dr
C d
D =
|
|
\
|
+ (Eq. 4.5)
Materiais e mtodos

50
onde r a posio radial (m); D
O2,L
a difusividade de oxignio na fase
lquida (m
2
/s); C
L
a concentrao de oxignio no lquido (mol/m
3
); R
O2
a taxa de
consumo de oxignio no biofilme. As condies de contorno foram:
0 0 = =
dr
dC
; r
L
(Eq. 4.6)
dr
dC
D
dr
dC
D ; R r
S
L S
L , O
F
L F
L , O
2 2
1
= =
(Eq. 4.7)
( )
i
G G G
F
L F
L , O
C C k
dr
dC
D ; R r = =
2
2
(Eq. 4.8)
onde R
1
o raio da partcula slida (m); R
2
o raio da partcula slida
mais biofilme (m); D
O2
F
L
a difusividade de oxignio do filme na fase lquida
(m
2
/s); D
O2
S
L
a difusividade de oxignio do fase lquida na partcula (m
2
/s);C
L
a
concentrao de oxignio dissolvido na fase lquida (mol/m
3
); C
G
a concentrao
de oxignio na fase gs; C
G
i
a concentrao de oxignio na interface ou a
concentrao de saturao (mol/m
3
); k
G
o coeficiente de transferncia de
oxignio da fase gasosa. O coeficiente de transferncia de massa convectivo pode
ser estimado por vrias correlaes na literatura. De acordo com a Eq. 4.9
(Brodkey & Hershey, 1988), k
G
pode ser obtido para a faixa de vazo de ar
utilizados, considerando o Nmero de Reynolds (Re), dimetro mdio das
partculas (d
p
) porosidade do leito de partculas () e difusividade de oxignio no
gs (D
O2,G
):
Re
) (
,
D
dp k
1,4
,
G , O
G
4 1
1
1 0
2

= (Eq. 4.9)
O coeficiente de transferncia de oxignio gs-lquido (K
L
a) foi determinado
nas condies experimentais atravs do balano de oxignio nos biorreatores,
considerando sempre o maior gradiente da concentrao de oxignio dissolvido
verificado ao longo do biofilme formado ao redor das partculas slidas.
Primeiramente, a taxa global de transferncia de oxignio (N) foi calculada de
acordo com a Eq. 4.10, onde Vs o volume de meio slido; Q a vazo
Materiais e mtodos

51
volumtrica do ar; T a temperatura na entrada e sada das colunas; R a
constante dos gases e p a presso parcial de oxignio no gs de entrada e
sada das colunas:

T
Qp
T
Qp
RV
1
N
saida entrada S
(
\
|
|
\
|
= (Eq. 4.10)

( ) C C a K N
L L
=

(Eq. 4.11)
Assim, K
L
a foi calculado atravs da Eq. 4.11, assumindo C
*
como a
solubilidade de oxignio na fase lquida na temperatura e presso consideradas. A
concentrao de oxignio no filme lquido formado na superfcie da matriz slida
(C
L
) foi estimada atravs do perfil radial de oxignio no biofilme formado em torno
das partculas (Equao 4.5). A taxa mdia de consumo de oxignio (
2
O
R ) em
termos de volume de biofilme foi calculada de acordo com a Eq. 4.12,
considerando a diferena de concentrao de oxignio na fase gasosa (C
G
) na
entrada e sada das colunas. Como o denominador da Eq. 4.12 o volume de
biofilme, utilizou-se volume total de filme lquido formado ao redor das partculas
de farelo de trigo e nos poros da espuma de poliuretano. Assim, R
1
a distncia
do centro da partcula at a superfcie do suporte (raio das partculas esfricas);
R
2
a distncia do centro das partculas at a superfcie do biofilme; n
p
o
nmero de partculas no leito ou o nmero de poros da espuma de poliuretano,
calculado para o volume de meio slido considerado.
( ) ( ) ( )
( ) ( )

R R 4/3 n
QC QC
R
3
1
3
2 p
saida G entrada G
O
2
=
(Eq. 4.12)
A espessura do biofilme foi assumida como sendo constante e igual a
25m para os ensaios iniciais (Thibault et al., 2000) e determinada por
microscopia em diferentes condies de umidade para farelo de trigo e espuma de
poliuretano. A densidade do biofilme foi assumida como constante e igual a da
gua (Mitchell et al., 2003).
Materiais e mtodos

52
Assim, para clculo do K
L
a foi necessrio a estimativa de C
L
. Partindo das
condies de contorno apresentadas e conforme resoluo em anexo, temos o
perfil radial de oxignio no biofilme considerando consumo de oxignio segundo
reao de ordem zero (Eq. 4.13):
1
r
R
R
R
2 1
R
r
C , D
R R
6
1
1
C
(r) C
2
3
2
1
2
2
*
L O
2 O
*
L
2
2
(
(
\
|

|
|
\
|
+
|
|
\
|
|
|
\
|
|
|
\
|
+ =
(Eq. 4.13)
4.10 Estimativas da concentrao celular
4.10.1 Demanda de oxignio
A taxa de consumo de oxignio (
2
O
R ) por Drechslera (Helminthosporium)
monoceras em meio lquido Czapeck foi determinada pela equao 4.14, sendo
obtidas as curvas de concentrao oxignio dissolvido (
2
O
C
) versus tempo. Os
ensaios foram realizados em cubetas com banho agitado e termostatizado (YSI

5301B Standard Bath), sendo utilizado 10 mL de caldo Czapeck. A concentrao
de oxignio dissolvido foi medida por oxmetro YSI
Model 5300 e a taxa

especfica de consumo de oxignio (q
o
) foi calculada conforme a Eq. 4.15 para
cada concentrao celular (X). Partindo-se de uma soluo concentrada de
inoculo (0,186mg/mL) foram realizadas cinco diluies para avaliao do consumo
de oxignio. Assim, foi estabelecida uma correlao entre a quantidade de
biomassa e a taxa de consumo de oxignio para avaliao do perfil da
concentrao celular ao longo dos cultivos em meio slido.
dt
dC
R
L
O
=
2
(Eq. 4.14)
X
R
q
O
o
2
= (Eq. 4.15)
Materiais e mtodos

53
4.10.2 Grau de empacotamento do meio slido
A concentrao celular (X) pode ser relacionada tambm com fator ou
grau de empacotamento do meio slido (), o qual definido pela relao entre o
volume de clulas no leito de partculas (V
m
) e o volume disponvel para o
crescimento microbiano (V
X
). O fator de compactao tem valor unitrio quando as
clulas ocupam todo o espao disponvel para crescimento no leito, ou seja, a fase
lquida mais a fase gasosa quando for o caso de fungos com miclio areo
(Laukevics et al., 1985). Assim, a concentrao celular proporcional ao fator de
compactao conforme a Eq. 4.16, sendo que m
X
a concentrao de biomassa
por massa de meio slido e
ap
a densidade aparente do meio slido.
=
ap X
m X (Eq. 4.16)
Da Eq. 4.16, a concentrao de biomassa (m
X
) pode ser calculada de
acordo com a taxa especfica de consumo de oxignio, considerando a taxa de
consumo por biofilme (R) e a relao entre volume de biofilme e volume de leito
(Eq. 4.17).
ap
leito
biofilme
X
q
)
V
V
( R
m
=
0
(Eq. 4.17)
4.10.3 Balano do grau de reduo
A concentrao celular (X) e o quociente respiratrio (RQ) foram
estimados pela estequiometria da biorreao, considerando o grau de reduo do
substrato e da biomassa. A equao geral para crescimento microbiano aerbio
sem formao de produtos pode ser escrita como:

calor s metablito O H CO Biomassa O Nitrognio de Fonte C de Fonte
2
+ + + + + +
2 2

Esta equao pode ser reescrita tendo glicose como fonte de carbono e
nitrato como fonte de nitrognio:
Materiais e mtodos

54
calor s metablito O eH dCO N O cCH bNO aO O H C
-2
3 2 6 12 6
+ + + + + +
2 2
(Eq. 4.18)
onde (CH
) representa a composio da biomassa e a, b, c, d

e e so os coeficientes estequiomtricos para oxignio, nitrato, biomassa, gs
carbnico e gua, respectivamente. De acordo com Lareo et al. (2005), a
composio elementar para fungos filamentosos seria 40,11% de C, 7,37% de N,
7,13% de H e 40,39% de O, assumindo contedo de cinzas de aproximadamente
5% (Oijkaas et al., 2000). Assim, teramos CH
2,13
O
0,76
N
0,16
e considerando grau de
reduo de glicose (
s
) igual a 4, pode-se calcular os coeficientes a e c da
equao pelo grau de reduo da biomassa (
B
):
B S
c a = 4 (Eq. 4.19)
Partindo dos coeficientes da Eq. 4.18 para oxignio e gs carbnico
obtidos pelo grau de reduo, temos que o quociente respiratrio (RQ) pode ser
calculado pela Eq. 4.20:
a
d
RQ = (Eq. 4.20)
4.10.4 Balano do contedo de gua no meio slido
De acordo com proposto por Lekanda & Prez-Correa (2004), assumindo
que o contedo de gua no leito homogneo, havendo uma umidade mdia no
leito (X
W
), o acmulo de gua (dX
W
/dt) pode ser escrito como:
dt
dM
M
X
M
W F
E R
dt
dX
S
S
W
S
p w
W
W
+ = (Eq. 4.21)
Materiais e mtodos

55
Na equao, R
W
taxa de produo de gua [g
gua
/g
meio slido
.h]; E
representa a perda de gua por evaporao [g
gua
/g
meio slido
.h]; F
W
a quantidade
adicionada por meio slido; W
P
a quantidade de gua perdida no fundo da
coluna; M
S
a massa de meio slido. Considerando que o substrato slido
farelo de trigo, no havendo quantidade de gua adicionada ou perdida alm da
evaporao, temos:
dt
dM
M
X
E R
dt
dX
S
S
W
W
W
= (Eq. 4.22)
No caso de suportes inertes como espuma de poliuretano onde no h
degradao do meio slido, o balano da quantidade de gua torna-se:
E R
dt
dX
W
W
= (Eq. 4.23)
De acordo com a Eq. 4.23, no h acmulo de gua no meio slido e a
umidade mantida constante quando a taxa de produo de gua pelas reaes
metablicas for equivalente taxa de evaporao da gua. A produo de gua
pode ser estimada pelo consumo de glicose de acordo com a reao
estequiomtrica (Eq. 4.18), ou ento pela Eq. 4.24, considerando a produo de
CO
2
. R
CO2
a taxa de produo de CO
2
e k
W
o fator de converso entre a
quantidade de gua e CO
2
produzidos, sendo que o valor tpico fica em torno de
1,15 kg
gua
/kg CO
2
(Lekanda & Prez-Correa, 2004).
S
CO W
W
M
R k
R
2
=
(Eq. 4.24)

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao dos suportes slidos e dos seus leitos
Os farelos de trigo com 12% de umidade original foram esterilizados,
umidificados aos nveis de 25, 35 e 45% e caracterizados pelo dimetro mdio e
distribuio de tamanhos e densidade aparente do leito formado pelas partculas
(
ap
). Os slidos secos foram ainda caracterizados ainda pela sua rea superficial,
tamanho e volume de poros. A espessura inicial do filme lquido ao redor das
partculas foi determinada para os diferentes nveis de umidade inicial e para as
partculas saturadas com gua. O dimetro mdio das partculas midas foi
determinado no incio e ao longo dos ensaios, sendo apresentada a distribuio de
tamanhos em anexo.
Os leitos formados pelas partculas secas e midas foram caracterizados
pela porosidade, determinada indiretamente a partir das densidades real e
aparente das partculas.
A espuma de poliuretano foi caracterizada pela sua capacidade mxima
de absoro de gua, densidade aparente e porosidade do leito formado por um
cilindro de dimetro aproximadamente igual ao dimetro interno da coluna
(30mm).

5.1.1 Densidade aparente e porosidade dos leitos
As Tabelas 5.1 a 5.3 apresentam os resultados de densidade aparente do
farelo de trigo original (12% de umidade) e nos nveis 25, 35 e 45%, assim como
da porosidade dos leitos formados pelas partculas midas. Para a espuma de
poliuretano a densidade aparente e porosidade do leito foram determinados sem
umidificao adicional.
A espuma de poliuretano utilizada apresentou capacidade de absoro de
gua mxima de 17,53mL/g. Esse resultado foi similar ao obtido por Lareo et al.
(2005), trabalhando com cultivo de Mucor bacilliformis em espuma de poliuretano.
Resultados e discusso

58
Tabela 5.1 Densidade aparente e porosidade dos leitos formados por partculas de
farelo de trigo e cilindro de espuma de poliuretano de dimetro 30mm
Suportes
aparente
(g/cm
3
) Porosidade (%)
*Farelo de trigo 0,35mm 0,292 30,5
*Farelo de trigo 0,59mm 0,168 57,14
Espuma de poliuretano 0,0275 66,93
* Farelo com 12% de umidade (base mida)

Observa-se que os valores de densidade aparente obtidos (Tabela 5.1)
foram similares aos encontrados na literatura para diversos tipos de farelos,
estando por volta de 0,2g/cm
3
(Henderson & Perry, 1976).
Nas Tabelas 5.2 e 5.3 observa-se que a umidificao adicional do farelo
de trigo conduz ao aumento do dimetro e densidade aparente das partculas e,
em conseqncia disso, ocorre reduo na porosidade dos leitos de 25,5 a 11,4%
quando a umidade inicial variou de 25 a 45%, para partculas de dimetro original
0,35mm.
A espessura do filme lquido formado na superfcie variou com a umidade
das partculas, sofrendo pequeno aumento (5,28 a 5,46m) quando a umidade do
meio passou de 25 para 35%, porm atingiu 8,83m para 45% de umidade.
Farelo de trigo com dimetro original 0,59mm, (Tabela 5.3) apresentou
menores densidades aparentes (0,17 a 0,20 g/cm
3
) com a variao do nvel de
umidade de 25 a 45%. Nessas condies, a porosidade do leito variou de 54,1
para 46,8% e a espessura do filme lquido na superfcie das partculas foi de 8,74
a 10,55m.

