Tcnica de Cromatografia Normalmente trabalhamos em laboratrio com substncias quimicamente puras.

Entretanto, muitas vezes os reagentes ou solventes utilizados contm impurezas. Por outro lado, as reaes qumicas geralmente produzem misturas mais ou menos complexas de produtos, os quais devem ser separados e purificados. Muitos so os mtodos existentes para a purificao e separao dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidos podemos citar a catao, a dissoluo/cristalizao/ recristalizao fracionada, a extrao, a destilao e a sublimao. Esses mtodos so muito teis, sendo largamente empregados em laboratrios e em indstrias com resultados satisfatrios. No entanto, esses mtodos no so eficientes quando os componentes da mistura possuem constantes fsicas muito semelhantes, isto , pontos de fuso ou ebulio prximos, solubilidade semelhante, etc. A cromatografia permite resolver este problema. A cromatografia um mtodo de separao de substncias baseado na distribuio seletiva dos diferentes componentes de uma mistura entre duas fases imiscveis. Os mtodos cromatogrficos permitem separar os componentes de uma mistura, baseados na migrao seletiva e diferencial dos solutos atravs de um sistema constitudo de duas fases: uma estacionria (ou fixa) e outra fluida (ou mvel). A fase estacionria denominada adsorvente e a fase mvel o eluente. Adsoro a capacidade de uma substncia (o adsorvente) de deter ou concentrar seletivamente sobre a sua superfcie gases, lquidos ou slidos, que podem ser arrastados pelo eluente. A cromatografia muito utilizada para anlise, separao e purificao de produtos naturais, tais como antibiticos, vitaminas, hormnios, corantes, entre outros, tanto em laboratrio quanto em escala industrial. Seu uso mais conhecido, no entanto, o da anlise, localizao e identificao de microgramas de substncias em meios biolgicos (por exemplo, em exames "anti-doping" e de medicina legal). Em laboratrios de sntese orgnica muitoutilizada no acompanhamento de reaes e na purificao de substncias. Os principais procedimentos cromatogrficos so os seguintes: cromatografia em papel, em camada delgada, em coluna, em fase gasosa, em fase lquida, e cromatografia por excluso de tamanho (GPC). Cromatografia em papel Esta tcnica cromatogrfica assim chamada porque utiliza para a separao e identificao das substncias ou componentes da mistura a migrao diferencial sobre a superfcie de uma tira de papel filtro de qualidade especial. Este tipo de cromatografia de execuo muito simples e necessita quantidades muito pequenas das

substncias para a realizao da anlise. A amostra aplicada a uma pequena distncia da borda inferior de uma tira de papel filtro. A seguir, a tira colocada em contato com o eluente escolhido, cuidando para que o mesmo no entre em contato direto com a amostra e permitindo que o mesmo molhe o papel, subindo por capilaridade. Ao subir, o eluente arrasta seletivamente os componentes da mistura, os quais podem ser identificados por visualizao direta (caso sejam coloridos) ou pela utilizao de reveladores adequados. A cromatografia em papel um mtodo muito til para separar substncias muito polares como os acares e os aminocidos. Possui o inconveniente de s permitir a separao de pequenas quantidades das misturas de cada vez. Cromatografia em camada delgada (CCD) A cromatografia em camada delgada uma tcnica cromatogrfica muito parecida com a realizada em papel, porm que conduz a resultados muito mais eficientes e perfeitos de separao. uma tcnica simples, barata e muito importante para a separao rpida e anlise qualitativa de pequenas quantidades de material. Ela usada para determinar a pureza de compostos, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padres, acompanhar o curso de reaes pelo aparecimento de produtos ou desaparecimento de reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura. A tcnica consiste em cobrir uma placa de vidro, alumnio ou plstico, com um adsorvente adequado e com uma granulao especial. A espessura da camada varia de 0,1 a 2,0 mm e deve ser a mais uniforme possvel. O adsorvente pode ser misturado a um aglutinante (geralmente gesso ou amido), sendo depois suspenso em gua ou outro solvente e depositado uniformemente sobre a placa (manualmente ou por intermdio de aplicadores apropriados). Ao secar, o adsorvente permanece aderido placa que, em geral, deve ser ativada por aquecimento em estufa. Atualmente as placas revestidas com adsorventes podem ser adquiridas prontas. A revelao e identificao das substncias feita da mesma maneira que na cromatografia em papel. Possui a vantagem, no entanto, de poder utilizar reveladores mais agressivos, pois seu suporte mais resistente que o papel. A cromatografia em camada delgada utilizada habitualmente em anlise qualitativa e quantitativa devido sua grande sensibilidade e preciso. Pode ser utilizada, tambm, em escala preparativa para amostras de at 250 mg. Para quantidades maiores prefere-se a cromatografia em coluna, que ser vista mais adiante. Pela comodidade, rapidez, perfeio e confiabilidade dos resultados esta tcnica cromatogrfica largamente utilizada em laboratrios clnicos e de controle de qualidade. Em alguns aspectos ela perde para a cromatografia gasosa e para a cromatografia lquida

