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7/22/2011

I Curso de Inverno em Oncologia Molecular da FMUSP 2011 ABORDAGENS MOLECULARES EM ONCOLOGIA Técnicas
I Curso de Inverno em Oncologia
Molecular da
FMUSP 2011
ABORDAGENS MOLECULARES
EM ONCOLOGIA
Técnicas em Biologia Molecular & Celular
Irina G. Bobrovnitchaia
2011

Histórico

& Celular Irina G. Bobrovnitchaia 2011 Histórico 1595 - Invenção do Primeiro Microscópio por Hans e

1595 - Invenção do Primeiro Microscópio por Hans e Zacharias Jansen

do Primeiro Microscópio por Hans e Zacharias Jansen 1665 - Robert Hooke, observou a cortiça ao

1665 - Robert Hooke, observou a cortiça ao microscópio, observando pequenos compartimentos hexagonais. Cada compartimento foi chamado - CÉLULA.

7/22/2011

7/22/2011 1953 - Watson e Crick propuseram a dupla-fita de DNA 1975 - Fred Sanger desenvolveu

1953 - Watson e Crick propuseram a dupla-fita de DNA

1953 - Watson e Crick propuseram a dupla-fita de DNA 1975 - Fred Sanger desenvolveu o
1953 - Watson e Crick propuseram a dupla-fita de DNA 1975 - Fred Sanger desenvolveu o

1975 - Fred Sanger desenvolveu o método da cadeia de rescisão de sequenciamento do DNA, (método rescisão Dideoxy ou método Sanger)

1980 – Kery Mullis e colaboradores descobrem uma forma de controlar a ação da polimerase
1980 – Kery Mullis e colaboradores
descobrem uma forma de controlar a
ação da polimerase
descobrem uma forma de controlar a ação da polimerase 2007 - Craig Venter é o primeiro

2007 - Craig Venter é o primeiro indivíduo a ter seu genoma individual completamente sequenciado.

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Técnicas da Biologia Molecular
Técnicas da Biologia Molecular
MATERIAL BIOLÓGICO CULTURA DNA RNA Proteína CELULAR PCR RT-PCR SDS-PAGE MTT FISH ELISA SSCP RTqPCR
MATERIAL
BIOLÓGICO
CULTURA
DNA
RNA
Proteína
CELULAR
PCR
RT-PCR
SDS-PAGE
MTT
FISH
ELISA
SSCP
RTqPCR
Western-Blot
Citometria de
Imunofluorescência
RFLP
Microarray
2D-PAGE
Fluxo
Imunofluorescência
Seqüenciamento

Material Biológico

Imunofluorescência Seqüenciamento Material Biológico – Tecido (tumor, bulbo capilar, órgãos, – Fluidos

Tecido (tumor, bulbo capilar, órgãos,

– Tecido (tumor, bulbo capilar, órgãos, – Fluidos (sangue, saliva, )

Fluidos (sangue, saliva,

– Tecido (tumor, bulbo capilar, órgãos, – Fluidos (sangue, saliva, )

)

bulbo capilar, órgãos, – Fluidos (sangue, saliva, ) – Cultura Celular (células em cultura) ) •

Cultura Celular (células em cultura)

)

saliva, ) – Cultura Celular (células em cultura) ) • Monocamada – células crescem aderidas a
saliva, ) – Cultura Celular (células em cultura) ) • Monocamada – células crescem aderidas a
saliva, ) – Cultura Celular (células em cultura) ) • Monocamada – células crescem aderidas a

Monocamada células crescem aderidas a superfície da garrafa ou placa

3D células crescem em altura, largura e profundidade

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Analisar presença de mutações Amplificação de fragmentos de interesse Analisar variações Analisar
Analisar
presença de
mutações
Amplificação
de
fragmentos
de interesse
Analisar
variações
Analisar
seqüencias

Extração de DNA

mutações Amplificação de fragmentos de interesse Analisar variações Analisar seqüencias Extração de DNA 4
mutações Amplificação de fragmentos de interesse Analisar variações Analisar seqüencias Extração de DNA 4

7/22/2011

PCR (Polymerase Chain Reaction)

7/22/2011 • PCR (Polymerase Chain Reaction) SSCP ( Single-Strand Conformation Polymorphism ) – A técnica do
7/22/2011 • PCR (Polymerase Chain Reaction) SSCP ( Single-Strand Conformation Polymorphism ) – A técnica do