59
Tabela 5.2 Caracterizao do farelo de trigo 0,35mm com diferentes umidades e
da porosidade do leito de partculas
Umidade
(g/100g)
Dimetro
mdio (mm)
ap
(g/cm
3
)
Porosidade
(%)
Espessura mdia
do filme lquido
(m)*
Desvio
padro
(m)
25 0,9 0,27 25,5 5,28 0,62
35 1,55 0,29 18,6 5,46 0,59
45 1,75 0,28 11,4 8,83 1,41
* resultados obtidos pela mdia de no mnimo 20 medidas

Tabela 5.3 Caracterizao do farelo de trigo 0,59mm com diferentes umidades e
da porosidade do leito de partculas
Umidade
(g/100g)
Dimetro
mdio (mm)
ap
(g/cm
3
)
Porosidade
(%)
Espessura mdia
do filme lquido
(m)*
Desvio
padro
(m)
25 1,5 0,17 54,1 8,74 1,74
35 1,9 0,18 50,9 8,92 1,57
45 2,2 0,20 46,8 10,55 1,54

Os valores de espessura de filme lquido determinados para ambos
tamanhos de partculas foram inferiores aos reportados em trabalhos anteriores
sobre fermentao em estado slido, em geral em torno de 25m, variando at
100m (Tanaka et al., 1986; Rajapolan & Modak, 1995; Thibault et al., 2000;
Rahardjo et al., 2002). No entanto, em muitos casos os autores basearam-se em
espessuras de biofilmes de microrganismos depositados em filtros biolgicos ou
acumulados em outras superfcies, nas quais os nveis de umidades eram bem

60
superiores, havendo inclusive a presena de gua livre. Oostra et al. (2001)
encontraram por simulao matemtica valores semelhantes aos filmes lquidos
obtidos neste trabalho, que correspondiam a espessura mxima do biofilme
formado na superfcie de gel de gar para que no ocorresse anaerobiose.
A Tab. 5.4 apresenta as espessuras de filme lquido determinadas por
microscopia tica para suporte espuma de poliuretano com diferentes umidades.
Pode-se constatar que o aumento de 25 para 35% de umidade eleva
consideravelmente a espessura do filme lquido formado na superfcie e nos poros
da espuma. No entanto, a espessura se mantm praticamente constante de 35
para 45% de umidade. A espessura de filme lquido mxima foi obtida na
saturao do suporte (24,1m), conforme verificado na Tab. 5.5. Neste caso, com
94% de umidade, ou seja, no mximo de gua absorvida pela espuma sem a
presena de gua livre, a espessura de biofilme obtida foi similar aos valores
sugeridos pela literatura para cultivos em estado slido (Thibault et al., 2000).
Entretanto, para farelo de trigo foram obtidas espessuras bem inferiores ao
relatado na literatura, sendo aproximadamente 12m para os dois tamanhos de
partculas. Estes resultados sugerem que o dimetro do farelo de trigo apresenta
pouca influncia no filme lquido formado ao redor das partculas e,
consequentemente, na resistncia transferncia de oxignio. Alm disso, pode-
se verificar que a capacidade mxima de absoro de gua, por volta de 80% de
umidade, sugere que em muitos trabalhos na literatura h presena de gua livre
no meio slido, descaracterizando a fermentao em estado slido, promovendo
um regime intermedirio entre o crescimento em biofilme e submerso, tornando
crtica a transferncia de massa.


61
Tabela 5.4 Caracterizao do filme lquido em espuma de poliuretano com
diferentes umidades
Umidade (g/100g) Espessura mdia do
filme lquido (m)*
Desvio padro (m)
25 14,45 2,65
35 17,85 2,60
45 18,04 2,95

Tabela 5.5 Caracterizao dos suportes saturados com gua
Suportes Absoro de
gua mxima
(%)
Espessura mdia
do filme lquido
(m)*
Desvio padro
(m)
Farelo de trigo 0,35mm 81,74 11,45 2,00
Farelo de trigo 0,59mm 84,31 12,05 2,06
Espuma de poliuretano 94,02 24,10 2,98

Os dados apresentados nas Tab. 5.2 a 5.5 foram obtidos a partir das
fotografias ilustradas nas Fig. 5.1 a 5.4, onde pode-se visualizar os suportes com
diferentes umidades e saturados com gua: partculas de farelo de trigo 0,35mm,
partculas de farelo de trigo 0,59mm e espuma de poliuretano. Esses resultados
so importantes para o entendimento dos mecanismos de transferncia de
oxignio nos cultivos em estado slido, uma vez que em geral os trabalhos da
literatura no relatam as propriedades fsico-qumicas dos suportes slidos usados
nem a espessura dos filmes lquidos formados nas suas superfcies.

62

Figura 5.1 Fotografias das partculas de 0,35mm do farelo de trigo: (a) 25%, (b) 35
%, (c) 45% de umidade (as setas indicam o filme lquido formado na superfcie do
suporte slido)

(b)

(c)

(a)

63

Figura 5.2 Fotografias das partculas de 0,59mm do farelo de trigo : (a) 25%, (b)
35 %, (c) 45% de umidade (as setas indicam o filme lquido formado na superfcie
do suporte slido)

(a)

(b)

(c)

64

Figura 5.3 Fotografias da espuma de poliuretano : (a) 25%, (b) 35 %, (c) 45% de
umidade (as setas indicam o filme lquido formado na superfcie do suporte slido)

(a)

(b)

(c)

65

Figura 5.4 Fotografias dos suportes saturados com gua: (a) farelo de trigo
0,35mm, (b) farelo de trigo 0,59mm, (c) espuma de poliuretano (as setas indicam o
filme lquido formado na superfcie do suporte slido)

(a)

(b)

(c)

66
5.1.2 rea superficial, tamanho e volume de poros dos suportes

Os resultados de rea superficial, tamanho e volume de poros dos
suportes slidos so apresentados na Tabela 5.6. Pode-se verificar que a espuma
de poliuretano apresentou maior tamanho mdio de poros e rea superficial, o que
permite uma melhor distribuio dos nutrientes, do oxignio gasoso e formao de
biofilmes na superfcie e no interior da matriz slida. Os dados de tamanho e
volume de poros obtidos para os farelos de trigo sugerem que o crescimento
fngico ocorre preferencialmente na superfcie das partculas e no espao areo
interpartcula, conforme reportado por Rahardjo et al., 2002. O oxignio consumido
seria o correspondente adsoro nas hifas areas, sem as limitaes
difusionais, e no filme lquido formado ao redor das partculas, onde a difuso
seria limitante. Alm disso, pelos valores de volume de poros pode-se considerar
que toda a gua adicionada fica na forma de um filme lquido na superfcie da
matriz slida. Assim, as partculas de farelo de trigo comportam-se praticamente
como slidos no porosos. Desta forma, a determinao de densidade real e
aparente realizada no item 5.1.1 pode ser feita com gua, de acordo com a
metodologia indicada no item 4.1.1, uma vez que a quantidade de gua absorvida
pelos poros desprezvel.
Para espuma de poliuretano verifica-se rea superficial e volume de poro
cem vezes maior que para farelo de trigo 0,35mm. Desta forma, conforme pode-se
visualizar na Fig. 5.3, h formao de filme lquido na superfcie e nos poros da
espuma. Devido maior rea para formao de biofilme, estes resultados
sugerem um maior crescimento fngico sobre este suporte, uma melhor
distribuio de oxignio devido maior porosidade do leito (Tab. 5.1) e formao
de filmes lquidos mais espessos (Tab. 5.4).


67
Tabela 5.6 rea superficial, tamanho mdio e volume de poros para os farelos de
trigo e espuma de poliuretano determinados atravs das isotermas de BET
Suportes rea superficial
(m
2
/g)
Volume de poro
(cm
3
/g)
Tamanho mdio de
poro ()
Farelo de trigo
0,35mm
0,3560 0,000872 97,9849
Farelo de trigo
0,59mm
0,2817 0,000378 53,6621
Espuma de
poliuretano
3,4932 0,07006 106,7792

5.1.3 Dimetro mdio do farelo de trigo
As partculas de farelo de trigo antes da umidificao com a soluo
nutriente e soluo do inculo apresentavam umidade em torno de 12%. Foram
utilizadas amostras de farelo de trigo com 0,59 mm, como usado por Hasan, 2002,
e adicionalmente o tamanho de 0,35mm, visando melhorar a transferncia de
oxignio (Oostra et al., 2001). A Figura 5.5 apresenta a variao do tamanho das
partculas de farelo de trigo ao longo dos cultivos analisadas por granulometria em
peneiras. Verifica-se a reduo no seu tamanho conforme sugerido por Mitchell et
al., 2003. As matrizes slidas sofrem degradao durante a fermentao, tendo a
sua estrutura fsica alterada. Com a umidificao passando dos 12% para 25, 35
ou 45%, houve aumento no tamanho mdio das partculas para todos os casos,
em conseqncia do seu intumescimento. Assim, para as partculas de 0,59mm
no incio dos cultivos o dimetro mdio foi de 2,2, 1,9 e 1,5mm para 45, 35 e 25%
de umidade, respectivamente. Para partculas de farelo com 0,35mm o tamanho
foi 1,75, 1,45 e 0,9mm para 45, 35 e 25% de umidade, respectivamente. Para
farelo de trigo com 0,35mm aps 11 dias de cultivo, o dimetro mdio determinado
por espalhamento dinmico de luz (Mastersizer S Malvern) foi de 0,51159mm
(90% das partculas apresenta tamanho abaixo de 0,74667mm), com rea

68
superficial de 0,1417m
2
/g para partculas com densidade real (
real
) igual a
0,42g/cm
3
(Figura 12 Anexo V).
Verifica-se que para todos os casos foram obtidos dimetros maiores de
partcula para umidades de 45%, sendo que houve diminuio do tamanho ao
longo dos cultivos em todos os casos, exceto para farelo 0,35mm com 25% de
umidade inicial. A queda no tamanho de partcula foi observada nos primeiros
cinco dias de cultivo, mantendo-se praticamente constante aps este perodo. Isto
pode ser explicado uma vez que muitos substratos so degradados durante a
fermentao, alterando sua estrutura fsica e causando efeitos importantes nas
propriedades do leito de partculas, quando utiliza-se suportes naturais (Mitchell et
al., 2003). Por isso, Viccini & Mitchell (2003) propuseram que a concentrao de
biomassa no processo em estado slido devesse ser expressa como
concentrao relativa, considerando a massa de matria seca no momento da
amostragem, uma vez que a massa seca do leito de substrato diminui durante a
fermentao devido liberao de gs carbnico. Segundo esses autores, h uma
taxa de mudana global na matria seca total que dada pela soma das taxas de
variao na biomassa e no substrato. Esta variao na matria seca pode causar
a diminuio das partculas ao longo dos cultivos. Terebiznik & Pilosof (1999)
estudaram a perda de matria seca no cultivo de Aspergillus oryzae sobre farelo
de trigo. De acordo com estes autores, 40% em massa da matria seca inicial
perdida at a fase estacionria de crescimento fngico. Esta perda foi altamente
correlacionada com o crescimento microbiano, apesar de continuar ocorrendo
mesmo aps a fase estacionria. Assim, a menor diminuio das partculas de
farelo de trigo 0,35mm e 25% de umidade inicial poderia sugerir um menor
crescimento fngico nesta condio. As maiores diminuies nos dimetros das
partculas ocorreram para farelo 0,59mm com 35 e 45% de umidade. Apesar
destas constataes, no existem estudos na literatura mais especficos
relacionando a perda de matria seca, atividade biolgica e variao no tamanho
das partculas, de modo a se poder analisar melhor esses resultados.
Nandakumar et al. (1996), verificaram a reduo de 30 - 60% no tamanho
das partculas de farelo de trigo durante o cultivo de B. coagulans. Partculas de

69
600-850m foram degradadas em 12 horas e as partculas maiores (1200-
2057m) em 36 horas. De acordo com os autores, as partculas menores contm
mais amido e apresentam uma frao maior de hemicelulose e celulose. Assim,
devido preferncia dos microrganismos pelo consumo de carboidratos, houve
uma maior reduo nas partculas menores no tempo de fermentao
considerado. Esse fato explicaria a maior reduo de tamanho para as partculas
de 0,35mm com 35% de umidade ao longo do cultivo, sugerindo maior
crescimento microbiano nesta condio. Do ponto de vista da engenharia de
processos, a reduo e mudana na estrutura dos suportes naturais um
problema nos cultivos em estado slido. Assim, a utilizao de suportes inertes
que mantivessem sua estrutura fsica ao longo da fermentao seria importante no
estudo dos fenmenos de transferncia de calor e massa destes processos
(Gutirrez-Correa & Villena, 2003).
Figura 5.5 Perfis de reduo do dimetro das partculas durante as fermentaes
em farelo de trigo 0,35 mm (a) e 0,59 mm (b) com vazo de ar 0,4 L/min (Umidade
inicial: ( ) 25%, () 35%, () 45%)

a b
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
D
i
m
e
t
r
o

d
e

p
a
r
t
c
u
l
a

(
m
m
)
Tempo (dias)

0 2 4 6 8 10 12 14 16
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
D
i
m
e
t
r
o

d
e

p
a
r
t
c
u
l
a

(
m
m
)
Tempo (dias)


70
5.2 Inculo

A cepa do fungo Drechslera (Helminthosporium) monoceras (ICB USP K-
1-16 e CBS 154.26) foi mantida em gar-batata com leo mineral em estufa a
25
o
C, conforme trabalhos de Menezes et al, 1995, e Hasan, 2002. Pode-se
verificar na Figura 5.6 que a cultura foi propagada em frascos Erlenmeyer de 1000
mL contendo 600 mL de meio inclinado de gar-Czapeck. Tal como observado por
Hasan (2002), nas condies de cultivo o inculo apresenta-se praticamente na
forma de miclio.

Figura 5.6 Fotografia do inculo de Drechslera produzido em frascos Erlenmeyers
contendo meio gar-Czapeck

Aps um perodo de 14 dias, o miclio foi suspenso em gua destilada
estril e a sua concentrao foi determinada atravs de curva-padro de massa
celular seca, com leituras de absorbncias das diluies a 550 nm (Hasan, 2002),
conforme a Figura 3 do Anexo.

71
5.3 Cultivo em estado slido em colunas de leito fixo
Na Figura 5.7 (a - c) so apresentados os resultados obtidos para os
ensaios preliminares conduzidos em colunas de Raimbault para a produo de
protenas alergnicas da biomassa de Dreschslera monoceras, visando verificar a
viabilidade do inculo, reproduzir os resultados e os aspectos limitantes do cultivo
de Drechslera discutidos por Hasan (2002). As condies operacionais foram
aquelas otimizadas estatisticamente: substrato farelo de trigo com 0,59 mm de
tamanho de partcula, 25
o
C, pH 9,5, 0,4 mg/mL de inculo com 14 dias, umidade
de 45%, vazo de ar de 0,03 L/min e colunas totalmente preenchidas com
partculas (altura de leito de aproximadamente 200mm).
Os resultados foram semelhantes aos obtidos por Hasan (2002),
demonstrando no s a reprodutibilidade do processo de produo de protenas
alergnicas, mas tambm a preservao da viabilidade do microrganismo
estocado e os problemas resultantes do acmulo de gua e limitaes difusionais
do oxignio.
Na Figura 5.7a observa-se pouca variao do pH do meio slido nas 168
horas de experimento. O perfil de umidade do meio slido mostra um aumento de
aproximadamente 45% para 54% no tempo total de fermentao, devido ao
metabolismo respiratrio de Drechslera monoceras, que resulta na formao de
gua decorrente da oxidao do substrato. De acordo com Nakamundar et al.
(1998), a produo de gua metablica pode levar reduo da porosidade de at
10% em decorrncia do intumescimento das partculas e aumento de umidade do
leito de farelo de trigo. Devido vazo de ar baixa (0,03L/min), o acmulo de gua
metablica no leito levou ao aparecimento de gua livre, maior resistncia
passagem de ar atravs do leito pela sua compactao, favorecendo a formao
de caminhos preferenciais adjacentes parede da coluna principalmente aps 120
horas de fermentao. De acordo com os resultados apresentados na Tabela 5.3
verifica-se que h um aumento considervel na espessura do filme lquido quando
a umidade fica em torno de 45%. Sendo assim, a produo de gua metablica
leva formao de um filme lquido mais espesso na superfcie do substrato,

72
prejudicando a dissoluo do oxignio. Essas condies descaracterizam a
fermentao em meio slido, e quando o cultivo encontra-se plenamente
desenvolvido o que se observa com a compactao do leito e aparecimento de
gua livre um regime intermedirio entre a fermentao slida e submersa.

