UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE FARMCIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

ELAINE AMARAL LEITE

AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS DE CIRCULAO PROLONGADA CONTENDO CISPLATINA

Belo Horizonte - MG 2010

ELAINE AMARAL LEITE

AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS DE LONGA CIRCULAO CONTENDO CISPLATINA

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial, para a obteno do grau de doutor em Cincias Farmacuticas. Orientador: Profa. Dra. Mnica Cristina de Oliveira

Belo Horizonte - MG 2010

L533a

Leite, Elaine Amaral Avaliao da toxicidade aguda e atividade antitumoral de lipossomas pH-sensveis de longa circulao contendo cisplatina / Elaine Amaral Leite. 2010. 162 f. : il. Orientadora: Profa. Dra. Mnica Cristina de Oliveira. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmcia. Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas. 1. Cncer Tratamento Teses. 2. Lipossomas - Teses. 3. Tecnologia farmacutica Teses. 4. Agentes antineoplsicos Teses. I. Oliveira, Mnica Cristina de. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmcia. III. Ttulo. CDD 615.4

21

Dedico esse trabalho queles que sempre estiveram ao meu lado: meus pais, Lzaro e Din meu irmo, Leonardo

22

AGRADECIMENTOS

minha famlia, obrigada por dividirem comigo tantos momentos de dificuldades e multiplicarem a alegria das vitrias alcanadas. Aos meus pais, Lzaro e Din, pelo amor, carinho, dedicao e presena constante em minha vida. Obrigada por apoiarem sempre todas as minhas decises e por acreditarem em mim e em meus sonhos. Ao meu irmo, Leo, por tudo que representa na minha vida, pela amizade, companheirismo, apoio, incentivo e torcida por minhas realizaes. minha cunhada, Lu, pela amizade, carinho, apoio e presena em todos os momentos. Iacmi, por todos esses anos de convivncia, pela amizade nica, pelas conversas, pelo apoio, incentivo e compreenso nos momentos difceis. Profa. Mnica, agradeo imensamente pela admirvel orientao, pelos ensinamentos transmitidos, pela ateno e presena marcante no decorrer desse projeto. Obrigada pela confiana, pacincia, incentivo e amizade. Agradeo ainda por ter me recebido em sua equipe e pela oportunidade de trabalhar contigo, uma pessoa to especial e com qualidades mpares: honesta, justa, otimista, exemplo de dedicao e competncia profissional, atributos esses que muito contriburam para a minha formao profissional e pessoal. Aos professores, Vildete, Renata, Gilson, Lucas e Valbert, agradeo pela convivncia durante esses anos, pelo incentivo, apoio e por toda contribuio cientfica. Profa. ngela Maria Lana pela colaborao imprescindvel durante a realizao das anlises estatsticas.

23

patologista rika Meinick pela realizao das avaliaes histopatolgicas e pela disponibilidade em discutir os laudos. Ao Prof. Lauro, pela pacincia, ateno e gentileza em fotografar as imagens das anlises histopatolgicas. Ao Prof. Geovanni Cassali pela gentileza de disponibilizar o Laboratrio de Patologia Comparada para a realizao das anlises histomorfomtricas e pela ateno dispensada na anlise dos resultados. Aos professores Luiz Gonzaga e Paulo Savassi, ao Alberto e Ana Paula pelas sugestes dispensadas no decorrer desse trabalho. Aos meus amigos do LTF: lvaro, Cris Giuberti, Las, Talita, Svia, Berta, Guilherme Diniz, Soninha, Jos Geraldo, Luciene, Andr, Soraya, Guilherme Carneiro, Erly, Vanessa, Cristiane Moraes, Dlia, Gisele, Martinha, Isabel, Joo, Diego, Samuel, Elton, Andra, Daniel, Betnia, Lucas, Juliana, Ricardo, Laurinha, Cristiane Melo, Tatiana, Lorena e Denise, que fizeram parte desses anos de trabalho, agradeo pela amizade e convivncia. Agradeo de maneira especial aos amigos: lvaro, Cris Giurberti, Svia, Gui, Martinha, Gi, Lu e Andr pela amizade, companheirismo, cumplicidade, pelas horas e horas de conversas e acima de tudo pelos bons momentos vividos. Juntos dividimos o peso das dificuldades e compartilhamos inmeros momentos de alegrias e conquistas. Ao Eduardo, tcnico responsvel do LTF, obrigada pela amizade, pacincia, presteza, por todas as vezes que me socorreu quando alguma coisa dava errado. Agradeo ainda pela colaborao dispensada na execuo desse trabalho. Cristina Maria, pelo grande auxlio nas anlises histomorfomtricas e ajuda na obteno das fotomicrografias. Ao Gui, pela enorme ajuda nas figuras de histologia.

24

Ao Jamil, tcnico do Laboratrio de Fsico-qumica de Protenas (ICB/UFMG) pela presteza e disposio em operar a ultracentrfuga na parte inicial desse trabalho. veterinria Maria Adelaide e ao Jos Batista por estarem sempre disponveis e alegres, auxiliando na manuteno e cuidado aos animais. Aos amigos da Faculdade de Farmcia da UFMG pelos inmeros momentos compartilhados. FAPEMIG e FINEP pelo apoio financeiro. Muitas foram as pessoas que direta ou indiretamente estiveram presentes comigo durante esse percurso, que torceram e colaboraram de forma essencial para a realizao desse trabalho. Por isso, a todos a quem no me referi, obrigada! E sobretudo, agradeo a Deus por ser to maravilhoso comigo, colocando pessoas to especiais em minha vida e, principalmente, por conduzir meus passos, abrindome portas e iluminando sempre o meu caminho.

25

O mais importante na cincia no est na obteno de novos fatos, mas na descoberta de novas maneiras de pensar a respeito deles.
(Willian Lawrence Bragg)

26

RESUMO

O cncer uma das principais causas de mortalidade no mundo, sendo a quimioterapia uma das alternativas para o tratamento dessa doena. A cisplatina (CDDP) um dos agentes citotxicos mais ativos e tem sido comumente utilizada como quimioterpico de primeira escolha contra vrios tipos de tumores. Entretanto, a efetividade de seu uso clnico limitada pelos efeitos adversos graves, principalmente pela nefrotoxicidade, e sua tendncia de promover quimioresistncia. Novos carreadores nanoestruturados, lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada contendo CDDP (SpHL-CDDP) foram desenvolvidos objetivando promover uma liberao de CDDP mais seletiva para as clulas cancerosas, o que pode contribuir para reduzir ou eliminar a toxicidade e aumentar sua eficcia teraputica. Este trabalho apresenta a avaliao pr-clnica de SpHL-CDDP focando a toxicidade aguda aps sua administrao por via intravenosa (IV) e intraperitoneal (IP) em camundongos Swiss sadios e a eficcia antitumoral aps o tratamento por via IV em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich. Para o estudo de toxicidade aguda, os animais receberam diferentes doses de CDDP livre ou SpHL-CDDP e os parmetros avaliados incluram: variao do peso corporal, determinao da dose letal capaz de conduzir mortalidade de 50% dos animais (DL50) e da dose mxima tolerada (DMT), avaliao hematolgica e bioqumica bem como avaliao histopatolgica dos rins, fgado, bao e medula ssea. Os resultados demonstraram maior perda de peso corporal dos camundongos tratados com CDDP livre do que aqueles tratados com SpHL-CDDP, aps a administrao por via IP e IV. Os valores da DL50 e DMT foram significativamente aumentados em camundongos machos e fmeas aps o tratamento com SpHL-CDDP comparado com o tratamento com CDDP livre, em ambas as vias investigadas. Alteraes nos parmetros hematolgicos foram observadas aps a administrao de baixas doses de CDDP livre (5 e 10 mg/kg) por via IP, enquanto por via IV essas alteraes ocorreram aps a administrao de doses mais altas (20 mg/kg). Esses achados associados s alteraes histopatolgicas confirmaram o potencial mielossupressor da CDDP. Por outro lado, o tratamento com SpHL-CDDP no provocou modificao dos parmetros hematolgicos indicando ausncia de mielotoxicidade. Com relao nefrotoxicidade, o tratamento com CDDP livre causou alteraes significativas nos

27

nves de uria, creatinina e no ndice uria/creatinina em camundongos machos e fmeas. Alm disso, a avaliao microscpica dos rins revelou uma severa necrose tubular. Em contraste, alteraes menos pronunciadas dos parmetros bioqumicos e ausncia de modificao histopatolgica foram observadas nos grupos tratados com SpHL-CDDP. Nenhuma alterao morfolgica do fgado e bao foi observada aps ambos os tratamentos pelas duas vias utilizadas. Para o estudo de atividade antitumoral, camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich receberam trs doses de SpHL-CDDP (16 mg/kg) ou CDDP livre (8 mg/kg) por via IV e os parmetros avaliados incluram a determinao do volume do tumor e sua caracterizao histomorfomtrica. O tratamento com SpHL-CDDP inibiu significativamente o crescimento do volume do tumor em comparao com a CDDP livre. Nenhuma diferena nas caractersticas histomorfomtricas foi observada entre ambos tratamentos. Portanto, SpHL-CDDP mostrou ser menos txico que CDDP livre, permitindo aumentar a dose administrada o que promoveu um maior efeito farmacolgico em relao CDDP livre. Esses resultados demonstraram que SpHLCDDP um candidato promissor para a quimioterapia de tumores que respondem ao tratamento com CDDP. Palavras-chave: cisplatina, lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada, toxicidade aguda, eficcia antitumoral

28

ABSTRACT

Cancer is one of the main causes of mortality in the world, with chemotherapy being a valuable alternative for the disease treatment. Cisplatin (CDDP) is one of the most active cytotoxic agents and has been commonly used as first line chemotherapy against several tumors. However, the effectiveness of its clinical use is limited by severe side effects, mainly nephrotoxicity, and its tendency to provoke chemoresistance. New nanostructured carriers, pH-sensitive and long-circulating liposomes containing CDDP were developed aiming to promove a more selective administration of CDDP to cancer cells that may contribute to a decrease in or elimination of toxicity and enhance its therapeutic efficacy. This work presents the pre-clinical evaluation of SpHL-CDDP focusing on acute toxicity after its administration by intravenous (IV) and intraperitoneal (IP) route in healtly Swiss mice and antitumoral efficacy after administration by IV route in Ehrlich solid tumorbearing Swiss mice. For acute toxicity study, animals received different doses of free CDDP or SpHL-CDDP and the parameters evaluated included: body weight variation, LD50 and maximum tolerated dose (MTD) determination, hematological and biochemical analysis as well as histopathological evaluation of kidneys, liver, spleen and bone marrow. The results showed a greater loss of body weight in mice treated with free CDDP than those treated with SpHL-CDDP, after administration by IP and IV route. The LD50 and MTD were significantly increased in male and female mice after SpHL-CDDP treatment compared with free CDDP treatment, in both routes investigated. Hematological parameters alterations were observed after administration of low doses of free CDDP (5 and 10 mg/kg) by IP route, while by IV route these alterations only occurred after the administration of high doses (20 mg/kg). These findings associated to the morphological alterations confirmed the mielossupressor effect of CDDP treatment. On the other hand, SpHL-CDDP treatment provoked no modification over hematological parameters indicating the absence of myelotoxicity. As regards nephrotoxicity, free CDDP treatment caused significant alterations in the blood urea, creatinine levels and urea/creatinine index of male and female mice. In addition, the microscopic examination of kidneys revelead a severe toxic tubular necrosis. In contrast, slight alterations of biochemistry parameters and absence of histopathological modifications were observed in mice

29

treated with SpHL-CDDP. No morphological alteration of liver and spleen was observed after both treatments by two routes used. Concerning antitumoral activity, Ehrlich solid tumor-bearing Swiss mice received three doses of SpHL-CDDP (16 mg/kg) or free CDDP (8 mg/kg) by IV route and the tumor volume was evaluated along time as well as the histomorphological characterization of tumor was performed. The treatment with SpHL-CDDP inhibited significantly the growth of tumor volume in comparison with free CDDP. No difference in the histomorphometrical features has been detected. Therefore, SpHL-CDDP treatment showed to be less toxic than free CDDP treatment allowing to increase the administered dose, and consequently, to achieve a greater pharmacological effect than that observed after free CDDP treatment. These results demonstrated that SpHL-CDDP is a promising candidate for chemotherapy of tumors which are sensitive to CDDP treatment. Key-words: cisplatin, pH-sensitive and long-circulating liposomes, acute toxicity, antitumoral efficacy

30

LISTA DE FIGURAS

1 Frmula estrutural da CDDP...................................................................................................... 29 2 Formao dos aductos da CDDP.............................................................................................. 30 3 Reaes de hidrlise da CDDP................................................................................................. 31 4 Representao
esquemtica do mecanismo de toxicidade da CDDP via gamaglutamiltranspeptidase (GGT)............................................................................................. 33

5 Representao esquemtica de lipossoma demonstrando uma cavidade aquosa, com

material hidroflico em seu interior, envolvida por uma bicamada lipdica (A). Bicamada lipdica, visualizada em maior aumento, mostrando a cabea polar (regio hidroflica) e a cauda apolar (regio hidrofbica) dos lpides (B)....................................................................... 35

6 Estruturas qumicas do hemisuccinato de colesterila (A) e dioleoilfosfatidiletanolamina 7 Representao esquemtica da organizao estrutural de derivados da PE na ausncia 1.1 Variao do peso corporal de camundongos Swiss machos (A e B) e fmeas (C e D)

(B).................................................................................................................................................... 38 e na presena de CHEMS.............................................................................................................. 39 observada durante 14 dias aps a administrao IP de CDDP livre ou SpHL-CDDP.............. 71

1.2 Taxa de sobrevida de camundongos Swiss machos (A) e fmeas (B) tratados com

CDDP livre, SpHL-CDDP, salina e SpHL....................................................................................... 73

1.3 Nveis de uria (A) e creatinina (B) de camundongos Swiss machos e fmeas tratados por via IP com diferentes doses de CDDP livre ou SpHL-CDDP............................................... 80 1.4 Fotomicrografias da medula ssea de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D)............................................................................................................................... 84 1.5 Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D)............................................................................................................................... 84 1.6 Fotomicrografias do fgado de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D).................................................................................................................................... 85 1.7 Fotomicrografias do bao de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D).................................................................................................................................... 85 1.8 Variao do peso corporal de camundongos Swiss machos (A e B) e fmeas (C e D) monitorado durante 14 dias aps a administrao IV de CDDP livre, SpHL-CDDP, salina e SpHL................................................................................................................................................ 92 1.9 Taxa de sobrevida de camundongos Swiss machos (A) e fmeas (B) tratados com CDDP livre, SpHL-CDDP, salina e SpHL....................................................................................... 94

31

1.10 Nveis plasmticos de uria (A), creatinina (B) e ndice uria/creatinina (C) de camundongos Swiss machos e fmeas avaliados trs dias aps o tratamento por via IV com CDDP livre nas doses de 20 e 15 mg/kg para machos e fmeas, respectivamente; SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg para machos e fmeas, respectivamente; salina e SpHL............................................................................................................................................. 103 1.11 Fotomicrografias do tecido sseo de camundongos Swiss machos (A, C e E) e fmeas (B, D e F) tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre (C e D) e SpHL-CDDP (E e F). C e D representam cortes histolgicos realizados quatorze dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 10 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente. E e F mostram cortes histolgicos realizados quatorze dias aps o tratamento com SpHLCDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente........................... 107 1.12 Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss machos (A, C e E) e fmeas (B, D e F) tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre (C e D) e SpHL-CDDP (E e F). Os animais foram sacrificados quatorze dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 10 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente e SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente......................................................... 109 1.13 Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss machos (A e C) e fmeas (B e D) tratados com soluo CDDP livre (A e B) e SpHL-CDDP (C e D). Os animais foram sacrificados trs dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 15 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente e SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente............................................................................................................ 110 1.14 Fotomicrografias do tecido heptico (A, C e E) e esplnico (B, D e F) de camundongos Swiss machos tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (C e D) e SpHL-CDDP na dose de 35 mg/kg (E e F). Os animais foram sacrificados quatorze dias aps o tratamento............................................................................ 111 2.1 Esquema representativo do protocolo experimental para o estudo de atividade antitumoral...................................................................................................................................... 130 2.2 Efeito antitumoral (A) de CDDP livre na dose de 8 mg/kg (), SpHL-CDDP na dose de 16 mg/kg (), NSpHL-CDDP na dose de 16 mg/kg (g), SpHL () e NSpHL () administrados em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich. Em B, os valores foram calculados usando as equaes obtidas na anlise de regresso para os diferentes tratamentos..................................................................................................................................... 136 2.3 Fotomicrografias do tumor slido de Ehrlich representativas das diferentes variveis avaliadas no estudo histomorfomtrico: neoplasia (A), necrose (B) e inflamao (C)........... 139 2.4 Perfil de variao do peso corporal de camundongos Swiss acometidos pelo tumor slido de Ehrlich e submetidos a diferentes tratamentos. Os grficos A, B, C e D representam a variao de peso observada nos dias 7, 14, 19 e 23, respectivamente, aps o incio do tratamento.................................................................................................................... 141

32

LISTA DE TABELAS

1.1 DL50 e DMT estabelecidas aps administrao IP de CDDP livre ou SpHL-CDDP em camundongos Swiss..................................................................................................................... 74 1.2 Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao 1.3 Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao
tratamento por via IP com CDDP livre ou SpHL-CDDP.............................................................. 77 tratamento por via IP com CDDP livre ou SpHL-CDDP.............................................................. 78

1.4 Avaliao da alterao renal detectada no perodo inicial ps-tratamento por via IP

com CDDP livre ou SpHL-CDDP................................................................................................... 81

1.5 Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade heptica avaliados em

camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao tratamento por via IP com CDDP livre ou SpHL-CDDP....................................................................................................................... 82

1.6 DL50 e DMT estabelecidas aps tratamento IV com CDDP livre ou SpHL-CDDP em 1.7 Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas avaliados 1.8 Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas avaliados

camundongos Swiss..................................................................................................................... 95 quatorze dias aps o tratamento por via IV com CDDP ou SpHL-CDDP.................................. 97 quatorze dias aps o tratamento por via IV com CDDP ou SpHL-CDDP.................................. 98

1.9 Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade renal avaliados em camundongos

machos e fmeas quatorze dias aps a administrao por via IV de CDDP livre ou SpHLCDDP............................................................................................................................................... 101

1.10 Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade heptica avaliados em camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao tratamento por via IV com CDDP livre ou SpHL-CDDP...................................................................................................................... 105 2.1 Caractersticas fsico-qumicas de diferentes formulaes lipossomais......................... 134 2.2 Variveis Morfomtricas avaliadas no tumor slido de Ehrlich de camundongos Swiss fmeas submetidos a diferentes tratamentos................................................................. 138

33

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALT APN AST CDDP CHEMS Cis CLAE DL50 DMT DNA DOPC DOPE DSPE-MPEG2000 EDTA EMEA EPR FA FDA GGT GHS GLC4 GLC4/CDDP Gli Glu GOG ICH ICT IP IV

Alanina aminotransferase Diaminopeptidase Aspartato aminotransferase Cisplatina Hemisuccinato de colesterila Cistena Cromatografia lquida de alta eficincia Dose letal que induz a morte de 50% dos animais Dose mxima tolerada cido desoxirribonuclico Dioleoilfosfatidilcolina Dioleoilfosfatidiletanolamina Diestearoilfosfatidiletanolamina associada a metoxipolietilenoglicol 2000 cido etileno diamino tetractico European Medicines Agency Efeito de permeabilidade e reteno Fosfatase alcalina Food and Drug Administration -glutamiltransferase Glutationa Linhagem celular de carcinoma de pulmo sensvel cisplatina Linhagem celular de carcinoma de pulmo resistente cisplatina Glicina cido glutmico Grupo de Oncologia Ginecolgica International Conference on Harmonisation Inibio do crescimento do tumor Intraperitoneal Intravenosa

34

LUV MLV NSpHL NSpHL-CDDP PE PEG SC SFM SpHL SpHL-CDDP SPI-077 SUV TE TOC VRT

Lipossoma unilamelar grandev Lipossoma multilamelar Lipossomas no pH-sensveis de circulao prolongada sem CDDP Lipossomas no pH-sensveis de circulao prolongada contendo CDDP Fosfatidiletanolamina Polietilenoglicol Subcutnea Sistema fagocitrio mononuclear Lipossomas pH-sensveis de longa circulao sem CDDP Lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada contendo CDDP Lipossoma de circulao prolongada contendo cisplatina Lipossoma unilamelar pequeno Teor de encapsulao Transportadores orgnicos de ctions Volume relativo do tumor

35

SUMRIO

1 INTRODUO...................................................................................................... 21 2 REVISO DA LITERATURA................................................................................ 24 2.1 Viso Geral do Cncer..................................................................................... 25 2.2 Tratamento do Cncer..................................................................................... 27 2.3 Cisplatina.......................................................................................................... 28 2.4 Lipossomas...................................................................................................... 35 2.4.1 Lipossomas de Cisplatina............................................................................ 40 2.5 Estudos pr-clnicos........................................................................................ 45 2.5.1 Estudo de toxicidade.................................................................................... 46 2.5.2 Avaliao da atividade antitumoral............................................................. 52 3 OBJETIVOS......................................................................................................... 54 3.1 Objetivos Especficos...................................................................................... 55 CAPTULO 1 AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE LIPOSSOMAS pHSENSVEIS DE CIRCULAO PROLONGADA CONTENDO CISPLATINA........................................................................................................... 56 1 INTRODUO...................................................................................................... 57 2 MATERIAL E MTODOS..................................................................................... 59 2.1 Material............................................................................................................. 60 2.2 Preparao de SpHL-CDDP............................................................................ 60 2.3 Caracterizao qumica e fsico-qumica de SpHL-CDDP............................ 61 2.3.1 Determinao do dimetro e potencial zeta............................................... 61 2.3.2 Determinao do teor de CDDP encapsulada em SpHL-CDDP................ 62 2.3.3 Determinao da relao CDDP/fosfolpide............................................... 63 2.4 Experimentao in vivo................................................................................... 64 2.4.1 Animais.......................................................................................................... 64 2.4.2 Avaliao da Toxicidade Aguda.................................................................. 64 2.5 Anlise Estatstica........................................................................................... 66 3 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................... 68

36

PARTE 1 AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE SpHL-CDDP ADMINISTRADOS POR VIA INTRAPERITONEAL............................................... 68 3.1 Resultados........................................................................................................ 69 3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP........................................ 69 3.1.2 Avaliao do peso dos animais................................................................... 69 3.1.3 Mortalidade e Sinais Clnicos...................................................................... 72 3.1.4 Investigaes hematolgicas...................................................................... 74 3.1.5 Anlise Bioqumica....................................................................................... 79 3.1.6 Avaliao Histopatolgica........................................................................... 83 3.2 Discusso......................................................................................................... 86 PARTE 2 AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE SpHL-CDDP ADMINISTRADOS POR VIA INTRAVENOSA........................................................ 89 3.1 Resultados........................................................................................................ 90 3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP........................................ 90 3.1.2 Avaliao do peso dos animais................................................................... 90 3.1.3 Mortalidade e Sinais Clnicos...................................................................... 92 3.1.4 Investigaes hematolgicas...................................................................... 95 3.1.5 Anlise Bioqumica....................................................................................... 99 3.1.6 Avaliao Histopatolgica........................................................................... 106 3.2 Discusso......................................................................................................... 112 PARTE 3 ESTUDO COMPARATIVO DA TOXICIDADE AGUDA INDUZIDA PELA CDDP LIVRE E SpHL-CDDP CONSIDERANDO A VIA DE ADMINISTRAO UTILIZADA............................................................................. 116 CAPTULO 2 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE SpHL-CDDP EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE TUMOR SLIDO DE EHRLICH......... 123 1 INTRODUO...................................................................................................... 124 2 MATERIAL E MTODOS..................................................................................... 127 2.1 Material............................................................................................................. 128 2.2 Preparao e caracterizao dos lipossomas.............................................. 128 2.3 Preparo e inoculao das clulas tumorais.................................................. 129

37

2.4 Avaliao da atividade antitumoral................................................................ 129 2.5 Avaliao histomorfomtrica..........................................................................131 2.6 Anlise estatstica............................................................................................132 3 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................... 133 3.1 Resultados........................................................................................................134 3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos lipossomas......................................... 134 3.1.2 Atividade antitumoral................................................................................... 134 3.2 Discusso......................................................................................................... 142 CONCLUSES........................................................................................................145 PERSPECTIVAS..................................................................................................... 148 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................... 150 APNDICES............................................................................................................ 159 APNDICE A........................................................................................................... 160

21

INTRODUO

22

1 INTRODUO O cncer uma doena que apresenta elevada incidncia e alta taxa de mortalidade no mundo, sendo a segunda maior causa de morte no Brasil. Apesar dos inmeros avanos no conhecimento da biologia do cncer, os avanos teraputicos no seguiram a mesma dinmica (FERRARI, 2005). Uma das principais formas de interveno mdica no tratamento do cncer a quimioterapia, cuja tendncia atual a utilizao de frmacos cada vez mais seletivos e isentos ou com menor nmero de efeitos adversos. Compostos de platina so agentes antitumorais bem estabelecidos na prtica clnica, sendo a cisplatina (CDDP) o composto dessa classe mais amplamente utilizado no tratamento de vrios tipos de tumores malignos (HANIGAN; DEVARAJAN, 2003; ARMSTRONG et al., 2006). Seu uso clnico, entretanto, restrito em funo dos efeitos txicos induzidos pelo frmaco, os quais incluem principalmente nefrotoxicidade aguda e neurotoxicidade crnica (MATTHEOLABAKIS et al., 2009). Outras limitaes incluem a resistncia intrnseca ou adquirida em muitos tipos de tumores e a rpida inativao do frmaco, resultante de complexao com protenas plasmticas (MONTI et al., 2005). Para reduzir os efeitos txicos, contornar a resistncia e aumentar o ndice teraputico da CDDP, vrias formulaes nanoestruturadas tm sido desenvolvidas, incluindo formulaes lipossomais (BOULIKAS, 2004; CARVALHO-JNIOR, 2007a,b; NEWMAN et al., 1999). Melhorar a eficincia de liberao de compostos platinados, como a CDDP, pode contribuir para uma diminuio da toxicidade e ainda permitir que doses mais elevadas sejam administradas, promovendo um aumento da resposta farmacolgica da CDDP (BOULIKAS, 2007). Em trabalhos anteriores, uma formulao lipossomal denominada SpHL-CDDP foi desenvolvida por nosso grupo de pesquisa e avaliada quanto sua citotoxicidade, biodistribuio e eficcia antitumoral em modelo experimental de camundongos acometidos pelo tumor slido e asctico de Ehrlich (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a,b; CARVALHO-JNIOR, 2008; VIEIRA, 2003). SpHL-CDDP uma formulao contendo CDDP encapsulada em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada. Aps a administrao intravenosa (IV) e intraperitoneal (IP), SpHL-CDDP exibiu um tempo de circulao sangunea prolongado e alterou a

23

distribuio tecidual em relao CDDP livre. Uma reduo da reteno do frmaco no tecido renal e um aumento significativo da concentrao de CDDP na regio tumoral foram observados aps a administrao IV e IP de SpHL-CDDP em modelo experimental murino (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Contudo, o efeito farmacolgico da CDDP no foi alterado em virtude de sua encapsulao nas vesculas lipossomais, uma vez que o perfil de crescimento do tumor slido de Ehrlich, avaliado aps a administrao de SpHL-CDDP por via IV foi semelhante ao observado para o tratamento com CDDP livre (CARVALHO-JNIOR, 2008). Nesse contexto, aspirando possveis aplicaes clnicas de SpHL-CDDP, a proposta desta tese de doutorado foi explorar os aspectos pr-clnicos relacionados toxicidade aguda de SpHL-CDDP aps sua administrao por via IV e IP. Alm disso, avaliar o potencial de SpHL-CDDP em proporcionar uma melhor resposta teraputica em relao ao tratamento com CDDP livre, mediante o estudo da sua atividade antitumoral com o emprego de camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich utilizando doses maiores em relao s empregadas em estudos anteriores (CARVALHO-JNIOR, 2008).

24

REVISO DA LITERATURA

25

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Viso Geral do Cncer

O cncer objeto de estudo de vrios centros de pesquisa em todo o mundo, sendo o responsvel por aproximadamente 13% das mortes, cerca de sete milhes de pessoas a cada ano. Dados do Instituto Nacional do Cncer (INCA, 2009) apontam o cncer como a segunda maior causa de morte por doena no Brasil e, as estimativas para o ano de 2010, que so vlidas tambm para o ano de 2011, apontam a ocorrncia de 489.270 casos novos de cncer. Os tipos mais incidentes, exceo do cncer de pele do tipo no melanoma, so os cnceres de prstata e de pulmo no sexo masculino e os cnceres de mama e do colo do tero no sexo feminino.

A multiplicao e a diferenciao morfolgica e funcional so processos essenciais para os seres vivos. Esses dois processos recebem influncias de um grande nmero de agentes internos e externos s clulas, porm esto sob o controle de um sistema integrado e complexo que mantm a populao celular dentro de limites fisiolgicos. No surpresa que, com certa frequncia, surjam transtornos nos mecanismos que os controlam. Alteraes nesse sistema regulatrio resultam em distrbios do crescimento e da diferenciao ou distrbios de ambos ao mesmo tempo, e, uma das consequncias so as chamadas neoplasias (BRASILEIROFILHO et al., 2006). Portanto, segundo Brasileiro-Filho e colaboradores (2006) uma neoplasia pode ser entendida como uma leso constituda pela proliferao celular anormal, descontrolada e autnoma, na qual as clulas reduzem ou perdem a capacidade de se diferenciar, em consequncia de alteraes nos genes e protenas que regulam o crescimento e a diferenciao celulares.

Do ponto de vista clnico, evolutivo e comportamental, as neoplasias so divididas em duas categorias: benignas e malignas. As neoplasias benignas caracterizam-se pela presena de clulas bem diferenciadas, com atipias celulares e arquiteturais

26

discretas, baixo ndice mittico, crescimento lento e expansivo e, alm disso, o tumor bem delimitado e geralmente no recidivam aps cirurgia. Por outro lado, as neoplasias malignas, tambm denominadas cncer, apresentam alteraes na expresso gnica com tendncias sntese de isoformas das enzimas predominantes na fase embrionria, suas clulas captam aminocidos com maior velocidade do que as clulas normais, so mais resistentes a hipxia, mais indiferenciadas, tm menor adeso entre si, tem motilidade considervel e geralmente originam metstase (BRASILEIRO-FILHO et al., 2006).

Pode-se dizer que o cncer uma doena essencialmente gentica cujos processos de iniciao e progresso envolvem etapas nas quais o DNA acumula uma srie de mutaes decorrentes de alteraes de sequncia, perdas, ganhos e rearranjos cromossmicos. Essas alteraes, estruturais e/ou funcionais, levam ativao de proto-oncogenes, inativao de genes supressores de tumor, alm de comprometer tambm genes de reparo e genes de apoptose. Sabe-se que os fatores ambientais possuem um importante papel na etiologia do cncer e, dentre os principais fatores, destacam-se os carcingenos qumicos e fsicos, agentes infecciosos e o estilo de vida do indivduo. Alm disso, fatores endgenos relacionados com o sistema de reparo a danos do DNA e o sistema de detoxificao e eliminao de carcingeno tambm influenciam a carcinognese. Todos esses fatores atuam desencadeando alteraes no DNA da clula que culminam na transformao de uma clula normal em uma clula cancerosa (ALMEIDA et al., 2005).