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

A técnica do polimorfismo de conformação de fita simples é um método de triagem de mutações

Permite detectar alterações na mobilidade eletroforética de fitas simples de ácidos nucléicos em condições não-desnaturantes

Detecta mudança em uma base na seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR

condições não-desnaturantes – Detecta mudança em uma base na seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR
condições não-desnaturantes – Detecta mudança em uma base na seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR

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RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm)

O método de polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrição utiliza enzimas de restrição para detecção de mutações e polimorfismos genéticos

As enzimas de restrição reconhecem sítios específicos na seqüência do DNA que é clivada somente quando o sítio está presente, gerando fragmentos de vários tamanhos

Esses fragmentos são separados e analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida e hibridizado por Southern Blot

em gel de poliacrilamida e hibridizado por Southern Blot Seqüenciamento Automático – Técnica utilizada para
em gel de poliacrilamida e hibridizado por Southern Blot Seqüenciamento Automático – Técnica utilizada para

Seqüenciamento Automático

Técnica utilizada para determinar a seqüência de nucleotídeos que compõem o DNA

Utiliza o princípio de Sanger e os ddNTPs terminais

ddNTPs marcados com fluorescência

Utiliza capilares, lasers e softwares específicos

Resultados analisados na forma de cromatograma

– Utiliza capilares, lasers e softwares específicos – Resultados analisados na forma de cromatograma 6
– Utiliza capilares, lasers e softwares específicos – Resultados analisados na forma de cromatograma 6

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Piroseqüenciamento

Técnica de seqüenciamento baseada na detecção de pirofosfafo (PPi) liberado durante a síntese de DNA

SOLiD - ABI ~03 GB de DNA/corrida 454 - Roche Solexa - Illumina
SOLiD - ABI
~03 GB de DNA/corrida
454 - Roche
Solexa - Illumina

~120 MB de DNA/corrida

~01 GB de DNA/corrida

Personal Genome Machine

Personal Genome Machine – Ion Torrent Guanina Citosina Adenina Timina
Personal Genome Machine – Ion Torrent
Guanina
Citosina
Adenina
Timina

Detecta a variação dos átomos de hidrogênio

A capacidade consiste no chip

Sinais químicos convertidos em informação digital

Sequencia genoma de

microorganismos, vírus e trechos de DNA mais longos

Cada novo seqüenciamento requer

um chip novo (custo de 500 a mil dolares)

A análise dura cerda de 2 horas

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Obtenção de cDNA Analisar expressão gênica Quantificar a expressão gênica
Obtenção de
cDNA
Analisar
expressão gênica
Quantificar a
expressão gênica

Extração de RNA

7/22/2011 Obtenção de cDNA Analisar expressão gênica Quantificar a expressão gênica Extração de RNA 8

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RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

PCR de Transcrição Reversa reação de PCR que converte mRNA em cDNA

Utiliza primers inespecíficos (nunca em pares) compostos por várias timinas consecutivas hibridizados às regiões Poly-A do RNA

PCR catalizada pela DNA Pol I é realizada para gerar dupla fita de cDNA a partir da fita simples

A DNA Pol I possui atividade polimerase 5’-3’ e exonuclease 3’-5’, mas não possui a atividade exonuclease 5’-3’ – evita degradação do cDNA

exonuclease 5’ - 3’ – evita degradação do cDNA Real Time PCR (PCR em Tempo Real)

Real Time PCR (PCR em Tempo Real)

Analisa expressão gênica a partir da molecula de cDNA

Utiliza primers (sondas) e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes

Detecta da fluorescência emitida durante a reação

Método quantitativo

emitida durante a reação – Método quantitativo São conjugadas com um fluorocromo quencher (absorve a

São conjugadas com um fluorocromo quencher (absorve a fluorescência do fluorocromo reporter)

Duratne a amplificação ocorre separação do quencher do reporter, e na emissão da fluorescência.

do quencher do reporter, e na emissão da fluorescência. A fluorescência emitida é aumentada após a

A fluorescência emitida é aumentada após a ligação ao DNA dupla fita.