Figura 5.7 Comportamento da fermentao para a produo de biomassa de D.
monoceras conduzida em colunas de Raimbault com farelo de trigo como
substrato para 200 mm de altura de leito: (a) evoluo do pH ( ) e umidade () do
meio slido (b) perfil de acares redutores totais ( ) e protenas solveis () no
extrato bruto; (c) perfil do rendimento de glicose em protenas
20 40 60 80 100 120 140 160 180
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Y
X
/
S
(
m
g
p
r
o
t
e
n
a
/
m
g
g
l
i
c
o
s
e
)
Tempo (horas)
(b)
(c)

0 30 60 90 120 150 180
6
7
8
9
10
11
12
Tempo (horas)
p
H
45
50
55
60
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)

0 30 60 90 120 150 180
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (horas)
G
l
i
c
o
s
e

(
m
g
/
g
)
0
5
10
15
20
25
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)

(a)

73
De acordo com Mitchell et al., 2003, colunas com leito fixo podem
apresentar gradientes de temperatura, umidade e concentrao de oxignio
gasoso. Assim, estes cultivos que utilizam colunas de Raimbault totalmente
preenchidas com substrato natural, esto sujeitos formao de regies com
baixo teor de oxignio, desenvolvendo condies de anaerobiose que limitam o
crescimento fngico. Esses aspectos foram relatados por Oostra et al. (2001)
atravs da produo de etanol por Rhizopus oligosporus em zonas anaerbias
formadas no leito e observados por Hasan (2002).
Os efeitos das limitaes de oxignio refletem-se nos perfis de protenas
(biomassa produzida), acares redutores e no rendimento de glicose em
protenas (Y
P/S
), apresentados na Figura 5.7b e c. Esses resultados so indicativos
das limitaes progressivas da transferncia de oxignio no meio, com
aparecimento de condies de anaerobiose aps as 72 horas de fermentao.
O perfil de acares redutores no extrato bruto obtido a partir do meio
slido fermentado apresentou queda brusca na concentrao nas primeiras 72
horas, sendo que aps este perodo a concentrao mantm-se praticamente
constante at o final das 168 horas de experimento, com um percentual de cerca
de 40 mg/g de acar residual no consumido.
O perfil de protenas mostra clara evoluo at aproximadamente 72
horas de fermentao, com oscilaes no tempo restante, indicando a
aproximao de um patamar em torno de um valor mximo de aproximadamente
19 mg/g.
O coeficiente de rendimento Y
P/S
(Figura 5.7c) sofre uma queda
progressiva no decorrer do processo, atingindo aps 120 horas um rendimento
entre 0,1 e 0,2 mg
protena
/mg
glicose
. Nesse comportamento devem-se levar em conta
as oscilaes no valor da concentrao de protenas aps 72 horas de
fermentao. Com essas consideraes, o rendimento assumiria um valor
aproximadamente constante aps as 72 horas de cultivo, tendo em vista que aps
esse tempo verifica-se uma concentrao de acares residual aproximadamente
constante no meio.

74
,Por outro lado, Gowthaman et al., 1995, trabalhando com Aspergillus
niger em leito fixo de farelo de trigo constataram que em altas vazes de ar
(25L/min) houve queda na umidade do meio slido. Hamidi-Esfahani et al. (2004)
tambm verificaram que a aerao forada intensa pode resultar na diminuio do
contedo de umidade do leito de partculas e queda na produo de biomassa.
Esses resultados demonstram a necessidade de se operar os biorreatores
de leito fixo em condies que preservem as caractersticas da fermentao em
estado slido, o teor de umidade durante o cultivo e a oxigenao do meio.
A Figura 5.8 apresenta a variao da umidade medida experimentalmente
no meio slido durante a fermentao e os valores estimados pelo balano de
massa considerando que o consumo de uma molcula de glicose leva formao
de seis molculas de gua. Os valores estimados e experimentais apresentaram
uma correlao de 0,97 (conforme Fig. 4 dos Anexos). Assim, podemos observar
que a quantidade de gua produzida devida fundamentalmente s reaes
metablicas no perodo de cultivo considerado. De acordo com os resultados
obtidos utilizando a Eq. 4.22, houve alta taxa de produo de gua quando
comparada com a taxa de evaporao. Alm disso, o efeito da perda de matria
seca no influenciou consideravelmente o contedo de gua no meio slido. Desta
forma, para que o acmulo de umidade no meio seja minimizado a produo de
gua pelo metabolismo microbiano deve ser compatvel com as perdas por
evaporao, isto , com a retirada de gua do meio slido. A evaporao da gua
pode ser afetada por alguns parmetros como a umidade relativa do ar em torno
do substrato slido, a temperatura do meio, a vazo de ar e as foras
intermoleculares dentro do slido (Lekanda & Prez-Correa, 2004). Neste caso,
como a umidade relativa e a temperatura do sistema foram mantidas praticamente
constantes, a vazo de ar e as foras intermoleculares foram os parmetros que
influenciaram a taxa de evaporao. Assim, a evaporao eficiente que permita
um equilbrio do contedo de umidade do leito pode ser obtida utilizando altas
vazes de ar e diferentes caractersticas de compactao do meio slido.


75
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tempo (horas)
42
44
46
48
50
52
54
56
58
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)

medida experimental: dados estimados (o) e experimentais ( )

De acordo com Hasan (2002), as principais variveis que influenciaram a
produo de protenas alergnicas de Drechslera monoceras conduzida em
colunas de Raimbault com farelo de trigo como substrato foram o pH e umidade
inicial do substrato. Portanto, para o estudo da transferncia de oxignio do
presente trabalho, adotou-se o pH 9,5, otimizado por Hasan (2002), e a
transferncia de oxignio foi estudada em funo da umidade inicial do substrato a
qual procurou-se manter aproximadamente constante ao longo da fermentao.


76
5.4 Estabelecimento dos nveis de vazo de ar e altura de leito - Ensaios na
ausncia de microrganismos

Os nveis de vazo de ar e altura de leito foram estabelecidos de modo a
garantir a manuteno da umidade inicial do meio. A Figura 5.9 apresenta os
perfis axiais de umidade do leito de farelo de trigo nos ensaios sem
microrganismos, nas vazes de ar de alimentao de 0,03 L/min (2 L/h), nvel
timo obtido estatisticamente por Hasan (2002) e 1 L/min.
Pode-se verificar que o contedo de umidade do meio slido manteve-se
praticamente constante para as duas vazes, nas diferentes alturas de leito. Desta
forma, mesmo utilizando vazes de ar de alimentao da ordem de (1L/min),
constatou-se que o sistema de umidificao foi eficiente, promovendo entrada de
ar com 100% de umidade relativa, monitorado pelo termohigrmetro. Isto impede a
secagem do farelo de trigo, mantendo a umidade do substrato slido
aproximadamente constante ao longo do tempo.

Figura 5.9 Perfis axiais de umidade do leito de partculas com vazo de ar de 0,03
(a) e 1 L/min (b). Alturas de leito: 30mm ( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ().
0 2 4 6 8 10 12
40
42
44
46
48
50
52
54
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)
(a)

0 2 4 6 8 10 12
40
42
44
46
48
50
52
54
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

(b)

77
5.4.1 Cultivo em estado slido
5.4.1.1 Influncia da altura do leito e vazo de ar
A Figura 5.10 apresenta os perfis de umidade do meio slido com alturas de
leito de 30 e 130 mm, para as vazes de ar de 0,03 e 1L/min. Verifica-se um
aumento da umidade durante o perodo experimental, em virtude da produo de
gua metablica devido ao crescimento fngico. Esse aumento foi mais acentuado
para a maior altura de leito (130mm), independente da vazo de ar. Para a menor
altura de leito (30mm), a vazo de ar 1L/min produziu apenas 5% de aumento da
umidade, enquanto para 0,03 L/min, foi observado aps 96h, acmulo de gua
para o leito de altura 130mm.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
40
45
50
55
60
65
70
75
80
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.10 Perfis de umidade do meio slido para diferentes vazes e alturas de
leito (farelo de trigo 0,59mm): 30mm - 0,03L/min ( ); 130mm - 0,03L/min ();
30mm - 1l/min (); 130mm 1l/min ()

A produo de protena e consumo de glicose foram dependentes
somente da vazo de ar para ambas as alturas de leito. Para a menor vazo,
menos protena foi produzida com mximo em 48 horas (Figura 5.11). O consumo
de glicose foi maior (aproximadamente 80% da glicose inicial) e mais rpido (72h)
(Figura 5.12). Para a vazo de 1L/min, a produo mxima de protena (16mg/g)
foi atingida em 96 horas, com consumo de apenas 40% da glicose inicial a 30mm
de altura de leito e 60% de consumo para 130mm.

78
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.11 Perfis de protena no extrato bruto obtido para diferentes vazes e
alturas de leito (farelo de trigo 0,59mm): 30mm-0,03L/min ( ); 130mm-0,03L/min
(); 30mm-1L/min (); 130mm1L/min ()

0 20 40 60 80 100 120 140 160
20
40
60
80
100
120
140
160
180
G
l
i
c
o
s
e

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.12 Perfil de glicose no extrato bruto obtido para diferentes vazes e
alturas de leito (farelo de trigo 0,59mm): 30mm-0,03L/min ( ); 130mm-0,03L/min
(); 30mm-1L/min (); 130mm1L/min ()

Observando a evoluo dos rendimentos em protena apresentados na
Figura 5.13, verifica-se que estes foram praticamente constantes ao longo da
fermentao quando utilizou-se vazo de ar 1L/min, embora para 130mm de altura
de leito o seu valor seja de apenas 0,03 mg/mg comparado com 0,06 mg/mg

79
obtido 30mm. Nas condies de maior altura de leito, onde h maior acmulo de
gua no biofilme reduzindo o espao areo, o rendimento em biomassa menor,
situao de 1L/min e 130 mm de leito. Para a vazo de 0,03 L/min os rendimentos
decresceram com o tempo, sendo tambm menores a 130 mm, quando observou-
se maior acmulo de gua no meio. Esses resultados sugerem a importncia do
balano entre o crescimento areo do microrganismo e confinado no biofilme.
H um melhor entendimento dos resultados quando se analisa os
rendimentos ao invs dos perfis de protenas, glicose e umidade. As variaes no
rendimento apresentadas em todos os casos esto dentro do admitido para
sistemas biolgicos, ao nvel de significncia de 5%. A Tab. 5.7 apresenta os
valores mdios, desvio padro e coeficiente de variao percentual, calculado pela
relao entre a mdia e desvio padro, dos rendimentos nas diferentes condies
de altura de leito e vazo de ar. Pode-se verificar rendimentos praticamente
constantes para 30mm de altura de leito, independente da vazo de ar. No
entanto, os dados apresentaram alta variao para a menor vazo de ar,
independente da altura de leito. Os dados indicam que a vazo de ar discrimina de
maneira melhor o rendimento, de maneira que as menores variaes
correspondem a limitaes menos expressivas quando se utiliza mais alta vazo
de ar.
Portanto, esses resultados mostram que a produo de protenas,
associada ao crescimento da biomassa favorecida pela menor altura de leito
(30mm) e mais alta vazo de ar (1L/min), conforme esperado. Ressalta-se aqui
que em geral as fermentaes convencionais em meio slido reportadas na
literatura so conduzidas com vazes da ordem de 10
-2
L/min (Alvaraz-Sandoval et
al., 1997; Favela Torres et al., 1997; Pandey et al., 2001; Soccol & Vandenberg,
2003).


80
20 40 60 80 100 120 140 160
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
Y
P
/
S

(
m
g
p
r
o
t
e
n
a
s
/
m
g
g
l
i
c
o
s
e
)
Tempo (horas)

Figura 5.13 Perfis de Y
P/S
nas diferentes condies de vazo de ar e altura de leito
(farelo de trigo 0,59mm): 30mm-0,03L/min ( ); 130mm-0,03L/min (); 30mm-
1L/min (); 130mm1L/min ()

Tabela 5.7 Dados dos rendimentos de glicose em protenas para farelo de trigo
0,59mm para diferentes condies de vazo e altura de leito
Condio de vazo de
ar e altura de leito

Rendimento
mdio (mg/mg)
Desvio padro
(mg/mg)
Coeficiente de
variao (%)
30mm e 0,03L/min 0,062 0,0282 45,46
130mm e 0,03 L/min 0,042 0,0188 44,57
30mm e 1L/min 0,062 0,0163 26,86
130mm e 1 L/min 0,027 0,0070 25,52

Os comportamentos relativos transferncia de oxignio nos cultivos so
apresentados atravs dos seus parmetros nas Figuras 5.14 e 5.15. A Fig. 5.14
apresenta a variao da taxa de transferncia de oxignio (N) determinada por
unidade de volume de slidos no meio. Observa-se que houve diferenciao de N
somente para a condio de 30mm de leito e 1L/h de vazo de ar. Em todas as
outras condies os valores de N foram muito baixos e praticamente constantes
ao longo da fermentao. Esses resultados explicam o maior rendimento em
protenas (biomassa) em relao glicose apresentado na Figura 5.13.

81
Considerando os dois tipos de crescimento fngico, a maior taxa de transferncia
de oxignio nessas condies deve-se ao favorecimento do crescimento areo em
conseqncia do menor acmulo de gua no leito. Para a condio de 30mm de
leito e 1L/min, observa-se que o valor de N, inicialmente alto, decresce em 48
horas, voltando a crescer at o final da fermentao. Sabendo-se que nesse
tempo no houve variao significativa no tamanho mdio das partculas,
conforme Figura 5.5, a variao de N deve-se ao efeito conjunto da transferncia e
demanda de oxignio. Como houve variao de apenas 10% na umidade, pode-se
considerar que a espessura do filme lquido durante a fermentao aumentou
aproximadamente na mesma proporo, no alterando significativamente a
resistncia transferncia de oxignio no biofilme. Portanto, a variao de N
deve-se principalmente demanda de oxignio por parte dos microrganismos. Em
48h, com a menor demanda de oxignio (incio da fase logartmica conforme
Figura 5.11), a vazo de ar elevada produziu saturao do filme lquido, baixando
N, e elevando-o em seguida com a fase logartmica em evoluo.
Comportamento semelhante ao de N pode ser observado quando a taxa de
consumo de oxignio foi expressa atravs do parmetro R, calculado em relao
ao volume do biofilme. Na Figura 5.15, os valores de R foram calculados para a
espessura do filme mxima (25m), considerada constante ao longo da
fermentao. Nessas condies, o coeficiente de transferncia oxignio (K
L
a),
calculado a partir do perfil de concentrao de oxignio dissolvido no biofilme
lquido considerando o maior gradiente, foi similar para todas as condies,
ficando em torno de 3,98s
-1
para leito com 30mm e 4,015s
-1
para leito com
130mm. Esse resultado, obtido a partir dos parmetros N e R, coerente, j que o
K
L
a depende somente das condies fsicas do meio, e o valor de R foi calculado
espessura constante de biofilme.

