7/22/2011

I Curso de Inverno em Oncologia Molecular da FMUSP 2011

ABORDAGENS MOLECULARES EM ONCOLOGIA

Tcnicas em Biologia Molecular & Celular
Irina G. Bobrovnitchaia 2011

Histrico

1595 - Inveno do Primeiro Microscpio por Hans e Zacharias Jansen

1665 - Robert Hooke, observou a cortia ao microscpio, observando pequenos compartimentos hexagonais. Cada compartimento foi chamado - CLULA.

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1953 - Watson e Crick propuseram a dupla-fita de DNA

1975 - Fred Sanger desenvolveu o mtodo da cadeia de resciso de sequenciamento do DNA, (mtodo resciso Dideoxy ou mtodo Sanger)

2007 - Craig Venter o primeiro indivduo a ter seu genoma individual completamente sequenciado.

1980 Kery Mullis e colaboradores descobrem uma forma de controlar a ao da polimerase

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Tcnicas da Biologia Molecular

MATERIAL BIOLGICO

DNA

RNA

Protena

CULTURA CELULAR

PCR

RT-PCR

SDS-PAGE

SSCP

RTqPCR

Western-Blot

MTT

FISH

ELISA

RFLP

Microarray

2D-PAGE

Imunofluorescncia

Citometria de Fluxo

Seqenciamento

Imunofluorescncia

Material Biolgico
Tecido (tumor, bulbo capilar, rgos, ...)

Fluidos (sangue, saliva, ...)

Cultura Celular (clulas em cultura)

Monocamada clulas crescem aderidas a superfcie da garrafa ou placa 3D clulas crescem em altura, largura e profundidade

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Analisar presena de mutaes

Amplificao de fragmentos de interesse

Analisar variaes

Analisar seqencias

Extrao de DNA

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PCR (Polymerase Chain Reaction)

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

A tcnica do polimorfismo de conformao de fita simples um mtodo de triagem de mutaes Permite detectar alteraes na mobilidade eletrofortica de fitas simples de cidos nuclicos em condies no-desnaturantes Detecta mudana em uma base na seqncia do cido nuclico amplificado pela PCR

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RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm)

O mtodo de polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio utiliza enzimas de restrio para deteco de mutaes e polimorfismos genticos As enzimas de restrio reconhecem stios especficos na seqncia do DNA que clivada somente quando o stio est presente, gerando fragmentos de vrios tamanhos Esses fragmentos so separados e analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida e hibridizado por Southern Blot

Seqenciamento Automtico
Tcnica utilizada para determinar a seqncia de nucleotdeos que compem o DNA Utiliza o princpio de Sanger e os ddNTPs terminais ddNTPs marcados com fluorescncia Utiliza capilares, lasers e softwares especficos Resultados analisados na forma de cromatograma

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Piroseqenciamento
Tcnica de seqenciamento baseada na deteco de pirofosfafo (PPi) liberado durante a sntese de DNA

SOLiD - ABI 454 - Roche

~120 MB de DNA/corrida ~03 GB de DNA/corrida

Solexa - Illumina
~01 GB de DNA/corrida

Personal Genome Machine

Detecta a variao dos tomos de hidrognio A capacidade consiste no chip Sinais qumicos convertidos em informao digital Sequencia genoma de microorganismos, vrus e trechos de DNA mais longos Cada novo seqenciamento requer um chip novo (custo de 500 a mil dolares)
Timina

Guanina

Citosina

Adenina

A anlise dura cerda de 2 horas

Personal Genome Machine Ion Torrent

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Obteno de cDNA

Analisar expresso gnica

Quantificar a expresso gnica

Extrao de RNA

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RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

PCR de Transcrio Reversa reao de PCR que converte mRNA em cDNA Utiliza primers inespecficos (nunca em pares) compostos por vrias timinas consecutivas hibridizados s regies Poly-A do RNA PCR catalizada pela DNA Pol I realizada para gerar dupla fita de cDNA a partir da fita simples A DNA Pol I possui atividade polimerase 5-3 e exonuclease 3-5, mas no possui a atividade exonuclease 5-3 evita degradao do cDNA

Real Time PCR (PCR em Tempo Real)

Analisa expresso gnica a partir da molecula de cDNA Utiliza primers (sondas) e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes Detecta da fluorescncia emitida durante a reao Mtodo quantitativo

So conjugadas com um fluorocromo quencher (absorve a fluorescncia do fluorocromo reporter) Duratne a amplificao ocorre separao do quencher do reporter, e na emisso da fluorescncia.

A fluorescncia emitida aumentada aps a ligao ao DNA dupla fita. Durante a extenso, SYBR green vai se ligar ao produto de PCR, resultando em um aumento de fluorescncia

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cDNA Microarray (Microarranjos de cDNA)

Tecnologia usada para detectar diferenas no nvel de expresso gnica de clulas e tecidos de interesse Possibilita estudo em grande escala (milhares de genes/experimento) Consiste em fragmentos ou sondas de cDNA conhecidos, fixos a um tipo de suporte slido em um padro ordenado O cDNA marcado com fluorocromos (Cy3 controle e Cy5 amostra) Amostras de cDNA so hibridizadas sobre os arranjos (spots), e a fluorescncia emitida detectada por um scanner

Presena de RNA do experimento RNA originado tanto do experimento quanto do controle Presena de RNA do controle