Durante a extensão, SYBR green vai se ligar ao produto de PCR, resultando em um aumento de fluorescência

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cDNA Microarray (Microarranjos de cDNA)

Tecnologia usada para detectar diferenças no nível de expressão gênica de células e tecidos de interesse

Possibilita estudo em grande escala (milhares de genes/experimento)

Consiste em fragmentos ou sondas de cDNA conhecidos, fixos a um tipo de suporte sólido em um padrão ordenado

O cDNA é marcado com fluorocromos (Cy3 controle e Cy5 amostra)

Amostras de cDNA são hibridizadas sobre os arranjos (spots), e a

fluorescência emitida é detectada por um scanner

e a fluorescência emitida é detectada por um scanner Presença de RNA do experimento RNA originado
e a fluorescência emitida é detectada por um scanner Presença de RNA do experimento RNA originado
e a fluorescência emitida é detectada por um scanner Presença de RNA do experimento RNA originado

Presença de RNA do experimento

RNA originado tanto do experimento quanto do controle

Presença de RNA do controle

O gene em questão não está expresso nem no controle nem no experimento

não está expresso nem no controle nem no experimento cDNA array • Confecção: uso de um

cDNA array

Confecção: uso de um robô

para depositar sondas em um vidro

Requer design do array e equipamentos in house

Caracteristicas: barato, requer trabalho inicial, customização

Necessita sempre de 2

amostras (controle e referência)

• Necessita sempre de 2 amostras (controle e referência) Affymetrix GeneChip • Confecção: uso de um

Affymetrix GeneChip

Confecção: uso de um processo de litografia

Tecnologia Comercial

Plataformas de arrays ja

definidas: Human U133, Mouse

430,

Características: barato, não

requer design, padronização

Características: barato, não requer design, padronização Agilent • Confecção: uso da tecnologia Inkjet •

Agilent

Confecção: uso da tecnologia

Inkjet

Sondas com 60 bases

Permite customização

Expressão controle e referencia (2 cores)

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Detectar presença da proteína de interesse Analisar o tamanho da proteína Analisar expressão da proteína
Detectar
presença da
proteína de
interesse
Analisar o
tamanho da
proteína
Analisar
expressão da
proteína
Extração de Proteína
Extração de Proteína
Analisar expressão da proteína Extração de Proteína Quantificação pelo método de Bradford (Coomassie
Analisar expressão da proteína Extração de Proteína Quantificação pelo método de Bradford (Coomassie

Quantificação pelo método de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250)

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SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate)

SDS é usado para desnaturar proteínas e para cobrir as moléculas da proteína com cargas negativas

A carga íntrinseca à proteína é mascarada, e a razão carga/massa torna-se constante

Gel de duas fases: concentração (stacking) e resolução (running), permite concentrar as amostras antes da corrida no gel, aumentando-se a resolução das proteínas

corrida no gel, aumentando-se a resolução das proteínas Western Blot – A proteína alvo, observada por

Western Blot

A proteína alvo, observada por SDS-PAGE, é identificada por anticorpo mono ou policlonal

A revelação do sistema é realizada com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo

Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

é realizada com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo – Informa o tamanho e a quantidade das

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2D-PAGE

1ª etapa: Separação de proteínas por massa molecular (SDS-PAGE)

2ª etapa: Focalização Isoelétrica (IEF) para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma determinada proteína

Separa proteínas de pesos moleculares iguais, mas com pontos isoelétricos (pIs) diferentes, ou proteínas com mesmo pI, mas pesos moleculares diferentes

Gel contém gradiente de pH. A migração se interrompe ao atingirem seu ponto isoelétrico

Aplicada a moléculas tanto positivamente quanto negativamente carregadas

A maioria das proteínas têm valores de pI na gama 4-7

Ponto Isoelétrico (pI) pH no qual há equilíbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de uma proteína.

há equilíbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de

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Analisar a Analisar viabilidade estágio de das células divisão das células Analisar o tipo de
Analisar a
Analisar
viabilidade
estágio de
das células
divisão das
células
Analisar o
tipo de
morte
celular da
célula
Contagem
celular
Analisar os
Analisar Ac
cromossom
e Ag
os
presentes

Ensaio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)

teste colorimétrico usado para avaliar viabilidade celular

MTT, quando incubado com células vivas, tem seu substrato quebrado por enzimas mitocondriais, transformando-se de um composto amarelo em um composto azul escuro (formazan)

quebrado por enzimas mitocondriais, transformando-se de um composto amarelo em um composto azul escuro (formazan) 14