82
20 40 60 80 100 120 140 160
0,00
0,08
0,16
0,24
0,32
0,40
0,48
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.14 Perfis das taxas de transferncia de oxignio (N) por volume de
slidos no meio em funo da vazo e altura do leito (farelo de trigo 0,59mm):
30mm-0,03L/min ( ); 130mm-0,03L/min (); 30mm-1L/min (); 130mm1L/min ()
20 40 60 80 100 120 140 160
0
1
2
3
4
5
6
7
8
R

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.15 Perfis das taxas de consumo de oxignio por volume de biofilme nas
em funo da vazo e altura do leito (farelo de trigo 0,59mm) ): 30mm-0,03L/min
( ); 130mm-0,03L/min (); 30mm-1L/min (); 130mm1L/min ()

83
Os valores obtidos para o K
L
a foram semelhantes aos encontrados por
Gowthaman et al., 1995 (2,4s
-1
em 15 horas), constatando que a fermentao em
estado slido caracteriza-se por apresentar valores de K
L
a bem superiores aos
valores tpicos dos cultivos submersos. Segundo estes autores, com as altas
vazes de ar utilizadas, ocorre um aumento na turbulncia do sistema o que tende
a reduzir a espessura do biofilme formado nos macro e micro-poros da matriz
slida. Desta forma, com a reduo da espessura do filme lquido, diminui a
resistncia transferncia de massa, refletindo-se em altos valores de K
L
a. Alm
disso, neste trabalho o K
L
a aumentou durante o perodo experimental, atingido os
valores mximos e diminuindo com a demanda de oxignio. No entanto, Thibault
et al. (2000) discordaram destes autores, constatando que a variao do K
L
a
apresentada no trabalho de Gowthaman et al. (1995) deve-se considerao que
o gradiente de concentrao de oxignio no biofilme constante igual a 10%, o
que implica em valores de R tambm constantes. Como os valores de N e R
obtidos neste trabalho variaram significativamente com o tempo,
conseqentemente no se obtm um gradiente de concentrao constante ao
longo da fermentao. Os parmetros N e R so funo da transferncia fsica de
oxignio, determinada pelo K
L
a e pela demanda biolgica por parte dos
microrganismo no biofilme.
5.4.1.2 Influncia da altura de leito vazo de ar 1L/min
Na vazo de ar onde foram obtidos os melhores resultados do item
anterior, foram conduzidos experimentos em quatro diferentes alturas de leito.
Conforme podemos verificar na Fig. 5.16, o leito a 30 mm de altura apresentou o
menor aumento no contedo de umidade do substrato. Para as outras trs alturas
pode-se considerar que o aumento de umidade foi semelhante. A produo de
protenas, consumo de glicose e rendimento no apresentam uma tendncia
definida de variao com a altura, para os leitos de 80, 130 e 180mm. Destaca-se
em todos os casos a superioridade do leito de 30 mm em relao aos referidos
parmetros (Fig. 5.17 a 5.19), o que pode ser ainda enfatizada a partir dos
rendimentos mdios apresentados na Tab. 5.8.

84
0 20 40 60 80 100 120 140 160
45
50
55
60
65
70
75
80
85
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.16 Perfis de umidade em diferentes alturas de leito (vazo de ar 1L/min;
farelo de trigo 0,59mm): 30mm ( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ()
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.17 Perfis de protena no extrato bruto (vazo de ar 1L/min; farelo de trigo
0,59mm): 30mm ( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ()
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
G
l
i
c
o
s
e

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.18 Perfis de glicose no extrato bruto (vazo de ar 1L/min; farelo de trigo
0,59mm): 30mm ( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ()


85
20 40 60 80 100 120 140 160
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
Y
P
/
S

(
m
g
p
r
o
t
e
n
a
/
m
g
g
l
ic
o
s
e
)
Tempo (horas)

Figura 5.19 Perfis do rendimento protena/glicose (vazo de ar 1L/min; farelo de
trigo 0,59mm): 30mm ( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ()

Tabela 5.8 Dados dos rendimentos de glicose em protenas para farelo de trigo
0,59mm nas diferen tes alturas de leito
Condies de altura
de leito

Rendimento
mdio (mg/mg)
Desvio padro
(mg/mg)
Coeficiente de
variao (%)
30mm 0,061 0,0163 26,87
80mm 0,0043 0,00378 88,56
130mm 0,027 0,00698 25,52
180mm 0,0066 0,00474 71,43

Do mesmo modo, os perfis de N apresentam comportamento semelhantes
para as alturas de leito 80, 130 e 180mm, diferenciando-se somente para 30mm
(Fig. 5.20). Portanto, para maior transferncia de oxignio e conseqentemente
produo de protenas, a altura de leito deve situar-se em torno de 30mm. A
mesma discusso vlida para o K
L
a calculado ao longo das fermentaes.

86
As figuras do Anexo VI apresentam os perfis de umidade do meio slido,
protena e glicose do extrato fngico, rendimento de glicose em protenas e taxa
de transferncia de oxignio que resumem os resultados das ensaios conduzidos
em diferentes alturas de leito.
2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
0 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4

N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Te m p o ( h o r a s )

Figura 5.20 Perfis da taxa N (vazo de ar 1L/min; farelo de trigo 0,59mm): 30mm
( ); 80mm (); 130mm (); 180mm ()

5.4.1.3 Influncia da vazo de ar para altura de leito 30 mm
A Fig. 5.21 apresenta os perfis radiais de oxignio dissolvido no biofilme
calculados a diferentes velocidades superficiais de ar. Para estes resultados, foi
considerada a mxima resistncia transferncia de oxignio, com a espessura
do biofilme sendo 25m, conforme proposto por Thibault et al. (2000).
Considerando o perfil radial de oxignio (Eq. 4.13) e calculando a
concentrao de oxignio na interface biofilme lquido-partcula slida de
substrato, ou seja, em 25m, onde h o maior gradiente de concentrao, verifica-
se que o K
L
a aproximadamente 3,9 s
-1
em todos os tempos e condies de
vazo. K
L
a depende apenas das propriedades do sistema em transferir oxignio
da fase gasosa para o biofilme, no sendo influenciado pela vazo de ar na faixa
de valores testados. Assim, conforme verificamos na Fig. 5.21, a concentrao de
oxignio no varia significativamente aps 15m aproximadamente. No entanto,

87
de acordo com a Tab. 5.3, a espessura do filme lquido aproximadamente 10m.
Desta forma, obtivemos valores de K
L
a praticamente constantes durante os
cultivos, mas distintos para as diferentes vazes ar: 3,75 0,61s
-1
(0,2L/min),
4,23 0,62s
-1
(0,4L/min), 3,0 0,87s
-1
(0,6L/min), 3,5 1,59s
-1
(0,8L/min) e 3,33
1,36s
-1
(1Lmin). Embora os valores estejam na mesma ordem de grandeza, estas
pequenas variaes com a vazo podem ser atribudas variao de umidade do
meio, conforme os perfis apresentados na Fig.5.22, refletindo-se em variaes na
espessura do biofilme.
Pela anlise das Fig. 5.23 e 5.24 verifica-se que, exceto para 0,2 L/min
onde a demanda de oxignio foi baixa, as taxas de transferncia e consumo de
oxignio N e R foram semelhantes para todas as outras vazes de ar. As
diferenas nos perfis de umidade observados na Figura 5.22 refletiram-se no
clculo desses parmetros, produzindo pequena superioridade dessas taxas para
a vazo 0,4 L/min. Comportamento semelhante foi observado por Gowthaman et
al. (1995), que elegeu a velocidade superficial equivalente a vazo de 0,4 L/min
como valor timo para a vazo de ar em cultivo de Aspergillus niger sobre farelo
de trigo. Segundo estes autores, o aumento da vazo de ar aumenta a turbulncia,
reduzindo a espessura do biofilme.

88

Figura 5.21 Perfis radiais da concentrao de oxignio dissolvido no filme lquido
(altura de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm) (a) Q = 0,2 L/min; (b) Q = 0,4 L/min;
(c) Q = 0,6 L/min;(d) Q = 0,8 L/min; (e) Q = 1 L/min
1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)
r (mm)
24 h
72 h
168 h
192 h
216 h
240 h
264 h

(c)
1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)
r (mm)
24 h
72 h
144 h
168 h
216 h
240 h
264 h
312 h

(d)

1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)
r (mm)
24 h
144 h
168 h
192 h
216 h
240 h
312 h

(e)
1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
0,26
0,27
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)
r (mm)
24 h
72 h
144 h
168 h
192 h
216 h
240 h
264 h

(a)
1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)
r (mm)
24 h
72 h
144 h
168 h
192 h
216 h
240 h
264 h

(b)
10 m
10 m
10 m
10 m
10 m

89
0 50 100 150 200 250 300 350
40
44
48
52
56
60
64
68
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.22 Perfis de umidade para diferentes vazes de ar (altura de leito 30mm;
farelo de trigo 0,59mm): 0,2L/min ( ); 0,4L/min (); 0,6L/min (); 0,8L/min ();
1L/min ()
50 100 150 200 250 300
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.23 Perfis da taxa de transferncia de oxignio obtidos para diferentes
vazes de ar (altura de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm): 0,2L/min ( ); 0,4L/min
(); 0,6L/min (); 0,8L/min (); 1L/min ()

De acordo com esses resultados, considerando as taxas de consumo e
transferncia e o K
L
a, embora no haja diferenas expressivas na faixa de vazes
entre 0,4 e 1L/min, a vazo de 0,4 L/min apresenta-se como a melhor condio
de ar para o cultivo em estado slido de Drechslera em farelo de trigo 0,59mm.

90

50 100 150 200 250 300 350
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
R

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.24 Perfis da taxa de consumo de oxignio por volume de biofilme nas
diferentes vazes de ar (altura de leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm) ): 0,2L/min
( ); 0,4L/min (); 0,6L/min (); 0,8L/min (); 1L/min ()

A Figura 5.25 apresenta os perfis de umidade e protena ao longo do
cultivo a 0,4L/min. Verifica-se aumento gradativo no teor de protenas no extrato
bruto sugerindo crescimento microbiano homogneo nas 312 horas de
fermentao com ausncia das fases de adaptao e estacionria. Isto ocorre
quando no h limitao por nutrientes, inclusive oxignio, no perodo amostrado.
Alm disso, a umidade do meio slido permaneceu praticamente constante, o que
indica que, apesar do metabolismo microbiano acentuado gerar quantidades de
gua metablica, a altura de leito de 30mm e o sistema de umidificao mantm a
umidade do meio praticamente constante. Desta forma, conforme o referido na Eq.
4.22, a taxa de produo de gua pelos microrganismos foi semelhante taxa de
evaporao da gua, facilitada pelas condies de altura de leito (quantidade de
meio slido) e alta vazo de ar.


91

Figura 5.25 Perfis de umidade do substrato slido e protena obtidas a partir do
extrato fngico para cultivos a 0,4 L/min (altura de leito 30mm; farelo de trigo
0,59mm): Umidade do meio slido ( ) Protena no extrato fngico ()

Hasan et al. (2003), trabalhando com Drechslera sobre farelo de trigo em
colunas de Raimbault, verificaram que na condio tima determinada por um
planejamento estatstico foram obtidos mximos de 12mg/g de protena em 150h
de fermentao. Estes autores constataram que durante os experimentos ocorria
encolhimento do leito de partculas e umedecimento do meio slido, o que afetaria
o rendimento do processo. Quando neste trabalho utilizou-se 30mm de altura de
leito e 0,4L/min de vazo de ar, foram obtidos 26 mg/g de protena em 312 horas,
valor superior aos obtidos por Hasan et al., 2003. Isto deve-se possivelmente
eficiente transferncia de oxignio obtida nas condies investigadas no presente
trabalho. Assim, o aumento de escala deste processo dever priorizar um
aumento na quantidade de reatores em coluna com altura de leito reduzida.
A Fig. 5.26 apresenta o perfil do rendimento em protenas com relao
glicose. O rendimento em relao glicose praticamente constante aps 140h,
em torno de um valor mdio de 0,07mg/mg. Este valor superior aos valores
apresentados nas Tab. 5.6 e 5.7, indicando que h uma altura de leito e vazo de
ar que otimiza o rendimento devido manuteno das caractersticas do leito. De
acordo com Oostra et al. (2001) a obteno de rendimentos praticamente
constantes sugere que no h limitao de oxignio durante o cultivo. Estes

92
autores constataram limitaes de oxignio pela reduo no Y
X/S
de glicose,
havendo converso anaerbia com formao de etanol. Desta forma, o
rendimento de glicose um parmetro indicado para avaliar limitaes destes
processos devido correlao existente entre a transferncia de oxignio e o
consumo de glicose.
0 50 100 150 200 250 300
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Y
X
/
S

(
m
g
p
r
o
te
n
a
/
m
g
g
lic
o
s
e
)
Tempo (horas)

Figura 5.26 Rendimento de glicose em protena para cultivos a 0,4 L/min (altura de
leito 30mm; farelo de trigo 0,59mm)


93
5.5 Influncia da umidade inicial do meio slido e tamanho de partcula

A Fig. 5.27 apresenta os perfis de umidade do meio slido durante a
fermentao, para partculas de farelo de trigo com dimetro mdio 0,59mm em
leito de 30 mm com 0,4 L/min de vazo de ar. Verifica-se que para todas as
umidades iniciais testadas no houve variao considervel no contedo de gua
do meio, em conseqncia das condies de altura de leito e vazo de ar
anteriormente selecionados.