Do ponto de vista fsico, os tumores malignos podem ser classificados como tumores slidos ou csticos. sabido que os tumores slidos apresentam caractersticas fisiopatolgicas peculiares tais como hipervascularizao, arquitetura vascular incompleta, secreo de fatores de permeabilidade vascular e ausncia de um sistema linftico efetivo. Alguns estudos demonstraram que essas caractersticas so a base do chamado efeito de permeabilidade e reteno aumentados (efeito EPR) (MAEDA et al., 2000). Os tumores slidos possuem capilares com permeabilidade aumentada, em relao aos vasos normais, como resultado do processo de angiognese. Esses capilares possuem poros de dimetro

27

que variam de 100 a 800 nm, permitindo a penetrao de macromolculas. Alm disso, os tecidos tumorais so caracterizados por alta presso intersticial, que pode retardar o extravasamento dessas macromolculas. A falta de um sistema linftico para drenagem resulta em acmulo dessas partculas no interior dos tecidos tumorais, ocasionando o efeito EPR. Outra caracterstica importante dos tecidos patolgicos (tumores, inflamaes e infeces) a presena de um pH extracelular menor que o pH dos tecidos normais. O pH intracelular de ambos os tecidos relativamente similar devido necessidade de manter um ambiente favorvel para as vrias atividades citoplasmticas. Segundo Stubbs e colaboradores (1999), a principal explicao para essa diferena de gradiente de pH entre tecidos normais e tumorais est relacionada com o clearance ineficiente dos metablitos cidos produzidos durante a gliclise aerbica intensa da clula cancerosa.

2.2 Tratamento do Cncer

O tratamento do cncer tem como principal objetivo a erradicao da doena. Entretanto, nas situaes onde a cura impossvel, o foco passa a ser a melhoria dos sintomas e a preservao da qualidade de vida associada a um aumento da sobrevida dos pacientes. Atualmente, as modalidades de tratamento do cncer incluem processos cirrgicos, terapia radioativa, quimioterapia e terapia biolgica (imunoterapia e terapia gnica). A aplicao isolada ou a associao de tais modalidades tem maximizado a chance de cura ou o controle da doena (ALMEIDA et al., 2005).

A cirurgia considerada a forma mais eficaz de tratamento, principalmente quando o tumor est em estgio inicial e no apresenta metstase. A terapia radioativa frequentemente combinada com a cirurgia com o objetivo de aumentar a eficincia do tratamento. Mesmo isoladamente, a radioterapia pode diminuir tumores grandes, diminuir a recorrncia e a chance de metstase, sendo uma metodologia antineoplsica muito utilizada. Entretanto, em aproximadamente dois teros dos pacientes, as neoplasias se caracterizam por micrometstases, o que torna

28

necessria uma terapia sistmica que pode ser efetuada com o tratamento quimioterpico (ALMEIDA et al., 2005).

Com relao quimioterapia, o foco principal dessa modalidade teraputica envolve a destruio das clulas neoplsicas. Entretanto, a maioria dos agentes quimioterpicos atua de forma no-especfica, lesando tanto clulas malignas quanto normais, particularmente as clulas de rpido crescimento, como as gastrintestinais, as capilares e as do sistema imunolgico. Esse fato explica a ocorrncia de uma srie de efeitos adversos altamente deletrios para o organismo em decorrncia da quimioterapia (ALMEIDA et al., 2005). Nesse contexto, um dos grandes desafios enfrentados na quimioterapia do cncer o desenvolvimento de agentes antineoplsicos que apresentem baixa toxicidade e elevada eficcia antitumoral. Atualmente, no existem frmacos que satisfaam estes critrios, e a utilizao clnica dos agentes antitumorais exige que os benefcios sejam confrontados com a toxicidade na busca de um ndice teraputico favorvel. Dentre os quimioterpicos mais utilizados destacam-se os derivados de platina, como a CDDP.

2.3 Cisplatina

O potencial da CDDP como agente antitumoral foi reconhecido a partir de uma observao feita por Barnett Rosenberg e colaboradores (1969), ao estudar os possveis efeitos de um campo eltrico sobre o crescimento de Eschericia coli. Eles observaram que as bactrias apresentavam um crescimento totalmente irregular e filamentoso e, de forma inesperada, paravam de se dividir. Esse fato foi atribudo no aos fenmenos eltricos, mas sim presena de um agente qumico, a CDDP. Estudos adicionais determinaram que o ismero cis-Pt(NH3)2Cl2 era o principal responsvel pela alterao no padro de crescimento das bactrias. Em seguida, demonstraram que esse mesmo ismero apresentou elevada atividade antitumoral em ratos implantados com clulas de sarcoma 180 e de leucemia 1210. Em 1978, a CDDP foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) para uso clnico.

29

Considerado um dos quimioterpicos mais efetivos e potentes na terapia antitumoral, a CDDP frequentemente utilizada em combinao com outros frmacos como tratamento de primeira escolha contra vrios tipos de tumores slidos, incluindo cncer testicular, carcinoma de ovrio, cncer de cabea e pescoo e cncer de pulmo (HANIGAN; DEVARAJAN, 2003; KONDAGUNTA et al., 2005; MUGGIA; FOJO, 2004). Atualmente, a CDDP vem sendo tambm utilizada no tratamento da carcinomatose peritoneal, uma doena comum em pacientes com cncer ginecolgico e do trato gastrintestinal (ARMSTRONG et al., 2006).

Quimicamente, a CDDP o cis-diaminodicloroplatina (II), um complexo inorgnico divalente de configurao planar formado por um tomo de platina ligado a dois tomos de cloro e dois grupos amnio na posio cis do plano horizontal (Figura 1).

Figura 1 - Frmula estrutural da cisplatina.

O mecanismo de ao da CDDP est relacionado com a inibio seletiva da sntese do DNA. O principal stio de ligao da CDDP com o DNA o N7 da guanina, embora tambm existam relatos de ligao com N3 da adenina. A CDDP desencadeia ligaes cruzadas intra e interfilamentos em particular com a guanina e adenina mudando a conformao do DNA e inibindo a sua sntese (Figura 2).

30

Ligao intrafilamentos 1,2-d(GG) 60-65%

Ligao intrafilamentos 1,2-d(GA) 20-25% Ligao interfilamentos (GG)

Ligao intrafilamentos 1,3-d(GXG)

Ligao Protena-DNA

Figura 2 - Formao dos aductos da CDDP. O tomo de platina se liga covalentemente

posio N7 da guanina e N3 da adenina, formando ligaes cruzadas 1,2 ou 1,3 intrafilamentos ou ligaes cruzadas interfilamentos. Pt (platina), G (guanina), A (adenina) (adaptado de BOULIKAS, 2007).

Aps penetrar na clula, os ons cloreto da molcula de CDDP so lentamente deslocados por molculas de gua formando complexos de platina carregados positivamente, a espcie ativa da CDDP, que interagem com stios nucleoflicos de DNA, RNA e protenas. Esse processo desencadeado devido baixa concentrao intracelular (~3-20 mM) de ons cloreto em relao concentrao extracelular (~100 mM). A hidrlise intracelular da CDDP leva formao de metabltios ativos, diaquo-diamino-platino e mono-cloro-mono-aquo-diaminoplatino, capazes de alquilar bases pricas e pirimdicas do DNA (Figura 3). Estudos prvios demonstraram que as alteraes conformacionais ocasionadas pela ligao da

31

CDDP ao DNA afetam os processos de replicao e transcrio, provocando tores da fita de DNA que dificultam a ao de enzimas de reparo e o remodelamento da cromatina e leva a clula cancerosa morte por apoptose (BOULIKAS; VOUGIOUKA, 2003).

H3N Pt H3N

Cl

- Cl , +H2O

H3N Pt H3N

OH2

- Cl , +H2O

H3N Pt H3N

OH2

+2

Cl

Cl

OH2
- H+

-H+

H3N Pt H3N

OH

H3N Pt

OH

Cl

H3N

OH2

- H+

H3N Pt H3N

OH

OH

Figura 3 - Reaes de hidrlise da CDDP.

A CDDP comumente administrada por via parenteral, principalmente por via IV e IP. Comercialmente, est disponvel como soluo injetvel na concentrao de 1 mg/mL. Os esquemas tpicos de administrao IV de CDDP, como agente nico a adultos ou crianas, so: 50-100 mg/m2 como infuso a cada 3 ou 4 semanas; ou infuso de 15-20 mg/m2 por dia durante 5 dias consecutivos, a ser repetido a cada 3 ou 4 semanas (MARTINDALE, 2005). Por via IP, os regimes teraputicos utilizam a CDDP tambm nas doses de 50-100 mg/m2, normalmente em associao com

32

outros quimioterpicos (ARMSTRONG et al., 2006, MARKMAN et al., 2006). Entretanto, a administrao continuada deste quimioterpico bastante limitada em funo de reaes adversas graves, incluindo efeitos agudos como nusea e vmitos alm de efeitos adversos crnicos, como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, neurotoxicidade, mielotoxicidade e ototoxicidade. A disfuno renal manifesta-se como o efeito adverso mais problemtico, dificultando o tratamento quimioterpico. sabido que os efeitos teraputicos da CDDP so significativamente melhorados com o aumento da dose administrada, no entanto, doses mais altas implicam em maior vulnerabilidade dos rins aos efeitos deletrios, os quais se manifestam, principalmente, por comprometimento dos tbulos renais e reduo da taxa de filtrao glomerular (HANIGAN; DEVARAJAN, 2003).

Segundo reviso feita por Yao e colaboradores (2007), o mecanismo de nefrotoxicidade da CDDP envolve sua converso a molculas potencialmente nefrotxicas nas clulas dos tbulos proximais. Concentraes elevadas de CDDP so encontradas no citosol, mitocndria, ncleo e microssomas. Sabe-se que a captao de CDDP ocorre principalmente atravs de transportadores orgnicos de ction (TOC) e, os rins acumulam CDDP em maior grau que os outros rgos sendo a sua principal fonte de excreo. Existem basicamente trs isoformas de TOC conhecidas como TOC 1, TOC 2 e TOC 3, as quais so expressas no fgado, rim e placenta, respectivamente. Em humanos, a CDDP no transportada por TOC 1, mas por TOC 2, o que explica parcialmente a maior toxicidade renal induzida pela CDDP (YAO et al., 2007). A CDDP conjugada glutationa (GSH) e metabolizada, via -glutamiltransferase (GGT), a um composto tiol reativo, uma potente nefrotoxina (Figura 4). A GGT uma enzima localizada na superfcie da membrana celular e responsvel pela clivagem de GSH extracelular em cido glutmico e cisteinilglicina. A cisteinil-glicina por sua vez clivada a cistena e glicina por uma diaminopeptidase. Dessa forma, GGT proporciona uma elevao nos nveis de cistena intracelular, a qual pode tornar-se limitante para o crescimento celular e para a sntese de GSH intracelular. Vrios estudos tm demonstrado que nveis elevados de GGT nas clulas dos tbulos renais aumentam a sensibilidade dessas clulas toxicidade pela CDDP. Por outro lado, a expresso aumentada nas clulas cancerosas torna-as mais resistentes CDDP (HANIGAN; DEVARAJAN, 2003).

33

Essa diferena do papel de GGT na atividade antitumoral e na nefrotoxicidade sugere que o mecanismo pelo qual a CDDP destri as clulas cancerosas distinto do mecanismo que induz a morte celular das clulas do tecido renal.

GSH GGT
CDDP

is-Gli Glu + C APN

Pt-GSH GGT

Pt-Cis-Gli
APN

Pt-Cis

TOC 2
CDDP

Cis Glu GSH

CDDP

Gli Pt-Cis
S ciste cistena liase

GSH transferase

Pt-GSH

Composto tiol reativo

Morte Celular

Figura 4 - Representao esquemtica do mecanismo de toxicidade da CDDP via

-glutamiltransferase (GGT). Glutationa (GSH), cido glutmico (Glu), cistena (Cis), glicina (Gli), diaminopeptidase (APN), transportadores orgnicos de ctions (TOC).

Embora, os mecanismos in vivo de nefrotoxicidade no estejam bem elucidados, alguns estudos sugerem uma correlao com os mecanismos de apoptose, inflamao, fibrognese e estresse oxidativo. Dependendo do tempo de exposio e da dose administrada, a CDDP pode ainda induzir morte das clulas tubulares por necrose ou por apoptose. Estudos tm demonstrado que em altas concentraes, a CDDP induz morte celular por necrose enquanto em baixas concentraes o frmaco induz morte celular por apoptose por uma via dependente de caspase 3. Alm disso, as alteraes mais comuns nos estudos histopatolgicos do tecido renal incluem necrose tubular, degenerao e edema intersticial (UEHARA et al., 2005).

34

Alm dos efeitos adversos graves, a CDDP apresenta outros inconvenientes como a capacidade de interagir com outros frmacos administrados concomitantemente na terapia antineoplsica e o desenvolvimento de resistncia clnica. Como exemplo de incompatibilidades da CDDP com outros frmacos ou constituintes da formulao pode-se citar: (i) sua precipitao em presena de etoposdeo dissolvido em soluo de cloreto de sdio 0,9 % (p/v); (ii) precipitao em presena de tiotepa dissolvida em soluo de glicose a 5 % (p/v); (iii) degradao da CDDP decorrente de sua interao com trometamol, um excipiente utilizado na formulao de 5-fluouracila (FOURNIER et al., 1992; TRISSEL et al., 1996). Com relao resistncia adquirida, quatro alteraes bioqumicas parecem estar envolvidas: (i) aumento dos nveis de GSH; (ii) aumento dos nveis de metalotionena; (iii) aumento na capacidade de reparo celular; (iv) alteraes no influxo e efluxo da CDDP nas clulas (MONTI et al., 2005). A GSH um nuclefilo potente que reage com a CDDP antes que essa se ligue ao DNA, formando um complexo que eliminado da clula. A metalotionena uma protena de 61-62 aminocidos que se liga CDDP produzindo um composto com 10 tomos de platina por molcula. Alguns estudos demonstraram um aumento significativo dos nveis de GSH e/ou metalotionena em linhagens de clulas resistentes CDDP (RABIK; DOLAN, 2007). Outro fator responsvel pela reduo da citotoxicidade o aumento na capacidade de reparo, o qual pode ser determinado por uma competio entre as protenas responsveis pelo reparo do DNA e o sinal de apoptose (CHU, 1994). Alm disso, estudos tm demonstrado que as linhagens tumorais resistentes acumulam menos CDDP que as linhagens sensveis (JAIN et al., 1996) Na tentativa de contornar esses inconvenientes e melhorar o ndice teraputico da CDDP, tem sido proposto o desenvolvimento de anlogos menos txicos que a CDDP, como por exemplo, carboplatina e oxaliplatina. Porm, nenhum deles apresenta um amplo espectro de ao como a CDDP (BOULIKAS, 2007). Outra estratgia adotada refere-se a modificaes farmacotcnicas como a encapsulao da CDDP em sistemas de liberao de frmacos, tais como microesferas (KUMAGAI et al., 1996; TAMURA et al., 2002a), nanocpsulas (BURGER et al., 2002; VELINOVA et al., 2004), micelas (MIZUMURA et al., 2001; NISHIYAMA et al., 2003) e lipossomas (BOULIKAS, 2004; HARRINGTON et al., 2001; CARVALHOJUNIOR et al., 2007a).

35

2.4 Lipossomas

Esses sistemas foram descritos pela primeira vez por Bangham e colaboradores (1965) como modelo de membrana biolgica. Durante estudos para avaliar a difuso de ons atravs de membranas lipdicas artificiais, Bangham observou que alguns lpides, em meio aquoso, se organizavam espontaneamente em bicamadas formando vesculas esfricas, os lipossomas. Essas bicamadas circundam uma cavidade aquosa interna e se encontram suspensas coloidalmente em um meio aquoso externo (Figura 5). Em 1971, Gregoriadis e colaboradores propuseram a utilizao dos lipossomas como sistemas transportadores de frmacos. O grande potencial teraputico dos lipossomas deve-se a sua versatilidade estrutural em termos de tamanho, composio lipdica, carga superficial, fluidez da membrana e sua capacidade de incorporar frmacos lipoflicos, hidroflicos e anfiflicos.

Bicamada lipdica Regio Hidroflica

Frmaco hidroflico Cavidade aquosa

Regio hidrofbica

Figura 5 - Representao esquemtica do lipossoma demonstrando uma cavidade aquosa, com material hidroflico em seu interior, envolvida por uma bicamada lipdica (A). Bicamada lipdica, visualizada em maior aumento, mostrando a cabea polar (regio hidroflica) e a cauda apolar (regio hidrofbica) dos lpides (B).

36

Os lipossomas podem ser classificados com relao ao tamanho, nmero de bicamadas, composio e mecanismo de liberao intracelular. Lipossomas que apresentam apenas um compartimento aquoso circundado por uma bicamada lipdica so denominados unilamelares de pequeno tamanho (SUV, Small Unilamellar Vesicles) com dimetro mdio de 25 a 100 nm ou unilamelares de grande tamanho (LUV, Large Unilamellar Vesicles) com dimetro mdio superior a 100 nm. Aqueles que apresentam vrios compartimentos aquosos circundados por vrias bicamadas lipdicas so denominados lipossomas multilamelares (MLV, Multilamellar Vesicles) e possuem dimetro mdio superior a 1000 nm (LASIC, 1998). Com relao composio e ao mecanismo de liberao intracelular, as vesculas podem ser classificadas como convencionais, de circulao prolongada e polimrficas, incluindo nessa ltima classe, os lipossomas pH-sensveis, termosensves e catinicos (BATISTA et al., 2007). Inicialmente, o desenvolvimento de sistemas vesiculares encontrou alguns obstculos no mbito farmacutico e farmacolgico. Sob o aspecto farmacutico, os lipossomas apresentavam uma instabilidade fsico-qumica e biolgica e baixa eficincia de encapsulao dos frmacos. Em relao ao aspecto farmacolgico, os lipossomas eram rapidamente capturados pelas clulas do sistema fagocitrio mononuclear (SFM) aps administrao sistmica. Estudos sobre o comportamento in vivo da primeira gerao de lipossomas, denominados convencionais, demonstraram que os mesmos se acumulavam rapidamente em tecidos ricos em macrfagos tais como fgado, bao e medula ssea e, eram rapidamente eliminados da circulao sangunea, limitando sua ao em outros tecidos (ALLEN; HANSEN, 1991). A partir disso, foram propostas a incorporao de glicolpides na membrana lipdica bem como modificaes qumicas na superfcie dos lipossomas com o objetivo de torn-los capazes de escapar do SFM e permanecerem um tempo maior na circulao sangunea (revisado por GABIZON; PAPAHADJOPOULOS, 1992). Esses lipossomas modificados, conhecidos como lipossomas de circulao prolongada, representaram um grande passo para a sua aplicao in vivo. Allen e Chonn (1987) desenvolveram os primeiros lipossomas de circulao prolongada contendo monosialogangliosdeos e observaram uma reduo significativa na captao pelos macrfagos do SFM. Entretanto, os monosialogangliosdeos apresentam alguns inconvenientes como a fonte de extrao (crebro de gado), que

37

considerada inadequada para uso farmacutico e o custo elevado do processo extrativo. Em 1990, Klibanov e colaboradores mostraram que a incorporao de um polmero hidroflico, o polietilenoglicol (PEG), na bicamada lipdica aumentou significativamente o tempo de circulao sangunea dos lipossomas. Segundo esses autores, a presena de grupos volumosos hidroflicos na superfcie dos lipossomas constitui um impedimento estrico ligao de protenas plasmticas, opsoninas, impedindo o reconhecimento e a destruio pelas clulas do SFM. Alguns estudos tm mostrado que, independente da composio lipdica e da carga superficial, a capacidade de evaso do SFM assim como as propriedades de circulao prolongada das vesculas so decorrentes da presena de grupos hidroflicos como o PEG. De modo geral, concentraes de 5-10 % de PEG com massa molecular variando de 1000-2000 Da so suficientes para reduzir a opsonizao e conferir maior estabilidade s formulaes (ULRICH, 2002). Na tentativa de aumentar a especificidade de interao dos lipossomas com as clulas-alvo e a quantidade do frmaco liberado nestas clulas, o desenvolvimento de lipossomas polimrficos, entre eles lipossomas pH-sensveis, tambm tm sido proposto. O uso de lipossomas pH-sensveis como sistemas de liberao de frmacos foi sugerido a partir da observao de que tecidos patolgicos como tumores, tecidos inflamados e infecciosos apresentam um pH extracelular menor do que os tecidos normais (GULINO et al., 1967). Os lipossomas pH-sensveis consistem na combinao de lpides insaturados, como a fosfatidiletanolamina (PE) e seus derivados, entre eles a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), com compostos carboxilados como o hemisuccinato de colesterila (CHEMS) (Figura 6) (SIMES et al., 2004).

38

A
CH3 O HO O O

H3C CH3

CH3 CH3

O O O O H O

O P O NH3+

-O

Figura 6 Estruturas qumicas do hemisuccinato de colesterila (A) e

dioleoilfosfatidiletanolamina (B).

Ao contrrio da maioria dos fosfolpides, a PE apresenta uma cabea polar pequena e pouco hidratada, a qual ocupa um volume menor quando comparado com sua respectiva cadeia de hidrocarboneto, exibindo, portanto, uma organizao supramolecular do tipo cnica. Essa organizao favorece a formao de interaes intermoleculares entre grupos amina e fosfato da cabea polar, o que explica a tendncia dessas molculas em adquirir a fase hexagonal invertida (HII) no sendo capazes de formar vesculas. A obteno de lipossomas com estes fosfolpides requer a adio de agentes estabilizantes, como o CHEMS, os quais encontram-se sob a forma ionizada em pH fisiolgico. O CHEMS se distribui homogeneamente entre as molculas de PE e o aparecimento de repulses eletrostticas entre os grupos carboxlicos presentes no CHEMS e os grupos fosfatos presentes nos fosfolpides favorece a organizao lamelar e a formao dos lipossomas (Figura 7). Enquanto em pH fisiolgico esses lipossomas so estveis, sua exposio a um meio cido, como o caso dos tecidos tumorais, resulta na protonao dos agentes estabilizantes, com consequente desestabilizao das vesculas e a liberao do material encapsulado (DE OLIVEIRA et al., 1998; SIMES et al., 2004). Alm disso, deve-se enfatizar que ao considerar a

39

administrao IV, para alcanar as clulas alvo, como por exemplo, as clulas cancerosas, os lipossomas precisam exibir tempo de circulao prolongado. Estudos tm mostrado que a incluso de fosfolpides acoplado ao PEG aumenta a estabilidade in vivo e proporciona maior tempo de circulao sangunea sem alterar suas propriedades de pH-sensibilidade at atingir o rgo ou tecido alvo (SIMES et al., 2004).

Diante disso, o emprego de lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada como carreadores de agentes antineoplsicos, especificamente da CDDP, pode ser uma alternativa potencial para a reduo de sua toxicidade e para o aumento de sua eficcia antitumoral, conduzindo a uma liberao preferencial na regio tumoral devido ao ambiente de menor pH em relao s regies normais.

Fase Hexagonal - HII

Derivados da PE

CHEMS

Fase Lamelar

Figura 7 Representao esquemtica da organizao estrutural de derivados da PE

na ausncia e na presena de CHEMS.

40

2.4.1 Lipossomas de Cisplatina

Vrios estudos tm demonstrado que os lipossomas podem modificar a distribuio tecidual do frmaco encapsulado, sendo esse comportamento dependente das caractersticas fsico-qumicas das vesculas e no do contedo encapsulado (FERRARI, 2005; HARRINGTON et al., 2000). Como mencionado anteriormente, a CDDP livre administrada por via IV e IP. Portanto, os estudos pr-clnicos bem como estudos clnicos, utilizando diferentes formulaes lipossomais contendo CDDP, tambm tm focado a utilizao de ambas as vias de administrao.

2.4.1.1 Administrao intravenosa

A utilizao de sistemas nanoestruturados como carreadores de CDDP tm mostrado modificaes importantes no perfil toxicolgico e na atividade antitumoral desse antineoplsico, aps administrao por via IV. Lipossomas convencionais contendo CDDP constitudos de fosfatidilcolina, fosfatidilserina e colesterol foram avaliados em ratos portadores de imunocitoma IgM. Os resultados mostraram menor incidncia e severidade de leses renais aps a administrao das formulaes lipossomais em comparao com a CDDP livre. Por outro lado, a atividade antitumoral da CDDP lipossomal foi similar quando comparada com a CDDP livre (STEERENBERG et al., 1988 apud HARRINGTON et al., 2000). Newman e colaboradores (1999) verificaram aumento da concentrao da CDDP na regio tumoral, melhora da eficcia teraputica e reduo da toxicidade em camundongos acometidos com carcinoma de clon e pulmo aps a administrao de CDDP encapsulada em lipossomas de circulao prolongada. Essa formulao, conhecida como SPI-077, constituda por fosfatidilcolina hidrogenada de soja, colesterol e diestearoilfosfatidiletanolamina associada a metoxipolietilenoglicol 2000 (DSPE-MPEG2000), razo molar 51:44:5, respectivamente. Os resultados

41

demonstraram que o nvel de platina nos rins foi significativamente menor (cerca de quatro vezes) em animais tratados com a formulao lipossomal comparado queles tratados com a mesma dose de CDDP livre. Alm disso, quando os camundongos receberam uma dose de 100 mg/kg de CDDP lipossomal nenhuma morte foi observada, ao passo que a dose letal (DL50) para a CDDP livre foi 12 mg/kg. Com relao aos estudos pr-clnicos de eficcia antitumoral realizado em camundongos portadores de tumor de clon (C26) ou pulmo, Newman e colaboradores (1999) mostraram que SPI-077 exibiu atividade superior CDDP livre. Entretanto, os estudos clnicos de fase I e II em pacientes portadores de carcinoma escamoso de cabea e de pescoo avanado demonstraram ineficcia dessa formulao, sendo esse fato atribudo baixa biodisponibilidade e a lenta cintica de liberao da CDDP a partir dos lipossomas (HARRINGTON et al., 2001). Estudos pr-clnicos de outra formulao lipossomal, denominada Lipoplatin, constituda por dipalmitoilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, colesterol e DSPEMPEG2000 mostraram menor nefrotoxicidade aps o tratamento com essa formulao em relao ao tratamento com a CCDP livre em camundongos e ratos (BOULIKAS, 2004; DEVARAJAN et al., 2004). Os resultados desse estudo demonstraram que os animais tratados com CDDP livre desenvolveram insuficincia renal com clara evidncia de danos tubular enquanto aqueles tratados com a mesma dose de Lipoplatin no apresentaram injria renal (DEVARAJAN et al., 2004). Outro estudo realizado em ces permitiu definir que o Lipoplatin pode ser seguramente administrado na dose de 150 mg/m2 sem a necessidade de protocolos de hidratao, enquanto a dose mxima tolerada estabelecida aps o tratamento com CDDP livre foi 70 mg/m2. Stathopoulos e colaboradores (2005) conduziram um estudo clnico de fase I, administrando essa mesma formulao lipossomal contendo CDDP por infuso IV, em vinte e sete pacientes com tumores malignos avanados pr-tratados (19 com carcinoma pancretico, 6 com carcinoma de clulas renais, 1 com cncer gstrico e 1 com carcinoma escamoso de cabea e de pescoo). Nesse estudo, os pacientes receberam doses de Lipoplatin variando de 25 a 125 mg/m2. Toxicidade hematolgica e do trato gastrintestinal foram observadas apenas nos pacientes tratados com Lipoplatin na dose de 125 mg/m2. Entretanto, no foi observado o aparecimento de nefrotoxicidade em nenhum dos pacientes.

42

Carvalho-Jnior e colaboradores (2007a) avaliaram a biodistribuio da CDDP livre e dos lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada contendo CDDP, administrados por via IV, em camundongos portadores de tumor slido de Ehrlich. Esses lipossomas constitudos de DOPE, CHEMS e DSPE-MPEG2000 apresentaram uma razo molar igual a 5,7:3,8:0,5, respectivamente e uma concentrao lipdica total igual a 40 mM. Os resultados demonstraram uma quantidade de CDDP na regio tumoral duas vezes maior aps a administrao de SpHL-CDDP em relao CDDP livre. Alm disso, a reteno de CDDP no tecido renal e o coeficiente de partio tecido-sangue foi maior aps a administrao IV de CDDP livre em comparao com a administrao de SpHL-CDDP. Esses resultados mostraram que a administrao de SpHL-CDDP contribuiu para uma menor passagem de CDDP para o tecido renal, o que pode consequentemente reduzir a toxicidade neste rgo. Carvalho-Jnior e colaboradores (2007b) demonstraram ainda que os SpHL-CDDP apresentaram uma maior atividade citotxica sobre linhagem celular A549 (clulas cancerosas de pulmo humano) do que a CDDP livre. Por outro lado, SpHL-CDDP exibiu a mesma eficincia antitumoral em clulas sensveis (GLC4) e em clulas resistentes CDDP (GLC4/CDDP), sugerindo que esta formulao lipossomal de CDDP pode burlar os mecanismos de resistncia oferecidos pelas clulas penetrao do frmaco. Alm disso, a atividade antitumoral de SpHL-CDDP e CDDP livre administrados na dose de 8 mg/kg, semanalmente por trs ciclos, foi avaliada em modelo animal experimental portador de tumor slido de Ehrlich e os resultados demonstraram efeitos similares em ambas as formulaes (CARVALHOJNIOR, 2008).