O gene em questo no est expresso nem no controle nem no experimento

cDNA array Confeco: uso de um rob para depositar sondas em um vidro Requer design do array e equipamentos in house Caracteristicas: barato, requer trabalho inicial, customizao Necessita sempre de 2 amostras (controle e referncia)

Affymetrix GeneChip Confeco: uso de um processo de litografia Tecnologia Comercial Plataformas de arrays ja definidas: Human U133, Mouse 430, ... Caractersticas: barato, no requer design, padronizao

Agilent Confeco: uso da tecnologia Inkjet Sondas com 60 bases Permite customizao Expresso controle e referencia (2 cores)

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Detectar presena da protena de interesse

Analisar o tamanho da protena

Analisar expresso da protena

Extrao de Protena

Quantificao pelo mtodo de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250)

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SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate)

SDS usado para desnaturar protenas e para cobrir as molculas da protena com cargas negativas A carga ntrinseca protena mascarada, e a razo carga/massa torna-se constante Gel de duas fases: concentrao (stacking) e resoluo (running), permite concentrar as amostras antes da corrida no gel, aumentando-se a resoluo das protenas

Western Blot
A protena alvo, observada por SDS-PAGE, identificada por anticorpo mono ou policlonal A revelao do sistema realizada com anticorpo secundrio fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das protenas

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2D-PAGE
1 etapa: Separao de protenas por massa molecular (SDS-PAGE) 2 etapa: Focalizao Isoeltrica (IEF) para determinar o ponto isoeltrico (pI) de uma determinada protena Separa protenas de pesos moleculares iguais, mas com pontos isoeltricos (pIs) diferentes, ou protenas com mesmo pI, mas pesos moleculares diferentes Gel contm gradiente de pH. A migrao se interrompe ao atingirem seu ponto isoeltrico Aplicada a molculas tanto positivamente quanto negativamente carregadas A maioria das protenas tm valores de pI na gama 4-7

Ponto Isoeltrico (pI) pH no qual h equilbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos inicos de um aminocido ou de uma protena.

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Analisar a viabilidade das clulas

Analisar estgio de diviso das clulas

Analisar o tipo de morte celular da clula

Contagem celular
Analisar os cromossom os

Analisar Ac e Ag presentes

Ensaio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)

teste colorimtrico usado para avaliar viabilidade celular MTT, quando incubado com clulas vivas, tem seu substrato quebrado por enzimas mitocondriais, transformando-se de um composto amarelo em um composto azul escuro (formazan)

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Citometria de Fluxo
Tcnica de medio das propriedades (tamanho, granulosidade, ptns de superfcie, densidade) de partculas em suspenso, orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (Laser)

Focalizao Hidrodinmica

Side Scatter

Forward Scatter

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Imunofluorescncia
Permite a deteco e localizao de Ag em clulas e tecidos utilizando Ac especficos, marcados com fluorocromos (Isotiocionato de fluorescenaFITC, rodamina, umbeliferona, ficoeritrina) Detecta e localiza Ac em fluidos biolgicos usando seu Ag correspondente Baseiase na capacidade de molculas de Ac se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade especfica com o Ag Mtodo qualitativo/semi-quantitativo Resultado visualizado ao miscroscpio de epifluorescncia

Imunofluorescncia Direta
O Ac especfico marcado com Fluorocromo (conjugado) adicionado e se fixa ao Ag, formando um imunocomplexo estvel Deteco de protenas intracelulares e sua localizao Deteco direta de microrganismos em secrees, fenotipagem de clulas tumorais, utilizada em bacteriologia

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Imunofluorescncia Indireta
Incuba-se a clula ou tecido em que se quer pesquisar o Ag com o Ac primrio ou um monoclonal, levando formao de um imunocomplexo A preparao incubada com um Ac secundrio

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Enzimaimunoensaio utilizado para deteco de Ac ou Ag presentes no soro ou meio celular O mtodo se baseia na interao antgeno-anticorpo A enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com o substrato, levando a oxidao de um cromgeno incolor, o qual desenvolver colorao dependente da concentrao de Ag/Ac pesquisados Utiliza-se base slida (placa de 96 wells) na qual Ag:Ac vo se ligar atravs de interaes hidrofbicas
Enzima Fosfatase alcalina Peroxidade Peroxidade Peroxidade Substrato P-nitrofenil-fosfato (pNPP) ABTS OPD TMB Cor Amarelo Verde Laranja Azul

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Tipos de ELISA:
Indireto conjugado se liga ao Ag do substrato Sanduche Ag se liga ao Ac ligado ao substrato, e o Ac secundrio se liga a esse complexo Competitivo detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)

FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

Tcnica de citogentica molecular Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescncia para detectar anomalias cromossmicas que esto alm do poder de resoluo da citogentica de rotina, como microdelees e rearranjos cromossmicos complexos Detecta seqncias especficas de cidos nuclicos pela formao de duplex entre a sonda e a seqncia alvo no espcime fixado Pode ser aplicada tanto para clulas em pr-metfase, metfase como em interfase

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Tipos de sondas:
Sondas Centromricas - para seqncias de DNA repetitivo localizadas no centrmero ou regio pericentromrica Sondas de seqncia - sondas especficas para determinado loco ou gene Sondas para cromossomo inteiro - Identificao da origem de material cromossmico adicional Cariotipagem por espectro multicolorido

Bioinformtica
Estudo da aplicao de tcnicas computacionais e matemticas gerao e gerenciamento de (bio)informao.

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