Figura 5.27 Perfis de umidade do meio slido com farelo de trigo 0,59mm para
diferentes umidades iniciais: 25% (), 35% () e 45% ()

A Figura 5.28 apresenta a produo de protenas no extrato bruto fngico
obtido para cultivos com diferentes umidades iniciais. Pode-se constatar que a
maior produo de protenas ocorreu a 45% de umidade inicial. Estes resultados
indicam que h um teor de umidade timo para o crescimento de Drechslera por
volta de 45%. Para umidades inferiores, h limitao na disponibilidade de
nutrientes, principalmente os acares, devido menor atividade de gua do
sistema. Alm disso, considerando o empacotamento do meio, nota-se que a
densidade aparente do leito de partculas de farelo de trigo 0,59mm (Tab. 5.3)
maior a 45% de umidade (0,2 g/cm
3
). Assim, de acordo com Laukevics et al.,
1985, como mantm-se praticamente a mesma porosidade e caractersticas de

94
compactao do meio, a concentrao celular atingida proporcional densidade
aparente (Eq. 4.16).
0 50 100 150 200 250 300
0
5
10
15
20
25
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.28 Perfis de protena no extrato bruto para os cultivos com farelo de trigo
0,59mm a diferentes umidades iniciais: 25% (), 35% () e 45% ()

A Figura 5.29 apresenta os perfis da concentrao de oxignio dissolvido
calculados ao longo do biofilme, considerando espessuras de 5 a 45m. Pode-se
constatar que para 45% de umidade inicial, com exceo de 312 horas, os
gradientes de concentrao de oxignio so semelhantes, indicando consumo
homogneo de oxignio ao longo do biofilme durante os cultivos. O oxignio foi
totalmente consumido no biofilme quando a sua espessura foi 45m, e para
espessura em torno de 10 m a variao da concentrao de oxignio no biofilme
esteve em torno de 20%, demonstrando que no h limitao de oxignio. Para as
demais umidades, as variaes situaram-se em torno de 10% ao longo de toda a
fermentao para todas as espessuras de biofilme. Os mximos de gradientes
ocorreram em 120 horas (25% de umidade), 144 horas (35% de umidade). Assim,
estes resultados esto em concordncia com os perfis de protena (Fig. 5.28),
sugerindo um crescimento microbiano melhor a 45 e 35% de umidade.

95

Figura 5.29 Perfis radiais de oxignio dissolvido no biofilme para as diferentes
umidades iniciais do meio slido com farelo de trigo 0,59 mm: 25% (a); 35% (b) e
45% (c)

Analisando a transferncia de oxignio, observa-se pela Fig. 5.30 uma taxa
bem maior (0,8mol/s.m
3
) para 35% de umidade em relao a valores menores em
torno de 0,3mol/s.m
3
para 25 e 45% de umidade inicial. Essa condio produziu
K
L
as cerca de dez vezes maiores, como mostrado nas Figuras 5.31 a 5.33, onde
observa-se tambm que para espessuras de filmes maiores que 20 m as
variaes no so significativas. Pela determinao da espessura do filme lquido
obtida por microscopia verifica-se que para todas as umidades testadas h uma
influncia significativa da espessura no K
L
a. Esses dados constatam a importncia

96
da medida analtica do biofilme nestes processos quando se pretende analisar a
transferncia de oxignio. Os perfis de K
L
a apontam para uma melhor
transferncia de oxignio para umidade de 35% uma vez que de acordo com a
Tab. 5.3, para essa umidade inicial a espessura de biofilme menor (8m),
comparado com 10 m a 45% de umidade inicial.
0 50 100 150 200 250 300 350
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.30 Perfis da taxa de transferncia de oxignio para cultivos sobre farelo
de trigo 0,59 mm com diferentes umidades iniciais: 25% (), 35% () e 45% ()
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
K
L
a

(
s
-
1
)
Espessura do biofilme (
m
m)

Fig. 5.31 Perfil do K
L
a para leito de farelo de trigo 0,59 mm com 25% de umidade
inicial (a seta indica os dados com diferena significativa ao nvel de 5%)

p<0,05
8m

97
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
K
L
a

(
s
-
1
)
Espessura do biofilme (m)

L
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
K
L
a

(
s
-
1
)
Espessura de biofilme (m)

L

A Fig. 5.34 mostra a camada de miclio na superfcie das partculas,
demonstrando que o fungo se desenvolve no apenas na fase lquida, como um
biofilme ao redor das partculas, mas tambm nos espaos vazios do leito.
Rahardjo et al. (2002) demonstraram a importncia das hifas areas na respirao
microbiana. Isto significa que a limitao de transferncia de oxignio devido
difuso lenta na fase lquida apresenta uma menor importncia para fungos
filamentosos que se desenvolvam na fase area, como o caso de Drechslera.
p<0,05
8m
10m
p<0,05

98

Fig. 5.34 Fotografias das partculas de farelo de trigo 0,59mm com 11 dias de
cultivo a 35% de umidade inicial

A Fig. 5.35 apresenta os perfis de umidade do meio slido para leito de
0,35mm. Verifica-se que para todas as condies iniciais no houve variao
considervel na umidade do meio slido, em conseqncia das condies de
altura de leito e vazo de ar previamente selecionados, conforme o observado
anteriormente para leito de partculas de 0,59mm.

Figura 5.35 Perfis de umidade do meio slido com farelo de trigo 0,35mm para
diferentes umidades iniciais: 25% (), 35% () e 45% () para 30mm e 0,4L/min


99
A variao da concentrao de protenas solveis no extrato fngico
apresentada na Figura 5.36. Hasan et al. (2003), trabalhando com Drechslera em
colunas de leito fixo de aproximadamente 200 mm de altura obtiveram atravs de
um planejamento estatstico a umidade inicial tima de 45%, sendo encontrados
teores de protenas por volta de 12 mg/g. No entanto, para leito de 30 mm e 0,4
L/min, estimando o comportamento microbiano pela concentrao de protenas
solveis, podemos afirmar que h uma tendncia maior de crescimento da
atividade metablica em 35% de umidade inicial do leito de partculas. De acordo
com a Fig. 5.5, houve realmente uma maior diminuio do tamanho das partculas
a 35% de umidade, resultado da perda de matria seca devido ao consumo do
substrato. Para meio slido com 25% de umidade no houve praticamente
nenhuma modificao da estrutura das partculas, sugerindo crescimento
microbiano menor conforme o perfil de protenas apresentado na Fig. 5.36. Estes
resultados so importantes na busca do entendimento dos fenmenos de
transferncia de massa que ocorrem nos processos em estado slido, alm de
contribuir para o escalonamento dos processos.
0 5 0 1 0 0 1 5 0 20 0 2 5 0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
1 8
2 0
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
T e m p o (h o r a s )

Figura 5.36 Perfis de protenas solveis no extrato bruto para diferentes umidades
iniciais em leitos de farelo de trigo 0,35mm: 25% (), 35% () e 45% ()

A Figura 5.37 apresenta os perfis de concentrao de oxignio para farelo
de trigo 0,35mm nas diferentes condies de umidade. Verifica-se que os maiores
gradientes de oxignio ocorreram em 168 e 120 horas de cultivo, decrescendo ao

100
longo do biofilme para todos os tempos de cultivo. Para espessura de biofilme em
torno de 10m observa-se que a concentrao de oxignio diminui
aproximadamente 10%. Esta reduo est de acordo com os dados mencionados
na literatura (Gowthaman et al., 1995). Entretanto, este gradiente no permanece
constante durante o cultivo e depende fortemente da espessura do biofilme,
podendo ser de at 40% para espessuras de 45 m. Neste caso, a variao na
concentrao muito superior ao assumido por estes autores, o que fez com que
eles obtivessem valores inferiores de K
L
a.
De acordo com a Tabela 5.2 h uma espessura de filme lquido formado
ao redor das partculas de farelo de trigo 0,35mm com 25% de umidade de
aproximadamente 5m. Pela anlise da Fig. 5.37a, verifica-se que nestas
condies h um gradiente de concentrao de aproximadamente 8%, o que
reflete o baixo consumo de oxignio. Isto justifica o crescimento lento nesta
condio, o que tambm correspondeu baixa reduo do tamanho das partculas
nesta condio (Fig. 5.5).

101

Figura 5.37 Perfis radiais de oxignio dissolvido no biofilme para as diferentes
umidades iniciais do meio slido com farelo de trigo 0,35 mm: 25% (a); 35% (b) e
45% (c)

A Figura 5.38 apresenta os perfis de N ao longo do tempo para as
diferentes condies de umidade. Similarmente ao ocorrido com os gradientes de
concentrao, os maiores valores de N foram obtidos entre 120 e 168 horas,
ficando em torno de 0,7 e 0,4 mol/s.m
3
para 45 e 35% de umidade,
respectivamente, onde ocorrem os maiores gradientes de concentrao de
oxignio (Fig. 5.38b e c). Os valores praticamente constantes de N nestas

102
condies de umidade demonstram que a distribuio homognea do ar permitiu
transferncia de oxignio eficiente para todos os tempos experimentais.

50 100 150 200 250 300 350
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.38 Perfis da taxa de transferncia de oxignio para cultivos sobre farelo
de trigo 0,35 mm com diferentes umidades iniciais : 25% (), 35% () e 45% ()

O K
L
a constante ao longo do perodo de cultivo, uma vez que no h
variao fsica do sistema, com manuteno da umidade (vide perfil de umidade
Fig. 5.35). A variao na taxa N compensada com uma variao proporcional no
gradiente de concentrao (Fig. 5.37), mantendo K
L
a constante. Entre 120 e 168
horas de cultivo, N e o gradiente apresentaram seus valores mximos, mantendo
o valor de K
L
a fixo. No entanto, K
L
a varia na posio dependendo da espessura do
biofilme para todas as condies de umidade testadas, conforme as Fig. 5.39 a
5.41, sendo que a variao significativa para espessuras de leito menores que
29m (p<0,05). A resistncia ao transporte de oxignio maior nas maiores
espessuras, fazendo com que o K
L
a atinja os menores valores, por volta de 5s
-1

para 25 e 35% de umidade e 10 s
-1
para 45% de umidade.
Os perfis de K
L
a com 25 e 35% de umidade so exatamente iguais,
sugerindo que o aumento de umidade das partculas de farelo de trigo 0,35mm at
35% no promoveu uma melhor dissoluo do oxignio gasoso para o filme
lquido, mas tambm no resultou num aumento da resistncia ao transporte. De

103
acordo com a determinao experimental da espessura dos filmes por microscopia
(Tab. 5.2 e Fig. 5.1), no h variao nesta espessura quando do aumento de
umidade de 25 para 35%. Assim, como o K
L
a depende da difusividade de oxignio
e da espessura do filme, ele mantm-se praticamente constante com a mudana
de umidade. K
L
a no variou significativamente, ao nvel de 5% de significncia,
para espessuras de biofilme acima de 29m para todas as umidades testadas.
Como as espessuras determinadas experimentalmente nas diferentes condies
de umidade (Tab. 5.2) ficam bem abaixo de 29m, h desta forma uma influncia
significativa das espessuras no valor do K
L
a, conforme havia sido verificado
tambm para as partculas de farelo de trigo 0,59mm. Assim, independente do
tamanho de partcula e das condies de umidade, a transferncia de oxignio
nos cultivos em estado slido afetada pela espessura do filme lquido uma vez
que nem a saturao do farelo de trigo permitiria a formao de filmes superiores
a 20m (Tab. 5.5).
A taxa de transferncia de oxignio para partculas para 45% de umidade
inicial foi superior aos cultivos com umidades inferiores em praticamente todo o
perodo experimental (Fig. 5.38). Partindo destas taxas elevadas durante o cultivo,
a curva de K
L
a, situou-se em nvel superior com relao a 25 e 35% de umidade
(Fig. 5.41). No entanto, considerando a maior espessura de biofilme constatada
pelos resultados de microscopia apresentados na Tab. 5.2 (8m a 45% e 5m
para 25 e 35%), percebe-se que os valores de K
L
a foram semelhantes para todas
as condies de umidade com partculas 0,35mm, ficando em torno de 32 s
-1
.


104
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
20
25
30
35
K
L
a

(
s
-
1
)

L
a ao longo do biofilme com 25% de umidade inicial do meio
slido de farelo de trigo 0,35 mm (a seta indica os dados com diferena
significativa ao nvel de 5%)

0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
20
25
30
35
K
L
a

(
s
-
1
)
Espessura do bi of il me (m)

L
a com 35% de umidade inicial do meio slido de farelo de
trigo 0,35mm (a seta indica os dados com diferena significativa ao nvel de 5%)

p<0,05
5m
p<0,05
5m

105
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
K
L
a

(
s
-
1
)

L
a com 45% de umidade inicial do meio slido de farelo de
trigo 0,35 mm (a seta indica os dados com diferena significativa ao nvel de 5%)

Comparando-se o comportamento da transferncia de oxignio quando o
tamanho de partcula variou de 0,35 a 0,59mm, verifica-se que a 0,35mm, quando
o biofilme variou de 5 a 8m, no houve diferena significativa na transferncia de
oxignio com a umidade inicial das partculas. Por outro lado, para partculas de
0,59mm, quando se obtm espessuras entre 8 e 10m, a umidade inicial influencia
a transferncia de oxignio, sendo maior a 35% onde a espessura de biofilme da
ordem de 8m. Em termos de produo de protenas houve superioridade para as
partculas de 0,59mm. Para esse tamanho de partcula verifica-se tambm maior
porosidade do leito formado e a importncia das hifas areas na concentrao
total de protenas (biomassa). Portanto, esses resultados mostram claramente
no s a importncia da espessura do biofilme em torno das partculas como
tambm da porosidade do leito formado. Evidentemente que a importncia desses
fatores s pode ser observada quando no se tem acmulo de gua livre no leito,
o que foi produzido a 30mm de altura e 0,4L/min de vazo de ar. Ressalta-se
tambm que essas condies operacionais garantiram as caractersticas da
fermentao em estado slido durante todo o perodo.
p<0,05
8m

106

5.6 Avaliao da transferncia de oxignio em coluna de leito fixo com
maiores dimenses
Os experimentos em coluna com maiores dimenses foram realizados
para avaliar a transferncia de oxignio em uma escala diferente, em coluna com
50mm de dimetro, mantendo a altura de leito em 30mm. A velocidade superficial
de ar utilizada nos ensaios anteriores foi mantida, sendo que para esta coluna a
vazo tima 0,4L/min foi ajustada para 0,9L/min para manter as mesmas
condies de aerao. A umidade tambm foi mantida em 35%, a qual dentre as
umidades testadas o valor que maximiza o valor de K
L
a. A Fig. 5.42 apresenta a
variao da taxa mdia de consumo de oxignio por volume de biofilme para
farelo 0,35mm. Pelas oscilaes durante o cultivo, verifica-se que a taxa aumenta
aps o incio do cultivo, atingindo um valor mximo em 192 horas para todas as
espessuras testadas. As taxas obtidas por volume de biofilme foram bem
inferiores aos valores obtidos no item anterior para colunas menores (30 mm)
correspondendo formao de gradientes de concentrao menores (Fig. 5.43).
Com exceo ao tempo de 192 horas, nos outros perodos foram obtidos
gradientes similares e mximos para 45m.
0 10 20 30 40 50
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
24h
96h
192h
216h
264h
288h
312h
R

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)

Figura 5.42 Perfis da taxa de consumo de oxignio por volume de biofilme para
partculas de farelo de trigo 0,35mm em coluna de leito fixo com maiores
dimenses

107
10 20 30 40 50
0,250
0,255
0,260
0,265
0,270
0,275
0,280
24h
96h
192h
216h
264h
288h
312h
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)

Figura 5.43 Perfis dos gradientes de concentrao de oxignio dissolvido no
biofilme para partculas de farelo de trigo 0,35mm em coluna de leito fixo com
maiores dimenses

Estes resultados so corroborados pelo perfil da taxa de transferncia
apresentado na Fig. 5.44, onde pode-se constatar variao devido ao metabolismo
microbiano, com valor mximo em 192 horas. As taxas obtidas foram menores do
que os resultados obtidos para coluna de menores dimenses, uma vez que N
definido por volume de leito, que neste caso foi bem superior do que nas amostras
do item anterior.
O perfil do K
L
a apresentado na Fig. 5.45 aponta uma variao significativa
com a espessura de biofilme, sendo obtidos valores similares aos encontrados em
coluna de menores dimenses. Neste caso, a mudana de escala no favorece a
distribuio de oxignio para partculas de farelo de trigo 0,35mm, uma vez que as
condies fsicas do sistema, tais como umidade, no foram afetadas, j que a
altura de leito e velocidade superficial de ar foram mantidas constantes. As
variaes apresentadas nas taxas de consumo e de transferncia de oxignio
devem-se ao maior volume de meio slido considerado.