2.4.1.2 Administrao intraperitoneal

Apesar do grande progresso na quimioterapia sistmica, a maioria dos pacientes em tratamento oncolgico ainda morre em funo dessa doena. Atualmente, vrios estudos tm demonstrado vantagens da terapia IP em relao terapia sistmica, tornando-a potencialmente benfica em situaes nas quais a doena permanece em grande parte limitada cavidade peritoneal e desenvolve um quadro de

43

carcinomatose peritoneal. A carcinomatose peritoneal uma forma frequente de metstase em pacientes com cncer gstrico, duodenal, pancretico e, principalmente, em mulheres com carcinoma ovariano. Esse tumor caracterizado por mltiplos depsitos metastticos variando de pequenos ndulos a grandes massas tumorais que frequentemente invadem rgos subjacentes e, normalmente, so acompanhadas de ascite (CHAUFFERT et al., 2003). Diante disso, foi introduzida na terapia a administrao IP de quimioterpicos para o tratamento da carcinomatose peritoneal com o objetivo de aumentar os nveis do frmaco na regio tumoral, reduzindo os efeitos colaterais sistmicos. Armstrong e colaboradores (2006) descreveram um passo notvel no tratamento de cncer ovariano avanado usando a quimioterapia IP. A carcinomatose proveniente do carcinoma ovariano apresenta uma condio de tratamento extremamente complicada, e a maioria das pacientes apresenta recidiva e morte. Nessas situaes, elevar simplesmente as doses do quimioterpico administrado por via IV parece no ser satisfatrio. No entanto, um estudo no qual foi realizada a administrao loco-regional de CDDP na cavidade abdominal levou a reduo de 25% de mortalidade em comparao com o grupo cuja administrao foi realizada por via IV. Segundo reviso feita por Alberts e colaboradores (2006), trs grandes estudos clnicos de fase III, conduzidos pelo Grupo de Oncologia Ginecolgica (GOG 104, GOG 114 e GOG 172) investigaram a hiptese de que a administrao IP de CDDP quando comparada administrao IV prolongaria a sobrevida de mulheres com cncer ovariano em estgio avanado. Os resultados do primeiro estudo, GOG 104, mostraram um aumento de oito meses na durao da sobrevida e 24% de reduo da mortalidade no grupo tratado com o regime IP. Alm disso, foi observado menor pico de concentrao plasmtica da CDDP, aps administrao IP, o que explicaria a menor incidncia de toxicidade em relao quelas tratadas com CDDP por via IV. Os dados do estudo GOG 114 demonstraram uma sobrevida mdia de 63 meses para as pacientes submetidas ao tratamento IP com CDDP enquanto que para aquelas que receberam o tratamento IV a sobrevida foi de 52 meses. Esse foi o primeiro estudo que apresentou uma sobrevida superior a cinco anos aps administrao IP de CDDP. O estudo mais recente, GOG 172, demonstrou uma

44

sobrevida mdia similar ao estudo GOG 114 (66 e 50 meses para as pacientes tratadas com CDDP por via IP e IV, respectivamente). Porm, um nmero menor de pacientes submetidas ao tratamento por via IP em relao via IV completou todos os ciclos de tratamento (42 e 83%, respectivamente) devido aos efeitos txicos da quimioterapia, complicaes relacionadas com o implante do cateter, recusa do paciente e aparecimento de infeco no advinda do implante do cateter. Embora existam evidncias de efeitos superiores da CDDP administrada por via IP em relao via IV aps cirurgia citoredutora, o problema de sua toxicidade ainda permanece e parece ser um grande obstculo para implementao efetiva da via IP (ARMSTRONG et al., 2006; GORE et al., 2006). Alm disso, a administrao IP da CDDP limitada a pacientes que aps cirurgia citoredutora apresentam ndulos residuais com dimetro inferior a 0,5 cm (CHAUFFERT et al., 2003). Porm, a penetrao de CDDP nas doses usuais no suficiente para destruir as clulas tumorais localizadas no centro de grandes tumores. Para penetrar em um tumor profundamente, o frmaco deve estar em contato com o mesmo por um perodo de tempo prolongado ou em uma concentrao consideravelmente mais alta. Entretanto, como a CDDP um composto hidrossolvel de baixa massa molar (300 Da), ela absorvida rapidamente atravs dos capilares e atinge a circulao sangunea, o que resulta em altas concentraes plasmticas do frmaco e, consequentemente, nos efeitos adversos graves mencionados anteriormente. Estudos recentes tm utilizado substncias vasoconstritoras, como a epinefrina, com o objetivo de reduzir a passagem do frmaco da cavidade peritoneal para a corrente sangunea, favorecendo consequentemente, sua difuso nos ndulos tumorais (FAVOULET et al., 2001; CHAUFFERT et al., 2003). Outra estratgia a ser adotada visando manter o agente antineoplsico por um maior perodo de tempo na cavidade IP o emprego de sistemas controladores da liberao, os lipossomas. Como as partculas corpusculares so absorvidas lentamente pelo sistema linftico, no so capazes de atravessar diretamente para a circulao sangunea mediante a passagem pela membrana peritoneal, ficando retidas na cavidade peritoneal. Portanto, o uso dos lipossomas contendo agentes

45

antitumorais no tratamento da carcinomatose peritoneal poderia ter uma aplicao potencial (KUMAGAI et al., 1996). Boulikas (2004) demonstrou a reduo de toxicidade aps tratamento IP com lipossomas de CDDP, Lipoplatin, utilizando como modelo experimental ratos Wistar. Os resultados demonstraram valores normais para os parmetros indicativos de toxicidades renal, heptica e medular no grupo de animais tratados com uma dose nica (30 mg/kg) da formulao lipossomal em comparao com animais no tratados. No entanto, neutropenia grave foi observada no grupo de animais tratados com trs doses repetidas de Lipoplatin (30 mg/kg), administradas semanalmente, embora no tenha sido observada nefrotoxicidade mesmo aps administrao repetida. A reduo dos efeitos txicos observada aps administrao dos lipossomas de CDDP em comparao CDDP livre foi atribuda alterao do perfil de biodistribuio da CDDP encapsulada em lipossomas. Arajo e colaboradores (2008) avaliaram a biodistribuio de CDDP livre e de SpHL-CDDP, administrados por via IP, em camundongos portadores de tumor asctico de Ehrlich. Os resultados demonstraram uma quantidade de CDDP na regio tumoral aproximadamente trs vezes maior aps a administrao de SpHLCDDP em relao CDDP livre. Alm disso, a reteno de CDDP no tecido renal foi menor aps a administrao de SpHL-CDDP livre em comparao com a administrao de CDDP livre, o que pode consequentemente contribuir para a reduo da toxicidade neste rgo.

2.5 Estudos pr-clnicos

Os estudos pr-clnicos so essenciais para dar embasamento administrao de novos medicamentos em seres humanos. Esses estudos devem checar os parmetros de segurana e eficcia atravs da avaliao da toxicidade e da atividade in vitro e in vivo, fornecendo informaes sobre a farmacodinmica, farmacocintica e a toxicologia de frmacos em desenvolvimento. Informaes de segurana e eficcia obtidas nessa fase so fundamentais para estimar uma dose

46

inicial a ser administrada em seres humanos e identificar parmetros a serem monitorados para detectar possveis efeitos adversos (MEYER; SVENDSEN, 2003). Portanto, vale ressaltar que um grande nmero de entidades qumicas no chega aos estudos clnicos devido a riscos inaceitveis detectados nos estudos prclnicos. Baseado nas orientaes da European Medicines Agency (EMEA) e International Conference on Harmonisation (ICH) para registro de medicamentos, os principais objetivos da avaliao pr-clnica de medicamentos antineoplsicos so: estabelecer a dose mxima tolerada (DMT) e identificar sinais de toxicidade em rgos alvos relacionados exposio do frmaco e a ciclos de tratamento para assegurar o aumento de doses nos estudos clnicos de fase I e a durao da terapia (EMEA, 1998; ICH, 2008).

2.5.1 Estudo de toxicidade

Com relao avaliao pr-clnica de segurana, estudos de toxicidade em dose nica (toxicidade aguda), toxicidade aps a administrao de doses repetidas, toxicidade reprodutiva, genotoxicidade, tolerncia local, carcinogenicidade alm de avaliao da segurana farmacolgica e farmacocintica/toxicocintica devero ser realizados. De modo geral, os estudos de segurana so conduzidos em duas espcies, sendo uma roedora e outra no-roedora, visando obter uma melhor base para a extrapolao dos dados de toxicidade para humanos. A escolha de um modelo experimental adequado requer informaes prvias das semelhanas e diferenas entre o perfil farmacocintico no animal e no homem. Alm disso, devese considerar a facilidade da reproduo ou aquisio da espcie, o tempo de crescimento/desenvolvimento e a facilidade de manuseio em condies experimentais. De acordo com essas informaes, ratos e ces tem sido comumente utilizados em investigaes de segurana (WHO, 2004). Com base nas diferentes regulamentaes preconizadas por diversos rgos internacionais para estudo de toxicidade aguda (EMEA, 1998; FDA, 1996; ICH,

47

2008), tais investigaes devem ser conduzidas em animais saudveis, de origem conhecida, com peso e idade adequados. Especificamente, com base nas regulamentaes do EMEA (1998) e do ICH (2008) para o estudo de toxicidade aguda de agentes antineoplsicos, esse deve ser realizado em uma espcie roedora e, em casos onde essa espcie no apresenta boa correlao com a toxicidade humana, como por exemplo, para os antifolatos ou novos agentes sob investigao que apresentem um novo mecanismo de ao, os estudos devem tambm ser conduzidos em uma espcie no-roedora. Os guias preconizam ainda que o perodo de acompanhamento dos animais seja de no mnimo quatorze dias ps-tratamento e que, em todos os grupos experimentais sejam avaliados os sinais clnicos, o peso corporal e a patologia clnica (hematolgica e qumica clnica) e ainda, que todos os animais sejam necropsiados. Como mencionado anteriormente, o uso da CDDP na prtica clnica limitado em funo de seus efeitos adversos como nefrotoxicidade, neurotoxicidade, ototoxicidade, mielotoxicidade e distrbios gastrintestinais. Alm disso, h relatos de que a administrao de altas doses de CDDP induz hepatotoxicidade (PRATIBHA et al., 2006). Neste contexto, a avaliao da bioqumica clnica de uma nova formulao contendo CDDP deve inicialmente focar, dentre outros, os parmetros que avaliem a funo renal e a funo heptica.

2.5.1.2 Funo renal

Os rins so rgos dinmicos que representam o maior sistema de controle da homeostase corporal. Apresentam como principal funo a formao da urina por meio da ultrafiltrao nos glomrulos, da reabsoro tubular seletiva de gua e solutos e da secreo tubular seletiva de solutos. Alm disso, atuam na produo de hormnios tais como eritropoietina (estimula a produo de eritrcitos) e renina (mantm as concentraes de sdio e, consequentemente, a presso arterial) e na metabolizao de vitamina D (GUYTON; HALL, 1998). Embora constituam menos de 1% da massa corporal, os rins recebem cerca de 20 a 25% do fluxo sanguneo cardaco e, consequentemente, todo frmaco ou substncia qumica que atinja a

48

circulao sistmica atingir os rins em quantidades elevadas. Portanto, os rins so considerados alvos frequentes de toxicidade de muitos xenobiticos (DEKANT; VAMVAKAS, 1996). Vrios fatores esto envolvidos na maior susceptibilidade dos rins aos efeitos txicos dos frmacos, entretanto, o alto fluxo sanguneo e a concentrao de alguns frmacos pelo mecanismo de reabsoro tubular so os mais importantes. Alm disso, a biotransformao dos frmacos, em especial da CDDP, em metablitos reativos potencialmente txicos um fator importante no desenvolvimento de nefrotoxicidade. Nos tbulos proximais so encontrados altos nveis de enzimas responsveis pelo processo de metabolizao (como a enzima citocromo P450), tornando-os particularmente susceptveis aos danos qumicos. Como os metablitos so geralmente instveis, tendem a interagir com as macromolculas presentes nos stios onde foram gerados, induzindo assim aos efeitos txicos. Alm disso, altas concentraes de GSH so tambm encontradas nos rins o que demonstra o seu importante papel nos mecanismos de detoxificao (HANIGAN; DEVARAJAN, 2003). Como o rim o rgo alvo de toxicidade da CDDP, alteraes significativas nas funes normais so comumente observadas aps o tratamento com esse antineoplsico, estabelecendo com frequncia um quadro de insuficincia renal aguda. Uma reduo de 20 a 40% na taxa de filtrao glomerular, assim como aumento nos nveis sricos de uria e creatinina, so alteraes frequentes observadas aps o tratamento com CDDP (DEKANT; VAMVAKAS, 1996). A maioria dos estudos para acompanhamento da funo renal de animais tratados com CDDP utiliza como parmetros avaliativos a determinao plasmtica de uria e creatinina, bem como a avaliao morfolgica do tecido renal. A uria o produto final do catabolismo protico sendo sintetizada primariamente no fgado e excretada principalmente pelos rins. Um aumento na uria sangunea pode refletir tanto uma acelerao no catabolismo protico quanto uma diminuio na sua excreo urinria. Nveis aumentados de uria so comumente encontrados em situaes clnicas de hipercatabolismo protico, glomerulonefrite aguda, necrose tubular aguda, dentre outros. Por outro lado, uma reduo nos nveis sricos de uria pode ser detectada em quadros de insuficincia heptica grave, diminuio do

49

catabolismo protico e nefrose no complicada de insuficincia renal (MILLER, 1999). A creatinina uma substncia nitrogenada no protica formada durante o metabolismo muscular da creatina e fosfocreatina. A creatinina excretada por filtrao glomerular e no secretada nem reabsorvida em quantidades significativas. Contudo, elevaes nos nveis sricos de creatinina so consideradas importantes indicativos de comprometimento da funo renal. Apesar de ser um teste especfico na identificao de disfuno renal, alteraes nos nveis de creatinina so detectadas somente aps a perda de aproximadamente 50% da funo renal, o que torna o teste tardio, pouco sensvel e impreciso (MILLER, 1999). sabido ainda que nos estgios iniciais de falncia renal, pode ocorrer aumento na secreo de creatinina, o que reduz seus nveis plasmticos. Portanto, nesses estgios iniciais, a razo uria/creatinina utilizada como um marcador importante que reflete uma reduo na perfuso renal bem como na taxa de filtrao glomerular, sugerindo um dano renal inicial que leva falncia renal (ASNA et al., 2005). Com relao s alteraes morfolgicas do tecido renal advindas da administrao de CDDP, essas so observadas principalmente nas clulas epiteliais do segmento S3, e, inicialmente so detectadas nos tbulos proximais. As anlises microscpicas revelam degenerao, necrose e descamao das clulas epiteliais. Nos quadros de falha renal aguda, a leso predominante a necrose aguda, cuja severidade dose e tempo-dependente (YAO et al., 2007).

2.5.1.2 Funo heptica

Se por um lado, a nefrotoxicidade decorrente do tratamento com CDDP bem caracterizada e um fator limitante da terapia com CDDP, por outro, pouco se sabe sobre os danos hepticos induzidos por esse frmaco. Alm disso, a hepatotoxicidade no um fator limitante da terapia, mas ocorre comumente quando a CDDP administrada em altas doses (PRATIBA et al., 2006).

50

O fgado, atravs de suas enzimas, participa de complexas funes de armazenar, sintetizar, metabolizar, conjugar e excretar numerosas substncias endgenas e exgenas. Por ser um rgo com diversas funes metablicas, qualquer avaliao do seu estado funcional ser dependente da sua capacidade de executar uma funo metablica especfica. Por isso, provas bioqumicas realizadas no soro sanguneo tornam-se um excelente subsdio para a elucidao de comprometimento heptico induzido por diferentes frmacos (MEYER; SVENDSEN, 2003). Dentre os exames laboratoriais utilizados para avaliar a funo heptica, tem sido recomendado avaliao da atividade enzimtica da alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA) e GGT, alm da determinao do proteinograma e dos nveis das bilirrubinas. Em condies fisiolgicas, as enzimas so encontradas em pequenas quantidades no plasma sanguneo e em grandes quantidades no interior das clulas de certos tecidos. Assim, um aumento da atividade srica de tais enzimas indica alteraes teciduais decorrente do aumento da permeabilidade da membrana celular e extravasamento dessas enzimas para o plasma sanguneo (MILLER; GONALVES, 1999). Em pequenos animais, a dosagem srica de ALT o teste de escolha para avaliar o comprometimento heptico. A ALT uma enzima que est livre no citoplasma dos hepatcitos e essencialmente hepato-especfica para ces e gatos. Qualquer leso tissular ou doena que afete o parnquima heptico induz a liberao de ALT na corrente sangunea. Dessa forma, a ALT alm de ser sensvel bastante especfica para o diagnstico de leso heptica. O aumento da ALT est relacionado com a extenso da leso e no com a gravidade da mesma. Portanto, mesmo que uma leso no cause morte celular, pode ser suficiente para induzir a liberao de ALT na corrente sangunea (KRAMER; HOFFMAN, 1997). A AST tambm comumente utilizada para avaliar leso heptica em pequenos animais, porm apresenta menor especificidade que ALT. Por ser uma enzima citoslica e mitocondrial, a liberao de AST na corrente sangunea apenas ocorre com uma leso de maior extenso. Portanto, o aumento da atividade enzimtica srica de AST diretamente proporcional ao nmero de hepatcitos afetados. Outro marcador utilizado no diagnstico de leso hepatocelular a FA. Embora, nem todo

51

comprometimento heptico cause um aumento significativo dessa enzima, necrose hepatocelular geralmente leva a um aumento transitrio da FA (KRAMER; HOFFMAN, 1997). Com relao a GGT, a membrana celular do epitlio do ducto biliar apresenta grande atividade enzimtica da GGT (KRAMER; HOFFMAN, 1997). Sua elevao a alterao laboratorial mais frequente nas doenas hepatobiliares, pois observada nas leses hepticas inflamatrias, txicas e nas colestases. Dessa forma, a atividade srica de GGT est aumentada, em grau dependente da magnitude da hiperplasia e do bloqueio do sistema biliar. A GGT tem maior especificidade que a AST e a FA para avaliar doena heptica (MILLER; GONALVES, 1999). Na patologia clnica, a avaliao do proteinograma tambm tem grande importncia para o estabelecimento do grau de comprometimento heptico, visto que o fgado o principal responsvel pela produo de protenas plasmticas e, que a albumina produzida exclusivamente por esse rgo. Diante disso, a determinao dos teores sricos de protena total deve estar associada quantificao de albumina srica e, eventualmente, ao fracionamento eletrofortico de globulinas. Geralmente no se observa hipoalbuminemia at que ocorra perda de 60 a 80% da funo heptica (TRALL, 2007). Embora a maior parte das globulinas que participam do sistema imune seja sintetizada nos tecidos linfide, o fgado outro importante rgo de sntese. A insuficincia heptica pode resultar em menor sntese, portanto em menor concentrao srica de globulina. Segundo Kramer e Hoffman (1997), o primeiro sinal de anormalidade heptica comumente identificado pela menor proporo de albumina em relao globulina. Por fim, a dosagem de bilirrubina srica tambm tem grande importncia no diagnstico de hepatopatias. A bilirrubina um pigmento resultante do catabolismo da hemoglobina, aps a destruio normal ou patolgica das hemcias. Ao ser lanada no plasma, a bilirrubina liga-se rapidamente albumina formando um complexo que denominado bilirrubina no conjugada ou indireta. Ao passar pelos hepatcitos, a bilirrubina se desliga da albumina e conjuga-se ao cido glicurnico, transformando-se em glicurondios de bilirrubina, conhecidos como bilirrubina conjugada ou direta. Nos quadros de leses hepatocelulares aguda ocorre aumento simultneo das bilirrubinas direta e indireta (MILLER; GONALVES, 1999).

52

2.5.2 Avaliao da atividade antitumoral

Os estudos in vivo de atividade antitumoral so frequentemente conduzidos em roedores, principalmente camundongos, levando em considerao as provveis diferenas com o homem no que diz respeito farmacocintica e farmacodinmica. A seleo de um modelo animal adequado, incluindo espcie, cepa e tipo de tumor, deve ser dependente das propriedades do agente quimioterpico e das indicaes teraputicas propostas (EMEA, 1998). Na oncologia, diversos modelos experimentais tm sido propostos, quer para compreender os mecanismos bsicos da biologia tumoral quer para a investigao de novas modalidades teraputicas. Os modelos de tumores experimentais transplantveis so os mais utilizados, dentre eles, os tumores asctico e slido de Ehrlich. Essa utilizao decorre principalmente da facilidade de padronizao do nmero e das caractersticas das clulas tumorais inoculadas e devido ao desenvolvimento rpido da neoplasia, o que restringe o tempo de estudo (DAGLI et al., 1992). O tumor de Ehrlich uma neoplasia transplantvel de origem epitelial maligna e corresponde a um adenocarcinoma mamrio de camundongo fmea (EHRLICH, 1906). Esse tumor desenvolve-se em cavidades serosas como a abdominal e pleural, bem como em msculos. As formas asctica ou slida de seu crescimento ocorrem conforme o local de inoculao. Quando inoculado na cavidade abdominal, as clulas tumorais crescem na sua forma asctica, desenvolvendo um quadro de carcinomatose peritoneal. Essa forma tem como caracterstica um grande acmulo de lquido no abdmen e uma baixa resposta inflamatria, com pequeno infliltrado de macrfagos e um influxo tardio de clulas polimorfonucleares para a cavidade. Quando inoculado no tecido subcutneo, as clulas desenvolvem a forma slida do tumor. Morfologicamente, as clulas apresentam um alto grau de atipias, caracterizadas por nuclolos evidentes e numerosos, cromatina condensada, mitoses atpicas ou aberrantes e com uma relao ncleo-citoplasma maior que a das culas normais. O estroma constitudo por fibras colgenas e capilares neoformados (HOSSNE, 2002).

53

O tumor de Ehrlich possui capacidade de crescimento em quase todas as linhagens de camundongos, considerado pouco imunognico, pois no expressa molculas do complexo de histocompatibilidade de classe II. Devido a sua baixa imunidade, esta neoplasia apresenta crescimento bastante agressivo, com proliferao celular acelerada e invaso de tecidos adjacentes (KODAMA; KODAMA, 1975).

54

OBJETIVOS

55

3 OBJETIVOS

Esta tese de doutorado tem como objetivo avaliar os parmetros de segurana e eficcia, mediante o estudo de toxicidade aguda e da atividade antitumoral in vivo, de uma nova formulao lipossomal contendo CDDP, SpHL-CDDP.

3.1 Objetivos Especficos

Em mbito mais especfico os objetivos principais so: Determinar a DMT e a DL50 da CDDP livre e dos SpHL-CDDP administrados por via IV ou IP em camundongos Swiss sadios; Avaliar as alteraes hematolgicas, indicativas de mielotoxicidade, advindas da administrao IV ou IP de diferentes doses de SpHL-CDDP em camundongos Swiss sadios e comparar com a administrao de CDDP livre; Avaliar as alteraes bioqumicas, indicativas de toxicidade renal e heptica, observadas aps a administrao IV ou IP de SpHL-CDDP em camundongos Swiss sadios e comparar com a administrao de CDDP livre; Avaliar as alteraes histolgicas da medula ssea, rins, fgado e bao de camundongos Swiss sadios tratados por via IV ou IP com SpHL-CDDP e comparar com a administrao de CDDP livre; Estudar a atividade antitumoral de SpHL-CDDP administrados por via IV em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich e comparar com a administrao de CDDP livre e uma formulao lipossomal no pH-sensvel contendo CDDP (NSpHL-CDDP).

56

CAPTULO 1

AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS DE CIRCULAO PROLONGADA CONTENDO CISPLATINA

57

1 INTRODUO

58

1 INTRODUO

Como mencionado anteriormente, a CDDP largamente utilizada, tanto em pacientes adultos quanto em crianas, na terapia contra vrios tipos de cnceres humanos. De acordo com o tipo de tumor, a CDDP utilizada em associao com outros frmacos em diferentes esquemas teraputicos, administrados por via IP ou IV. Entretanto, como a maioria dos antineoplsicos, a CDDP atua indiscriminadamente, tanto nas regies tumorais quanto nas regies no acometidas pelo tumor, causando uma srie de efeitos adversos graves para o organismo. O inconveniente do uso desse quimioterpico reside, sobretudo, na nefrotoxicidade severa, mielosupresso, ototoxicidade e neurotoxicidade, alm de efeitos colaterais como nuseas e vmitos, que podem levar interrupo do tratamento. Os pacientes que necessitam dessas terapias e os mdicos que as prescrevem so obrigados a fazer um balano da relao risco/benefcio para avaliar se, e at quando, pode-se utilizar esse frmaco. A encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis pode constituir uma alternativa para contornar esses inconvenientes, pois SpHL-CDDP pode conduzir a uma maior seletividade farmacolgica decorrente da liberao preferencial da CDDP no stio tumoral, diminuindo e/ou eliminando a toxicidade sistmica. Como j mencionado, estudos de biodistribuio demonstraram que a administrao de SpHL-CDDP induziu uma menor passagem da CDDP para o tecido renal em comparao com a administrao do frmaco livre (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Pensando em possveis aplicaes clnicas dos SpHL-CDDP no tratamento da carcinomatose peritoneal por via IP, bem como, no tratamento por via IV dos diversos tipos de tumores slidos, faz-se necessrio avaliar a toxicidade pr-clnica dessa formulao a fim de avaliar sua segurana e seu potencial para aplicao clnica. Portanto, nesta primeira parte do estudo foi avaliada a toxicidade aguda de SpHL-CDDP aps sua administrao por via IP e IV em camundongos Swiss sadios.

59

2 MATERIAL E MTODOS

60

2 MATERIAL E MTODOS

2.1 Material

DOPE e DSPE-MPEG2000 foram adquiridos da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha). CHEMS e a soluo padro de fsforo foram fornecidos pela SigmaAldrich (Steinheim, Alemanha). A cisplatina (CDDP) foi adquirida da Quiral Qumica do Brasil S/A (Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil). N-2-hidroxietilpiperazina e hidrxido de sdio foram adquiridos da Vetec Qumica Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brasil). O metanol, acetato de etila e a dimetilformamida, todos os solventes grau HPLC, foram adquiridos da Tedia (Fairfield, Ohio, Estados Unidos). Clorofrmio P.A. e ter etlico P.A. foram adquiridos da Synth (So Paulo, Brasil). O cloreto de sdio P.A. e o isopropanol foram provenientes da Merck (Darmstadt, Alemanha). A gua utilizada em todos os experimentos foi deionizada e destilada.

2.2 Preparao de SpHL-CDDP e CDDP livre

A preparao dos lipossomas foi realizada pelo mtodo de evaporao em fase reversa, como descrito anteriormente por Carvalho-Jnior e colaboradores (2007a). Os lipossomas foram preparados utilizando um rotavapor Buchi Labortechnik AG CH-9233, modelo R-210, acoplado a uma bomba de vcuo de mesma marca, modelo V-700 (Flawil, Sua). Primeiramente, alquotas clorofrmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-MPEG2000 (concentrao lipdica total igual a 40 mM; razo molar 5,7:3,8:0,5, respectivamente) foram transferidas para um balo de fundo redondo, e submetidas evaporao para eliminao do solvente. Em seguida, o filme lipdico obtido foi dissolvido em ter etlico e, uma soluo de CDDP a 2,0 mg/mL preparada em soluo de NaCl 0,9% (p/v) foi adicionada. A razo entre as fases aquosa e etlica foi igual a 1:3, respectivamente. A mistura obtida foi submetida agitao no vrtex durante 3 minutos, produzindo uma emulso do tipo gua/leo. A emulso foi, em seguida, levada ao rotavapor e o ter etlico foi completamente removido sob

61

presso reduzida, at a formao das vesculas lipdicas. Os lipossomas obtidos foram calibrados, utilizando um extrusor Lipex Biomembranes modelo T001 (Vancouver, Canad), mediante sua passagem em membranas de policarbonato de 0,4 m, 0,2 m e 0,1 m (5 ciclos em cada membrana). A CDDP no encapsulada foi separada dos lipossomas por ultracentrifugao (ultracentrfuga Optima L-80XP, Beckman Coulter) a 150.000 g, a 10 C, durante 90 minutos para a obteno dos lipossomas purificados. Os lipossomas brancos (SpHL sem CDDP) foram preparados nas mesmas condies descritas acima. A soluo de CDDP livre foi preparada mediante solubilizao de 50 mg de CDDP em 20 mL de soluo de NaCl 0,9% (p/v), sob aquecimento em temperatura de 37 oC, seguida de agitao em vrtex. Essa soluo foi transferida para um balo volumtrico de 25 mL, completando-se o volume com soluo de NaCl 0,9% (p/v).

2.3 Caracterizao qumica e fsico-qumica de SpHL-CDDP

Os lipossomas foram caracterizados quanto ao dimetro, potencial zeta, teor de encapsulao e pela determinao da razo molar CDDP:fosfolpide.

2.3.1 Determinao do dimetro e potencial zeta

A anlise do dimetro das vesculas e o ndice de polidisperso foram determinados por espectroscopia de correlao de ftons utilizando o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra). Para a realizao das medidas, aproximadamente 50 L de lipossomas (SpHL ou SpHL-CDDP) foram diludos em 5 mL de soluo de NaCl 0,9 % (p/v), at a obteno de uma contagem adequada de partculas. As medidas foram efetuadas a temperatura de 25 C, utilizando um ngulo de incidncia do laser de 90 e anlise monomodal. O ndice de polidisperso reflete o perfil de homogeneidade do dimetro das vesculas e, amostras com ndice de polidisperso

62

inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas. O potencial zeta das vesculas foi determinado por espectroscopia de correlao de ftons associado mobilidade eletrofortica utilizando tambm o equipamento Zetasizer 3000 HSA. As medidas foram feitas em triplicata e os resultados foram apresentados como a mdia desvio padro.

2.3.2 Determinao do teor de CDDP encapsulada em SpHL-CDDP

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foi utilizada como mtodo de doseamento da CDDP. O aparato consistiu de uma bomba modelo 515, um autoinjetor modelo 717 Plus e um detector DAD modelo 2996 (Waters Instruments, Milford, Estados Unidos), conectado a um computador apresentando o software Empower, verso 2.0. Para a separao da CDDP foi utilizada uma pr-coluna 4 x 4 mm, 5 m (Merck, Darmstadt, Alemanha) conectada a uma coluna Lichrosper 100 NH2, 25 cm x 4 mm, 10 m (Merck, Darmstadt, Alemanha). O sistema eluente foi composto por acetato de etila, metanol, dimetilformamida e gua, na proporo 4:4:1:1, respectivamente. O volume de injeo foi de 20 L, em fluxo igual a 1,0 mL.min-1 e o material eludo foi detectado em comprimento de onda igual a 310 nm. Inicialmente, a membrana lipdica dos SpHL-CDDP foi aberta com lcool isoproplico na proporo 1:2, respectivamente, e em seguida, a preparao foi diluda 1,5 vezes com o sistema eluente e injetada no cromatgrafo. A quantidade de CDDP foi determinada nos lipossomas antes da ultracentrifugao (SpHL-CDDP no purificados) e aps a ultracentrifugao (SpHL-CDDP purificados). O teor de encapsulao (TE) da CDDP foi calculado de acordo com a seguinte equao:

TE =

[CDDP presente nos SpHL-CDDP purificados] [CDDP presente nos SpHL-CDDP no purificados]

x 100

63

2.3.3 Determinao da relao CDDP/fosfolpide

A concentrao de fosfolpides presente nas preparaes foi determinada de acordo com o mtodo descrito por Bartlett (1959). O mtodo consistiu em um doseamento colorimtrico baseado na formao de um complexo entre ons fosfato e molibdato, o qual em meio cido apresenta uma colorao azul. A intensidade da colorao azul produzida foi proporcional concentrao de fsforo contida na amostra. A sensibilidade do mtodo est compreendida entre 0,5 e 5 g de fsforo. Primeiramente, 250 L da soluo padro de fsforo ou de SpHL-CDDP foi adicionada em tubos de borosilicato. Em seguida, o fsforo orgnico presente nas amostras foi mineralizado atravs da adio de 400 L de uma soluo de cido sulfrico 10 N. Os tubos foram transferidos para um dry-block (MA 4004, Marconi, Brasil) temperatura de 180-195 oC e aquecidos durante 30 minutos. Em seguida, os tubos foram resfriados temperatura ambiente e, 100 L de uma soluo de gua oxigenada 10% (v/v) foram adicionados. Os tubos foram novamente transferidos para o dry-block temperatura de 180-195 oC e aquecidos durante 30 minutos. Em situaes onde a soluo no se encontrava lmpida, o procedimento anterior foi novamente realizado. Em seguida, os tubos foram novamente resfriados temperatura ambiente e, 4,6 mL de uma soluo de molibdato de amnio (2,22g de molibdato de amnio, 0,7 mL de H2SO4 36 N e gua destilada qsp 100 mL) e 0,5 mL de uma soluo de cido ascrbico a 10% (p/v) foram adicionados. Os tubos foram agitados vigorosamente com o auxlio de um vrtex e aquecidos temperatura de 90 oC por 20 minutos. Um complexo de cor azulada foi formado e a densidade tica da soluo foi medida em espectrofotmetro (Hitachi U 2001, Japo) em comprimento de onda igual a 800 nm. Para a obteno da curva de calibrao de fsforo foram utilizados cinco diferentes pontos (1, 2, 3, 4 e 5 g) desse elemento a partir de uma soluo padro de fsforo 0,65 mM. Os testes foram realizados em triplicata e a equao da reta foi determinada por regresso linear. Para a dosagem da concentrao de fsforo presente nos SpHL-CDDP, as amostras foram preparadas de acordo com a concentrao terica de fosfolpides de modo a se obter uma massa de fsforo de aproximadamente 3 g de fsforo.