de alta eficincia. Estas ltimas, porm, so muito menos acessveis e mais dispendiosas e no esto acessveis em qualquer laboratrio ou indstria. Fator de Reteno (Rf) Um dos aspectos mais importantes de um determinado sistema cromatogrfico o movimento relativo de um composto em relao frente do solvente, que uma propriedade caracterstica e reprodutvel. Nas cromatografias em papel e em camada delgada se expressa este movimento como um valor do fator de reteno Rf (Rate of flow). Este definido como a razo entre a distncia percorrida pela mancha e a distncia percorrida pelo solvente conforme mostrado abaixo:

Exemplo de cromatograma:

Esses valores so reprodutveis em condies idnticas de trabalho (temperatura, solvente e umidade constantes) e servem para caracterizar e identificar as substncias. A medida feita desde a linha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) at o centro da mancha em estudo. O valor obtido comparado aos tabelados na literatura especializada podendo servir para identificar a substncia em questo. Cromatografia em coluna A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento cromatogrfico. Foi descrito pela primeira vez pelo botnico russo M. S. Tswett que a utilizou para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais. Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida com um adsorvente adequado. A coluna pode ser um tubo simples, aberto em ambas as extremidades, ou semelhante a uma bureta, com uma torneira na parte inferior. O adsorvente pode ser colocado na coluna diretamente (seco) ou suspenso em um solvente adequado (geralmente o prprio eluente a ser usado no processo de separao). Os principais adsorventes normalmente utilizados so silicagel, alumina, carbonato de clcio, xido de magnsio, carvo ativado, sacarose e amido. Os principais eluentes so o ter de petrleo, ter etlico, clorofrmio, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, gua destilada ou misturas dos eluentes anteriores. O procedimento consiste em colocar a substncia a ser separada ou analisada na parte superior da coluna e o eluente vertido em seguida, em quantidade suficiente para promover a separao. Em alguns casos pode-se aplicar vcuo na parte inferior da coluna ou uma leve presso na parte superior, visando acelerar o processo de separao. Quando a mistura a ser separada contm substncias coloridas, podem-se visualizar diferentes zonas descendo pela coluna, de modo a permitir a separao em diferentes fraes. Quando a amostra no possuir cor recolhem-se vrias fraes iguais do material eludo, testando-as para verificar a presena de substncias dissolvidas pelo uso de reveladores adequados (luz UV, reveladores qumicos, etc.). comum monitorar a eluio de uma coluna utilizando CCD. Cromatografia gasosa, HPLC (Cromatografia lquida de alta eficincia) e GPC (Cromatografia de permeao em gel) Estes procedimentos cromatogrficos envolvem o uso de aparelhagem instrumental mais sofisticada. So procedimentos cromatogrficos de uso mais recente, quando comparados aos demais, e muito difundidos em laboratrios acadmicos e industriais.