108
0 50 100 150 200 250 300 350
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.44 Taxa de transferncia de oxignio para partculas de farelo de trigo
0,35mm em coluna de leito fixo com maiores dimenses

0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
K
L
a

(
s
-
1
)

Figura 5.45 Perfis do K
L
a para partculas de farelo de trigo 0,35mm em coluna de
leito fixo com maiores dimenses

A Fig. 5.46 apresenta os perfis da taxa de consumo de oxignio para
partculas de farelo de trigo 0,59mm, em coluna com dimetro 50mm e altura de
leito 30mm, para as condies onde foram obtidos maiores valores de K
L
a a 35%
de umidade (Fig. 5.35). Verifica-se uma variao na taxa N, com valor mximo
obtido em 192 horas (Fig. 5.48). O comportamento foi bem diferente dos

109
resultados obtidos para esta condio em coluna com menores dimenses. Foram
obtidos valores bem menores de R com ponto mximo em 192 horas (0,35
mol/s.m
3
para 5m de espessura de biofilme). Os perfis radiais de concentrao
de oxignio no biofilme so apresentados na Fig. 5.47, onde se verifica que o
comportamento foi similar quele obtido em leito com partculas 0,35mm (Fig.
5.43). O tamanho das partculas no interferiu na taxas de transferncia de
oxignio nestas condies e o perfil de K
L
a obtido foi semelhante ao das partculas
com 0,35mm, com valores superiores para partculas de 0,59 mm (Fig. 5.49). No
entanto, para partculas de 0,59mm os valores de K
L
a so aproximadamente a
metade dos obtidos para a coluna de menor dimetro operando nas mesmas
condies. Portanto, infere-se que nesse caso, com o maior crescimento
microbiano observado anteriormente para partculas de 0,59mm, houve
provavelmente acmulo de gua na coluna, decrescendo os valores de K
L
a.
0 10 20 30 40 50
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
24h
96h
192h
216h
264h
288h
312h
R

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)

Figura 5.46 Perfis da taxa de consumo de oxignio por volume de biofilme para
partculas de farelo de trigo 0,59mm em coluna de leito fixo com maiores
dimenses


110
10 20 30 40 50
0,260
0,262
0,264
0,266
0,268
0,270
0,272
0,274 24h
96h
192h
216h
264h
288h
312h
C
L

(
m
o
l
/
m
3
)

Figura 5.47 Perfis dos gradientes de concentrao de oxignio dissolvido no
biofilme para partculas de farelo de trigo 0,59mm em coluna de leito fixo com
maiores dimenses

0 50 100 150 200 250 300 350
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.48 Taxa de transferncia de oxignio para partculas de farelo de trigo
0,59mm em coluna de leito fixo com maiores dimenses

111
10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
K
L
a

(
s
-
1
)

Figura 5.49 Perfis do K
L
a para partculas de farelo de trigo 0,59mm em coluna de
leito fixo com maiores dimenses

Esses resultados mostram que a manuteno das condies de
transferncia de oxignio representa um ponto crtico no aumento de escala dos
processos, mesmo para pequenas alturas de leito, onde h a necessidade de se
utilizar vazes bem maiores para contornar o acmulo de gua no sistema.

112
5.7 Avaliao da transferncia de oxignio em cultivos sobre suporte inerte

Os experimentos em coluna de leito fixo contendo espuma de poliuretano
como suporte inerte foram conduzidos com 0,4L/min de vazo de ar e altura de
leito 30mm, condies estas que asseguraram a manuteno da umidade do meio
slido, promovendo uma eficiente transferncia de oxignio. A espuma de
poliuretano foi testada com 25, 35 e 45% de umidade inicial.
A Fig. 5.50 apresenta as fotografias obtidas no microscpio tico para a
amostra de espuma de poliuretano com 11 dias de cultivo com 45% de umidade
inicial. Devido s caractersticas da matriz slida (Tab. 5.1), verifica-se
crescimento tanto na superfcie do suporte como na fase area, o que explica os
altos teores de protena obtidos. Alm disso, o filme lquido formado na superfcie
dos poros do material sugere espessuras de biofilme da ordem de 25m.

Figura 5.50 Fotografias da espuma de poliuretano com 11 dias de cultivo a 45%
de umidade inicial e 0,4L/min de vazo de ar

A Figura 5.51 apresenta a taxa de transferncia de oxignio (N) obtida, a
qual foi constante para as umidades utilizadas, indicando que o suporte manteve
eficiente distribuio de ar no leito. Lareo et al. (2005) verificaram em cultivos com

113
Mucor bacilliformis em espuma de poliuretano que as maiores taxas de consumo
de oxignio ocorreram nas maiores umidades do meio slido.
Os perfis de K
L
a so apresentados na Fig. 5.52, tendo um comportamento
bastante similar para as umidades utilizadas. Com o aumento de umidade o
material inerte tende a aproximar-se da saturao, sendo que a espessura de
filme fica ao redor de 24m, conforme ilustrado na Fig. 5.52. De acordo com os
dados da Tab. 5.4, para 25, 35 e 45% de umidade, a espessura do biofilme fica
em torno de 14, 17 e 18m, respectivamente. Assim, coerente esperar valores
de K
L
a superiores para 25 e 35% no incio dos cultivos. No entanto, com o
aumento da umidade do suporte slido e conseqente aumento da espessura do
biofilme em todos os casos, os valores de K
L
a tendem a ficar por volta de 20s
-1
.
0 50 100 150 200 250 300
2,60
2,65
2,70
2,75
2,80
2,85
2,90
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tempo (horas)

Figura 5.51 Taxa de transferncia de oxignio (N) ao longo do cultivo em espuma
de poliuretano para todas as condies de umidades iniciais com 0,4L/min de
vazo de ar

114
10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
120
K
L
a

(
s
-
1
)
Espessura do biofilme (
m
m)

L
a no cultivo com espuma de poliuretano com 0,4L/min de
vazo de ar em diferentes umidades iniciais: 25% (), 35% () e 45% ()

Como a vazo de ar e altura de leito utilizados foram estabelecidos para
farelo de trigo, ocorreu aumento de umidade para espuma de poliuretano (Fig.
5.53), indicando que devem ser utilizadas vazes de ar superiores para promover
a manuteno da umidade do meio. Pela anlise dos dados experimentais e
estimados (Fig. 5.54) verifica-se que aps 96 horas o aumento de umidade no
est mais associado apenas ao consumo de glicose, havendo acmulo de gua.
Ainda assim, o perfil de protenas no extrato fngico obtido para espuma de
poliuretano com 45% de umidade foi muito superior do que os dados obtidos para
farelo de trigo (Fig. 5.55). Estes resultados sugerem um crescimento microbiano
mais balanceado na espuma, havendo o desenvolvimento fngico no filme lquido
formado no interior dos poros da matriz slida e crescimento areo, facilitado pela
manuteno da porosidade do meio. Assim, como no ocorre a compactao da
espuma durante os cultivos, os espaos vazios do leito favorecem o crescimento
das hifas areas, as quais no so limitadas por oxignio. Diversos autores
indicam o uso deste tipo de suporte inerte impregnado com soluo nutriente
adequada para o cultivo em estado slido (Zhu et al., 1996; Pintado et al, 1998).
Lareo et al. (2005) verificaram considervel produo de esporos utilizando
espuma de poliuretano nos cultivos de Mucor bacilliformis em colunas de 20cm de
24m

115
altura. Como conseqncia deste crescimento microbiano acentuado verifica-se
um alto consumo de glicose para o cultivo sobre espuma nas primeiras 144 horas
(Figura 5.56), resultado das altas taxas de transferncia de oxignio. A Fig. 5.57
indica que, devido ao acmulo gradativo de gua, ocorre uma queda progressiva
do rendimento at o consumo total da glicose. Neste caso, a diminuio do
rendimento est ligada ao esgotamento de glicose no meio. O rendimento tem
uma queda brusca devido ao alto consumo de glicose. No entanto, este consumo
no compensado por um crescimento proporcional, de maneira que o
rendimento no apresenta um aumento no perodo experimental.
Estes resultados mostram que altas produtividades nos cultivos em
estado slido podem ser obtidas devido estrutura fsica de suportes inertes que
no apresentam compactao, mantendo o filme lquido na superfcie dos poros e
permitindo desenvolvimento de miclio areo.

0 50 100 150 200 250 300 350
35
40
45
50
55
60
65
U
m
i
d
a
d
e

d
o

s
u
p
o
r
t
e

s
l
i
d
o

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.53 Perfil de umidade do suporte inerte durante o cultivo com 0,4L/min de
vazo de ar


116
0 50 100 150 200 250 300 350
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60
62
64
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

medida experimental para vazo de ar 0,4L/min: dados estimados (o) e
experimentais ( )
0 50 100 150 200 250 300 350
0
200
400
600
800
1000
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.55 Perfil de protenas no extrato bruto durante o cultivo em suporte inerte
com 0,4L/min de vazo de ar


117
0 50 100 150 200 250 300 350
0
25
50
75
100
125
150
175
G
l
i
c
o
s
e

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.56 Perfil da glicose no extrato bruto durante o cultivo em suporte inerte
com 0,4L/min de vazo de ar
50 100 150 200 250 300 350
0,0
2,5
5,0
7,5
Y
X
/
S
(
m
g
p
r
o
t
e
n
a
/
m
g
g
l
i
c
o
s
e
)
Tempo (horas)

Figura 5.57 Perfil do rendimento no cultivo em suporte inerte com 0,4L/min de
vazo de ar

A Fig. 5.58 apresenta o perfil de umidade do meio slido para
experimento com espuma de poliuretano utilizando 1L/min de vazo de ar e 45%
de umidade inicial. Verifica-se um aumento de umidade menos acentuado do que
nos experimentos usando 0,4L/min (Fig. 5.55), apesar do desenvolvimento
microbiano sugerido pelo perfil de protenas (Fig. 5.60). Conforme pode-se
observar na Fig. 5.59, o contedo de umidade estimado pelo consumo de glicose
e os dados experimentais indicaram que aps aproximadamente 120 horas a
umidade do meio slido estimada deveria ser um pouco superior. No entanto, isso
no ocorreu uma vez que a taxa de evaporao conseguiu manter a umidade em

118
um nvel um pouco abaixo, de acordo com a Eq. 4.22. No entanto, os valores
mximos de protena foram inferiores aos encontrados para cultivo com 0,4L/min,
o que sugere que a alta vazo pode ter dificultado o desenvolvimento do miclio
areo, predominando o crescimento no biofilme. Assim, como o teor de protenas
considera o total no extrato fngico, a presena menos expressiva do miclio
areo levou a mximos de protenas menores do que no cultivo a 0,4L/min. O
consumo de glicose apresentado na Fig. 5.61 foi similar ao obtido com 0,4L/min,
com esgotamento deste nutriente em aproximadamente 96 horas de cultivo, na
fase exponencial indicado pelo teor de protenas. Assim, os resultados indicam
que houve um acentuado crescimento microbiano devido eficiente transferncia
de oxignio, o que permitiu um consumo rpido da glicose com formao de gua.
No entanto, o acmulo de gua foi menos agravante uma vez que a alta vazo de
ar permitiu a equilbrio da umidade por volta de 50%. Nota-se que o rendimento
(Fig 5.62) no varia tanto quanto no experimento com menor vazo, indicando que
a manuteno do nvel de umidade minimiza as limitaes do cultivo. Este perfil de
rendimento se aproxima mais do apresentado nos cultivos com farelo de trigo, ou
seja, uma queda no incio devido ao alto consumo de glicose para suprir a
adaptao, seguido de uma estabilidade e reduo do consumo, o que eleva o
rendimento.
0 50 100 150 200 250 300 350
35
40
45
50
55
60
65
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.58 Perfil de umidade do meio slido durante o cultivo em espuma de
poliuretano com 1L/min de vazo de ar


119
0 50 100 150 200 250 300 350
42
44
46
48
50
52
54
56
58
U
m
i
d
a
d
e

(
g
/
1
0
0
g
)
Tempo (horas)

medida experimental para vazo de ar 1L/min: dados estimados (o) e
experimentais ( )

0 50 100 150 200 250 300
0
200
400
600
800
P
r
o
t
e
n
a

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.60 Perfil de protenas no extrato bruto durante o cultivo com espuma de
poliuretano a 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial


120
0 50 100 150 200 250 300 350
0
25
50
75
100
125
150
175
200
G
l
i
c
o
s
e

(
m
g
/
g
)
Tempo (horas)

Figura 5.61 Perfil da glicose no extrato bruto durante o cultivo em espuma de
poliuretano com 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial

50 100 150 200 250 300 350
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Y
X
/
S
(
m
g
p
r
o
t
e
n
a
/
m
g
g
l
i
c
o
s
e
)
Tempo (horas)

Figura 5.62 Perfil do rendimento do cultivo em espuma de poliuretano com 1L/min
de vazo de ar e 45% de umidade inicial

Com menores limitaes de oxignio devido manuteno da umidade,
os altos valores de N apresentados na Fig. 5.63 refletem as condies de
transferncia de oxignio. As taxas apresentam algumas oscilaes no incio do
processo, devido alta demanda de oxignio e crescimento microbiano, sendo

121
constante aps aproximadamente 96 horas. De acordo com o perfil do K
L
a
apresentado na Fig. 5.64 verifica-se que com o aumento mais discreto da umidade
devido alta vazo de ar, a espessura do biofilme deve passar dos 18m para
aproximadamente 20m. Assim, o K
L
a deve ficar por volta de 25s
-1
, ou seja, um
pouco superior ao obtido no ensaio com 0,4L/min. Como a vazo mais elevada
permitiu uma evaporao da gua mais acentuada, o aumento do contedo de
umidade do meio slido foi menor, levando formao de filmes lquidos menos
espessos, proporcionando valores de K
L
as superiores. Desta forma, suportes
inertes como espuma de poliuretano so promissores nos cultivos em estado
slido por permitir em melhor distribuio de ar e eficiente transferncia de
oxignio desde que haja um controle da umidade do meio.
0 50 100 150 200 250 300
2
3
4
5
6
7
8
9
10
N

(
m
o
l
/
s
.
m
3
)
Tenpo (horas)

Figura 5.63 Taxa de transferncia de oxignio (N) ao longo do cultivo em espuma
de poliuretano para 1L/min de vazo de ar e 45% de umidade inicial


122
10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
K
L
a

(
s
-
1
)

L
a no cultivo com espuma de poliuretano com 1L/min de
vazo de ar e 45% de umidade inicial
24m

123
5.8 Caracterizao das protenas produzidas por eletroforese SDS-PAGE

As Figuras 5.65 e 5.66 apresentam os perfis eletroforticos das amostras
de extratos fngicos obtidos a partir de farelo de trigo e espuma de poliuretano
com marcador de alta e baixa massa molar, respectivamente. Foram analisadas
amostras de farelo de trigo 0,59 e 0,35mm com 11 dias de cultivo. Pode-se
verificar que no extrato obtido para farelo de trigo 0,59mm foram identificadas 18
protenas de massa molecular entre 139 a 15 kDa, sendo que as mais intensas
foram 139, 129, 119, 103, 91, 81, 73, 70, 59, 48, 32, 26 e 13kDa. No extrato obtido
com 11 dias de cultivo sobre farelo de trigo 0,35mm foram identificadas 15
protenas entre 129 a 29kDa, sendo que as mais intensas foram 129, 119, 89, 88,
81, 60, 59, 40 e 32kDa.