64

2.4 Experimentao in vivo

2.4.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos (30 5g) e fmeas (25 5g), com 6 semanas de idade, obtidos no biotrio da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais foram alojados em gaiolas de plstico, mantidos em ambiente com controle de ciclo de luz e ventilao e tiveram livre acesso rao e gua. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comit de tica em Experimentao Animal (CETEA) da UFMG e esto de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratrio recomendado pelo Institute of Laboratory Animal Resources.

2.4.2 Avaliao da Toxicidade Aguda

Os parmetros utilizados para a avaliao da toxicidade aguda incluram: avaliao dos sinais clnicos, acompanhamento do peso corporal, mortalidade, anlise hematolgica e bioqumica, alm de avaliao histopatolgica. Para o estudo de toxicidade aguda aps administrao da CDDP livre ou SpHLCDDP por via IP, diferentes grupos de camundongos, machos e fmeas, receberam uma dose nica de CDDP livre (5; 10; 20 e 30 mg/kg) ou SpHL-CDDP (7; 12; 30; 45 e 80 mg/kg). A soluo de CDDP livre e SpHL-CDDP foram injetadas nos animais imediatamente aps sua preparao. Os grupos controle receberam soluo salina ou SpHL (a dose de lpide foi equivalente quela administrada nos animais tratados com SpHL-CDDP nas doses de 30 e 80 mg/kg). Cada grupo experimental consistiu de 10 camundongos machos e 10 fmeas. A escolha da dose inicial foi baseada em dados da literatura, cujos valores de DMT estabelecidos para a CDDP livre administrada por via IP foram de aproximadamente 8 mg/kg, enquanto para CDDP

65

associada

microesferas,

os

valores

de

DMT

estabelecidos

foram

de

aproximadamente 35 mg/kg (TAMURA et al., 2002c). Para o estudo de toxicidade aguda aps administrao da CDDP livre ou SpHLCDDP por via IV, diferentes grupos de camundongos, machos e fmeas, receberam uma dose nica de CDDP livre (5; 7,5; 10; 15; 20 e 25 mg/kg) ou SpHL-CDDP (20; 25; 30; 35 e 40 mg/kg). A soluo de CDDP livre e SpHL-CDDP foram injetadas nos animais imediatamente aps sua preparao. Os grupos controle receberam soluo salina ou SpHL (a dose de lpide foi equivalente quela administrada nos animais tratados com SpHL-CDDP na dose de 40 mg/kg). Cada grupo experimental consistiu de 5 camundongos machos e 5 fmeas. A escolha da dose inicial foi baseada em dados da literatura, cujos valores de DMT para a CDDP livre administrada por via IV foram aproximadamente igual a 6-8 mg/kg (NEWMAN et al., 1999). Aps o tratamento com CDDP livre ou SpHL-CDDP os animais foram acompanhados por um perodo de 14 dias. Durante esse perodo experimental, mudanas no comportamento e o peso dos animais foram monitorados. Alm disso, o tempo em que os sinais de toxicidade ou morte ocorreram tambm foi registrado. Para os dados de peso corporal, a variao do peso ao longo do perodo experimental foi calculada em relao ao peso inicial. A DL50 foi determinada usando o mtodo estabelecido por Litchifield e Wilcoxon (1949). A DMT foi definida como a maior dose que causou perda de peso inferior a 15%, no causou morte ou qualquer sinal de toxicidade proeminente durante os 14 dias de observao (VASSILEVA et al., 2007).

2.4.2.1 Investigaes Hematolgicas e Qumica Clnica 4 ww2 Exames hematolgicos e bioqumicos foram realizados em todos os animais sobreviventes 14 dias aps o tratamento com CDDP livre, SpHL-CDDP, soluo NaCl 0,9% (p/v) ou SpHL. Os camundongos foram anestesiados com uma mistura de xilazina (7,5 mg/kg) e ketamina (60 mg/kg) e amostras de sangue foram

66

coletadas em tubos sem anticoagulantes (para avaliao bioqumica) e em tubos contendo 0,18% (p/v) de EDTA (para avaliao hematolgica). A coleta do sangue foi realizada no plexo braquial dos animais e o sangue foi imediatamente transferido para os diferentes tubos e encaminhado para anlise. Os parmetros hematolgicos avaliados incluram contagem de hemcias, hemoglobina, hematcrito, contagem de leuccitos (total e diferencial) e contagem de plaquetas. Todas as anlises foram realizadas usando um analisador automatizado (Abacus Junior Vet, Diatron R Messtechnick GmbH, ustria). As funes heptica e renal foram avaliadas utilizando-se a qumica clnica. Para a determinao da funo heptica foram realizadas dosagens de ALT, AST, FA, GGT, protena total, globulina e albumina. A nefrotoxicidade foi determinada mediante medidas da concentrao srica de uria e creatinina. Todos os testes bioqumicos foram realizados mediante anlise espectrofotomtrica utilizando um autoanalizador (Cobas Mira Plus, Roche, EUA) e kits de diagnstico obtidos do Laboratrio Labtest Diagnstica (Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil).

2.4.2.2 Avaliao Histopatolgica

Para anlise histopatolgica, os rins, o fgado, o bao e a medula ssea foram removidos, lavados com soluo de NaCl 0,9% (p/v) e fixados em formaldedo a 10% (v/v). Os fragmentos dos tecidos foram includos em blocos de parafina, seccionados em cortes de 5 m de espessura e corados pelo mtodo hematoxilinaeosina. As lminas foram analisadas por um patologista e as imagens foram obtidas usando um microscpio ptico conectado a uma cmera.

2.5 Anlise Estatstica

Os dados hematolgicos e bioqumicos foram expressos como a mdia erro padro da mdia. Para a verificao da normalidade e homocedasticidade da

67

varincia utilizou-se os testes de Lilliefors e Bartlett, respectivamente. As variveis que no apresentaram distribuio normal foram transformadas pelas equaes: y = log (varivel + 1) ou y = raiz (varivel + 1). A diferena entre os grupos experimentais foi testada por anlise de varincia seguida do teste de Tukey. Para analisar a variao de peso corporal, foi realizada anlise de covarincia e os valores antes do tratamento foram considerados como covarivel. Para todas as anlises adotou-se o intervalo de confiana de 95% e as diferenas foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P < 0,05).

68

3 RESULTADOS E DISCUSSO PARTE 1

AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE SpHL-CDDP ADMINISTRADOS POR VIA INTRAPERITONEAL

69

3.1 Resultados

3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP

A porcentagem de encapsulao da CDDP nos SpHL-CDDP foi 24,7 3,2. A razo molar CDDP:lpide nos SpHL-CDDP foi de 0,050 0,003. O dimetro mdio das vesculas de SpHL-CDDP foi igual a 133,1 7,7 nm e o ndice de polidisperso foi igual a 0,11, indicando que esta formulao monodispersa. SpHL-CDDP exibiram valores de potencial zeta prximo da neutralidade (0,9 1,3 mV). SpHL apresentaram valores de dimetro mdio, ndice de polidisperso e potencial zeta equivalentes aqueles obtidos para SpHL-CDDP. Esses achados foram similares queles descritos anteriormente por Carvalho-Jnior e colaboradores (2007a).

3.1.2 Avaliao do peso dos animais

Durante os 14 dias de monitoramento, no foi observada perda de peso em camundongos Swiss machos e fmeas tratados com CDDP livre (5 mg/kg) ou SpHL-CDDP (7 mg/kg), exceto para o grupo de camundongos fmeas no segundo e quarto dias aps injeo de SpHL-CDDP e CDDP livre, respectivamente (Figura 1.1). Por outro lado, uma perda de peso no perodo inicial psadministrao de CDDP livre (10 mg/kg) ou SpHL-CDDP (12 mg/kg) foi observada no grupo de camundongos machos (Figura 1.1 A e B). A recuperao do peso corporal dos animais dentro do grupo tratado com CDDP livre foi mais tardia do que dentro do grupo tratado com SpHL-CDDP (dcimo e oitavo dias, respectivamente; P < 0,05). Entretanto, no caso de camundongos fmeas, um maior impacto sobre o o peso corporal pde ser detectado. Os camundongos fmeas tratados com CDDP livre (10 mg/kg) apresentaram uma pronunciada perda de peso (-36%) at o oitavo dia ps-tratamento e a recuperao tambm ocorreu a partir do dcimo dia. Por outro lado, aps a administrao de SpHL-CDDP na dose de 12 mg/kg, a perda mxima de peso observada foi igual a 12%. Alm disso, o ganho de peso foi maior

70

para as fmeas tratadas com SpHL-CDDP do que quelas tratadas com CDDP livre (P < 0,05; Figura 1.1 C e D). Sinais de toxicidade mais expressivos relacionados perda de peso corporal foram observados aps o tratamento com CDDP livre na dose de 20 mg/kg (Figura 1.1 A e C). Os camundongos machos e fmeas apresentaram uma grande perda de peso at o quarto dia ps-injeo. Alm disso, vale destacar que uma taxa de mortalidade significativa ocorreu em ambos os sexos de camundongos (90% e 70% para machos e fmeas, respectivamente) at o quinto dia aps a administrao de CDDP livre na dose de 20 mg/kg (Figura 1.2). Os camundongos fmeas que sobreviveram apresentaram uma recuperao do peso a partir do sexto dia ps-injeo de CDDP livre. Em contraste, camundongos machos e fmeas que receberam SpHL-CDDP, na dose de 30 mg/kg, mostraram uma perda de peso corporal at o quarto dia ps-tratamento (Figura 1.1 B e D), enquanto apenas dois camundongos machos morreram e nenhuma morte foi observada no grupo de camundongos fmeas (Figura 1.2). A variao de peso corporal para os animais tratados com SpHL-CDDP nas doses de 45 e 80 mg/kg no foi registrada, uma vez que uma alta taxa de mortalidade ocorreu no perodo inicial do tratamento (70% at o quarto dia ps-injeo). O grupo controle tratado com soluo salina, em ambos os sexos, mostrou um ganho de peso durante o perodo de investigao, exceto os quatro primeiros dias no caso de fmeas, o qual apresentou perda de 16% do peso corpreo. As razes para essa perda de peso inicial no esto claras. Os animais que receberam SpHL apresentaram uma perda de peso no perodo inicial, at o quarto dia, mas a recuperao ocorreu a partir do sexto dia ps-tratamento (Figura 1.1 B e D).

71
Machos
Fmeas
CDDP livre (20mg/kg)

40 30

Salina

CDDP livre (5mg/kg)

CDDP livre (10mg/kg)

40 30

Salina

CDDP livre (5mg/kg)

CDDP livre (10mg/kg)

CDDP livre (20mg/kg)

Peso corporal (% variao )

Peso corporal (% variao)

20 10 0 -10
# #

20
c

*
#

*
a b ND

10
#

0 -10 -20 -30 -40

*# *# * * *# *# *#

-20 -30 -40 *# *#

SpHL

40 30

SpHL-CDDP (7mg/kg)

SpHL-CDDP (12mg/kg)

SpHL-CDDP (30mg/kg)

40 30

SpHL

SpHL-CDDP (7mg/kg)

SpHL-CDDP (12mg/kg)

SpHL-CDDP (30mg/kg)

Peso corporal (% variao)

# #

10 0 -10 -20 -30 -40

Peso corporal (% variao)

20
#

20 10
# # #

0 -10 -20 -30 -40

Dia 2 Dia 10

Dia 4 Dia 12

Dia 6 Dia 14

Dia 8

Figura 1.1 - Variao do peso corporal de camundongos Swiss machos (A e B) e fmeas (C e D) observada durante 14 dias aps a administrao IP de CDDP livre ou SpHL-CDDP. * Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre e SpHL-CDDP em doses similares (5, 10 e 7, 12 mg/kg, respectivamente). # Representa diferena significativa entre os tratamentos CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. O nvel de significncia foi considerado para valores de a,b,c P < 0,05. Variao do peso corporal foi determinada apenas para oito, sete e trs camundongos sobreviventes, respectivamente. ND indica que a variao no foi determinada a partir do sexto dia devido morte dos animais. Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

72

3.1.3 Mortalidade e Sinais Clnicos

Na Figura 1.2 esto apresentados os resultados de mortalidade de camundongos machos e fmeas aps o tratamento com CDDP livre, SpHL-CDDP e controles (salina e SpHL). A administrao de CDDP livre na dose de 10 mg/kg em fmeas induziu uma alta mortalidade (60%), enquanto nenhuma morte foi observada aps o tratamento com SpHL-CDDP em dose similar (12 mg/kg). Alm disso, um alto nvel de mortalidade tambm foi observado em camundongos machos (90%) e fmeas (70%) tratados com CDDP livre na dose de 20 mg/kg. O tratamento com 30 mg/kg de CDDP livre causou 100% de morte dos camundongos de ambos os sexos. Por outro lado, a administrao de SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg induziu apenas 20% de morte no grupo de camundongos machos e nenhuma morte foi observada no grupo de camundongos fmeas. O aumento da dose administrada de SpHLCDDP para 45 mg/kg levou a uma alta taxa de mortalidade (80% e 90% para machos e fmeas, respectivamente). Aps a administrao de 80 mg/kg de SpHLCDDP, pde-se observar a morte de todos os animais. Nenhuma morte foi observada no grupo controle tratado com soluo salina e somente uma morte ocorreu em ambos os sexos de camundongos tratados com SpHL apresentando concentrao lipdica equivalente quela presente no tratamento com SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg. No grupo controle tratado com SpHL apresentando concentrao lipdica equivalente quela presente no tratamento com SpHL-CDDP na dose de 80 mg/kg, ocorreu 10% e 20% de morte para fmeas e machos, respectivamente. Aps a administrao de todas as doses de CDDP livre, alguns efeitos como diarria, ataxia e fraqueza foram observados em todos os camundongos machos e fmeas, no entanto, nos grupos tratados com SpHL-CDDP, esses efeitos foram somente observados aps a administrao de altas doses (45 e 80 mg/kg). Alm disso, piloereo foi detectada nos grupos que receberam CDDP livre em todas as doses. Para os grupos que receberam SpHL-CDDP, piloereo foi observada aps a administrao de 30, 45 e 80 mg/kg. Entretanto, nos animais tratados com 30 mg/kg de SpHL-CDDP esse efeito desapareceu no terceiro dia aps o

73

tratamento. Nenhum sinal clnico aparente de toxicidade foi detectado nos grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL.

A
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Taxa de Sobrevida (%)

Tempo (dias)

B
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Taxa de sobrevida (%)

Tempo (dias)

Figura 1.2 - Taxa de sobrevida de camundongos Swiss machos (A) e fmeas (B) tratados com CDDP livre (5 mg/kg, ; 10 mg/kg, ; 20 mg/kg, ; 30 mg/kg, ), SpHLCDDP (7 mg/kg, ; 12 mg/kg, ; 30 mg/kg, ; 45 mg/kg, ; 80 mg/kg, ), salina () e SpHL
(dose de lpides foi equivalente quela administrada no tratamento com SpHL-CDDP na dose 30 () e 80 (|) mg/kg).

74

Os valores de DL50 e DMT estabelecidos para camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre ou SpHL-CDDP esto apresentados na Tabela 1.1. Os resultados mostraram que os valores de DL50 obtidos aps o tratamento com SpHLCDDP para camundongos machos e fmeas foram, respectivamente, 2,7 e 3,2 vezes superiores queles obtidos aps a administrao de CDDP livre. A DMT estabelecida aps o tratamento com SpHL-CDDP foi cerca de 3 vezes superior quela estabelecida com a administrao de CDDP livre. Esses resultados demonstram que a encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada capaz de reduzir sua toxicidade in vivo.

Tabela 1.1 - DL50 e DMT estabelecidas aps administrao IP de CDDP livre ou

SpHL-CDDP em camundongos Swiss

Sexo

Tratamento
CDDP livre SpHL-CDDP CDDP livre SpHL-CDDP

DL50 (mg/kg)
16,8 45,4 14,9 47,5

95% ICa
12,9 - 21,9 37,4 - 55,1 10,6 - 21,6 41,8 - 54,0

DL50 SpHLDMT CDDP / DL50 (mg/kg) CDDP livre

2,7 < 10 < 30 < 10 30

Machos Fmeas
a

3,2

IC significa intervalo de confiana de 95%.

3.1.4 Investigaes hematolgicas

As alteraes dos parmetros hematolgicos de camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre e SpHL-CDDP esto sumarizadas nas Tabelas 1.2 e 1.3. Inicialmente, foi investigado o efeito da interao sexo e tratamento nos diferentes parmetros hematolgicos. Os resultados estatsticos demonstraram a ausncia desse efeito na quantificao de hemcias, hemoglobina e linfcitos (Tabela 1.2), ao passo que, a quantificao do hematcrito, contagem de leuccitos, neutrfilos, moncitos e plaquetas foram diretamente influenciados por essa interao (Tabela 1.3). Nenhuma alterao significativa sobre a contagem de hemcias e a

75

quantificao de hemoglobina foi observada aps a administrao da maioria das doses de CDDP livre e SpHL-CDDP (Tabela 1.2). Uma pequena reduo nos nveis de hemcia e hemoglobina foi detectada somente aps a injeo de CDDP livre na dose de 10 mg/kg. A administrao de SpHL-CDDP (12 mg/kg) induziu um aumento da contagem de hemcias e hemoglobina em comparao com o grupo controle SpHL. As razes dessas alteraes permanecem ainda sem esclarecimento. Com relao aos nveis de linfcitos, pde-se observar que os mesmos foram drasticamente afetados pela administrao de CDDP livre em todas as doses. A contagem de linfcitos foi significativamente menor nos grupos tratados com CDDP livre em comparao aos grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL (P < 0,05). O tratamento com SpHL-CDDP no afetou a contagem de linfcitos quando comparado ao grupo controle SpHL (P > 0,05). Uma reduo no hematcrito foi detectada em camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre na dose de 10 mg/kg quando comparado ao grupo controle tratado com soluo salina e ao grupo tratado com SpHL-CDDP (Tabela 1.3). Esses achados associados com a diminuio na contagem de hemcias e nos nveis de hemoglobina sugerem o aparecimento de uma leve anemia aps o tratamento com CDDP livre. Por outro lado, esse sinal de toxicidade no apareceu em camundongos que receberam SpHL-CDDP. A contagem de leuccitos total foi significativamente reduzida e associada com uma marcada neutropenia em camundongos machos e fmeas submetidos ao tratamento com CDDP livre nas doses de 5 e 10 mg/kg (P < 0,05) (Tabela 1.3). Nenhuma alterao nas contagens de leuccitos e neutrfilos foi observada aps a administrao de SpHL-CDDP em camundongos machos e fmeas quando comparado ao grupo controle tratado com SpHL, demonstrando que a encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada mantm as clulas do sistema imune dentro dos nveis de normalidade. Nenhuma diferena significativa foi observada na contagem de moncitos de animais tratados com SpHL-CDDP, ao passo que, para camundongos machos tratados com CDDP livre, diferenas significativas foram detectadas. Alm disso, nenhuma alterao na contagem de eosinfilo e basfilo foi observada aps ambos tratamentos (dados no apresentados).

76

Finalmente,

os

nveis

de

plaquetas

aumentaram

significativamente

em

camundongos machos tratados com CDDP livre na dose de 5 mg/kg e em camundongos fmeas tratados com CDDP livre (10 mg/kg) e SpHL-CDDP (30 mg/kg). Vale ressaltar que todos os parmetros hematolgicos foram similares entre os grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL. Este fato indica que a administrao IP de lpides no induz toxicidade hematolgica.

77

Tabela 1.2 - Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao tratamento por via IP
com CDDP livre ou SpHL-CDDP
*

Controles Parmetros Hemcias (106/mm3) M F G Hemoglobina (g/dl) M F G Linfcitos (103/mm3) M F G Salina

8,1 0,2 8,4 0,5 8,3 0,3 13,6 0,4 13,6 0,8 13,6 0,4 3,6 0,3 3,1 0,4 3,4 0,3

CDDP livre (mg/kg) 5

8,6 0,4 7,1 0,4 8,0 0,3 12,7 0,5 11,9 0,6 12,4 0,4 1,8 0,2 1,7 0,2 1,8 0,2
a,b

SpHL-CDDP (mg/kg) 7
8,2 0,2 7,7 0,5 8,0 0,3 13,0 0,5 12,7 0,6 12,8 0,4 4,6 0,7 1,7 0,5 3,2 0,6

SpHL
7,8 0,2 8,0 0,2 7,9 0,1 12,4 0,2 12,6 0,2 12,5 0,1 4,3 0,3 2,7 0,5 3,4 0,3

10
7,2 0,3 7,1 0,4 7,0 0,3
a,b

12
9,4 0,2 9,1 0,1 9,3 0,1
b

30
7,1 0,2 7,6 0,2 7,3 0,2 12,2 0,4 12,8 0,2 12,5 0,2 3,3 0,4 2,6 0,2 3,0 0,3

10,8 0,5 11,7 0,3 11,1 0,4

a,b

15,0 0,2 15,2 0,4 15,1 0,2 5,0 0,2 3,6 0,4 4,3 0,3
b

2,2 0,2 1,3 0,3 1,9 0,2

a,b

* Esses parmetros no foram influenciados pela interao sexo e tratamento. M (machos), F (fmeas) e G (mdia do grupo) a Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre e SpHL-CDDP em doses similares (5, 10 e 7, 12 mg/kg, respectivamente). b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

77

78

Tabela 1.3 - Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas submetidos ao tratamento por via IP com CDDP livre ou
SpHL-CDDP
*

Parmetros Hematcrito M (%) F Leuccitos (10 /mm ) Neutrfilos (103/mm3) Moncitos (103/mm3) Plaquetas (103/mm3)
3 3

Controles Salina
45 1 47 3 5,8 0,6 5,2 0,4 2,1 0,4 1,7 0,2

CDDP livre (mg/kg) SpHL

38 1 40 1

SpHL-CDDP (mg/kg) 7
42 1 44 1 7,5 1,3c 2,9 0,7 2,4 1,3c 1,1 0,3 0,191 0,082c 0,024 0,015 768 39 803 40
a,b

5
43 2c 33 2
a,b

10
33 1a,b 34 2 2,5 0,2a,b 1,7 0,4
a,b

12
51 1b 50 1
b

30
39 1 41 1 6,5 0,9 4,7 0,4 3,0 0,5c 1,9 0,2 0,206 0,097 0,096 0,017 792 54 885 73b

M F M F

6,7 0,6c 4,7 0,7 2,3 0,4 1,8 0,3

2,1 0,2a,b 1,9 0,2

b

7,7 0,3c 6,1 0,5 2,4 0,2 2,2 0,1 0,139 0,031 0,121 0,023 837 35c 605 35

0,3 0,1a,b 0,1 0,0b

0,2 0,0a,b 0,5 0,1a,b

M 0,141 0,047 0,171 0,021c F 0,059 0,021 0,046 0,016 M F

682 59c 427 39 697 96c 494 50

0,004 0,004a,b 0,007 0,005a,b 0,025 0,006 957 83b,c 327 79

a

0,006 0,006 806 54c 1085 98

a,b

* Esses parmetros foram influenciados pela interao sexo e tratamento. M (machos) e F (fmeas). a Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre e SpHL-CDDP em doses similares (5, 10 e 7, 12 mg/kg, respectivamente). b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. c Representa diferena estatstica significativa entre camundongo macho e fmea. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

78

79

3.1.5 Anlise Bioqumica

As alteraes nos parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade renal esto apresentadas na Figura 1.3. A administrao IP de CDDP livre nas doses de 5 e 10 mg/kg em camundongos machos e fmeas no afetou os nveis sanguneos de uria e creatinina quando comparado ao grupo controle tratado com soluo salina (Figura 1.3 A). Entretanto, para verificar as possveis razes de morte observada para o grupo tratado com CDDP livre na dose de 20 mg/kg, a toxicidade renal foi avaliada quatro dias aps a administrao dessa mesma dose (a razo de escolha deste procedimento se deve ao fato de que nenhuma morte foi observada nesse intervalo de tempo, como demonstrado na Figura 1.2). Os resultados desse estudo demonstraram aumento significativo (P < 0,05) nos nveis de uria e creatinina de camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre na dose de 20 mg/kg. Os valores foram aproximadamente 9,5 vezes maiores que os do grupo controle (Figura 1.3 A e B). Entretanto, nenhuma alterao nos nveis de uria foi detectada aps o tratamento com SpHL-CDDP nas doses de 7 e 12 mg/kg em ambos os sexos de camundongos. Aumento significativo nos nveis de uria foram somente observados aps a administrao de 30 mg/kg de SpHL-CDDP (valor aproximadamente 1,7 vezes superior ao obtido para o grupo controle tratado com SpHL) (Figura 1.3 A). Surpreendentemente, os grupos que receberam SpHL-CDDP nas doses de 7 e 12 mg/kg apresentaram menores nveis de creatinina do que o grupo controle tratado com SpHL. Nos camundongos machos e fmeas tratados com SpHL-CDDP (30 mg/kg), foram obtidos nveis de creatinina similares aos camundongos tratados com SpHL (P > 0,05). interessante notar que mesmo quando altas doses de SpHL-CDDP foram administradas, a toxicidade renal ainda foi menor que aps o tratamento com CDDP livre. Nenhuma diferena significativa foi observada entre os grupos controle. Alm disso, camundongos machos e fmeas submetidos ao tratamento com CDDP livre apresentaram um ndice uria/creatinina duas vezes maior que aqueles tratados com SpHL-CDDP (Tabela 1.4). Por outro lado, o ndice uria/creatinina dos animais tratados com SpHL-CDDP foi similar queles encontrados para o grupo controle tratado com soluo salina. Portanto, esses achados indicam que o tratamento com SpHL-CDDP foi capaz de eliminar a

80

reduo na perfuso renal bem como na taxa de filtrao glomerular causada pela administrao de CDDP livre.

A
600

*#
500

Uria (mg/dl)

400

*#

300

200
# # #

100

Salina

SpHL

10

20

12

30

B
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Controles

CDDP livre (mg/kg)

SpHL-CDDP (mg/kg)

*#

Creatinina (mg/dl)

*#

0.0

Salina

SpHL

10

20

12

30

Controles

CDDP livre (mg/kg)

SpHL-CDDP (mg/kg)

fmeas () tratados por via IP com diferentes doses de CDDP livre ou SpHL-CDDP. * Representa diferena estatstica significativa entre o tratamento com CDDP livre e SpHL# CDDP em doses similares (5, 10, 20 e 7, 12, 30 mg/kg, respectivamente). Representa diferena estatstica significativa entre o tratamento com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

Figura 1.3 - Nveis de uria (A) e creatinina (B) de camundongos Swiss machos () e

81

Tabela 1.4 - Avaliao da alterao renal detectada no perodo inicial

ps-tratamento por via IP com CDDP livre ou SpHL-CDDP

ndice Uria/Creatinina Tratamento Salina CDDP livre (20 mg/kg) SpHL-CDDP (30 mg/kg)
a

Machos
115 27 221 35
a,b

Fmeas
118 7 261 40a,b 112 23

96 15

Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos CDDP livre e SpHL-CDDP. b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos CDDP livre ou SpHL-CDDP e o controle salina. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

Na Tabela 1.5 esto apresentados os resultados dos parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade heptica. Para camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre (5 e 10 mg/kg), nenhuma alterao clnica significativa foi observada em comparao com o grupo controle tratado com soluo salina, exceto para a quantificao de AST no grupo de camundongos machos submetidos ao tratamento com CDDP livre (10 mg/kg). Entretanto, camundongos machos e fmeas que receberam CDDP livre na dose de 20 mg/kg apresentaram nveis aumentados de AST, ALT e GGT, indicando o aparecimento de toxicidade heptica aps a administrao de altas doses de CDDP livre. Aps a injeo de SpHL-CDDP (30 mg/kg), um aumento nos nveis de ALT e AST foi observado apenas no grupo de camundongos fmeas. Alm disso, alteraes nos nveis de GGT foram detectadas aps a administrao de SpHL-CDDP nas doses de 12 e 30 mg/kg, em ambos os sexos de camundongos. Praticamente, nenhum efeito nos nveis de FA, protena total, albumina e globulina foram observados aps a administrao de ambas formulaes em todas as doses avaliadas.

82

Tabela 1.5 - Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade heptica avaliados em camundongos Swiss machos e fmeas
submetidos ao tratamento por via IP com CDDP livre ou SpHL-CDDP

Parmetros ALT (IU/L) AST (IU/L) GGT (g/dL) FA (IU/L) Protena Total (g/dL) Albumina (g/dL) Globulina (g/dL) M F M F M F M F M F M F M F

Controles Salina
60 4 70 5 194 29 193 13 4,7 0,3 4,2 0,5 108 12c 136 7 6,8 0,2c 5,1 0,3 2,3 0,1 3,1 0,1 2,9 0,2c 3,7 0,2

CDDP livre (mg/kg) SpHL

71 3 69 6 179 13 209 41 2,2 0,3 2,3 0,5 93 11 111 12 5,2 0,3 5,4 0,4 2,8 0,1 2,8 0,1 2,6 0,2 2,2 0,1

SpHL-CDDP (mg/kg) 20 7
b,c

5
60 4 62 10 247 29 212 36 4,1 0,5 4,7 0,6 127 5a 116 15 4,8 0,7c 5,4 0,1 2,3 0,1 2,3 0,3 3,1 0,1c 2,6 0,4

10
59 4 56 9 269 24a,b 243 38 4,5 0,7c 2,0 0,4a 140 12 121 11 5,5 0,3 5,6 0,1 2,5 0,1 2,6 0,2 3,1 0,1 2,9 0,2

12
64 5 75 5 166 16 185 19 4,8 0,6b 5,4 0,3b 169 11b 144 10 4,5 0,1 4,7 0,1 2,1 0,1 2,2 0,4 2,6 0,1 2,3 0,4

30
81 5c 174 29b 178 12c 408 12b 5,6 0,5b,c 3,6 0,3 57 7c 145 15 6,2 0,6 5,1 0,1 2,4 0,2 3,3 0,3 2,7 0,2 2,8 0,4

246 49

52 4 50 6 200 21 238 24 2,8 0,2 3,8 0,2 57 9 55 6b 4,2 0,3 4,3 0,5 2,1 0,3 2,1 0,1 2,3 0,2 2,0 0,2

141 29b 615 44b 470 117b 9,5 0,9b 8,5 0,5b 130 16 112 15 6,9 1,1 6,6 0,5 2,4 0,5 3,2 0,8 4,2 0,3 3,7 0,3

ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), GGT (-glutamiltransferase), FA (fosfatase alcalina), M (machos) e a F (fmeas). Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre e SpHL-CDDP em doses similares (5, b 10 e 7, 12 mg/kg, respectivamente). Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP c e seu respectivo grupo controle. Representa diferena estatstica significativa entre camundongos machos e fmeas. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

82

83

3.1.6 Avaliao Histopatolgica

Neste estudo, somente as fotomicrografias de camundongos fmeas foram apresentadas, uma vez que as mesmas alteraes histopatolgicas foram observadas em ambos os sexos de camundongos. A avaliao histopatolgica da medula ssea est representada na Figura 1.4. Como discutido acima, a administrao de CDDP livre (20 mg/kg) induziu 100% de mortalidade dos camundongos. Por essa razo, as alteraes histolgicas da medula ssea aps o tratamento com 20 mg/kg de CDDP livre tambm foram investigadas. Os cortes histolgicos do tecido hematopoitico demonstraram uma hipocelularidade caracterizada por aumento do material intercelular e diminuio dos precursores das clulas sanguneas, a qual foi mais acentuada na linhagem megacarioctica (Figura 1.4 B). Entretanto, nenhuma alterao microscpica na medula ssea foi observada para os animais tratados com 30 mg/kg de SpHL-CDDP. O perfil morfolgico da medula ssea desses animais foi semelhante ao encontrado nos animais dos grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL (Figura 1.4 D). Com relao toxicidade renal, a avaliao microscpica dos rins de camundongos submetidos ao tratamento com CDDP livre na dose de 20 mg/kg revelou severa necrose tubular aguda (Figura 1.5 B). Cortes histolgicos do parnquima renal demonstraram morte celular e degenerao das clulas tubulares com um epitlio tubular achatado, luzes tubulares dilatadas e preenchidas por um material proteinceo. Esses resultados mostraram uma correlao direta entre os altos nveis de uria e creatinina sanguneos e a presena de alterao renal. Por outro lado, no houve evidncia de disfuno renal nos animais tratados com SpHLCDDP (Figura 1.5 D). As caractersticas morfolgicas dos rins foram similares aos grupos controle (salina e SpHL) (Figura 1.5 A e C). Portanto, vale destacar que mesmo aps a administrao de uma dose alta de SpHL-CDDP (30 mg/kg), nenhuma alterao indicativa de toxicidade renal foi observada. Com relao aos tecidos heptico e esplnico, nenhuma alterao histolgica foi observada em camundongos submetidos ao tratamento com CDDP livre ou SpHLCDDP em todas as doses administradas (Figuras 1.6 e 1.7).