Permitem anlises qualitativas e quantitativas de quantidades muito pequenas de substncias. PARTE EXPERIMENTAL Experimento 1. Cromatografia em papel Corte uma tira de papel especial para cromatografia na medida adequada para o recipiente a ser utilizado como cmara cromatogrfica, conforme instrues do professor. Desenhe uma linha (com um lpis de ponta fina) a cerca de 2 cm da extremidade da tira (linha base). Sobre esta linha faa duas pequenas marcas com canetas hidrocor de cores diferentes, distantes uma da outra. Introduza a tira na cmara cromatogrfica contendo um pequeno volume de etanol, com a linha base na parte inferior. Observe que o nvel de solvente deve ficar abaixo da linha. Deixando a tira na posio vertical, permita que o eluente suba pela tira, de modo a arrastar os componentes da tinta das canetinhas. A tira de papel NO DEVE tocar as paredes da cuba. aconselhvel colocar o eluente escolhido na cuba algum tempo antes de proceder anlise para permitir que o ambiente fique saturado com seus vapores. Quando a frente de eluente estiver a cerca de 1 cm do final da tira retire-a da cmara cromatogrfica e deixe evaporar. Verifique as posies relativas das manchas e determine os valores de Rf de cada pigmento. OBS: Preparao de uma cuba cromatogrfica: Cubas contendo os eluentes etanol e outras contendo outros eluentes (gua, acetona, cido actico, acetato de etila, mistura gua + etanol). Pode-se colocar uma tira de papel revestindo as paredes das cubas para melhorar a saturao do ambiente, cuidando para que fique uma janela que permita a visualizao do experimento. Experimento 2. CROMATOGRAFIA EM COLUNA 2.1. Preparao de uma coluna coluna cromatogrfica Prepare uma coluna cromatogrfica (tubo de vidro de 5 x 250 mm, afilado em uma das pontas) tapando a extremidade afilada com um pequeno chumao de algodo e preenchendo-a com cerca de 5 g de silicagel 60 (70-230 mesh) seca, ou na forma de uma suspenso em etanol. Neste ltimo caso, cuide para no deixar secar a slica em nenhum momento. A preparao da coluna seca mais rpida,

porm a possibilidade de formao de vazios maior, diminuindo a eficincia da separao. ATENO: A altura da camada de slica deve ser de aproximadamente 5-7 cm. Evite, portanto, o DESPERDICIO de eluente e de adsorvente. Coloque, CUIDADOSAMENTE, cerca de 5 gotas da soluo contendo a mistura de corantes na extremidade superior da coluna. Espere alguns instantes para que a amostra penetre na camada de adsorvente, iniciando ento a adio de etanol puro para que se proceda separao dos constituintes da amostra. Recolha as diferentes fraes em tubos de ensaio, evitando deixar secar a coluna. Terminada a eluio do primeiro corante, o segundo corante pode ser eludo utilizando soluo cido actico. 2.2. SEPARAO DOS COMPONENTES DE UMA MISTURA Distribua homogeneamente sobre o topo da coluna de alumina, com auxlio de uma pipeta ou conta-gotas, 1 a 3 mL de uma soluo etanlica de alaranjado de metila e azul de metileno. Aps a adsoro pela coluna, proceda a eluio com etanol, vertendo cuidadosamente o solvente pelas paredes internas da coluna, tomando cuidado para no causar distrbios ou agitao na coluna. Ao mesmo tempo, abra a torneira para escoar o solvente. Elua todo o azul de metileno com etanol. Elua, primeiro com gua, o alaranjado de metila retido na coluna e em seguida com uma soluo aquosa de cido actico.

Se o mesmo procedimento acima for realizado utilizando slica gel como fase fixa da coluna. Observe que a ordem de eluio se inverte, isto , o alaranjado de metila sai com etanol enquanto o azul de metileno fica retido na coluna. QUESTIONRIO: 1- Cite os principais tipos de foras que fazem com que os componentes de uma mistura sejam adsorvidos pelas partculas do slido: 2- Cite as caractersticas do solvente para lavar ou arrastar os compostos adsorvidos na coluna cromatogrfica: 3- Fale sobre cromatografia: o princpio bsico que envolve a tcnica de

6- O que e como calculado o Rf ?

7- Quais os usos mais importantes da cromatografia de camada delgada? 8- A alumina, ou xido de alumnio, tem ao bsica e interage fortemente com espcies cidas; por sua vez, a slica gel interage com espcies bsicas devido a natureza cida do xido de silcio. Baseado nessas informaes, explique o comportamento distinto dos dois corantes empregados quando se usa alumina ou slica como fase fixa. Obs: Pesquise a estrutura dos dois corantes.