Fig. 5.65 Eletroforetograma das amostras de extratos fngicos nas diferentes
condies de cultivo em gel com 7,5% de poliacrilamida e marcadores de alta
massa molecular (1) padro de massa molecular; (2) farelo de trigo 0,59mm - 11
dias; (3) farelo de trigo 0,35mm 11 dias; (4) espuma de poliuretano 4 dias
0,4L/min; (5) espuma de poliuretano 11 dias 0,4L/min; (6) espuma de
poliuretano 4 dias 1L/min; (7) espuma de poliuretano 11 dias 1L/min
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

kDa

212
170

116

76

53

124

Fig. 5.66 Eletroforetograma das amostras de extratos fngicos nas diferentes
condies de cultivo em gel com 12,5% de poliacrilamida e marcadores de baixa
massa molecular (1) padro de massa molecular; (2) farelo de trigo 0,59mm - 11
dias; (3) farelo de trigo 0,35mm 11 dias; (4) espuma de poliuretano 4 dias
0,4L/min; (5) espuma de poliuretano 11 dias 0,4L/min; (6) espuma de
poliuretano 4 dias 1L/min; (7) espuma de poliuretano 11 dias 1L/min

De acordo com Marques (1997), a qualidade e quantidade das fraes
alergnicas da biomassa est associada aos substratos e condies de cultivo.
Nos cultivos com farelo de trigo foram identificadas 18 protenas, sendo duas
similares ao reportado por Menezes et al., 1995 (14,4 e 60kDa) a partir da
biomassa de Drechslera produzida por fermentao submersa, e trs protenas de
massas moleculares similares ao obtido por Hasan et al., 2003 (27,8, 60 e 36kDa),
utilizando colunas de Raimbault. No entanto, as condies selecionadas de altura
de leito e vazo de ar que mantiveram as caractersticas da fermentao em
estado slido levaram identificao de protenas com massas molares
diferentes. Com o controle da umidade, houve um balano entre o crescimento do
fungo em biofilme e na forma area, o que sugere a obteno de diferentes
protenas. Guitirrez-Correa & Villena (2003) reportam que a aderncia dos fungos
em superfcies est ligada presena de determinadas protenas chamadas de
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

kDa

97

66

45

30
20,1

14,4

125
hidrofobinas. Wsten & De Vocht (2000) afirmaram que as hidrofobinas so
protenas excretadas por fungos durante o seu desenvolvimento, estando
diretamente envolvidas na formao de estruturas areas hidrofbicas como hifas,
esporos e corpos de frutificao, alm de controlar a adeso das hifas em
superfcies. Sendo assim, nas condies que cultivo que possibilitam o
crescimento areo intenso devido ao controle de umidade, coerente a
identificao de protenas diferentes das obtidas em trabalhos anteriores com
Drechslera (Menezes et al., 1995; Hasan et al., 2003). Dentre as protenas com o
maior potencial alergnico, foram identificadas no farelo de trigo com controle de
umidade protenas de massas moleculares similares tanto ao produzido em cultivo
submerso (36 e 60kDa) como em estado slido (103 e 60kDa).
As amostras de extrato obtido a partir do cultivo sobre espuma de
poliuretano com 45% de umidade inicial a 0,4L/min de alimentao de ar
apresentou protenas de massa molecular com 43 e 28 kDa, ou seja,
predominantemente de baixa massa molecular. De acordo com Linder et al.
(2005), as hidrofobinas so protenas de massa molecular baixa (por volta de
10kDa), sendo responsveis pela formao da estrutura das hifas areas. Assim,
como a estrutura do suporte inerte beneficia o crescimento areo por manter a
compactao do meio, isto pode ter influenciado a produo destas protenas pelo
fungo. Com 11 dias de cultivo na mesma vazo de ar (0,4L/min) no foram
identificadas protenas, o que sugere que as condies de aumento de umidade
no possibilitaram a produo de protenas na faixa de massa molecular
analisada. Alm disso, de acordo com Wessels (1999), algumas protenas
presentes nas paredes das hifas areas e, por vezes secretadas no meio, so
insolveis em soluo de SDS aquecida. Desta forma, estas protenas podem no
ser detectadas pela anlise SDS-Page convencional. No entanto, acredita-se que
os fungos concentrem grande parte da sua atividade para sintetizar estas
hidrofobinas.
O extrato obtido com 4 dias de cultivo sobre espuma de poliuretano com
45% de umidade inicial a 1L/min de alimentao de ar apresentou 4 protenas de
massa molar 139, 88, 40 e 34kDa. Com 11 dias foram identificadas 20 protenas

126
entre 244 e 11 kDa, sendo que as mais intensas foram 244, 91, 74, 58, 48, 35, 26,
24, 20, 16 e 14kDa. As massas molares identificadas foram bem diferentes dos
cultivos com vazo de ar de 0,4L/min, onde houve aumento considervel da
umidade e nota-se que apenas uma protena de alta massa molecular foi obtida
(244kDa). De acordo com o proposto por Wessels (1996), estes resultados
sugerem que D. monoceras tenha produzido uma grande quantidade de protenas
de baixa massa molecular com caractersticas anfiflicas pra facilitar sua aderncia
na superfcie inerte da espuma e para formao intensa das hifas areas. Este
desenvolvimento da fase area deve-se alta porosidade do leito de espuma de
poliuretano, mantida pelo aumento discreto da umidade. Nesta condio foram
identificadas protenas de alto potencial alergnico (14,4, 36, 60kDa), encontradas
tanto no cultivo submerso como em estado slido. Desta forma, a utilizao de
espuma de poliuretano com vazo de ar adequada leva a melhores rendimentos,
alta produtividade e obteno de protenas com caractersticas alergnicas.
De acordo com os resultados, o controle da umidade atravs da altura de
leito e vazo de ar melhora as condies de transferncia de oxignio nos cultivos
com partculas de farelo de trigo, possibilitando rendimentos e produtividades
superiores, mantendo a produo de protenas alergnicas por Drechslera. Da
mesma forma, a utilizao de espuma de poliuretano como suporte inerte para
cultivo em estado slido leva a um crescimento balanceado do crescimento no
biofilme e na fase area devido estrutura fsica do suporte, e mantm a
produo de protenas alergnicas da biomassa de Drechslera.

127
5.9 Estimativa da biomassa celular
Os ensaios em cubetas com banho agitado e termostatizado contendo
meio nutriente Czapeck lquido possibilitaram a determinao das taxas de
consumo de oxignio para diferentes concentraes celulares, conforme Fig. 5.67:
0 100 200 300 400 500
98,8
99,0
99,2
99,4
99,6
99,8
100,0
Sem microrganismos
0,0093 mg/mL
0,0186 mg/mL
0,037 mg/mL
0,093 mg/mL
0,186 mg/mL
O
x
i
g
n
i
o

d
i
s
s
o
l
v
i
d
o

(
%

d
a

s
a
t
u
r
a
o
)
Tempo (segundos)

Figura 5.67 Perfis de oxignio dissolvido para as diferentes concentraes de
inculo

A taxa de consumo de oxignio foi calculada conforme Eq. 4.14. Com
estes resultados, foi possvel calcular a taxa especfica de consumo de oxignio a
partir da curva R vs X (Fig. 5.68) como sendo o coeficiente angular da curva.
Assim, foi obtida uma taxa especfica 0,0234 (mmol/s.m
3
)/(mg/mL), ou seja, 0,39
mmol
oxignio
/(s.g
biomassa
). Considerando este parmetro constante para as
diferentes condies de cultivo, pode-se estimar a concentrao de biomassa (X)
pela Eq. 4.15. Assim, para a condio de maior K
L
a com farelo de trigo, ou seja,
partculas de 0,59mm com 35% de umidade, temos a curva de crescimento
apresentada na Fig. 5.69. As variaes na concentrao de biomassa constatadas
j haviam sido mencionadas por Viccini & Mitchell (2003), uma vez que h perda
de matria seca durante os cultivos, o que causa erros na determinao da
concentrao de microrganismos nos cultivos em estado slido. As partculas de

128
farelo de trigo apresentam reduo dos dimetros mdios, conforme verificado na
Fig 5.5. Assim, esta variao no meio slido pode levar a variaes na estimativa
da biomassa pela demanda biolgica em substratos naturais. Isto fica bastante
evidente quando analisamos a Fig. 5.70, que apresenta a curva de crescimento
em espuma de poliuretano. O comportamento da curva bem definido, havendo
um aumento gradativo na concentrao celular at 144 horas, seguido de uma
fase estacionria. Alm disso, foram verificadas maiores concentraes de
biomassa para esta condio, concordando com o perfil de protena apresentado
na Fig. 5.55. Assim, a curva tpica de crescimento celular foi visualizada para
espuma de poliuretano devido preservao das propriedades fsicas do suporte
slido. Alm disso, as maiores concentraes celulares registradas na Fig. 5.70
para espuma de poliuretano indicam, conforme havia sido verificado pela alta
demanda de oxignio (Fig. 5.51), que a melhor distribuio de ar no suporte e
conseqente consumo intenso de oxignio promovem um maior crescimento
fngico.
Outra condio que determina o crescimento microbiano nos cultivos em
estado slido o grau de compactao (), ou seja, a razo entre o volume de
clulas pelo volume disponvel no leito para crescimento celular. De acordo com
Laukevics et al. (1985), para fungos que crescem no filme lquido e na fase area,
este valor fica em torno de 0,25. Sendo assim, partindo dos dados apresentados
nas Fig. 5.69 e 5.70 e analisando a Eq. 4.16, temos que o volume disponvel para
crescimento celular na espuma no mnimo 2,2 vezes maior que no farelo de
trigo, o que corresponde a um grau de compactao de aproximadamente 0,55.
Deste modo, as clulas poderiam ocupar desta forma 55% do leito de slidos,
resultando num maior crescimento destacado nos perfis de protena apresentados
no item 5.7 e na curva de crescimento estimada pela demanda de oxignio (Fig.
5.70).

129
y = 0,0234x+ 0,004
R
2
= 0,9796
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0 0,05 0,1 0,15 0,2
Concentrao celular (mg/mL)
T
a
x
a

d
e

c
o
n
s
u
m
o

d
e

o
x
i
g
n
i
o

(
m
m
o
l
/
s
.
m
3
)

Figura 5.68 Relao entre a taxa de consumo de oxignio e concentrao de
biomassa

0 50 100 150 200 250 300 350
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
m
X

(
g
b
i
o
m
a
s
s
a

/
g
m
e
i
o
)
Tempo (horas)

Figura 5.69 Curva de crescimento em farelo de trigo estimada pela demanda de
oxignio (condies de cultivo: partculas 0,59mm, umidade inicial 35%, altura de
leito 30mm, vazo de ar 0,4L/min, coluna 30mm x 200mm)

130
0 50 100 150 200 250 300 350
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
m
x

(
g
b
i
o
m
a
s
s
a

/
g
m
e
i
o
)
Tempo (horas)

Figura 5.70 Curva de crescimento em espuma de poliuretano estimada pela
demanda de oxignio (condies de cultivo: umidade inicial 45%, altura de leito
30mm, vazo de ar 0,4L/min)

De acordo com o balano do grau de reduo de substrato e biomassa
(item 4.9.3), podemos estimar o quociente respiratrio (RQ), a quantidade de gs
carbnico produzida e a concentrao celular, assumindo glicose como fonte de
carbono e nitrato como fonte de nitrognio. De acordo com a Fig. 5.71, a produo
de gs carbnico estimado muito superior nos experimentos com espuma de
poliuretano. Isto indica acentuado crescimento celular, conforme j havia sido
evidenciado pelo perfil de protena e glicose (Fig. 5.55 e 5.56).


131
50 100 150 200 250 300 350
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C
O
2

p
r
o
d
u
z
i
d
o

(
g
/
g
m
e
io

s
l
id
o

s
e
c
o
)
Tempo (horas)

Figura 5.71 Perfil de gs carbnico produzido nos cultivos com suporte inerte e
natural: espuma de poliuretano () farelo de trigo ()

Se considerarmos a Eq. 4.24, a qual permite o clculo da produo de
gua pela taxa de produo de gs carbnico (CO
2
)

durante os cultivos, so
obtidos os resultados apresentados na Tab. 5.9, com fator de converso (k
W
) 1,15
kg
gua
/kg CO
2
(Lekanda & Prez-Correa, 2004). A massa de slido (M
S
) foi
calculada pela densidade do suporte e volume do leito. A taxa de produo de
CO
2
(R
CO2
) foi calculada pela regresso linear das curvas apresentadas na Fig.
5.66, obtendo-se a taxa pelo coeficiente angular (Fig. 5 e 6 dos Anexos). Desta
forma, temos que a taxa de produo de gua nos cultivos com espuma de
poliuretano muito superior ao apresentado com farelo de trigo, cerca de cem
vezes maior, levando ao acmulo de gua apresentado nas Fig. 5.53 e 5.58.
Assim, altas taxas de evaporao so necessrias pra manter a umidade
constante em cultivos com espuma de poliuretano. Caso contrrio, em algumas
horas de cultivo o acmulo de gua pode saturar o suporte, prejudicando a
transferncia de oxignio.

132
Tabela 5.9 Estimativa da produo de gua a partir da taxa de produo de gs
carbnico
Suporte k
W
(gH
2
O/gCO
2
)
M
S

(g
meio
)

CPR
(gCO
2
/g
meio
.h)
R
W

(gH
2
O/h)
Farelo de trigo 1,15 3,78 0,0142 0,00388
Espuma de poliuretano 1,15 0,56 0,2385 0,4898

O crescimento microbiano caracterizado pela Fig. 5.72, onde so
apresentadas as curvas de crescimento para espuma e farelo de trigo e verifica-se
que altas concentraes celulares so obtidas para o suporte inerte. Este
comportamento na espuma foi similar ao obtido na estimativa da biomassa pela
demanda de oxignio (Fig. 5.70) sendo obtidos os mximos de biomassa na
mesma ordem de grandeza, por volta de 25 - 30 g/g. Para farelo de trigo, verifica-
se que tambm foram obtidos valores mximos de biomassa na mesma ordem de
grandeza (10 g/g), embora deva-se considerar que a perda de matria seca e a
reduo no tamanho das partculas de farelo de trigo influenciam fortemente este
tipo de estimativa (Nandakumar et al., 1996).