84

40m

40m

40m

40m

Figura 1.4 - Fotomicrografias da medula ssea de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D). As setas mostram a presena de megacaricitos no tecido hematopoitico. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

40 m

40 m

40 m

40 m

Figura 1.5 - Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss fmeas tratados com
soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D). As setas mostram a presena de material proteinceo no interior dos tbulos renais. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

85

40 m

40 m

40 m

40 m

Figura 1.6 - Fotomicrografias do fgado de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D). Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

40 m

40 m

40 m

40 m

Figura 1.7 - Fotomicrografias do bao de camundongos Swiss fmeas tratados com soluo
salina (A), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (B), SpHL (C) e SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg (D). Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

86

3.2 Discusso

A quimioterapia IP para o tratamento de carcinomatose peritoneal usando como agente antitumoral a CDDP limitada devido a sua absoro atravs da membrana peritoneal. Consequentemente, toxicidade sistmica pode ser observada, a qual se manifesta principalmente no tecido renal e o principal fator dose-limitante da terapia com CDDP, por reduzir a qualidade de vida dos pacientes e restringir os protocolos de tratamento (BOULIKAS; VOUGIOUKA, 2003; PHILLIPS et al., 2002). Sistemas nanoestruturados contendo CDDP tm sido desenvolvidos com o objetivo de aumentar a concentrao local do frmaco ou a durao da exposio do frmaco na cavidade peritoneal, dentre estes destacam-se: microesferas, nanopartculas e lipossomas (BOULIKAS, 2004; TAMURA et al., 2002 a,b; XU et al., 2006). Esta nova tentativa teraputica pode contribuir para uma diminuio ou eliminao dos efeitos txicos sistmicos. Nessa primeira parte do estudo, a toxicidade aguda de um novo carreador nanoestruturado contendo CDDP, SpHLCDDP (desenvolvido por nosso grupo de pesquisa), foi avaliada. A encapsulao da CDDP neste novo sistema de liberao para a administrao IP tem algumas vantagens potenciais. A rpida absoro da CDDP atravs da membrana peritoneal pode ser evitada, resultando, portanto, em sua reteno na cavidade peritoneal por perodos longos de tempo e seu melhor influxo nas clulas tumorais. Essa localizao de SpHL-CDDP prximo ao stio tumoral pode favorecer a liberao preferencial da CDDP nessa regio devido ao baixo pH. Uma maior concentrao de CDDP no stio tumoral pode levar a uma penetrao mais profunda dentro do tumor, melhorando, portanto, sua eficcia teraputica. Alm disso, sabe-se que a CDDP apresenta uma ao vesicante a qual pode ser contornada com o uso de lipossomas (BAIREY et al., 1997; PHILLIPS et al., 2002; SCHRIJVERS, 2003). Para desenvolver um novo agente teraputico contendo CDDP, uma srie de estudos pr-clnicos deve ser conduzida. Portanto, nesse estudo, vrios parmetros indicativos de toxicidade foram investigados, a saber: variao do peso corporal, mortalidade, perfis hematolgico e bioqumico (funes renal e heptica) e avaliao histopatolgica aps a administrao IP em camundongos Swiss machos e fmeas.

87

A administrao de CDDP livre (5 mg/kg) ou SpHL-CDDP (7 mg/kg) resultou em um perfil de perda de peso corporal semelhante. Porm, a injeo de CDDP livre em doses superiores a 10 mg/kg em camundongos machos e fmeas induziu uma resposta diferente com relao ao peso corporal quando comparado ao grupo SpHL-CDDP. A reduo do peso foi extremamente maior em camundongos fmeas que receberam 10 mg/kg de CDDP livre. Alm disso, a recuperao do peso em ambos os sexos de camundongos que receberam CDDP livre ocorreu mais tardiamente do que para o grupo que recebeu SpHL-CDDP. Os sinais de toxicidade tornaram-se mais evidentes no grupo tratado com CDDP livre a partir da dose de 10 mg/kg, uma vez que os valores de DL50 para camundongos machos e fmeas foram 16,8 e 14,9 mg/kg, respectivamente. No entanto, SpHL-CDDP provou ser capaz de reduzir a toxicidade induzida pela CDDP em camundongos machos e fmeas, visto que aumentou aproximadamente 3 vezes os valores da DL50, os quais foram estabelecidos como 45,4 e 47,5 mg/kg para machos e fmeas, respectivamente. importante ressaltar ainda que sinais clnicos como diarria, ataxia e fraqueza foram observados aps o tratamento de CDDP livre em todas doses avaliadas, enquanto que, no tratamento com SpHL-CDDP, esses sinais foram somente detectados em doses mais altas que a DL50. Os parmetros hematolgicos investigados confirmaram a maior toxicidade induzida pela CDDP livre, quando comparada administrao de doses similares de SpHLCDDP. Sabe-se que a quimioterapia com CDDP induz uma supresso hematopoitica, a qual foi confirmada, nesse estudo, mediante a depresso do nmero de hemcias, leuccitos, linfcitos e neutrfilos e da quantidade de hemoglobina e hematcrito (ASNA et al., 2005; WORKING et al., 1998). Em contraste, nenhuma alterao dos parmetros hematolgicos foi observada aps o tratamento com SpHL-CDDP (30 mg/kg), indicando ausncia de mielotoxicidade. A anlise histopatolgica da medula ssea tambm demonstrou reduo dos precursores celulares sanguneos nos animais tratados com CDDP livre, entretanto, nenhuma alterao notvel foi observada aps o tratamento com SpHL-CDDP. No que diz respeito toxicidade renal, bem documentado na literatura que a CDDP induz leses tbulo-intersticiais, danificando os tbulos proximais, especificamente o segmento S3 da regio medular alm de provocar alteraes

88

mitocondriais nos nfrons distais (YAO et al., 2007). No presente estudo, foram observadas diferenas significativas no tecido renal de camundongos submetidos ao tratamento com CDDP livre em comparao com aqueles tratados com SpHLCDDP. Os animais tratados com CDDP livre apresentaram um comprometimento histolgico caracterstico de necrose tubular aguda, enquanto o perfil histopatolgico dos camundongos tratados com SpHL-CDDP foi semelhante aos grupos controle tratados com SpHL ou salina. Alguns estudos relatam que, o comprometimento renal tambm pode ser expresso em funo do aumento dos nveis plasmticos de uria e creatinina. Entretanto, nas fases inicial de injria renal, pode ocorrer um aumento da secreo de creatinina, consequentemente, evitando um aumento dos nveis plasmticos da mesma (ASNA et al., 2005). Assim, nessa fase inicial, comum expressar o dano renal pelo ndice uria/creatinina, uma vez que valor elevado desse ndice reflete a reduo da perfuso renal bem como da taxa de filtrao glomerular, como foi observado aps a administrao de CDDP livre. Contudo, o uso de SpHL-CDDP demonstrou claramente prevenir a toxicidade renal como foi evidenciado pela reduo do ndice uria/creatinina. importante enfatizar que embora sejam observadas alteraes nos nveis plasmticos de uria e creatinina aps o tratamento com uma dose alta de SpHL-CDDP (30 mg/kg), essas no comprometeram a sobrevida dos animais diferentemente do observado aps a administrao de CDDP livre na dose de 20 mg/kg. Provavelmente, a reduo das alteraes renais observadas aps o tratamento com SpHL-CDDP foi devido capacidade dos lipossomas de modificar o perfil de distribuio do frmaco encapsulado. Estudos de biodistribuio realizado em camundongos portadores de tumor asctico de Ehrlich aps injeo IP de CDDP livre e SpHL-CDDP, demonstraram um maior coeficiente de partio tecido renal/sangue aps o tratamento com CDDP livre (3,8) em comparao com o tratamento com SpHLCDDP (1,8) (ARAJO et al., 2008). Esses resultados indicam o maior extravasamento da CDDP livre para o tecido renal, o que pode induzir severa nefrotoxicidade. Diante do exposto, os resultados demonstraram importantes diferenas no espectro de toxicidade IP dos SpHL-CDDP quando comparados com a CDDP livre, revelando os efeitos benficos desses lipossomas como carreadores da CDDP. Esse perfil favorvel de toxicidade indica seu potencial para estudos clnicos futuros.

89

PARTE 2
AVALIAO DA TOXICIDADE AGUDA DE SpHL-CDDP ADMINISTRADOS POR VIA INTRAVENOSA

90

3.1 Resultados

3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP

A porcentagem de encapsulao da CDDP nos SpHL-CDDP foi de 23,4 5,5. O dimetro mdio e o ndice de polidisperso das vesculas de SpHL-CDDP foi igual a 140,4 9,2 nm e 0,087 0,009, respectivamente. SpHL-CDDP exibiram valores de potencial zeta prximo da neutralidade (0,9 1,3 mV). SpHL apresentaram valores de dimetro mdio e ndice de polidisperso iguais a 145 nm e 0,051, respectivamente. O potencial zeta tambm apresentou valores prximos da neutralidade.

3.1.2 Avaliao do peso dos animais

A Figura 1.8 apresenta os resultados de variao do peso dos camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre ou SpHL-CDDP ao longo dos 14 dias experimentais. Foi observado um ganho no peso corporal dos camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre na dose de 5 mg/kg durante todo o perodo experimental, exceto nos dois primeiros dias no grupo de camundongos fmeas, no qual uma pequena perda (3%) de peso foi detectada (Figura 1.8 A e C). Aps o tratamento com 7,5 mg/kg de CDDP, uma perda de peso corporal no perodo inicial da avaliao tambm foi detectada no grupo de camundongos machos, porm a perda mxima observada foi igual a 6% e a recuperao do peso corporal ocorreu a partir do sexto dia experimental. Os camundongos fmeas tratados com CDDP livre na dose de 7,5 mg/kg apresentaram uma perda de peso corporal durante os 14 dias de monitoramento e a reduo mxima obtida foi igual a 14% (sexto e oitavo dias ps-tratamento). A administrao de CDDP livre na dose de 10 mg/kg tambm induziu uma perda de peso corporal at o quarto dia pstratamento em ambos os sexos de camundongos (Figura 1.8 A e C). Pronunciados sinais de toxicidade relacionados com a alterao do peso foram observados em

91

camundongos fmeas e machos tratados com CDDP livre nas doses de 15 e 20 mg/kg, respectivamente. O grupo de camundongos fmeas apresentou uma grande perda de peso corporal no perodo inicial de observao e todos os animais morreram at o stimo dia ps-tratamento. No grupo de camundongos machos, uma taxa de mortalidade expressiva (40%) foi observada at o quinto dia experimental (Figura 1.9). Os animais sobreviventes mostraram uma recuperao do peso corporal a partir do dcimo dia ps-administrao de CDDP livre. Por outro lado, o tratamento de camundongos machos e fmeas com 20 mg/kg de SpHLCDDP induziu uma perda de peso corporal at o quarto dia de observao (Figura 1.8 B e D) e nenhuma morte foi observada em ambos os sexos (Figura 1.9). Para os animais submetidos administrao de SpHL-CDDP na dose de 25 mg/kg, tambm foi detectada uma reduo no peso corporal no perodo inicial de monitoramento e a recuperao ocorreu a partir do sexto dia. O aumento da dose administrada para 30 mg/kg levou a uma perda de peso pronunciada em camundongos fmeas e, somente um animal sobreviveu mantendo o peso corporal reduzido ao longo do perodo experimental. A administrao de 35 mg/kg de SpHLCDDP em camundongos machos tambm induziu uma perda de peso expressiva observada at o quarto dia ps-tratamento. Com relao aos grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL, tanto camundongos machos quanto fmeas, apresentaram um ganho de peso ao longo de todo o perodo experimental.

92

A
30

Machos

C
30

Fmeas

Peso corpreo (% variao)

10 0 -10 -20 -30

Peso corpreo (% variao)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

20

20 10 0 -10 -20 -30

10

12

14

16

Tempo (dias)

Tempo (dias)

B
30

D
30

Peso Corpreo (% variao)

20 10 0 -10 -20 -30

Peso corpreo (% variao)

20 10 0 -10 -20 -30

10

12

14

16

10

12

14

16

Tempo (dias)

Tempo (dias)

Figura 1.8 - Variao do peso corporal de camundongos Swiss machos (A e B) e

fmeas (C e D) monitorado durante 14 dias aps a administrao IV de CDDP livre (5 mg/kg, ; 7,5 mg/kg, ; 10 mg/kg, ; 15 mg/kg,; 20 mg/kg, ), SpHL-CDDP (20 mg/kg, ; 25 mg/kg, ; 30 mg/kg, ; 35 mg/kg, ), salina () e SpHL (*). Os dados foram apresentados como a mdia erro padro da mdia.

3.1.3 Mortalidade e Sinais Clnicos

Os resultados de sobrevida de camundongos machos e fmeas submetidos ao tratamento com CDDP livre, SpHL-CDDP assim como os grupos controle esto apresentados na Figura 1.9. Aps administrao de doses baixas de CDDP livre (5 e 7,5 mg/kg), nenhuma morte foi observada em ambos os sexos de camundongos. O tratamento com 10 e 15 mg/kg de CDDP livre induziu somente 20% de mortes em

93

camundongos machos, enquanto em camundongos fmeas a taxa de mortalidade obtida foi de 40% e 100%, respectivamente. O aumento da dose administrada para 20 e 25 mg/kg em camundongos machos levou a uma taxa de mortalidade de 40% e 100%, respectivamente. Por outro lado, nenhuma morte foi observada aps o tratamento com SpHL-CDDP na dose de 20 mg/kg em ambos os sexos. A injeo de 25 e 35 mg/kg de SpHLCDDP, induziu uma alta taxa de mortalidade (60%) dos camundongos machos. O aumento da dose administrada de SpHL-CDDP para 40 mg/kg conduziu morte de todos os camundongos machos. Um alto nvel de mortalidade tambm foi observado em camundongos fmeas que receberam SpHL-CDDP na dose de 25 mg/kg (60%) e 30 mg/kg (80%), e 100% de morte foi obtido aps o tratamento com 35 mg/kg de SpHL-CDDP. Sinais clnicos de toxicidade como diarria, ataxia, piloereo e fraqueza foram observados nos camundongos tratados com CDDP livre, enquanto nos animais submetidos ao tratamento com SpHL-CDDP esses efeitos foram apenas detectados aps a administrao de doses altas (35 e 40 mg/kg). Alm disso, nos animais que receberam CDDP livre em doses superiores a 7,5 mg/kg, foi detectada uma severa reao na pele seguida de necrose no local da administrao. Esse mesmo efeito no foi observado em nenhum grupo tratado com SpHL-CDDP. Nenhum sinal clnico aparente de toxicidade e nenhuma morte foram verificados nos grupos controle tratados com salina ou SpHL. Os valores de DL50 e DMT obtidos para camundongos machos e fmeas tratados por via IV com CDDP livre ou SpHL-CDDP esto apresentados na Tabela 1.6. Os resultados demonstraram que SpHL-CDDP foi capaz de aumentar 1,7 e 2,4 vezes a DL50 em camundongos machos e fmeas, respectivamente. Por outro lado, a DMT estabelecida aps o tratamento com SpHL-CDDP foi cerca de 3 vezes superior quela estabelecida com a administrao de CDDP livre, indicando que a encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP foi capaz de reduzir sua toxicidade sistmica.

94

A
120

Taxa de Sobrevida (%)

100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tempo (dias)

B
120

Taxa de Sobrevida (%)

100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tempo (dias)

Figura 1.9 - Taxa de sobrevida de camundongos Swiss machos (A) e fmeas (B) tratados com CDDP livre (5 mg/kg, ; 7,5 mg/kg, ; 10 mg/kg, ; 15 mg/kg,; 20 mg/kg, ; 25 mg/kg, ), SpHL-CDDP (20 mg/kg, ; 25 mg/kg, ; 30 mg/kg, ; 35 mg/kg, ; 40 mg/kg, ), salina () e SpHL (|) (a dose de lpide foi equivalente quela administrada no
tratamento com SpHL-CDDP na dose 40 mg/kg).

95

Tabela 1.6 - DL50 e DMT estabelecidas aps tratamento IV com CDDP livre ou
SpHL-CDDP em camundongos Swiss

Sexo

Tratamento CDDP livre SpHL-CDDP CDDP livre SpHL-CDDP

DL50 (mg/kg)
15,9 27,5 10,8 25,9

95% ICa
13,0 - 19,4 23,7 - 31,8 9,5 - 12,4 23,1 - 29,1

DL50 SpHLCDDP / DL50 CDDP livre

1,7

DMT (mg/kg)
7,5 20 7,5 20

Machos Fmeas
a

2,4

IC representa o intervalo de confiana de 95% obtido nos grupos tratados com CDDP livre ou SpHL-CDDP.

3.1.4 Avaliao Hematolgica

Os parmetros hematolgicos dos camundongos machos e fmeas submetidos ao tratamento IV com CDDP livre ou SpHL-CDDP esto sumarizados nas Tabelas 1.7 e 1.8. Para esses parmetros tambm foi investigado o efeito da interao sexo e tratamento. Os resultados demonstraram a influncia direta desse efeito de interao apenas para a quantificao de hemoglobina, contagem de linfcitos e plaquetas (Tabela 1.8) enquanto os demais parmetros no sofreram influncia desse efeito (Tabela 1.7). Uma reduo significativa nos nveis de hemcias e no hematcrito foi detectada aps a administrao de CDDP livre nas doses de 7,5 e 10 mg/kg. Nenhuma alterao na contagem de leuccitos, neutrfilos e moncitos foi observada aps a administrao de CDDP livre nessas mesmas doses. Como mencionado anteriormente, uma taxa de mortalidade de 100% foi obtida no grupo de camundongos fmeas e 20% no grupo de camundongos machos tratados com CDDP livre na dose de 15 mg/kg. No entanto, para os machos que sobreviveram no foi detectada alterao significativa nos parmetros hematolgicos avaliados. O tratamento com CDDP livre (20 mg/kg) reduziu significativamente o hematcrito, a contagem de leuccitos e neutrfilos em relao ao grupo controle tratado com soluo salina (P < 0,05). A quantificao do hematcrito tambm foi

96

significativamente reduzida, aps o tratamento com 20 mg/kg (fmeas e machos) e 25 mg/kg (fmeas) de SpHL-CDDP em comparao com o grupo tratado com SpHL. Por outro lado, o tratamento com SpHL-CDDP no afetou a contagem de leuccitos, neutrfilos e moncitos em nenhuma das doses administradas (Tabela 1.7). Praticamente nenhuma alterao nos nveis de hemoglobina foi detectada aps a administrao de CDDP em todas as doses avaliadas. Uma reduo nos nveis de linfcito foi detectada aps a administrao de CDDP livre na dose de 20 mg/kg (Tabela 1.8). Esses achados correlacionados com a diminuio de leuccitos e neutrfilos demonstram uma acentuada reduo nas clulas de defesa do organismo o que poderia contribuir para a alta mortalidade obtida nesse grupo experimental (Figura 1.9). Por outro lado, esse sinal de toxicidade no apareceu em camundongos que receberam SpHL-CDDP. Com relao contagem de plaquetas, uma plaquetopenia foi detectada nos camundongos machos tratados com CDDP livre na dose de 10 mg/kg e em camundongos fmeas tratados com 25 mg/kg de SpHL-CDDP. Uma anlise comparativa entre CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg), doses correspondentes dose mxima tolerada em ambos os grupos, demonstrou que as alteraes nos nveis de hemcias, hemoglobina e linfcitos decorrentes da administrao com SpHL-CDDP apresentaram diferenas significativas em relao quelas tratadas com CDDP livre. Alm disso, vale ressaltar que no foram observadas diferenas entre parmetros hematolgicos dos grupos controle tratados com salina ou SpHL.

97

Tabela 1.7- Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas avaliados quatorze dias aps o tratamento por via IV com
CDDP ou SpHL-CDDP*

Controles Parmetros Hemcias (106/mm3) M F G Salina

8,3 0,1 8,2 0,1 8,2 0,1

CDDP livre (mg/kg) 5,0

8,4 0,4 8,6 0,4 8,5 0,3 45,3 2,0 46,6 0,4 46,0 0,8 5,4 0,8 4,8 0,6 5,1 0,7 2,0 0,4 1,6 0,4 1,8 0,3

SpHL-CDDP (mg/kg) 15 20
6,6 1,1 N.D.

SpHL
8,3 0,1 8,4 0,2 8,3 0,2 41,6 1,0 44,1 1,8 42,6 1,0 6,5 0,8 4,1 0,6 5,5 0,8 2,6 0,3 1,5 0,2 2,2 0,3

7,5
7,4 0,4 7,1 0,2 7,2 0,2
a

10
7,4 0,2 7,3 0,3 7,4 0,2
a

20
7,8 0,2 7,6 0,2 7,7 0,1
b

25
N.D. 8,0 0,1

35
7,3 0,2 N.D.

7,8 0,4 N.D.

Hematcrito M 44,3 1,1 (%) F 42,9 0,4 G 43,8 0,5 Leuccito (103/mm3) Neutrfilo (103/mm3) Moncito (103/mm3)
*

37,4 1,7 35,9 1,2 36,6 1,0 4,8 0,4 5,4 0,7 5,2 0,6 2,3 0,2 2,5 0,6 2,4 0,3
a

39,4 1,2 38,5 2,1 39,0 1,0 5,5 0,6 4,7 0,9 5,1 0,7 2,2 0,3 1,4 0,4 1,8 0,3
a

40,8 2,0 N.D.

33,3 2,5a N.D.

39,7 1,0 38,3 0,9

a

N.D.
a

37,9 0,1 N.D.

36,5 1,1 39,0 0,4

M F G M F G

5,6 0,4 5,8 0,5 5,8 0,4 2,2 0,3 2,0 0,2 2,1 0,2

5,2 0,6 N.D.

2,7 0,2a N.D.

6,3 0,8 5,8 0,7 6,1 0,5

N.D. 5,4 1,1

4,1 0,1 N.D.

1,8 0,3 N.D.

0,8 0,02a N.D.

1,5 0,3 3,3 0,3 2,3 0,4 0,08 0,02 0,10 0,02

N.D. 2,7 0,6

1,7 0,1 N.D.

M 0,12 0,04 0,13 0,03 F 0,07 0,01 0,10 0,01 G 0,09 0,02 0,10 0,02

0,11 0,04 0,07 0,01 0,14 0,05 0,08 0,02 0,13 0,03 0,07 0,01

0,16 0,01 0,18 0,08 0,06 0,001 0,09 0,04 0,13 0,02 N.D. N.D.

N.D.

0,10 0,06 N.D.

0,14 0,03 0,05 0,01

Esses parmetros no foram influenciados pelo efeito de interao sexo e tratamento. M (machos), F (fmeas) e G (mdia do grupo). Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg). N.D. significa no determinado. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.
a

97

98

Tabela 1.8 - Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss machos e fmeas avaliados quatorze dias aps o tratamento por via IV com
CDDP ou SpHL-CDDP*

Controles Parmetros Salina SpHL

12,6 0,2 13,4 0,5 3,7 0,6 2,4 0,4 638 54c 427 26

CDDP livre (mg/kg) 5,0

13,4 0,6 13,0 0,5 3,3 0,5 3,0 0,4 768 84a 807 48

SpHL-CDDP (mg/kg) 15 20
10,4 1,5 N.D. 1,8 01a N.D. 483 51 N.D.

7,5
11,2 0,5 11,4 0,3 2,3 0,3 3,6 0,6 652 21 732 32

10
11,2 0,4 12,4 0,6 3,1 0,4 3,9 1,0 268 30c 503 38

20
12,9 0,3b,c 11,3 0,2
a

25
N.D. 11,2 0,3 N.D. 2,5 0,2 N.D. 396 32
a a

35
10,8 0,1 N.D. 2,2 0,2 N.D. 699 140 N.D.

Hemoglobina M 12,8 0,1 (g/dl) F 13,1 0,3 Linfcito (103/mm3) Plaquetas (103/mm3)
*

11,3 0,4 N.D. 3,2 0,3 N.D. 757 122 N.D.

M 3,4 0,3 F 3,7 0,4 M 460 28 F 484 25

4,8 0,6b,c 2,1 0,3 716 53 677 31

Esses parmetros no foram influenciados pelo efeito de interao sexo e tratamento. a Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg). c Representa diferena significativa entre grupos de camundongos M (machos) e F (fmeas). N.D. significa no determinado. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

98

99

3.1.5 Anlise Bioqumica

As alteraes nos parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade renal avaliados 14 dias aps o tratamento com CDDP livre ou SpHL-CDDP esto apresentadas na
Tabela 1.9. O tratamento com CDDP livre na dose de 5 mg/kg no induziu

alteraes significativas nos nveis plasmticos de uria e creatinina em ambos os sexos de camundongos, em comparao com o grupo controle tratado com soluo salina. Para camundongos machos e fmeas submetidos administrao de CDDP livre na dose de 7,5 mg/kg, um aumento significativo nos nveis de uria (P < 0,05) foi observado. O aumento da dose administrada para 10 mg/kg e 20 mg/kg em fmeas e machos, respectivamente, induziu elevaes significativas nos nveis plasmticos de uria em comparao com o grupo controle tratado com soluo salina. Nenhuma alterao significativa nos nveis de creatinina foi observada aps a administrao de CDDP livre nas diferentes doses. Entretanto, nos estgios iniciais de comprometimento renal, um mecanismo compensatrio de secreo pode ser ativado e parte da creatinina pode ento ser secretada, mantendo seus nveis plasmticos dentro dos limites de normalidade. Nessas situaes, a avaliao do ndice uria/creatinina pode ser um indicativo de toxicidade renal em estgio inicial. Portanto, alteraes significativas no ndice uria/creatinina aps a administrao de CDDP livre (7,5 e 10 mg/kg) foram observadas em fmeas, enquanto para os machos, aumentos expressivos somente foram notados aps a administrao de 15 e 20 mg/kg de CDDP livre. Em relao ao tratamento com SpHL-CDDP praticamente nenhuma alterao significativa nos nveis de uria e creatinina foram observados aps a administrao das diferentes doses, exceto no grupo de animais machos tratados com SpHL-CDDP na dose de 20 mg/kg, no qual uma reduo nos nveis de uria e creatinina foi observada, em comparao com o grupo controle tratado com SpHL. Aumento do ndice uria/creatinina foi apenas observado aps a administrao de uma dose alta de SpHL-CDDP (35 mg/kg) em camundongos machos. Alm disso, uma anlise comparativa dos dois tratamentos considerando a DMT de ambos, demonstrou que a administrao de SpHL-CDDP reduziu significativamente a toxicidade renal induzida pela CDDP livre em camundongos machos como observado pelos nveis de uria e creatinina. No grupo de camundongos fmeas, diferenas significativas foram detectadas nos nveis de

100

uria e no ndice uria/creatinina dos animais tratados com SpHL-CDDP em relao CDDP livre (Tabela 1.9).

101

Tabela 1.9 - Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade renal avaliados em camundongos machos e fmeas quatorze dias aps a
administrao por via IV de CDDP livre ou SpHL-CDDP

Parmetros Uria M (mg/dL) F Creatinina (mg/dL)

Controles Salina SpHL 51 3 75 1a 54 4 66 6

5 38 1c 50 2

CDDP livre (mg/kg) 7,5 10 15 a,c c 89 8 72 1 65 5 a a 119 15 147 78 N.D.

N.D. 157 19a N.D.

20 83 10a N.D.
N.D. 172 39a N.D.

SpHL-CDDP (mg/kg) 20 25 35 a,b 54 5 N.D. 67 12 b 42 4 58 1 N.D.

0,39 0,04a,b 0,59 0,09 140 10c 87 10b N.D. 0,57 0,07 N.D. 105 21 0,30 0,02 N.D. 228 55a N.D.

M 0,70 0,05 0,94 0,05c F 0,61 0,05 0,49 0,01

70 4 91 11 85 4c 116 2

0,45 0,02 1,14 0,23c 0,87 0,03 0,43 0,06 0,44 0,03 0,42 0,05 0,62 0,12 0,71 0,21 87 5c 132 25 96 27c 212 32a 83 4c 197 24a

ndice Uria/ M creatinina F

a

Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg). c Representa diferena estatstica significativa entre M (machos) e F (fmeas). N.D. significa no determinado. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

101

102

Diante desses resultados pode-se inferir que uma das possveis razes de morte dos camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre na dose de 20 e 15 mg/kg, respectivamente, e dos animais tratados com SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg (Figura 1.9) seja a nefrotoxidade induzida pelo frmaco. Portanto, para confirmar essa hiptese, os parmetros indicativos de toxicidade renal tambm foram investigados trs dias aps o tratamento com CDDP livre (doses de 15 e 20 mg/kg para camundongos fmeas e machos, respectivamente) e SpHL-CDDP (doses de 25 e 35 mg/kg para camundongos fmeas e machos, respectivamente). Esse dia foi determinado a partir da observao de que nenhum animal morreu at o terceiro dia ps-tratamento, como pode ser verificado na Figura 1.9, com exceo dos camundongos machos tratados com 35 mg/kg de SpHL-CDDP. Os resultados demonstraram um aumento significativo nos nveis de uria e creatinina (P < 0,05) dos camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre ou SpHL-CDDP em comparao com seus respectivos grupos controle (Figura 1.10 A). Vale ressaltar que a dose de SpHL-CDDP administrada tanto em camundongos machos quanto em camundongos fmeas foi aproximadamente 1,7 vezes maior que a dose de CDDP livre administrada. No entanto, mesmo aps a administrao de SpHL-CDDP em doses superiores, as alteraes observadas nos nveis de uria (machos e fmeas) e creatinina (machos) no apresentaram diferena significativa (P > 0,05) em relao administrao de CDDP livre. Por outro lado, as alteraes nos nveis de creatinina detectadas no grupo de camundongos fmeas tratados com SpHLCDDP foram significativamente menores (P < 0,05) que aquelas induzidas pelo frmaco livre. Com relao ao ndice uria/creatinina, nenhuma alterao foi observada em camundongos machos e fmeas tratados com CDDP livre em relao ao grupo controle. Entretanto, a administrao de SpHL-CDDP em uma dose 1,7 vezes maior que aquela de CDDP livre provocou um aumento no ndice uria/creatinina (Figura 1.10 C). Esse conjunto de resultados sugere o aparecimento de um comprometimento renal tanto nos animais tratados com CDDP quanto naqueles tratados com SpHL-CDDP, porm nesses a toxicidade renal encontra-se em uma fase inicial. Nenhuma diferena significativa foi observada nos nveis de uria, creatinina e no ndice uria/creatinina entre os grupos controle tratados com salina e SpHL (P > 0,05).