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Citometria de Fluxo

Técnica de medição das propriedades (tamanho, granulosidade, ptns de superfície, densidade) de partículas em suspensão, orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (Laser)

e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (Laser) Focalização Hidrodinâmica Side Scatter Forward
Focalização Hidrodinâmica Side Scatter Forward Scatter
Focalização Hidrodinâmica
Side Scatter
Forward Scatter
e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (Laser) Focalização Hidrodinâmica Side Scatter Forward
e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (Laser) Focalização Hidrodinâmica Side Scatter Forward

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Imunofluorescência

Permite a detecção e localização de Ag em células e tecidos utilizando Ac específicos, marcados com fluorocromos (Isotiocionato de fluoresceína- FITC, rodamina, umbeliferona, ficoeritrina)

Detecta e localiza Ac em fluidos biológicos usando seu Ag correspondente

Baseiase na capacidade de moléculas de Ac se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag

Método qualitativo/semi-quantitativo

Resultado visualizado ao miscroscópio de epifluorescência

Resultado visualizado ao miscroscópio de epifluorescência • Imunofluorescência Direta – O Ac específico
Resultado visualizado ao miscroscópio de epifluorescência • Imunofluorescência Direta – O Ac específico

Imunofluorescência Direta

O Ac específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao Ag, formando um imunocomplexo estável

Detecção de proteínas intracelulares e sua localização

Detecção direta de microrganismos em secreções, fenotipagem de

células tumorais, utilizada em

bacteriologia

– Detecção direta de microrganismos em secreções, fenotipagem de células tumorais, utilizada em bacteriologia 16

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Imunofluorescência Indireta

Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o Ag com o Ac primário ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo

A preparação é incubada com um Ac secundário

– A preparação é incubada com um Ac secundário ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay )
– A preparação é incubada com um Ac secundário ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay )

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Enzimaimunoensaio utilizado para detecção de Ac ou Ag presentes no soro ou meio celular

O método se baseia na interação antígeno-anticorpo

A enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com o substrato, levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados

Utiliza-se base sólida (placa de 96 wells) na qual Ag:Ac

vão se ligar através de interações hidrofóbicas

Enzima

Substrato

Cor

Fosfatase alcalina

P-nitrofenil-fosfato (pNPP)

Amarelo

Peroxidade

ABTS

Verde

Peroxidade

OPD

Laranja

Peroxidade

TMB

Azul

(pNPP) Amarelo Peroxidade ABTS Verde Peroxidade OPD Laranja Peroxidade TMB Azul 17

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Tipos de ELISA:

Indireto conjugado se liga ao Ag do substrato

Sanduíche Ag se liga ao Ac ligado ao substrato, e o Ac secundário se liga a esse complexo

Competitivo detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)

– detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes) • FISH ( Fluorescence in situ Hybridization )

FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

Técnica de citogenética molecular

Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar anomalias cromossômicas que estão além do poder de resolução da citogenética de rotina, como microdeleções e rearranjos cromossômicos complexos

Detecta seqüências específicas de ácidos nucléicos pela formação de duplex entre a sonda e a seqüência alvo no espécime fixado

Pode ser aplicada tanto para células em pró-metáfase, metáfase como em interfase

alvo no espécime fixado – Pode ser aplicada tanto para células em pró-metáfase , metáfase como

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Tipos de sondas:

Sondas Centroméricas - para seqüências de DNA repetitivo localizadas no centrômero ou região pericentromérica

Sondas de seqüência - sondas específicas para determinado loco ou gene

Sondas para cromossomo inteiro - Identificação da origem de material cromossômico adicional

Cariotipagem por espectro multicolorido

adicional • Cariotipagem por espectro multicolorido • Bioinformática – Estudo da aplicação de técnicas
adicional • Cariotipagem por espectro multicolorido • Bioinformática – Estudo da aplicação de técnicas

Bioinformática

Cariotipagem por espectro multicolorido • Bioinformática – Estudo da aplicação de técnicas computacionais e

Estudo da aplicação de técnicas computacionais e matemáticas à geração e gerenciamento de (bio)informação.

Estudo da aplicação de técnicas computacionais e matemáticas à geração e gerenciamento de (bio)informação. 19

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