0 50 100 150 200 250 300 350
0
5
10
15
20
25
30
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

c
e
l
u
l
a
r

(
g
/
g
m
e
io

s
lid
o

s
e
c
o
)
Tempo (horas)

Figura 5.72 Estimativa da concentrao celular para cultivo com suporte inerte e
natural atravs do balano do grau de reduo: espuma de poliuretano () farelo
de trigo ()


133
As Fig. 5.73 e 5.74 apresentam as correlaes entre o teor de protenas
solveis no extrato fngico e as estimativas de biomassa pela demanda de
oxignio e pelo grau de reduo do substrato. De acordo com os resultados,
verifica-se que h uma alta correlao entre a produo de protenas
determinadas no extrato fngico pelo mtodo de Bradford e a estimativa da
biomassa pelo grau de reduo para farelo de trigo. Esta evidncia importante
uma vez que a estimativa da biomassa na fermentao em estado slido um
problema a ser contornado e objeto de diversos estudos, constituindo-se numa
das principais dificuldades de monitoramento destes processos (Desgranges et al.,
1991; Durand et al., 1997; Scotti et al, 2001; Webber et al., 1999; Zhao et al.,
2001; Viccini & Mitchel, 2003). Para espuma de poliuretano, verifica-se uma
correlao entre todos os casos, embora menor do que apresentado para farelo
de trigo. Esses resultados indicam que a estimativa do crescimento celular nos
cultivos em estado slido pode ser realizada de forma simples, atravs
determinao de protenas solveis por Ensaio de Bradford.

Fig. 5.73 Matriz de correlaes das estimativas de biomassa para farelo de trigo
(a) Teor de Protena versus demanda de oxignio: R
2
= -0,37
(b) Teor de Protena versus balano do grau de reduo: R
2
= 0,99
(c) Demanda de oxignio versus balano do grau de reduo: R
2
= -0,34

a b c

134

Fig. 5.74 Matriz de correlaes das estimativas de biomassa para espuma de
poliuretano
(a) Teor de Protena versus demanda de oxignio: R
2
= 0,74
(b) Teor de Protena versus balano do grau de reduo: R
2
= 0,53
(c) Demanda de oxignio versus balano do grau de reduo: R
2
= 0,70
a
b c

6 CONCLUSES

Dos resultados apresentados conclui-se que:
- Para partculas de farelo de trigo, a altura de leito 30mm e altas vazes de
ar (0,4L/min) mantm a umidade do meio slido praticamente constante, o que
minimiza a compactao do meio, assegura K
L
as elevados e permite crescimento
na fase area, mantendo assim as caractersticas da fermentao em estado
slido;
- O cultivo em espuma de poliuretano apresentou produo de protenas
superior aos ensaios com farelo de trigo, resultado da manuteno das
propriedades fsicas da matriz slida que permite crescimento balanceado no filme
lquido e na fase area;
- Os ensaios em farelo de trigo e espuma de poliuretano indicam que nos
cultivos em estado slido tanto a espessura de filme lquido formado na superfcie
da matriz slida como os espaos vazios do leito so fundamentais para minimizar
as limitaes de oxignio e para aumentar a produtividade do processo;
- A eletroforese SDS-Page permitiu identificao de protenas com potencial
alergnico no cultivo de Drechslera (Helminthosporium) monoceras com farelo de
trigo e espuma de poliuretano;
- A determinao do teor de protenas do extrato fngico pelo ensaio de
Bradford pode ser utilizada para predizer o crescimento microbiano nos cultivos
em estado slido em farelo de trigo.
Concluses

136
- Com base nos resultados, o controle da umidade do meio slido e da
porosidade do leito durante a fermentao so variveis fundamentais para o
escalonamento dos processos.

7 SUGESTES

- Determinar a altura de leito e vazo de ar que mantm a umidade
praticamente constante ao longo dos cultivos sobre espuma de poliuretano;
- Avaliar o cultivo de Dreschslera monoceras sobre diferentes suportes
inertes, identificando as protenas produzidas;
- Caracterizar experimentalmente as propores da fase area e do biofilme
no crescimento fngico, relacionando-as com a demanda de oxignio, consumo de
glicose e coeficiente global de transferncia de oxignio no meio.
- Estimar o impacto do crescimento da fase area no consumo de oxignio,
produo de biomassa e das protenas alergnicas.
- Explorar o controle da umidade no aumento de escala dos cultivos em
estado slido, com a utilizao de coluna de maiores dimenses.
- Estudar condies operacionais que produzam relaes semelhantes
entre o crescimento areo e em superfcie em coluna de maior dimenso.
146 Referncias bibliogrficas

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ANEXOS

Anexo I Perfil de concentrao de oxignio no filme lquido
A concentrao de oxignio dissolvido na fase lquida pode ser estimada
partindo das seguintes consideraes:
1) Transferncia de massa e consumo de oxignio ocorrendo no filme
lquido formado ao redor de partculas esfricas;
2) As partculas so isotrmicas, sendo assim os gradientes de
temperatura so desprezveis;
3) A transferncia de massa ocorre apenas por difuso, uma vez que a
conveco dentro dos poros desprezvel; so considerados slidos no porosos
(volume de poro desprezvel);
4) A difuso pode ser descrita pela Lei de Fick com difusividade efetiva
constante, sendo assim a interao do substrato com outros gradientes de
concentrao ou outros fenmenos desprezvel;
5) A difusividade do oxignio constante e independente da
concentrao de substrato na partcula, sendo funo apenas das caractersticas
de difuso molecular e do volume de partcula disponvel para o transporte;
6) As partculas so homogneas;
7) As partculas esto em regime permanente, ou seja, o oxignio
transportado consumido no filme lquido, no havendo acmulo;
8) A concentrao de oxignio varia numa nica direo, sendo
considerada radial para partculas esfricas, difundindo-se da superfcie externa
do filme para a superfcie das partculas.
Desta forma, o balano de oxignio pode ser escrito:
(
=
(
+
(
acumulada
Massa
consumida
Massa
gerada
Massa
sistema do sai
que Massa
sistema no entra
que Massa
(Eq.1)
Anexos

149
Taxa de oxignio que entra pela difuso:
r r
L
L , O
r
dr
dC
D
+
|
\
|

2
4
2

Sendo
L O
D
,
2
difusividade de oxignio;
2
O
C concentrao de oxignio no
filme lquido;
2
4 r rea para transferncia de massa; r espessura de filme
lquido.
Taxa de oxignio que sai pela difuso:
r
L
L , O
r
dr
dC
D |
\
|

2
4
2

Taxa de gerao de oxignio: Nula;
Taxa de consumo de oxignio: r r R
o

2
4
2
; sendo que r r
2
4 corresponde
ao volume de filme lquido;
Taxa de acmulo de oxignio: Nula.
Desta forma, temos que:
r r
L
L , O
r
dr
dC
D
+
|
\
|

2
4
2
-
r
L
L , O
r
dr
dC
D |
\
|

2
4
2
- r r R
o

2
4
2
=0 (Eq. 2)
Dividindo os termos por r 4 , temos que:
0
2
2
2 2
=
\
|
|
\
|
+
r R
r
dr
dC
D
dr
dC
D
O
r
L
L , O
r r
L
L , O
(Eq. 3)

0
2
2
2
2
=
\
|
r R
r
r
dr
dC
D
O
L
L , O
(Eq. 4)
Assim, aproximando r 0, temos:
0
2
2
0
2
2
=
\
|

r R
r
r
dr
dC
D
O
L
L , O
lim
r
(Eq. 5)
Anexos

150
Pela definio de derivada, o primeiro termo da equao leva a equao
diferencial de 2
a
ordem:
0
2 2
2 2
= |
\
|
r R r
dr
dC
D
dr
d
O
L
L , O
(Eq. 6)
Assumindo
L , O
D
2
constante e independente de r:
0
2 2
2 2
= |
\
|
r R r
dr
dC
dr
d
D
O
L
L , O
(Eq. 7)
Expandindo o termo da esquerda, temos:
0 2
2 2
2
2
2 2
=
|
|
\
|
+ r R
dr
dC
r r
dr
C d
D
O
L L
L , O
(Eq. 8)
Condies de contorno:
r = 0

(centro da partcula; condio de simetria)
dr
dC
L
= 0 (Eq. 9)
r = R
1
(superfcie da partcula
dr
dC
D
dr
dC
D
S
L S
L , O
F
L F
L , O
2 2
=
(Eq. 10)
r = R
2
(superfcie do filme lquido)
( )
i
G G G
F
L F
L , O
C C k
dr
dC
D =
2
(Eq. 11)
Os ndices F e S indicam filme lquido e partcula slida,
respectivamente. A concentrao de oxignio na superfcie do lquido (r=R
2
) a
concentrao de saturao na presso e temperatura considerada. Integrando a
Eq. 8 com as condies de contorno apresentadas (Equaes 9 e 10), temos o
perfil radial de concentrao de oxignio no filme lquido. Considerando reao de
consumo de oxignio de ordem zero, temos a Eq. 12. Esta expresso foi utilizada
no clculo da concentrao de oxignio no filme lquido na superfcie da partcula
slida (C
L
), de acordo com a Eq. 4.12.
|
|
\
|
+ + =

2
3
1
3
2
3
1
2
2
2
2
2 2
1
6
2
2
R
R
rR
R
R
r
D
R R
C C
L , O
O
L L
(Eq. 12)
Anexos

151
Anexo II Curvas-padro e de calibrao

y = 0,6947x + 0,166
R
2
= 0,9689
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1
Concentrao de protenas solveis (mg/mL)
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

a

5
9
5

n
m

Fig. 1 Curva padro de protena solveis no extrato fngico obtidas pelo ensaio
de Bradford usando BSA como padro

y = 0,7062x + 0,0848
R
2
= 0,9635
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Glicose (mg/mL)
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

a

5
0
5

n
m

Fig. 2 Curva padro de glicose no extrato fngico pelo mtodo enzimtico glicose -
oxidase

Anexos

152
y = 6,3417x + 0,0255
R
2
= 0,9909
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,05 0,1 0,15 0,2
Concentrao celular (mg/mL)
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

a

5
5
0

n
m

Fig. 3 Curva padro da biomassa de D. monoceras

y = -1,0631x + 2,4542
R
2
= 0,9746
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Rf
L
o
g
1
0
(
M
M
)

Fig. 4 Curva de calibrao do marcador de alta massa molar para identificao de
protenas por SDS-PAGE

Anexos

153
y = -1,2343x + 2,2172
R
2
= 0,9874
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf
L
o
g
1
0

(
M
M
)

Fig. 5 Curva de calibrao do marcador de baixa massa molar para identificao
de protenas por SDS-PAGE
Anexos

154
Anexo III Correlaes

R
2
= 0,9672
42 44 46 48 50 52 54 56 58
Umidade estimada (g/100g)
42
44
46
48
50
52
54
56
U
m
i
d
a
d
e

e
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

(
g
/
1
0
0
g
)

Fig. 6 Correlao entre dados de umidade experimental e estimados para farelo
de trigo
Anexos

155
y = 0,014x + 0,1826
R
2
= 0,9946
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 50 100 150 200 250 300 350
Tempo (horas)
C
O
2

p
r
o
d
u
z
i
d
o

(
g
/
g
)

Fig. 7 Regresso linear para estimativa da taxa de produo de gs carbnico
com cultivo em farelo de trigo (35% de umidade; 0,4L/min; partculas 0,59mm)
y = 0,2385x + 3,0756
R
2
= 0,9787
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300 350
Tempo (horas)
C
O
2

p
r
o
d
u
z
i
d
o

(
g
/
g
)

Fig. 8 Regresso linear para estimativa da taxa de produo de gs carbnico
com cultivo em espuma de poliuretano (45% de umidade; 0,4L/min)
Anexos

156
Anexo IV Isotermas de BET para os suportes inertes

Fig. 9 Isoterma BET para amostras de farelo de trigo 0,35mm

Anexos

157

Fig. 10 Isoterma BET para amostras de farelo de trigo 0,59mm
Anexos

158

Fig. 11 Isoterma BET para amostras de espuma de poliuretano
Anexos

159
Anexo V Distribuio de tamanho de partculas
Particle Diameter (m.)
Volume (%)
0
10
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.01 0.1 1.0 10.0 100.0 1000.0

Fig. 12 Distribuio de tamanho obtida no Mastersizer S (Malvern) para farelo de
trigo 0,35 mm com 11 dias de cultivo com 35% de umidade inicial
Anexos

160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3,327mm 3,327> dp
0,833
0,833> dp
0,589
0,589 > dp
0,295
0,295 > dp
0,147
0,147 > dp
Dimetro das partculas (mm)
F
r
a
o

e
m

m
a
s
s
a

r
e
t
i
d
a

(
%
)

(a)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3,327mm 3,327> dp
0,833
0,833> dp
0,589
0,589 > dp
0,295
0,295 > dp
0,147
0,147 > dp
F
r
a
o

e
m

m
a
s
s
a

r
e
t
i
d
a

(
%
)

(b)

Fig. 13 Distribuio de tamanhos obtida pelo conjunto de peneiras para farelo de
trigo 0,35mm no tempo zero (a) e com 11 dias (b) com 35% de umidade

Anexos

161

0
10
20
30
40
50
60
3,327mm 3,327> dp
0,833
0,833> dp
0,589
0,589 > dp
0,295
0,295 > dp
0,147
0,147 > dp
F
r
a
o

e
m

m
a
s
s
a

r
e
t
i
d
a

(
%
)

(a)

0
10
20
30
40
50
60
3,327mm 3,327> dp
0,833
0,833> dp
0,589
0,589 > dp
0,295
0,295 > dp
0,147
0,147 > dp
F
r
a
o

e
m

m
a
s
s
a

r
e
t
i
d
a

(
%
)

(b)

Fig. 14 Distribuio de tamanhos obtida pelo conjunto de peneiras para farelo de
trigo 0,59mm no tempo zero (a) e com 11 dias (b) com 35% de umidade

Anexos

162
Anexo VI Perfis de umidade do meio slido, protena e glicose do extrato
fngico, rendimento de glicose em protenas e taxa de transferncia de
oxignio para diferentes alturas de leito

Fig. 15 Comportamento do cultivo sobre farelo de trigo com 30 mm de altura de
leito (vazo 1L/min; farelo de trigo 0,59mm)
Anexos

163

Anexos

164


Anexos

165


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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

. A umidade relativa do ar da entrada das colunas foi monitorada por

. Inicialmente foram realizados ensaios com meio

, o qual contm as seguintes protenas e enzimas

5301B. A espessura do biofilme foi considerada

Model 5300 e a taxa

) representa a composio da biomassa e a, b, c, d

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