103

500
a

400 Uria (mg/dl) 300 200 100 0

a a

B
Creatinina (mg/dL)

2.5 2.0
a a a

1.5 1.0 0.5 0.0

a,b

C
ndice Uria/creatinina

400
a,b a,b

300

200

100

Machos

Fmeas

camundongos Swiss machos e fmeas avaliados trs dias aps o tratamento por via IV com CDDP livre ( ) nas doses de 20 e 15 mg/kg para machos e fmeas, respectivamente; SpHLCDDP () nas doses de 35 e 25 mg/kg para machos e fmeas, respectivamente; salina ( ) e a SpHL (g). Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre b ou SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre e SpHL-CDDP. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

Figura 1.10 - Nveis plasmticos de uria (A), creatinina (B) e ndice uria/creatinina (C) de

104

As alteraes dos parmetros bioqumicos relacionados com hepatotoxicidade esto apresentadas na Tabela 1.10. O tratamento com CDDP livre na dose de 5 mg/kg causou uma alterao nos nveis de AST de camundongos machos em comparao com o grupo controle tratado com soluo salina. A administrao de 7,5 mg/kg de CDDP em camundongos machos tambm induziu significativo aumento na concentrao srica de AST, FA, protena total e globulina, porm nenhuma alterao na relao albumina/globulina foi detectada quando comparada com o grupo tratado com soluo salina. Em camundongos fmeas, o tratamento com CDDP livre nas doses de 5 e 10 mg/kg causou uma reduo significativa nos nveis sricos de globulina, o que desencadeou uma reduo nos nveis de protena total. Com relao GGT, um dos marcadores mais especficos de dano heptico, as alteraes foram apenas observadas aps a administrao de CDDP livre na dose mais alta (20 mg/kg) em camundongos machos. Por outro lado, o tratamento de camundongos machos com SpHL-CDDP nas doses de 20 e 35 mg/kg induziu uma reduo significativa na concentrao de globulina acompanhado de uma diminuio de protena total em relao ao controle tratado com SpHL. Porm, quando os nveis de protena total e globulina desses grupos experimentais foram avaliados em relao ao grupo controle tratado com soluo salina, nenhuma alterao foi detectada. Possivelmente, esta diferena observada entre os grupos controle seja devido alta dose de lpides administrada, dose equivalente quela administrada no tratamento com SpHL-CDDP a 40 mg/kg. Alm disso, a administrao de SpHL-CDDP (20 mg/kg) apresentou nveis de AST, FA, protena total e globulina em camundongos machos significativamente menores do que os observados com o tratamento com CDDP livre (7,5 mg/kg). Para os camundongos fmeas, menores concentraes de protena total e fraes tambm foram observadas entre o grupo de animais tratados com CDDP livre (7,5 mg/kg) e o grupo tratado com SpHL-CDDP (20 mg/kg).

105

Tabela 1.10 - Parmetros bioqumicos indicativos de toxicidade heptica avaliados em camundongos Swiss machos e fmeas
submetidos ao tratamento por via IV com CDDP livre ou SpHL-CDDP

Controles Parmetros ALT (IU/L) AST (IU/L) FA (IU/L) M F Salina

58 4 82 16

CDDP livre (mg/kg) 5

132 11 124 29

SpHL-CDDP (mg/kg) 20
46 9 N.D. 188 54 N.D. 185 5 N.D. 4,3 0,4 N.D. 1,9 0,2 N.D. 2,5 0,3 N.D.

SpHL
74 7 80 7 205 15 170 12 185 19 134 20 6,7 0,1d 5,4 0,2 2,6 0,1 2,3 0,2 4,0 0,1c,d 3,0 0,1 2,1 0,5 1,8 0,4

7,5
96 31 72 13

10
65 6 40 3 236 80 223 82 158 6 134 9 4,9 0,1 4,3 0,3a 2,1 0,1 2,2 0,1

15
123 10 N.D. 166 15 N.D. 158 20 N.D. 4,7 0,1 N.D. 2,1 0,1 N.D. 2,5 0,2 N.D.

20
37 3 59 17 151 4a,b 165 29 103 17b 100 19

25
N.D. 68 4 N.D. 180 32 N.D. 89 12

35
109 7 N.D. 179 20 N.D. 189 52 N.D.

M 102 8 F 104 20 M F
121 13 109 21

218 12a 281 40a,c 214 14 199 10 138 5 197 19a 181 16 148 27 4,4 0,1 8,0 0,8a 4,7 0,2a 7,0 0,3a 2,2 0,1 2,3 0,2 3,4 0,5 3,1 0,3

Protena total M 4,9 0,1 (103/mm3) F 5,9 0,2 Albumina (g/dL) Globulina (g/dL) GGT (g/dL) M F
2,2 0,1 2,9 0,1

4,5 0,2a,b N.D. 4,6 0,2a 4,8 0,4b 4,1 0,1a N.D. 2,3 0,1 1,8 0,1b 2,3 0,2a,b 3,0 0,2b 3,0 0,4 1,8 0,4 N.D. 2,2 0,2 N.D. 2,2 0,1 3,0 0,4 N.D. 2,6 0,2a N.D.

M 2,7 0,1 F 3,3 0,1 M F

2,0 0,3 2,3 0,6

2,2 0,2 4,6 0,4a,c 2,9 0,1 2,4 0,1a 3,9 0,1 2,1 0,2a 2,8 0,4 2,6 0,5 1,6 0,3 2,2 0,5 3,3 0,3 4,0 0,6

2,5 0,7 3,4 0,6a N.D. N.D.

N.D. 2,5 0,5 2,5 1,5 N.D.

ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), FA (fosfatase alcalina), GGT (gama glutamiltransferase). a Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre, SpHL-CDDP e seu respectivo grupo controle. b Representa diferena estatstica significativa entre os tratamentos com CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg). c Representa diferena estatstica significativa entre M (machos) e F (fmeas). d Representa diferena estatstica significativa entre o grupo tratado com salina e o grupo tratado com SpHL. N.D. significa no determinado. O nvel de significncia foi considerado para valores de P < 0,05 (teste de Tukey). Os dados foram expressos como a mdia erro padro da mdia.

105

106

3.1.6 Avaliao Histopatolgica

Nesse estudo, apenas os cortes histolgicos do grupo controle tratado com soluo salina foram representados uma vez que os resultados foram semelhantes queles obtidos para o grupo controle tratado com SpHL. Os cortes histolgicos de tecido sseo dos camundongos tratados com diferentes doses de CDDP livre e SpHLCDDP esto apresentadas na Figura 1.11. A anlise microscpica da medula ssea de camundongos machos, realizada quatorze dias aps o tratamento com 20 mg/kg de CDDP livre, demonstrou uma pronunciada hipocelularidade com supresso predominante dos precursores eritrocticos e mielocticos (Figura 1.11 C). Para o grupo de camundongos fmeas tratados com CDDP livre na dose de 10 mg/kg, nenhuma alterao morfolgica da medula ssea foi observada (Figura 1.11 E). O tratamento com as diferentes doses de SpHL-CDDP no induziu alteraes morfolgicas da medula ssea (Figura 1.11 D e F). O perfil morfolgico da medula ssea desses animais foi semelhante aos animais dos grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL.

107

40m

40m

40m

40m

40m

40m

Figura 1.11 - Fotomicrografias do tecido hematopoitico de camundongos Swiss machos (A, C e E) e fmeas (B, D e F) tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre (C e D) e SpHLCDDP (E e F). C e D representam cortes histolgicos realizados quatorze dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 10 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente. E e F mostram cortes histolgicos realizados quatorze dias aps o tratamento com SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

108

Com relao toxicidade renal, os camundongos machos tratados com 20 mg/kg de CDDP livre mostraram clara evidncia de insuficincia renal com reas de necrose coagulativa do epitlio tubular, o qual mostrou-se achatado, parcialmente descamado e com a luz tubular preenchida por material proteinceo rseo (Figura 1.12 C). Por outro lado, nenhuma evidncia de disfuno renal foi observada em camundongos machos tratados com SpHL-CDDP (20 mg/kg), sendo o perfil morfolgico semelhante ao grupo controle. Para os animais tratados com SpHL-CDDP (35 mg/kg) que sobreviveram at quatorze dias aps o tratamento, tambm no foi observada alterao histollogica do tecido renal (Figura 1.12 E). No caso de camundongos fmeas, nenhuma alterao morfolgica do tecido renal foi observada quatorze dias aps o tratamento com CDDP livre na dose de 10 mg/kg e SpHL-CDDP na dose de 25 mg/kg (Figura 1.12 D e F). Por outro lado, a avaliao histolgica do tecido renal dos camundongos sacrificados trs dias aps o tratamento com CDDP livre (20 mg/kg em machos e 10 mg/kg em fmeas) demonstrou um perfil caracterstico de necrose tubular aguda (Figuras 1.13 A e 1.13 B). Da mesma forma, o exame microscpico dos rins de camundongos machos sacrificados trs dias aps o tratamento com 35 mg/kg de SpHL-CDDP revelou o aparecimento de moderadas reas de necrose tubular (Figuras 1.13 C). Os cortes histolgicos do tecido renal de camundongos fmeas submetidos ao tratamento com SpHL-CDDP na dose de 25 mg/kg tambm demonstraram alteraes morfolgicas indicativas de toxicidade renal. Esses resultados explicam a alta taxa de mortalidade dos animais obtidas nesses grupos experimentais. Vale destacar que o perfil morfolgico do tecido renal foi semelhante entre os grupos controle tratados com soluo salina ou SpHL. Esses resultados da avaliao histolgica corroboram a inexistncia de toxicidade renal induzida aps o tratamento dos camundongos com a soluo salina ou com SpHL.

109

40m

40m

40m

40m

40m

40m

Figura 1.12 Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss machos (A, C e E) e fmeas (B, D e F) tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre (C e D) e SpHL-CDDP (E e F). Os animais foram sacrificados quatorze dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 10 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente e SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente. A, B, D, E e F apresentam cortes de tecido renal dentro dos limites de normalidade. Em C, extensas reas de necrose podem ser observadas. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

110

40m

40m

40m

40m

fmeas (B e D) tratados com soluo CDDP livre (A e B) e SpHL-CDDP (C e D). Os animais foram sacrificados trs dias aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 15 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente e SpHL-CDDP nas doses de 35 e 25 mg/kg em machos e fmeas, respectivamente. Em A pode-se observar extensas reas de necrose (setas pretas), comprometendo praticamente todo parnquima renal. Em B, C e D, reas de necrose (setas pretas) menos intensas e algumas clulas inflamatrias tambm podem ser visualizadas. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

Figura 1.13 - Fotomicrografias do tecido renal de camundongos Swiss machos (A e C) e

111

Nenhuma alterao histopatolgica do fgado e bao foi observada em camundongos machos e fmeas submetidos ao tratamento com CDDP livre ou SpHL-CDDP em todas as doses administradas. Os cortes histolgicos em diferentes nveis do parnquima heptico e esplnico mostraram-se dentro dos limites de normalidade, com a arquitetura dos rgos preservada (Figura 1.14).

40m

40m

40m

40m

40m

40m

Figura 1.14 - Fotomicrografias do tecido heptico (A, C e E) e esplnico (B, D e F) de camundongos Swiss machos tratados com soluo salina (A e B), CDDP livre na dose de 20 mg/kg (C e D) e SpHL-CDDP na dose de 35 mg/kg (E e F). Os animais foram sacrificados quatorze dias aps o tratamento. Nenhuma alterao morfolgica foi observada nos tecidos heptico e esplnico. Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x100.

112

3.2 Discusso

Vrios estudos tm demonstrado que os lipossomas so sistemas de liberao de frmacos capazes de modificar a distribuio tecidual, o metabolismo e a eliminao in vivo de determinados antineoplsicos em relao administrao do frmaco livre (HARRINGTON et al., 2001; FERRARI, 2005). Uma formulao lipossomal contendo um antineoplsico projetada com o objetivo de reduzir sua toxicidade e manter ou aumentar sua atividade antitumoral (BOULIKAS, 2007). Estudos prvios realizados por nosso grupo de pesquisa demonstraram uma menor perfuso da CDDP para o tecido renal aps a administrao IV de SpHL-CDDP em relao CDDP livre, sugerindo que o uso de SpHL-CDDP como sistema de liberao da CDDP poderia reduzir a toxicidade induzida pelo frmaco (CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Portanto, nessa etapa do trabalho foi realizado o estudo da toxicidade aguda de SpHL-CDDP administrado por via IV em camundongos Swiss machos e fmeas. Os parmetros avaliados no estudo de toxicidade aguda por via IV incluram variao do peso corporal, mortalidade, avaliao hematolgica, bioqumica e histopatolgica. A administrao das doses mais baixas de CDDP livre (5 e 7,5 mg/kg) e SpHLCDDP (20 mg/kg) induziu uma resposta semelhante de variao do peso corporal. Em ambos os casos, a reduo foi inferior a 15% e nenhum sinal clnico de toxicidade foi observado. Esses dados associados aos resultados de letalidade permitiram estabelecer a DMT aps o tratamento com CDDP livre e SpHL-CDDP, sendo os valores obtidos iguais a 7,5 e 20 mg/kg, respectivamente. Os sinais de toxicidade tornaram-se mais evidentes aps a administrao de CDDP livre em doses superiores a DL50, a qual foi determinada como 15,9 mg/kg em camundongos machos e 10,8 mg/kg em camundongos fmeas. Uma grande reduo do peso e expressiva mortalidade foram observadas aps o tratamento com CDDP livre nas doses de 20 e 15 mg/kg em camundongos machos e fmeas, respectivamente. Esses resultados corroboram trabalhos anteriores cujos valores de DMT e DL50 estabelecidos para o tratamento com CDDP livre foram iguais a 8 e 15,4 mg/kg, respectivamente (TAMURA et al., 2002c). No entanto, a encapsulao de CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada foi capaz de reduzir a toxicidade

113

induzida pela CDDP, uma vez que aumentou significativamente a DMT (aproximadamente 2,7 vezes maior que aquela estabelecida para CDDP livre), em ambos os sexos. Alm disso, a DL50 obtida aps o tratamento com SpHL-CDDP foi 2,4 e 1,7 vezes superior quela obtida aps a administrao de CDDP livre, em camundongos machos e fmeas, respectivamente. Sinais clnicos de toxicidade e uma alta taxa de mortalidade foram somente observados aps a administrao de SpHL-CDDP em doses superiores DL50 (27,5 e 25,9 mg/kg para camundongos machos e fmeas, respectivamente). Tem sido claramente relatado que o tratamento com CDDP livre induz efeitos txicos severos dos quais destacam-se mielotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade (ASNA et al., 2005; YAO et al., 2007). No presente trabalho, as alteraes hematolgicas observadas aps a administrao de CDDP livre associadas s alteraes histopatolgicas do tecido sseo confirmaram o potencial mielossupressor da CDDP. Esses efeitos foram principalmente detectados em doses acima da DL50, sendo observada uma reduo significativa no sangue perifrico dos parmetros de srie vermelha e branca. A avaliao microscpica da medula ssea desses camundongos demonstrou pronunciada hipocelularidade, com reduo de todos os precursores celulares, sugerindo portanto, que essas alteraes so decorrentes do efeito mielotxico do frmaco. Achados semelhantes foram observados em estudos pr-clnicos utilizando uma formulao lipossomal contendo cisplatina, SPI-077, em comparao com o frmaco livre (WORKING et al., 1998). Por outro lado, alteraes no nmero de hemcias, valores do hematcrito e hemoglobina tambm foram observadas nos grupos tratados com SpHL-CDDP (20 mg/kg). Alguns estudos descrevem efeitos txicos indesejveis na circulao sangunea decorrente de regimes quimioterpicos utilizando a DMT (OOYAMA, et al., 2008). No entanto, a ausncia de toxicidade medular observada nesse grupo sugere que esses resultados apresentam pouco significado clnico. Com relao nefrotoxicidade, como j mencionado, o mecanismo de toxicidade induzido pela CDDP provoca leses iniciais nos tbulos-intersticiais, danificando inicialmente os tbulos proximais, especificamente o segmento S3 da regio medular alm de alterar as mitocndrias nos tbulos contorcidos distais (YAO et al., 2007). Nesse trabalho, as alteraes histopatolgicas do tecido renal de

114

camundongos tratados com CDDP livre nas doses de 15 e 20 mg/kg associadas alteraes nos nveis de uria e creatinina (Figura 1.10) demonstraram clara evidncia de insuficincia renal induzida por esse frmaco. Entretanto, a razo uria/creatinina no foi alterada em comparao com o grupo controle. Esse fato pode ser explicado por um maior comprometimento do tecido renal, induzindo uma reduo significativa na perfuso renal e na taxa de filtrao glomerular, aumentando significativamente os nveis plasmticos de uria e creatinina. sabido que em casos de funo renal muito baixa, um mecanismo compensatrio de secreo de creatinina ativado. No entanto, a quantidade de creatinina secretada muito pequena e, consequentemente, o que permanece na corrente sangunea to elevado que a razo uria/creatinina permanece inalterada em relao ao controle. Por outro lado, aps o tratamento com SpHL-CDDP nas doses de 25 e 35 mg/kg os nveis sanguneos de creatinina foram menores que aqueles obtidos aps o tratamento com CDDP livre e, consequentemente, um aumento no ndice uria/creatinina foi observado. Nesse caso, provavelmente ocorre um incio de comprometimento renal, porm o efeito na filtrao glomerular menor do que aquele detectado aps a administrao de CDDP, uma vez que parte da creatinina ainda est sendo filtrada e secretada. Por outro lado, a avaliao da nefrotoxicidade quatorze dias aps o tratamento demonstrou que SpHL-CDDP (20 mg/kg) reduziu significativamente a toxicidade renal quando comparado com a administrao de CDDP livre (7,5 mg/kg). Nenhuma alterao nos parmetros indicativos de toxicidade renal assim como ausncia de alteraes morfolgicas no tecido renal foram observadas no grupo de animais tratados com SpHL-CDDP. Como mencionado anteriormente, estudos prvios de biodistribuio demonstraram que o tratamento com SpHL-CDDP aumentou a rea sob a curva no tecido renal em comparao com a administrao de CDDP livre, porm, o coeficiente de partio tecido renal/sangue para o tratamento com CDDP livre foi maior do que para o tratamento realizado com SpHL-CDDP (CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Diante disso, a menor toxicidade observada nos camundongos tratados com SpHL-CDDP pode ser explicada pela modificao no perfil de biodistribuio obtido aps a encapsulao de CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada, a qual foi principalmente observada mediante a reduo da partio da CDDP entre o espao vascular e o tecido renal.

115

No que diz respeito toxicidade heptica, alguns estudos tm demonstrado que a administrao de CDDP na dose de 7,5 mg/kg induz leso heptica caracterizada por elevao significativa da atividade de AST e GGT (ZICCA et al., 2002). No presente trabalho, aumentos significativos dos nveis de AST, FA e protenas foram observados aps a administrao de CDDP livre na dose de 7,5 mg/kg, demonstrando o incio de um comprometimento heptico. Por outro lado, o tratamento com SpHL-CDDP no induziu alteraes bioqumicas indicativas de hepatotoxicidade em relao ao grupo controle tratado com soluo salina, sugerindo que a encapsulao promove maior proteo do tecido heptico. O estudo de biodistribuio tambm demonstrou que a concentrao de CDDP no tecido heptico foi 2,7 vezes maior aps a administrao de CDDP livre em relao adminsitrao de SpHL-CDDP (CARVALHO-JNIOR, 2007a). No entanto, apesar das alteraes observadas no sangue perifrico, nenhum comprometimento tecidual foi detectado. Diante disso, pode-se dizer que o tratamento IV com SpHL-CDDP mostrou ser mais seguro em relao administrao de CDDP livre, no que se refere mielotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Os resultados sugerem que a utilizao de SpHL-CDDP pode representar uma vantagem teraputica no tratamento de tumores slidos, uma vez que um dos principais problemas da terapia com CDDP consiste na no adeso do paciente terapia em funo da toxicidade induzida pelo frmaco.

116

PARTE 3
ESTUDO COMPARATIVO DA TOXICIDADE AGUDA INDUZIDA POR CDDP LIVRE E SpHL-CDDP ADMINISTRADOS POR VIA INTRAPERITOENAL E INTRAVENOSA

117

1 ESTUDO COMPARATIVO DA TOXICIDADE AGUDA INDUZIDA PELA CDDP LIVRE E SpHL-CDDP CONSIDERANDO A VIA DE ADMINISTRAO UTILIZADA

Sabe-se que para desenvolver um novo medicamento vrios estudos pr-clnicos devem ser conduzidos, entre eles, o estudo de toxicidade, o qual permite selecionar, por exemplo, formulaes de CDDP menos nefrotxicas em relao s formulaes convencionais. No desenvolvimento de frmacos antineoplsicos, um dos principais objetivos do estudo de toxicidade estabelecer uma dose inicial segura e um esquema de dose escalonada, a fim de alcanar uma DMT eficaz com benefcios mximos para o paciente. Alm disso, definir a dose limite de toxicidade e seus rgos-alvo potenciais para suportar os estudos clnicos de fase I (EMEA, 1998). Os frmacos antitumorais esto entre os agentes mais txicos administrados em humanos e, normalmente, os pacientes em estudos clnicos apresentam a doena, muitas vezes em estgio avanado. Consequentemente, esquemas de doses maiores so utilizados na clnica e, na maioria das vezes, o sucesso significa selecionar uma dose inicial elevada, reduzindo o nmero de administraes necessrias para alcanar uma dose biologicamente efetiva em seres humanos (MIRSALIS et al., 2003). Vrios estudos de terapia antitumoral tm utilizado o direcionamento de frmacos por meio de sistemas carreadores com o objetivo de assegurar um tempo de circulao sangunea prolongado com acmulo reduzido nos tecidos normais, o que pode favorecer a diminuio do nmero de doses administradas e a reduo da toxicidade. Nesta etapa do trabalho, ns comparamos os possveis efeitos txicos in vivo de uma formulao lipossomal contendo CDDP administrada em dose nica por via IP e IV. Os resultados desse estudo demonstraram que a administrao de SpHL-CDDP em dose nica em camundongos Swiss machos e fmeas foi bem tolerada tanto por via IP e quanto por via IV se comparado com o tratamento de CDDP livre. No entanto, foi detectada uma diferena marcante no perfil de toxicidade aps injeo IP e IV de SpHL-CDDP, sendo que essa formulao mostrou-se menos txica aps o tratamento por via IP do que por via IV. A DL50 variou de 45,4 - 47,5 mg/kg e 25,9 27,5 mg/kg em camundongos tratados por via IP e IV, respectivamente. Por outro

118

lado, a DMT foi igual ou superior a 30 mg/kg aps a administrao IP e igual a 20 mg/kg aps o tratamento por via IV. Esses dados correspondem a um aumento de aproximadamente 75% na DL50 e 50% na DMT quando a via IP foi utilizada, demonstrando que a injeo de doses mais altas foi necessria para alcanar o mesmo grau de toxicidade obtida por via IV em doses mais baixas. Por outro lado, a DL50 variou de 14,9 - 16,8 mg/kg e de 10,8 - 15,9 mg/kg em camundongos tratados com CDDP livre por via IP e IV, respectivamente, enquanto a DMT foi inferior a 10 mg/kg e igual a 7,5 mg/kg aps o tratamento IP e IV, respectivamente. Esses resultados demonstram que praticamente no houve diferena na DL50 e na DMT em funo da via de administrao quando a CDDP foi administrada na forma livre. No que diz respeito reduo do peso corporal, um dos parmetros utilizado como indicador de toxicidade aguda, nenhuma diferena significativa foi observada entre a administrao IP e IV para doses iguais ou prximas DMT. Efeitos sobre os parmetros hematolgicos devido administrao de CDDP foram anteriormente documentados em modelos experimentais (BOULIKAS, 2004; NEWMAN et. al., 1998). No presente trabalho, uma reduo no sangue perifrico dos parmetros de srie vermelha e srie branca foi observada aps a administrao de 10 mg/kg de CDDP livre por via IP, enquanto redues de srie vermelha e no nmero de plaquetas foram observadas nos animais tratados com 10 mg/kg de CDDP livre administrada por via IV. No entanto, nenhuma alterao histopatolgica foi detectada na medula ssea. Uma diminuio na contagem de hemcias e no hematcrito de camundongos machos e fmeas e nos nveis de hemoglobina em fmeas foi detectada aps a administrao IV de SpHL-CDDP na dose de 20 mg/kg. Embora em quantidade reduzida, as hemcias apresentavam-se normocitcas e normocrmicas. Possivelmente essas alteraes sejam consequncia de uma leve anemia hemoltica relacionada mais com um efeito citotxico perifrico do que com uma mielotoxicidade, uma vez que nenhuma alterao histopatolgica na medula ssea desses animais foi observada. Alguns estudos clnicos tm relatado o desenvolvimento de anemia hemoltica normoctica e normocrmica aps quimioterapia com CDDP, e o mecanismo proposto para explicar esse efeito envolve a formao de um complexo entre um anticorpo antiglobulina e a CDDP ligada membrana da hemcia (LEVI et al., 1981; MALOISEL et al., 1995). Por outro lado, o tratamento IP com 30 mg/kg de SpHL-

119

CDDP no induziu alterao hematolgica significativa, alm disso, nenhum comprometimento medular foi observado nesse grupo de animais. O principal efeito txico limitante da quimioterapia com a CDDP a nefrotoxicidade. Para minimizar a toxicidade renal e permitir o escalonamento de doses da CDDP, protocolos de hidratao so rotineiramente empregados, possibilitando uma reduo da exposio renal ao frmaco, no s pela diluio do mesmo, mas tambm pela diminuio do tempo de trnsito pelos tbulos renais (KINTZEL, 2001). Estudos realizados em pacientes com cncer epitelial do ovrio tm demonstrado menor incidncia de toxicidade aps administrao IP em relao administrao IV. Como a cavidade peritoneal o principal stio de disseminao do carcinoma ovariano, a via IP oferece maior possibilidade de alcanar concentraes locoregionais elevadas da CDDP e reduzir a disseminao sistmica (ARMSTRONG et al., 2006; MARKMAN et al., 2006). Considerando os valores de DMT, alteraes significativas nos nveis de uria e no ndice uria/creatinina de camundongos fmeas e nos nveis de uria de camundongos machos, indicativas de toxicidade do tecido renal, foram observadas aps a administrao IV de CDDP livre. Por outro lado, o tratamento IP induziu aumento dos nveis de uria apenas no grupo de camundongos fmeas. Essa diferena nos resultados de toxicidade renal induzida pela CDDP pode ser claramente explicada pela diferena obtida no perfil de biodistribuio. Estudos anteriores demonstraram que o coeficiente de partio tecido renal/sangue determinado aps a injeo IV e IP foi igual a 6,7 e 3,8, respectivamente (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a), demonstrando que concentraes mais elevadas de CDDP, potencialmente nefrotxicas, so alcanadas aps a administrao IV. Uma reduo mais evidente dos efeitos nefrotxicos foi observada aps a administrao de SpHL-CDDP e uma menor toxicidade foi detectada aps o tratamento IP em comparao com o IV. Na avaliao de toxicidade por via IP, elevaes nos nveis de uria foram detectadas aps a administrao de SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg, porm nenhuma alterao nos nveis de creatinina e no ndice uria/creatinina foi observada. Por outro lado, nenhuma alterao foi observada nos nveis de uria, creatinina e no ndice uria/creatinina aps a injeo IV de SpHL-CDDP na dose de 20 mg/kg. Alm disso, no foi detectada alterao morfolgica do tecido renal sugestiva de nefrotoxicidade aps o tratamento com SpHL-CDDP pelas vias de administrao

120

investigadas. No entanto, a avaliao histolgica do tecido renal dos animais tratados com SpHL-CDDP nas doses de 25 mg/kg em fmeas e 35 mg/kg em machos, sacrificados trs dias aps o tratamento, mostrou clara evidncia de insuficincia renal com reas de necrose coagulativa do epitlio tubular, demonstrando o maior comprometimento renal aps a administrao IV em comparao com a administrao IP. Essa diferena no perfil de toxicidade pode ser explicada pela menor reteno de CDDP no tecido renal, evidenciada pelo coeficiente de partio tecido renal/sangue, aps administrao IP de SpHL-CDDP em comparao com a administrao IV. Estudos prvios de biodistribuio realizados em camundongos portadores de tumor slido e asctico de Ehrlich, tratados com SpHL-CDDP na dose de 6 mg/kg por via IV e IP, respectivamente, demonstraram que o coeficiente de partio nos rins foi igual a 4,8 e 1,8 (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Portanto, a reteno no tecido renal de SpHL-CDDP foi 2,7 vezes maior aps o tratamento por via IV comparado com o tratamento IP. Com relao s avaliaes bioqumicas da atividade das enzimas hepticas, aumentos nos nveis de AST e ALT foram detectados em camundongos fmeas e aumento nos nveis de GGT foram observados nos camundongos machos submetidos ao tratamento por via IP com SpHL-CDDP na dose de 30 mg/kg. Por outro lado, apenas alteraes nos nveis de AST foram observados aps a administrao IV de 20 mg/kg de SpHL-CDDP. Entretanto, nenhuma alterao histolgica foi observada aps a administrao de SpHL-CDDP por ambas as vias. Vale destacar ainda que CDDP livre hepatotxica quando administrada em doses altas. Nesse trabalho, elevaes sricas dos marcadores de toxicidade heptica foram observadas aps a administrao IV de baixas doses de CDDP livre (7,5 mg/kg) e somente aps a administrao IP de doses altas de CDDP (20 mg/kg). O comportamento farmacodinmico da CDDP observado aps a injeo IV e IP pode explicar esses resultados. Uma maior reteno de CDDP no fgado (aproximadamente 8,7 vezes) foi observada aps a administrao por via IV em comparao com a via IP, utilizando uma dose equivalente do frmaco na forma livre (ARAJO et al., 2008; CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Com base nesses dados, seria necessrio administrar doses mais elevadas por via IP para atingir concentraes semelhantes do frmaco no tecido heptico capazes de induzir

121

alteraes. Por outro lado, quando administrado na forma lipossomal, o coeficiente de partio tecido heptico/sangue determinado aps o tratamento IV foi superior apenas 1,3 vezes em relao ao valor obtido por via IP, sugerindo que a administrao de uma dose mais alta por via IP (30 mg/kg) comparada com 20 mg/kg de SpHL-CDDP administrados por via IV poderia acarretar maior concentrao tecidual e, consequentemente maior complicao heptica, conforme demonstrado nesse estudo. No entanto, essas alteraes ocorreram em nveis de doses no-letais e no foram consideradas dose-limitante para a terapia. Entretanto, independente da via administrada, SpHL-CDDP apresentou um perfil de toxicidade favorvel em comparao com a toxicidade induzida pela CDDP livre, demonstrando seu potencial para aplicaes clnicas. Duas formulaes lipossomais contendo CDDP foram submetidas a estudos clnicos, a saber: SPI-077 e Lipoplatin. SPI-077, uma formulao lipossomal de circulao prolongada constituda por fosfatidilcolina hidrogenada de soja, colesterol e DSPE-mPEG2000 mostrou-se ineficaz em estudos clnicos de fase II para tratamento de cncer de cabea e pescoo em fase avanada, sendo essa ineficcia atribuda no liberao do frmaco a partir das vesculas de maneira suficiente para induzir resposta farmacolgica. Lipoplatin, outra formulao lipossomal tambm de circulao prolongada, constituda dipalmitoilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, colesterol e DSPE-mPEG2000 tem apresentado resultados satisfatrios nos estudos clnicos de fase III. Esses estudos esto sendo conduzidos em pacientes com carcinoma escamoso de cabea e pescoo e em pacientes com carcinoma de clulas pequenas de pulmo e os resultados tm demonstrado menores efeitos mielototxico, neurotxico e nefrotxico nos esquemas teraputicos utilizando Lipoplatin em relao CDDP livre. SpHL-CDDP difere do Lipoplatin por apresentar uma propriedade importante que a pH-sensibilidade, conferida pela associao na bicamada lipdica de derivados da PE e lpides carboxilados que se apresentam carregados negativamente em pH fisiolgico, e so protonados em pH cido, como o caso do pH tumoral, o que resulta na liberao stio-especfica da CDDP. Um dos esquemas tpicos de administrao IV de CDDP, como agente nico, envolve a administrao de 50 mg/m2 em regime de infuso a cada 3 ou 4 semanas

122

(MARTINDALE, 2005), enquanto por via IP, a CDDP normalmente administrada em associao com outros quimioterpicos em doses que variam de 50 a 100 mg/m2 (ARMSTRONG et al., 2006, MARKMAN et al., 2006). De acordo com as orientaes do International Conference on Harmonisation (2008), se o esquema proposto para uso humano envolve a aplicao do antineoplsico a cada trs semanas, o estudo pr-clnico preconizado para dar suporte ao estudo clnico de fase I inclue apenas a administrao em dose nica. Alm disso, alguns estudos relatam que, para frmacos antineoplscios, a determinao da DL10 em roedores e DMT em espcie no-roedora permite estabelecer uma boa correlao com a DMT em humanos quando essas doses so ajustadas para mg/m2 e o esquema de administrao semelhante ao utilizado no estudo pr-clnico (FDA, 2005). Considerando que a mdia da DL10 em camundongos machos e fmeas determinada aps a administrao de SpHL-CDDP por via IP e IV igual a 22,5 mg/kg e 18,5 mg/kg, respectivamente, a dose inicial recomendada para estudos clnicos seria aproximadamente de 125 mg/m2 e 100 mg/m2, respectivamente. Portanto, levando em considerao as doses de CDDP livre comumente utilizadas, SpHL-CDDP poderia ser administrado tanto em pacientes portadores de tumor slido como em pacientes com carcinomatose peritoneal, uma vez que o comportamento toxicolgico da CDDP foi significativamente alterado aps sua encapsulao em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada. Alm disso, a toxicidade renal, principal fator limitante da aplicao clnica desse frmaco, foi significativamente reduzida com a utilizao de SpHL-CDDP. Dessa forma, os resultados obtidos at o momento permitem estimar uma dose inicial para estudos clnicos com esquemas teraputicos utilizando a administrao de CDDP em intervalos de trs semanas. No entanto, diversos protocolos teraputicos utilizam a CDDP semanalmente em trs ou mais ciclos de acordo com a progresso da doena e com o tipo de cncer a ser tratado. Nesses casos, estudos pr-clnicos de toxicidade repetida devero tambm ser conduzidos. E ainda, considerando as diferenas fisiolgicas entre camundongos e humanos, estudos de toxicidade prclnica em modelos no roedor tambm devero ser realizados permitindo assim selecionar a espcie mais apropriada para determinao da dose mxima inicial recomendada para a conduo dos estudos clnicos.

123

CAPTULO 2

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE SpHL-CDDP ADMINISTRADO EM CAMUNDONGOS SWISS PORTADORES DE TUMOR SLIDO DE EHRLICH

124

1 INTRODUO

125

1 INTRODUO

Embora apresente atividade antitumoral comprovada contra vrios tipos de tumores slidos, como j relatado, a utilizao clnica da CDDP limitada em funo da toxicidade sistmica e da resistncia clnica adquirida. A fim de evitar esses inconvenientes, diferentes formulaes de liberao controlada tm sido propostas (BOULIKAS, 2004; HARRINGTON et al., 2001; CARVALHO-JNIOR et al., 2007b; KUMAGAI et al., 1996; MORENO et al., 2009; NISHIYAMA et al., 2003; TAMURA et al., 2002a,b,c). Esses sistemas so delineados principalmente com o objetivo de reduzir/eliminar a toxicidade, aumentar a concentrao efetiva do frmaco no tumor e ainda prolongar seu tempo de contato com as clulas tumorais. Melhorar a eficincia de liberao de compostos platinados, como a CDDP, permite que doses mais altas do frmaco sejam administradas, aumentando consequentemente a sua eficcia teraputica (BOULIKAS, 2007). Alguns estudos mostraram que o mecanismo primrio responsvel pela atividade antitumoral da CDDP envolve a formao de ligaes cruzadas com a molcula de DNA e a induo de apoptose (GONZALEZ et al., 2001). Carvalho-Jnior (2008) demonstrou que SpHL-CDDP tem um tempo de residncia na circulao sangunea prolongado, o que contribuiu para uma maior concentrao do frmaco no tecido tumoral. Alm disso, o estudo de distribuio de CDDP no tumor, mediante a determinao de seu coeficiente de partio tumor/sangue, revelou que a formulao de SpHL-CDDP apresenta maior afinidade pelo tecido tumoral em comparao com a CDDP livre, o que poderia levar uma maior eficcia teraputica. Entretanto, o estudo de atividade antitumoral de SpHL-CDDP em modelo experimental de camundongo portador de tumor slido de Ehrlich demonstrou semelhana no perfil do crescimento tumoral aps o tratamento com SpHL-CDDP e CDDP livre quando administrados na dose de 8 mg/kg, dose prxima DMT estabelecida para a CDDP livre (CARVALHO-JNIOR, 2008). Alm disso, a atividade de SpHL-CDDP foi comparada com uma formulao lipossomal no pHsensvel (NSpHL-CDDP) e, esta mostrou ser menos efetiva no controle do crescimento tumoral em relao quela. Considerando a limitao do aumento de doses da CDDP livre devido sua toxicidade, a melhora da quimioterapia com o

126

uso de SpHL-CDDP certamente poderia ser observada com o uso de doses mais altas desse sistema carreador de CDDP. Diante disso, nessa etapa do trabalho, foi realizado um estudo de avaliao da atividade antitumoral dos SpHL-CDDP administrados em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich em dose prxima a DMT dos SpHL-CDDP.

127

2 MATERIAL E MTODOS

128

2 MATERIAL E MTODOS

2.1 Material

DOPE, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e DSPE-PEG2000 foram adquiridos da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha). CHEMS foi fornecido pela Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). A CDDP foi adquirida da Quiral Qumica do Brasil S/A (Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil). HEPES e hidrxido de sdio foram adquiridos da Vetec Qumica Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brasil). O metanol, acetato de etila e a dimetilformamida, todos os solventes grau HPLC, foram adquiridos da Tedia (Fairfield, Ohio, Estados Unidos). Clorofrmio P.A. e ter etlico P.A. foram adquiridos da Synth (So Paulo, Brasil). O cloreto de sdio P.A. e o isopropanol foram provenientes da Merck (Darmstadt, Alemanha). A gua utilizada em todos os experimentos foi deionizada e destilada.

2.2 Preparao e Caracterizao dos Lipossomas

SpHL e SpHL-CDDP foram constitudos de DOPE, CHEMS e DSPE-MPEG2000 (concentrao lpidica total igual a 40 mM; razo molar igual a 5,7:3,8:0,5, respectivamente). NSpHL-CDDP e lipossomas brancos no pH-sensveis de longa circulao (NSpHL) foram constitudos de DOPC, CHEMS e DSPE-MPEG2000 (concentrao lpidica total igual a 40 mM; razo molar igual a 5,7:3,8:0,5, respectivamente). A preparao de todas as formulaes lipossomais foi realizada pelo mtodo de evaporao em fase reversa, como descrito anteriormente por Carvalho-Jnior e colaboradores (2007a). Todas as formulaes foram caracterizadas quanto ao dimetro, potencial zeta e teor de encapsulao, seguindo os protocolos descritos anteriormente no Captulo 1.

129

2.3 Preparo e inoculao das clulas tumorais

O preparo das clulas tumorais incluiu processos de lavagem, contagem das clulas e a determinao da viabilidade celular. Clulas de tumor asctico de Ehrlich (2 x 106 clulas), derivadas de adenocarcinoma mamrio de camundongos, foram inoculadas intraperitonealmente em camundongos Swiss fmeas (25 2g). Oito dias aps a inoculao, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de xilazina (7,5 mg/kg) e ketamina (60 mg/kg) e o lquido asctico contendo as clulas tumorais foi coletado. Esse fluido foi centrifugado a 3000 rpm por cinco minutos, numa temperatura de 5 oC e o sobrenadante foi desprezado. As clulas foram ressuspensas em soluo salina 0,9% (p/v) e novamente centrifugadas. Esse procedimento foi repetido at a obteno de um lquido denso e claro, com o mnimo possvel de fibrinas e hemcias. Em seguida foi realizada a contagem e a determinao da viabilidade celular. A contagem das clulas tumorais foi realizada com o uso de microscpio ptico utilizando uma cmara de Neubauer e uma soluo de azul de Tripan 0,4% (p/v) como corante. As clulas coradas pelo azul de Tripan foram consideradas inviveis e as clulas translcidas foram consideradas viveis. A viabilidade celular variou de 96 a 98%. Uma suspenso de clulas viveis foi ento preparada em uma densidade mdia de 1 x 107 clulas/mL. Essas clulas foram implantadas por via subcutnea (SC) no flanco direito de camundongos fmeas (0,2 mL/camundongo).

2.4 Avaliao da atividade antitumoral

Aps 15 dias da implantao, os tumores apresentavam-se palpveis com dimetro de aproximadamente 9 e 10 mm. Os animais foram ento aleatoriamente divididos em 5 grupos experimentais os quais receberam CDDP livre (8 mg/kg), SpHL-CDDP (16 mg/kg), NSpHL-CDDP (16 mg/kg), SpHL (a dose de lpide foi igual quela administrada nos animais tratados com SpHL-CDDP na dose de 16 mg/kg), NSpHL (a dose de lpide foi igual quela administrada nos animais tratados com NSpHLCDDP na dose de 16 mg/kg). A administrao das diferentes formulaes foi

130

realizada por via IV, perfazendo um total de 3 administraes com intervalos de 7 dias entre as doses. O primeiro dia de administrao foi considerado o dia 0 do estudo e, as formulaes foram, portanto, administradas nos dias 0, 7 e 14 (Figura
2.1).

Inoculao das clulas Ehrlich, SC 2 x 106 cels/animal

Tratamento IV das formulaes de CDDP D0 D7 D14

Sacrifcio D23

Figura 2.1 - Esquema representativo do protocolo experimental para o estudo de

atividade antitumoral.

A atividade antitumoral foi avaliada em termos de volume do tumor mediante a medida dos trs dimetros ortogonais (d1, d2 e d3, os quais representam largura, comprimento e profundidade, respectivamente) com o auxlio de um paqumetro (Mitutoyo, MIP/E-103) e, de acordo com a seguinte frmula:

V = (d1 x d2 x d3) 6

O crescimento do tumor e o peso dos animais foi monitorado durante 23 dias. No final do perodo experimental, o volume relativo do tumor (VRT) foi calculado de acordo com a equao:

VRT

volume do tumor no dia 23 volume do tumor no dia 0

131

A porcentagem de inibio do crescimento do tumor (IC) tambm foi determinada mediante o emprego da seguinte frmula:

ICT = 1 - (VRT do grupo tratado com a formulao contendo CDDP) x 100 VRT do grupo controle

No final do experimento, os animais foram sacrificados, o tumor foi removido e, posteriormente fixado em formaldedo a 10% (v/v). Os fragmentos dos tecidos foram includos em blocos de parafina, seccionados em cortes de 5 m de espessura e, posteriormente, corados pelo mtodo hematoxilina-eosina. Alm disso, os rgos alvo de toxicidade, rim e medula ssea, foram removidos para avaliao histopatolgica.

2.5 Avaliao histomorfomtrica

Em seces histolgicas do tumor slido de Ehrlich, utilizando objetiva de 40x, foram determinados a porcentagem de reas de neoplasia, necrose e inflamao. Para determinao dessas variveis foi realizada a captura de imagens em cmera digital Spot Insigh Color adaptado a um microscpio Olympus BX-40 e o software de captura SPOT verso 3.4.5. A anlise das imagens foi realizada utilizando o Corel DRAW verso 7.468 e a contagem foi determinada em um total de 15 campos, abrangendo toda a rea da seco histolgica. Foram determinados 25 pontos equidistantes no campo da imagem, contabilizando 375 pontos por lmina examinada.

132

2.6 Anlise estatstica

Para a verificao da normalidade e homocedasticidade da varincia utilizou-se os testes de Lilliefors e Bartlett, respectivamente. Os dados que no apresentaram distribuio normal foram transformados pela equao: y = log (varivel + 1). A avaliao do crescimento tumoral ao longo do tempo de investigao foi realizada por anlise de regresso. A diferena entre os grupos experimentais no parmetro peso do tumor e nos parmetros histomorfomtricos foi analisada por teste de Tukey. Para todas as anlises adotou-se o intervalo de confiana de 95% e as diferenas foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P < 0,05).

133

3 RESULTADOS E DISCUSSO

134

3.1 Resultados 3.1.1 Caracterizao fsico-qumica dos lipossomas

Tabela 2.1

apresenta

as

caractersticas

fsico-qumicas

das

diferentes

formulaes lipossomais contendo ou no CDDP. SpHL-CDDP, NSpHL-CDDP, SpHL e NSpHL apresentaram um dimetro mdio variando entre 120 e 135 nm e as populaes das vesculas so monodispersas (IP < 0,3). Todas as formulaes exibiram um potencial zeta prximo da neutralidade com valores mdios variando entre -1,6 e -2,8 mV. A quantidade de CDDP encapsulada foi similar em SpHLCDDP e NSpHL-CDDP (23 e 22%, respectivamente).
Tabela 2.1 - Caractersticas fsico-qumicas de diferentes formulaes lipossomais
Formulaes SpHL-CDDP NSpHL-CDDP SpHL NSpHL
a

Dimetro mdio (nm) DPa

130 7 121 14 135 4 120 10

ndice de Polidisperso DP
0,07 0,02 0,09 0,02 0,08 0,03 0,10 0,06

Potencial Zeta (mV) DP

-1,6 0,9 -2,7 0,5 -2,4 1,0 -2,8 1,6

Porcentagem Encapsulao de CDDP (%) DP

23 5 22 4 -

Cada valor representa a mdia desvio padro (n = 3).

3.1.2 Atividade antitumoral

Os dados da avaliao antitumoral, no que diz respeito curva de crescimento tumoral, de camundongos Swiss fmeas portadores de tumor slido de Ehrlich tratados com SpHL-CDDP, NSpHL-CDDP e CDDP livre assim como os grupos controle SpHL e NSpHL, esto apresentados na Figura 2.2 A. Os dados individuais dos animais submetidos aos diferentes tratamentos esto discriminados no Apndice A. Os dados foram posteriormente avaliados por anlise de regresso e,

135

os diferentes modelos utilizados esto apresentados na Figura 2.2 B. A administrao de CDDP livre na dose de 8 mg/kg/semana durante trs semanas, reduziu significativamente o crescimento tumoral em comparao com os grupos controle (Figura 2.2 A e B). Entretanto, o tratamento com SpHL-CDDP na dose de 16 mg/kg administrado semanalmente durante trs semanas resultou em uma atividade antitumoral significativamente maior em relao ao tratamento com CDDP livre (8 mg/kg/semana durante trs semanas) (P < 0,0001). Pode-se observar que a administrao de SpHL-CDDP inibiu de maneira significativa o crescimento tumoral, resultando praticamente na ausncia de alterao do volume tumoral durante todo o perodo experimental (Figura 2.2 A). A anlise de regresso nesse grupo experimental permitiu definir um coeficiente de correlao (r) igual a 0,596. No entanto, alguns estudos descrevem que para ensaios in vivo a regresso aceita quando o valor de r igual ou maior que 0,8 (TAVARES, 2004). Por esse motivo, nenhum modelo de regresso foi aplicado nesse gurpo experimental, portanto, ele no foi representado na Figura 2.2 B. No grupo de camundongos tratados com NSpHL-CDDP (16 mg/kg/semana durante trs semanas) tambm foi observado maior inibio do crescimento tumoral em relao ao grupo tratado com CDDP. A anlise de regresso demonstrou diferena estatstica significativa entre NSpHLCDDP e CDDP livre (P < 0,05), porm essa formulao mostrou ser menos efetiva no controle do crescimento tumoral quando comparada com a formulao SpHLCDDP (Figura 2.2 A). Considerando os valores mdios do volume tumoral obtidos at o nono dia de investigao pde-se observar que NSpHL-CDDP mostrou o mesmo perfil de inibio observado para SpHL-CDDP. Entretanto, aps esse intervalo, SpHL-CDDP mostrou ser mais efetivo no controle do volume do tumor do que NSpHL-CDDP. O valor de ICT determinado no D23 para os grupos tratados com SpHL-CDDP, NSpHL-CDDP e CDDP livre foi igual a 83%, 73% e 55%, respectivamente. Convm ainda destacar que o tratamento dos animais com SpHLCDDP foi capaz de promover a cura de dois animais (13%). A anlise de regresso no demonstrou diferena significativa entre os grupos controle (P > 0,05).

136

A
Volume do Tumor (cm3)

1 * 0 * * * 16 20

12 Tempo (dias)

24

B
Volume do Tumor (cm3)

5 4 3 2 1 0

12 16 Tempo (dias)

20

24

Figura 2.2 - Efeito antitumoral (A) de CDDP livre na dose de 8 mg/kg (), SpHL-CDDP na
dose de 16 mg/kg (), NSpHL-CDDP na dose de 16 mg/kg (g), SpHL () e NSpHL ( ) administrados em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich. Em B, os valores foram calculados usando as equaes obtidas na anlise de regresso para os diferentes tratamentos. Os valores de r das curvas CDDP, NSpHL-CDDP, SpHL e NSpHL foram 0,979, 0,851, 0,988 e 0,990, respectivamente. Nenhum modelo de regresso pde ser aplicado no grupo tratado com SpHL-CDDP portanto ele no est representado em B. As setas indicam os dias de tratamento. Os asteriscos representam diferenas estatsticas significativas entre SpHL-CDDP e NSpHL-CDDP.

137

A anlise macroscpica do tumor de Ehrlich revelou a presena de uma massa tumoral esbranquiada, de formato irregular, consistncia borrachide e superfcie lisa e, s vezes, infiltrado em tecidos adjacentes. Os tecidos tumorais foram cortados longitudinalmente e uma rea esbranquiada na regio central, indicativa de necrose, tambm foi observada. Esse aspecto foi observado em todos os grupos experimentais, independente do tratamento aplicado. A avaliao microscpica do tumor dos camundongos de todos os grupos experimentais confirmou uma rea de necrose coagulativa localizada na regio central, e clulas neoplsicas com intenso pleomorfismo celular, hipercromatismo nuclear, ncleos bizarros com cromatina condensada e, s vezes, clulas gigantes evidenciando uma intensa atipia celular (Figura 2.3 A). Na avaliao histomorfomtrica do tumor slido de Ehrlich, no foi detectada diferena significativa na quantificao das reas neoplsicas, necrose e inflamao entre os diferentes grupos avaliados (Tabela 2.2). Entretanto, os dados apontam uma tendncia para um aumento de reas neoplsicas nos grupos tratados com as formulaes contendo CDDP em relao aos grupos controle. No grupo de camundongos tratados com SpHL-CDDP pode-se observar uma diminuio nas reas de necrose e inflamao em comparao com o grupo controle SpHL. Embora o grupo tratado com SpHL-CDDP tenha apresentado menor crescimento tumoral (Figura 2.2), os dados de histomorfometria demonstram uma maior extenso de tecido neoplsico vivel em comparao com o grupo controle. Esse fato pode ser atribudo ao pequeno volume do tumor no grupo tratado com SpHLCDDP, que torna o suprimento sanguneo suficiente para as clulas se manterem viveis, no entanto, pode-se sugerir que o ndice proliferativo dessas clulas extremamente reduzido em relao ao grupo controle. Por outro lado, os animais dos grupos controle tratados com SpHL e NSpHL apresentaram um maior volume do tumor o que torna o suprimento sanguneo insuficiente para as clulas localizadas na regio central do tumor fazendo com que as mesmas morram por um mecanismo de necrose, o que justifica portanto maiores reas de clulas inviveis nesses grupos experimentais. Entretanto, vale destacar que esse foi um estudo preliminar e estudos posteriores utilizando um nmero maior de animais dever ser conduzido. Uma figura representativa das trs variveis analisadas na avaliao histomorfomtrica est apresentada na Figura 2.3.

138

Tabela 2.2 - Variveis Morfomtricas avaliadas no tumor slido de Ehrlich de

camundongos Swiss fmeas submetidos a diferentes tratamentos

Tratamento* SpHL SpHL-CDDP CDDP NSpHL NSpHL-CDDP

*

Neoplasia (%)
36 4 57 7 51 6 42 6 46 5

Necrose (%)
46 8 38 6 46 5 43 7 43 9

Inflamao(%)
18 7 52 31 15 4 10 4

Dados expressos com a mdia erro padro da mdia (n = 3).

139

40m

40m

40m

Figura 2.3 - Fotomicrografias do tumor slido de Ehrlich representativas das diferentes variveis avaliadas no estudo histomorfomtrico: neoplasia (A), necrose (B) e inflamao (C). Colorao hematoxilina-eosina, aumento original x 100.

140

Na Figura 2.4 est representada a variao do peso corporal dos camundongos acometidos com tumor slido de Ehrlich e tratados com as diferentes formulaes contendo CDDP e com os controles. Independente da formulao contendo CDDP administrada, foi observada uma perda de peso significativa em relao aos grupos controle (P < 0,05). No entanto, nenhuma diferena foi observada entre os grupos tratados com CDDP livre, SpHL-CDDP e NSpHL-CDDP. Vale destacar que a dose de SpHL-CDDP e NSpHL-CDDP administrada foi duas vezes superior dose de CDDP livre e, ainda assim, a perda de peso induzida pelas duas formulaes, foi semelhante quela observada aps a administrao do frmaco livre. Considerando os resultados obtidos para o perfil de toxicidade aguda das formulaes de CDDP livre (7,5 mg/kg) e SpHL-CDDP (20 mg/kg) em camundongos Swiss, pode-se sugerir que a menor reduo do peso dos animais tratados com SpHL-CDDP (16 mg/kg) seja decorrente do menor volume tumoral observado aps este tratamento em comparao com a administrao de CDDP livre (8 mg/kg) (Figura 2.2). Nos grupos controle foi observado um pronunciado ganho de peso em todos os dias avaliados, sugerindo que esse aumento seja decorente do crescimento tumoral. Alm disso, uma taxa de mortalidade de 20% foi observada nos grupos tratados com CDDP livre e NSpHL-CDDP, enquanto nenhuma morte foi observada no grupo tratado com SpHL-CDDP. Como observado no estudo de toxicidade, os principais rgos-alvo de toxicidade foram a medula ssea e os rins. Portanto, nesse experimento esses rgos tambm foram removidos e avaliados microscopicamente quanto possveis alteraes induzidas pelas diferentes formulaes. No que diz respeito toxicidade da medula ssea, a anlise histopatolgica demonstrou uma discreta hipoplasia caracterizada por reduo dos precursores eritrocticos, mielocticos e megacariocticos com aumento do material intercelular aps o tratamento com CDDP livre, NSpHL-CDDP e SpHL-CDDP. Por outro lado, a anlise microscpica do tecido renal de camundongos mostrados). submetidos ao tratamento com as diferentes formulaes demonstrou ausncia de alteraes caractersticas de toxicidade (dados no

141

A
60

B
60

20 0 -20 -40 -60

P P L L P pH Sp H D D D D D LCD S C C

Variao do peso (%)

Variao do peso (%)

40

40 20 0 -20 -40 -60

L P P Sp H H D Sp D D D C C C N Sp H LD D P L N

Sp H

Sp H

C
60

D
40 20 0 -20 -40 -60

60 40 20 0 -20 -40 -60

Variao do peso (%)

Variao do peso (%)

tumor slido de Ehrlich e submetidos a diferentes tratamentos. Os grficos A, B, C e D representam a variao de peso observada nos dias 7, 14, 19 e 23, respectivamente, aps o incio do tratamento. Os dados foram apresentados como valores individuais de variao em cada animal comparado ao dia inicial do tratamento. Os traos horizontais indicam a mdia da variao do peso. CDDP, SpHL-CDDP e NSpHL-CDDP apresentaram diferena significativa em relao SpHL e NSpHL ao nvel de significncia de 0,05 (P < 0,05).

Figura 2.4 - Perfil de variao do peso corporal de camundongos Swiss acometidos pelo

N Sp H

Sp HL -C DD P N Sp H LC DD P

N Sp H L

C D

Sp H

LC

LC

C D DP

Sp H L

Sp H

Sp HL

D P

D D

D D

pH

L-

L-

142

3.2 Discusso

Estudos prvios demonstraram a capacidade dos SpHL-CDDP promoverem uma maior concentrao no stio tumoral. Alm disso, foi constatado que a atividade antitumoral in vivo da CDDP no foi alterada aps sua encapsulao em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada. No entanto, nenhuma diferena no efeito antitumoral foi observada aps a administrao de CDDP e SpHL-CDDP em baixas doses (8 mg/kg) (CARVALHO-JNIOR, 2008). Sabe-se que uma grande limitao na quimioterapia com CDDP a dificuldade do aumento de doses em funo de sua elevada nefrotoxicidade e, nesse trabalho, foi demonstrado que a encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP reduziu significativamente os efeitos txicos induzidos por esse agente antineoplsico. Diante disso, um esquema teraputico utilizando SpHLCDDP em doses mais elevadas poderia contribuir para uma melhor eficcia teraputica em relao CDDP livre. Nesse contexto, nessa etapa do trabalho, o efeito antitumoral de SpHL-CDDP administrado em camundongos Swiss portadores de tumor slido de Ehrlich em uma dose duas vezes superior a CDDP livre foi investigado. Os resultados desse estudo confirmaram que a encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada no altera a atividade antitumoral desse frmaco, como demonstrado anteriormente por Carvalho-Jnior (2008). Foi demonstrado tambm que SpHL-CDDP (16 mg/kg/semana, 3 semanas) teve um maior efeito antitumoral comparado com as demais formulaes contendo CDDP. Em comparao com o tratamento com CDDP livre (8 mg/kg/semana, 3 semanas), a administrao de SpHL-CDDP inibiu significativamente tanto o crescimento do tumor slido de Ehrlich de camundongos Swiss bem como o volume tumoral. Esses resultados demonstraram que SpHL-CDDP permitiu administrar doses mais elevadas do frmaco, melhorando significativamente a atividade antitumoral. Entretanto, como os tumores so heterogneos por natureza e so compostos, normalmente, por reas de edema e necrose, muitas vezes, medidas de volume do tumor no considerado um marcador preciso de eficcia antitumoral. Para melhorar avaliao da atividade antitumoral recomendado tambm a anlise microscpica dos tumores (VASSILEVA et al., 2007). Neste contexto, embora no

143

tenha sido observada diferena significativa nos parmetros avaliados por histomorfometria, detectou-se uma maior tendncia diminuio na rea de necrose e no processo inflamatrio e aumento das clulas neoplsicas no grupo tratado com SpHL-CDDP em comparao com o grupo controle e CDDP livre. Esses achados associados reduo do volume tumoral sugerem um comprometimento da proliferao celular e da apoptose induzida pela CDDP. Possivelmente, uma menor taxa proliferativa seja decorrente da concentrao aumentada de CDDP na regio tumoral quando administrada sob a forma de SpHLCDDP em comparao com a adminstrao de CDDP livre, como demonstrado anteriormente (CARVALHO-JNIOR et al., 2007a). Alm disso, alguns estudos sugerem diferenas no mecanismo de induo de apoptose entre CDDP livre e CDDP associada a nanopartculas, sendo que nveis significativamente mais elevados foram observados aps a administrao de nanopartculas polimricas de CDDP (MORENO et al., 2009). Boulikas (2007) tambm demonstrou que o Lipoplatin induz morte celular por apoptose tanto em clulas neoplsicas como em clulas endoteliais da musculatura vascular da regio tumoral, sugerindo tambm um papel antiangiognico dessa formulao. Por outro lado, o tratamento com SpHL-CDDP tambm foi mais eficaz na inibio do crescimento tumoral do que NSpHL-CDDP, sugerindo portanto que a composio lipdica tem um papel importante no aumento da resposta antitumoral. A presena de DOPE na bicamada confere propriedades fusognicas s vesculas lipdicas e, possivelmente, a caracterstica de pH-sensibilidade conferida pela associao entre DOPE e CHEMS garante uma liberao preferencial da CDDP na regio tumoral. Com relao toxicidade, SpHL-CDDP mostrou ser menos txico que CDDP livre e NSpHL-CDDP visto que a administrao de CDDP livre e NSpHL-CDDP induziu 20% de morte dos camundongos e nenhuma morte foi observada no grupo tratado com SpHL-CDDP. Alm disso, ausncia de alterao morfolgica do tecido renal foi observada aps a injeo das diferentes formulaes, demonstrando que mesmo aps trs administraes de uma dose duas vezes superior CDDP livre, SpHLCDDP foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pela CDDP. No entanto, uma discreta mielotoxicidade foi detectada aps o tratamento com as diferentes formulaes contendo CDDP. Efeitos sobre os parmetros hematolgicos devido administrao repetida de uma formulao lipossomal contendo CDDP bem como

144

ausncia de toxicidade renal foram anteriormente documentados em modelos experimentais (BOULIKAS, 2004). Esses resultados demonstram que a encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis reduz a toxicidade renal mesmo quando administrada em modelos experimentais acometidos com tumor slido de Ehrlich. Diante do exposto, pode-se concluir que SpHL-CDDP uma alternativa potencial para o tratamento de tumores slidos que respondem a terapia com CDDP. O uso dessa formulao poder possibilitar o ajuste de doses, permitindo alcanar melhor eficcia teraputica e menor toxicidade comumente induzida pela CDDP.

145

CONCLUSES GERAIS

146

CONCLUSES

Os resultados do presente estudo demonstraram diferenas importantes no perfil toxicolgico e na atividade antitumoral dos SpHL-CDDP em relao CDDP livre, permitindo concluir que: A encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis de circulao prolongada reduz a toxicidade induzida pela CDDP em comparao com a sua forma livre, aumentando significativamente a DL50 e a DMT aps a administrao IP e IV. SpHL-CDDP induziu menos alteraes hematolgicas que a CDDP livre e nenhum comprometimento da medula ssea foi detectado aps quatorze dias de investigao, demonstrando que SpHL-CDDP menos mielotxico que a CDDP livre tanto aps administrao IP quanto IV. Uma reduo significativa da toxicidade renal foi observada aps a administrao de SpHL-CDDP por via IP e IV em comparao com a administrao de CDDP livre. Essa menor nefrotoxicidade foi evidenciada tanto pelos parmetros bioqumicos quanto pela avaliao histopatolgica e foi atribuda menor reteno de CDDP no tecido renal aps o tratamento com SpHL-CDDP em relao ao tratamento com a CDDP livre. Alteraes pouco expressivas nos parmetros indicativos de toxicidade heptica foram detectadas aps o tratamento com SpHL-CDDP e nenhuma alterao morfolgica foi observada aps administrao por ambas as vias investigadas. O tratamento com SpHL-CDDP tanto por via IP quanto por via IV mostrou ser mais seguro em relao administrao de CDDP livre, no que se refere mielotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, demonstrando os efeitos benficos dessa formulao e sua potencialidade para aplicao clnica.

147

SpHL-CDDP permitiu administrar doses mais elevadas do frmaco, melhorando significativamente a atividade antitumoral em modelo experimental de tumor slido de Ehrlich em comparao com a CDDP livre. Os resultados do presente trabalho demonstram o potencial dos SpHL-CDDP para aplicao teraputica em pacientes com tumores malignos que respondem ao tratamento com CDDP, visto que SpHL-CDDP podero contornar problemas limitantes da terapia tais como a dificuldade de ajuste de doses e principalmente a nefrotoxicidade induzida pela CDDP.

148

PERSPECTIVAS

149

PERSPECTIVAS

Com base nos resultados do presente trabalho, pode-se propor algumas perspectivas, a saber: Avaliar a toxicidade de SpHL-CDDP em esquemas de doses repetidas. Avaliar a toxicidade de SpHL-CDDP em modelo no roedor. Avaliar, por tcnicas imunoistoqumicas, o ndice proliferativo e apopttico das clulas neoplsicas do tumor slido de Ehrlich tratado com SpHL-CDDP e CDDP livre. Estudar a atividade antitumoral em esquemas teraputicos utilizando a DMT para os SpHL-CDDP, acompanhando os animais por um maior perodo de tempo. Avaliar a eficcia antitumoral de SpHL-CDDP em outros modelos experimentais.

150

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

151

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALBERTS, D. S.; MARKMAN, M.; MUGGIA, F.; OZOLS, R. F.; ELDERMIRE E.; BOOKMAN, M. A.; CHEN, T.; CURTIN, J.; HESS, L. M.; LIEBES L.; YOUNG, R. C.; TRIMBLE, E. Proceedings of a GOG workshop on intraperitoneal therapy for ovarian cancers. Gynecol. Oncol., v. 103, p. 783-792, 2006. ALLEN, T. M.; CHONN, A. Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system. FEBS Lett., v. 223, p. 42-46, 1987. ALLEN, T. M.; HANSEN, C. Pharmokinetics of stealth versus conventional liposomes effect of dose. Biochim. Biophys. Acta, v. 1068, p. 133-141, 1991. ALMEIDA, V. L.; LEITO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.; DONNICI, C. L.; LOPES, M. T. P. Cncer e agentes antineoplsicos ciclo-celular especficos e ciclocelular no especficos que interagem com o DNA: uma introduo. Quim. Nova, v. 28, p. 118-129, 2005. ARAJO, J. G. V. C.; MOTA, L. G.; CARDOSO, V. N.; COELHO, L. G. V., SAVASSI-ROCHA, P. R.; PEREIRA, M. T.; DE OLIVEIRA, M. C. Tissue distribution of long-circulating pH-sensitive liposomal and free cisplatin in Ehrlich ascitic tumor bearing mice after intraperitoneal administration. In: ENCONTRO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PESQUISA EM MATERIAIS, 7. 2008. Guaruj. Anais do VII Encontro da SBPMAT. Guaruj, 2008. 1 CD-ROM. ARMSTRONG, D. K.; BUNDY, B.; WENZEL, L.; HUANG, H. Q.; BAERGEN, R.; LELE, S.; COPELAND, L. J.; WALKER, J. L.; BURGER, R. A. Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer. N. Engl. J. Med., v. 354, p. 34-43, 2006. ASNA, N.; LEWY, H.; ASHKENAZI, I. E.; DEUTSCH, V.; PERETZ, H.; INBAR, M.; RON, I. G. Time dependent protection of amifostine from renal and hematopoietic cisplatin induced toxicity. Life Sci., v. 76, p. 1825-1834, 2005. BAIREY, O.; BISHARA, J.; STAHL, B.; SHAKLAI, M. Severe tissue necrosis after cisplatin extravasation at low concentration: possible "immediate recall phenomenon". J. Natl. Cancer Inst., v. 89, p. 1233-1234, 1997. BANGHAN, A. D.; STANDISH, M. M.; WATKINS, J. C. Diffusion of univalent ions the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol., v. 13, p. 238-252, 1965. BARTLETT, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem., v. 234, p. 466-468, 1959. BATISTA, C. M.; CARVALHO, C. M. B.; MAGALHES, N. S. S. Lipossomas e suas aplicaes teraputicas: Estado da arte. Braz. J. Pharm. Sci., v. 43, p. 167-179, 2007. BOULIKAS, T. Low toxicity and anticancer activity of a novel liposomal cisplatin (Lipoplatin) in mouse xenografts. Oncol. Rep., v. 12, p. 3-12, 2004.

152

BOULIKAS, T. Molecular mechanisms of cisplatin and its liposomally encapsulated form, Lipoplatin. Lipoplatin as a chemotherapy and antiangiogenesis drug. Cancer Ther., v. 5, p. 349-376, 2007. BOULIKAS, T.; VOUGIOUKA, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level (Review). Oncol. Rep., n. 10, p. 1663-1682, 2003. BRASILEIRO-FILHO, G.; PEREIRA, F. E. L.; GUIMARES, R. C. Distrbios do Crescimento e da Diferenciao Celular. In: Brasileiro-Filho, G. Bogliolo Patologia. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. p. 175-236. BURGER, K. N.; STAFFHORST, R. W.; VIJLDER, H. C.; VELINOVA, M. J.; BOMANS, P. H.; FREDERIK, P. M.; DE KRUIJFF, B. Nanocapsules: lipid-coated aggregates of cisplatin with high cytotoxicity, Nat. Med., v. 8, p. 81-84, 2002. CARVALHO-JNIOR, A. D. Avaliao Pr-Clnica de Lipossomas pH-Sensveis de Longa Circulao contendo Cisplatina. 2008. 93 f. Tese (Doutorado em Cincias Farmacuticas). Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2008. CARVALHO-JNIOR, A. D.; MOTA, L. G.; NUNAN, E. A.; WAINSTEIN, A. J.; WAINSTEIN, A. P.; LEAL, A. S.; CARDOSO, V. N.; DE OLIVEIRA, M. C. Tissue distribution evaluation of stealth pH-sensitive liposomal cisplatin versus free cisplatin in Ehrlich tumor-bearing mice. Life Sci., v. 80, p. 659-664, 2007a. CARVALHO-JNIOR, A. D.; VIEIRA, F. P.; MELO, V. J. M.; LOPES, M. T. P.; SILVEIRA, J. N.; RAMALDES, G. A.; GARNIER-SUILLEROT, A.; PEREIRA-MAIA, E. C.; DE OLIVEIRA, M. C. Preparation and cytotoxicity of cisplatin loaded liposomes. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 40, p. 1149-1157, 2007b. CHAUFFERT, B.; FAVOULET, P.; POLYCARPE, E.; DUVILLARD, C.; BELTRAMO, J. L.; BICHAT, F.; RAT, P.; GENNE, P.; BENOIT, L. Rationale supporting the use of vasoconstrictors for intraperitoneal chemotherapy with platinum derivatives. Surg. Oncol. Clin. N. Am., v. 12, p. 835-848, 2003. CHU, G. Cellular responses to cisplatin. The roles of DNA-binding proteins and DNA repair. J. Biol. Chem., v. 269, p. 787-790, 1994. DAGLI, M. L. Z.; GUERRA, J. L.; SALDIVA, P. H. N. An experimental study on the lymphatic dissemination of the solid Ehrlich tumor in mice. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v. 29, p. 97-103, 1992. DEKANT, W.; VAMVAKAS, S. Biotransformation and membrane transport in nephrotoxicity. Crit. Rev. Toxicol., v. 26, p. 309-334, 1996. DE OLIVEIRA, M. C.; FATTAL, E.; COUVREUR, P.; LESIEUR, P.; BOURGAUX, C.; OLLIVON, M.; DUBERNET, C. pH-sensitive liposomes as a carrier for oligonucleotides: a physico-chemical study of the interaction between DOPE and a 15-mer oligonucleotide in quasi-anhydrous samples. Biochim. Biophys. Acta, v. 1372, p. 301-310, 1998.

153

DEVARAJAN, P.; TARABISHI, R.; MISHRA, J.; MA, Q.; KOURVETARIS, A.; VOUGIOUKA, M.; BOULIKAS, T. Low renal toxicity of Lipoplatin compared to cisplatin in animals. Anticancer Res., v. 24, p. 2193-2200, 2004. EHRLICH, P. Experimentelle carcinomstudien an Musen. Arb. Inst. Exp. Ther. Frankfurt, v. 1, p. 78-80, 1906. EUROPEAN MEDICINES AGENCY - EMEA. Note for Guidance on the Pre-Clinical Evaluation of Anticancer Medicinal Products CPMP/SWP/997/96. 1998. Disponvel em: <http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/swp/099796en.pdf> Acesso em: 06 maio 2009. FAVOULET, P.; MAGNIN, G.; GUILLAND, J. C.; BELTRAMO, J. L.; OSMAK, L.; BENOIT, L.; RAT, P.; DOUVIER, S.; DUVILLARD, C.; CHAUFFERT, B. Pre-clinical study of the epinephrine-cisplatin association for the treatment of intraperitoneal carcinomatosis. Eur. J. Surg. Oncol., v. 27, p. 59-64, 2001. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA. Guidance for Industry and Reviewers Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. 2005. Disponvel em: < http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Gu idances/UCM078932.pdf >. Acesso em: 10 dezembro 2009. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA. Guidance for Industry - Single Dose Acute Toxicity for Pharmaceuticals. 1996. Disponvel em: < http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Gu idances/UCM079270.pdf>. Acesso em: 06 maio 2009. FERRARI, M. Cancer nanotechnology: opportunities and challenges. Nat. Rev. Cancer, v. 5, p. 161-171, 2005. FOURNIER, C.; HECQUET, B.; BASTIAN, G.; KHAYAT, D. Modification of the physicochemical and pharmacological properties of anticancer platinum compounds by commercial 5-fluorouracil formulations: a comparative study using cisplatin and carboplatin. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 29, p. 461-466, 1992. GABIZON, A.; PAPAHADJOPOULOS, D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearance in vivo. Biochim. Biophys. Acta, v. 1103, p. 94-100, 1992. GONZALEZ, V. M.; FUERTES, M. A.; ALONSO, C.; PEREZ, J. M. Is cisplatin induced cell death always produced by apoptosis? Mol. Pharmacol., v. 59, p. 657 663, 2001 GORE, M.; DU, B. A.; VERGOTE, I. Intraperitoneal chemotherapy in ovarian cancer remains experimental. J. Clin. Oncol., v. 24, p. 4528-4530, 2006. GREGORIADIS, G.; LEATHWOOD, P. D.; RYMAN, B. E. Enzyme entrapment in liposomes. FEBS Lett., v.14, p.95-99, 1971.

154

GULINO, P. M.; GRANTHAM, F. H.; SMITH, S. H.; HAGGERTY, A. C. Modification of the acid-basic status of the internal milieu of tumors. J. Natl. Cancer Inst., v. 34, p. 857-869, 1967. GYTON, A. C.; HALL, J. E. Os lquidos corporais e os rins. In:____. Fisiologia Humana e Mecanismos das Doenas. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. p. 179-244. HANIGAN, M. H.; DEVARAJAN, P. Cispaltin nephrotoxicity: molecular mechanisms. Cancer Ther., v. 1, p. 47-61, 2003. HARRINGTON, K. J.; LEWANSKI, C. R.; NORTHCOTE, A. D.; WHITTAKER, J.; WELLBANK, H.; VILE, R. G.; PETERS, A. M.; STEWART, J. S. Phase I-II study of pegylated liposomal cisplatin (SPI-077) in patients with inoperable head and neck cancer. Ann. Oncol., v. 12, p. 493-496, 2001. HARRINGTON, K. J.; LEWANSKI, C. R.; STEWART, J. S. W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer. Part 1: preclinical development. Clin. Oncol. v. 12, p. 2-15, 2000. HOSSNE, R. S. Tumor heptico experimental (VX-2) em coelho: implantao do modelo no Brasil. Acta Cir. Bras., v. 17, p. 208-210, 2002. INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION ICH. Nonclinical Evaluation for Anticancer Pharmaceuticals. 2008. Disponvel em: <http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA4917.pdf> Acesso em: 28 abril 2009. INSTITUTO NACIONAL DO CANCER INCA. 2009. Incidncia de cncer no Brasil. Disponvel em: <http://www.inca.gov.br/estimativa/2010/estimativa20091124.pdf> Acesso em: 24 novembro 2009. JAIN, N.; LAM Y. M.; PYM, J.; CAMPLING, B. G. Mechanisms of resistance of human small cell lung cancer lines selected in VP-16 and cisplatin. Cancer v. 77, p. 1797-1808, 1996. KINTZEL, P. E. Anticancer drug-induced kidney disorders. Drug Saf., v. 24, p. 1938, 2001 KLIBANOV, A. L.; MARUYAMAL, K.; TORCHILIN, V. P.; HUANG, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett., v. 268, p.235-237, 1990. KODAMA, M.; KODAMA, T. Enhancing effect of hydrocortisone on hematogenous metastasis of Ehrlich ascites tumor in mice. Cancer Res., v. 35, p.1015-1021, 1975. KONDAGUNTA, G. V.; BACIK, J.; DONADIO, A.; BAJORIN, D.; MARION, S.; SHEINFELD, J.; BOSL, G. J.; MOTZER, R. J. Combination of paclitaxel, ifosfamide and cisplatin is an effective second-line therapy for patients with relapsed testicular germ cell tumors. J. Clin. Oncol., v. 23, p. 6549-6555, 2005.

155

KRAMER, J. W.; HOFFMAN, W. E. Clinical Enzymology. In: KANEKO, J. J.; HARVEY, J. W.; BRUSS, M. L. Clinical biochemistry of domestic animals. 5 ed. California: Academic Press, 1997. p. 303-325. KUMAGAI, S.; SUGIYAMA, T.; NISHIDA, T.; USHIJIMA, K.; YAKUSHIJI, M. Improvement of intraperitoneal chemotherapy for rat ovarian cancer using cisplatincontaining microspheres. Jap. J. Cancer Res., v. 87, p. 412-417, 1996. LASIC, D. D. Novel applications of liposomes. Trends Biotechnol., v. 16, p. 307321, 1998. LEVI, J. A.; ARONEY, R. S.; DALLEY, D. N. Haemolytic anaemia after cisplatin treatment. Br. Med. J., v. 282, p. 2003-2004, 1981. LITCHFIELD J. T.; WILCOXON F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 96, p. 99-113, 1949. MAEDA, H.; WU, J.; SAWA, T.; MATSUMURA, Y.; HORI, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J.Control. Release, v. 65, p. 271-84, 2000. MALOISEL, F.; KURTZ, J. E.; ANDRES, E.; GORODETSKY, C.; DUFOUR, P.; OBERLING, F. Platin salts-induced hemolytic anemia: cisplatin- and the first case of carboplatin-induced hemolysis. Anticancer Drugs, v. 6, p.324-326, 1995. MARKMAN, M.; WALKER, J.L. Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment. J. Clin. Oncol., v. 24, p. 988994, 2006. MARTINDALE: The Extra Pharmacopoeia. 34 ed. London: The Pharmaceutical Press, 2005. p. 538-539. MATTHEOLABAKIS, G.; TAOUFIK, E.; HARALAMBOUS, S.; ROBERTS, M. L.; AVGOUSTAKIS, K. In vivo investigation of tolerance and antitumor activity of cisplatin-loaded PLGA-mPEG nanoparticlees. Eur. J.Pharm.Biopharm., v. 71, p. 190-195, 2009. MEYER, O.; SVENDSEN, O. Animal Models in Pharmacology and Toxicology. In: HAU, J.; VAN HOOSIER, G. L. Handbook of laboratory animals science, 2. ed. New York: CRC Press, 2003, cap. 2. MILLER, O. Bioqumica do Sangue - Substncias no eletrolticas. In: MILLER, O.; GONALVES, R. R. Laboratrio para o Clnico. 8. ed. So Paulo: Atheneu, 1999. p. 3-31 MILLER, O.; GONALVES, R. R. Bioqumica do Sangue - Enzimas. In: ___. Laboratrio para o Clnico. 8. ed. So Paulo: Atheneu, 1999. p. 55-65.

156

MIRSALIS, J. C.; SCHINDLER-HORVAT, J.; HILL, J. R.; GREEN, C. E.; MITOMA, C.; TOMASZEWSKI, J. E.; TYSON, C. A.; DONOHUE, S. J. Toxicity of a quinorcarmycin analog, DX-52-1, in rats and dogs in relation to clinical outcome. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 51, p. 193-201, 2003. MIZUMURA, Y.; MATSUMURA, Y.; HAMAGUCHI, T.; NISHIYAMA, N.; KATAOKA, K.; KAWAGUCHI, T.; HRUSHESKY, W. J.; MORIYASU, F.; KAKIZOE T. Cisplatinincorporated polymeric micelles eliminate nephrotoxicity, while maintaining antitumor activity. Jpn. J. Cancer Res., v. 92, p. 328-336, 2001. MONTI, E.; GARIBOLDI, M.; MAIOCCHI, A.; MARENGO, E.; CASSINO, C.; GABANO, E.; OSELLA, D. Cytotoxicity of cis-platinum(II) conjugate models. The effect of chelating arms and leaving groups on cytotoxicity: a quantitative structureactivity relationship approach. J. Med. Chem., v. 48, p. 857-866, 2005. MORENO, D.; ZALBA, S.; NAVARRO, I.; TROS DE ILARDUYA, C.; GARRIDO, M. J. Pharmacodynamics of cisplatin-loaded PLGA nanoparticles administered to tumor-bearing mice. Eur. J. Pharm. Biopharm., doi:110.1016/j.ejpb.2009.10.005, 2009. MUGGIA, F. M.; FOJO, T. Platinums: extending their therapeutic spectrum. J. Chem., v. 16, p. 77-82, 2004. NEWMAN, M. S.; COLBERN, G. T.; WORKING, P. K.; ENGBERS, C.; AMANTEA, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 43, p. 1-7, 1999. NISHIYAMA, N.; OKAZADI, S.; CABRAL, H.; MIYAMOTO, M.; KATO, Y.; SUGIYAMA, Y.; NISHIO, K.; MATSUMURA, Y.; KATAOKA, K. Novel cisplatin incorporated polymeric micelles can eradicate solid tumors in mice. Cancer Res., v. 63, p. 8977-8983, 2003. OOYAMA, A.; OKA, T.; ZHAO, H.; YAMAMOTO, M.; AKIYAMA, S.; FUKUSHIMA, M. Anti-angiogenic effect of 5-Fluorouracil-based drugs against human colon cancer xenografts. Cancer Lett., v. 267, p. 26-36, 2008. PHILLIPS, W. T.; MEDINA, L. A.; KLIPPER, R.; GOINS, B. A novel approach for the increased delivery of pharmaceutical agents to peritoneum and associated lymph nodes. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 303, p. 11-16, 2002. PRATIBA, R.; SAMEER, R.; RATABOLI, P. V.; BHIWGADE, D. A.; DHUME, C.Y. Enzymatic studies of cisplatin induced oxidative stress in hepatic tissue of rats. Eur. J. Pharmacol., v. 532, p. 290-293, 2006. RABIK, C. A.; DOLAN, M. E. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents. Cancer Treat. Rev., v. 33, p. 9-23, 2007.

157

ROSENBERG, B.; VAN CAMP, L.; TROSKO, J. E.; MANSOUR, V. H. Platinum compounds: a new class of potent antitumour agents. Nature, v. 222, p. 385-386, 1969. SCHRIJVERS, D. L. Extravasation: a dreaded complication of chemotherapy. Ann. Oncol., v. 14 (supplement 3) iii26-iii30, 2003 SIMES S.; MOREIRA, J. M.; FONSECA, C.; DZGNES, N.; LIMA, M. C. P. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Adv. Drug Deliv. Rev., v. 56, p. 947 965, 2004. STATHOPOULOS, G. P.; BOULIKAS, T.; VOUGIOUKA, M.; DELICONSTANTINOS, G.; RIGATOS, S.; DARLI, E.; VILIOTOU, V.; STATHOPOULOS, J. G. Pharmacokinetics and adverse reactions of a new liposomal cisplatin (Lipoplatin): phase I study. Oncol. Rep., v. 13, p. 589-595, 2005. STEERENBERG, P. A.; STORM, G.; DE GROOT, G.; CLAESSEN, A.; BERGERS, J. J.; FRANKEN, M. A.; VAN HOESEL, Q. G.; WUBS, K. L.; DE JONG, W. H. Liposomes as drug carrier system for cis-diamminedichloroplatinum (II). II: Antitumour activity in vivo, induction of drug resistance, nephrotoxicity and Pt distribution. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 21, p. 299307, 1988. STUBBS, M.; Mc SHEEHY, P. M. J.; GRIFFITHS, R. Causes and consequences of acidic pH in tumors: a magnetic resonance study. Adv. Enzime Regul., v. 39, p. 1330, 1999. TAMURA, T.; IMAI, J.; MATSUMOTO, A.; TANIMOTO, M.; SUZUKI, A.; HORIKIRI, T.; SUZUKI, T.; YOSHINO, H.; IKE,O. Organ distribution of cisplatin after intraperitoneal administration of cisplatin-loaded microspheres. Eur. J. Pharm. Biopharm., v. 54, p. 1-7, 2002a. TAMURA, T.; IMAI, J.; TANIMOTO, M.; MATSUMOTO, A.; SUZUKI, A.; HORIKIRI, Y.; SUZUKI, T.; YOSHINO, H. Relation between dissolution profiles and toxicity of cisplatin-loaded microspheres. Eur. J. Pharm. Biopharm., v. 53, p. 241-247, 2002b. TAMURA, T., FUJITA, F., TANIMOTO M., KOIKE, M., SUZUKI, A., FUJITA, M., HORIKIRI, Y., SAKAMOTO, Y., SUZUKI, T., YOSHINO, H. Anti-tumor effect of intraperitoneal administration of cisplatin-loaded microspheres to human tumor xenografted nude mice. J. Cont. Release, v. 80, p. 295-307, 2002c. TAVARES, L. B. QSAR: A Abordagem de Hansch. Quim. Nova, v. 27, n. 4, p. 631639, 2004. THRALL, M. Hematologia e Bioqumica Clnica Veterinria. Roca: So Paulo, 2007. TRISSEL, L. A.; MARTINEZ, J. F. Compatibility of thiotepa (lyophilized) with selected drugs during simulated y-site administration. Am. J. Health Syst. Pharm., v. 53, p. 1041-1051, 1996.

158

UEHARA, T.; WATANABE, H.; ITOH, F.; INOUE, S.; KOSHIDA, H.; NAKAMURA, M.; YAMATE, J.; MARUYAMA, T. Nephrotoxicity of a novel antineoplastic platinum complex, nedaplatin: a comparative study with cisplatin in rats. Arch. Toxicol., v. 79, n. 8, p. 451-460, 2005. ULRICH, A. S. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. Biosci. Rep., v. 22, p. 129-150, 2002. VASSILEVA, V.; GRANT, J.; SOUZA, R.; ALLEN, C.; PIQUETTE-MILLER, M. Novel biocompatible intraperitoneal drug delivery system increases tolerability and therapeutic efficacy of paclitaxel in a human ovarian cancer xenograft model. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 60, p. 907-914, 2007. VELINOVA, M. J.; STAFFHORST, R. W. H. M.; MULDER, W. J. M.; DRIES, A. S.; JANSEN, B. A. J.; KRUIJFF, B.; KROON, A. I. P. M. Preparation and stability of lipid-coated nanocapsules of cisplatin: anionic phospholipid specificity. Biochim. Biophys. Acta, v. 1663, p.135-142, 2004. VIEIRA, F. P. Desenvolvimento de lipossomas pH-sensveis de cisplatina: aspectos farmacotcnicos e avaliao da atividade antitumoral. 2003. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas) Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2003. XU, P.; VAN KIRK, E. A.; MURDOCH, W. J.; ZHAN, Y.; ISAAK, D. D.; RADOSZ, M.; SHEN, Y. Anticancer efficacies of cisplatin-releasing pH-responsive nanoparticles. Biomacromolecules, v. 7, p. 829-835, 2006. YAO, X.; PANICHPISAL, K.; KURTZMAN, N.; NUGENT, K. Cisplatin nephrotoxicity: a review. Am. J. Med. Sci., v. 334, p. 115-124, 2007. WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION. Handbook Non Clinical Safety Testing. Geneva: TDR/WHO, 2004. 117p. Disponvel em: <http://apps.who.int/tdr/publications/training-guideline-publications/handbook-nonclinical-safety-testing/pdf/safety_handbook.pdf>. Acesso em: 06 mai 2009. WORKING, P. K; NEWMAN, M. S.; SULLIVAN, T.; BRUNNER, M.; PODELL, M.; SAHENK, Z.; TURNER N. Comparative intravenous toxicity of cisplatin solution and cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes in cynomolgus monkeys. Toxicol. Sci., v. 46, p. 155-165, 1998. ZICCA, A.; CAFAGGI, S.; MARIGGIO, M.; VANNOZI, M. O.; OTTONE, M.; BOCCHINI, V.; CAVIGLIOLI, G.; VIALE, M. Reduction of cisplatin hepatotoxicity by procainamide hydrochloride in rats. Eur. J. Pharmacol., v. 442, p. 265-272, 2002.

159

APNDICES

160

APNDICE A Dados individuais de volume do tumor de camundongos Swiss fmeas portadores de tumor slido de Erlich submetidos a diferentes tratamentos. Grupo SpHL
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Mdia Erro Padro

D0 350 291 345 298 353 262 236 307 362 312 262 329 236 345 297 306 11

D2 498 443 657 443 424 366 420 411 633 529 513 560 491 396 472 484 23

D5 617 517 584 712 667 530 618 579 746 589 710 635 528 494 582 607 20

D7 806 536 804 823 695 487 714 719 1049 640 971 902 810 654 497 741 44

D9 1066 850 810 622 638 648 727 858 1119 454 820 824 1002 565 786 51

D12 1289 736 759 653 696 1010 634 1434 740 1092 876 779 968 613 877 67

D14 1529 1436 912 846 840 1448 991 1812 974 1638 1150 1124 1244 765 1193 88

D16 1576 1813 1406 924 1123 1711 1320 2023 1257 2271 1410 1456 1245 1006 1467 102

D19 2665 1956 1484 1715 1300 2321 1638 2523 2100 2206 1810 1811 1452 1405 1885 114

D21 2917 2595 2105 1961 1866 2295 1971 2925 2377 3345 2385 2248 1946 2130 2362 118

D23 3215 3087 2911 2482 2669 3339 2823 3373 3588 4089 2301 3407 3342 3168 3128 125

Grupo NSpHL
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Mdia Erro Padro

D0 334 280 346 333 270 318 330 326 325 271 339 288 325 231 314 309 9

D2 630 392 462 431 308 366 414 486 515 498 413 441 533 460 369 448 21

D5 646 560 429 674 390 399 826 526 546 450 682 399 452 583 554 541 34

D7 1003 733 694 805 692 640 1160 664 761 939 764 592 490 754 577 751 46

D9 1012 911 1020 891 587 884 1180 589 935 840 703 680 918 1166 886 880 48

D12 1376 1146 1189 1397 878 839 1799 813 756 1095 872 775 870 1269 1005 1072 79

D14 1528 2009 1747 1813 1203 1781 2092 1149 1005 1212 1166 1252 1221 1712 1345 1482 93

D16 1611 2567 2129 2159 1232 2275 1587 1234 1707 1477 1533 1380 1985 2221 1586 1779 110

D19 2801 2478 2189 3065 1906 2419 4617 1480 2099 1747 2306 1500 2339 3634 2533 2474 212

D21 3176 2995 2221 2676 1499 2407 4094 2164 2428 1972 1398 1339 1702 3447 2593 2407 212

D23 3794 4684 4549 4297 1960 2513 5500 1686 3172 2332 4486 1984 2339 4847 3781 3462 396

161

Grupo CDDP
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Mdia Erro Padro

D0 376 492 435 446 369 459 374 391 371 426 319 346 377 425 391 400 12

D2 492 792 475 494 668 621 595 495 566 582 659 590 436 702 433 573 28

D5 669 871 607 745 912 567 687 492 593 789 880 563 569 634 428 667 39

D7 905 1354 644 1063 755 800 885 764 416 1046 835 596 841 965 630 833 60

D9 691 1310 815 914 558 812 732 669 426 896 1093 622 647 1251 537 798 69

D12 550 1751 733 895 640 544 550 1263 839 959 910 1662 1022 948 106

D14 655 1245 887 906 734 669 626 1290 1064 632 1036 1491 622 912 78

D16 1469 996 1400 652 972 933 744 1022 768 828 1756 848 1032 90

D19 908 1594 1405 968 392 687 751 864 3539 819 991 2254 1115 1249 214

D21 1173 2714 893 1156 409

D23 1420 2419 1111 1371 603

626 579 1749 519 1050 2309 883 1200 188

925 736 2630 583 1013 2923 1189 1410 215

Grupo SpHL-CDDP
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Mdia Erro Padro

D0 264 408 310 310 326 359 327 250 289 264 351 331 317 320 304 315 10

D2 229 343 345 264 358 422 386 388 302 395 318 372 201 330 332 17

D5 317 380 368 393 359 474 483 348 259 293 378 323 386 143 311 348 21

D7 387 403 540 419 622 476 548 489 410 323 466 376 528 268 358 441 25

D9 470 444 546 278 401 401 421 292 451 273 509 397 332 311 395 23

D12 415 374 498 414 330 252 272 302 368 243 506 232 313 384 350 24

D14 608 272 639 483 607 318 395 302 392 213 579 258 444 414 423 38

D16 587 337 480 388 497 148 297 354 462 128 630 215 344 422 378 40

D19 771 239 583 440 490 116 266 332 389 181 714 153 294 362 388 51

D21 645 162 590 331 435 279 477 291 116 578 179 237 388 362 46

D23 1062 181 563 453 746 207 716 333 153 1307 140 357 672 530 97

162

Grupo NSpHL-CDDP
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Mdia Erro Padro

D0 315 353 354 268 306 217 280 357 336 267 426 300 266 334 421 320 15

D2 282 369 427 338 301 293 340 379 390 461 353 336 344 343 335 353 13

D5 417 242 376 371 372 260 374 422 423 483 360 460 451 383 357 383 18

D7 526 241 550 530 538 269 504 469 823 606 443 487 266 498 439 479 40

D9 770 331 429 674 757 452 588 740 613 670 403 527 409 464 715 569 41

D12 696 355 515 578 863 435 549 899 679 443 321 399 361 411 551 537 50

D14 909 353 603 372 814 607 614 1124 463 440 421 373 571 778 533 598 62

D16 843 357 1152 546 694 311 560 912 522 364 321 224 535 563 455 557 78

D19 794 372 336 578 657 197 546 921 656 440 214 225 331 746 691 514 74

D21 698 357 377 526 598 399 538 803 622 392 330 325 329 647 691 509 50

D23 1653 657 692 729 412 556 1844 810 467

547 914 1225 875 143