Revista de Cincias

Farmacuticas
Bsica e Aplicada
Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences
Rev Cinc Farm Bsica Apl., 2012;33(3):341-346
ISSN 1808-4532
Autor correspondente: Profa. Dra. Kellen C. B. de Souza - Universidade
Federal de Cincias da Sade de Porto Alegre - Departamento de Cincias
Bsicas da Sade - Rua Sarmento Leite, 245 - CEP.90050-170 - Porto Alegre
RS - Brasil - telefone/fax: (51) 3303-8741 - e-mail: kellens@ufcspa.edu.br
Validao de mtodo analtico para doseamento de
favonoides totais em cpsulas contendo extrato seco
de Passifora incarnata L.
Juliana Ziliotto
1
; Cristina Farina
2
; Kellen Cristhinia Borges de Souza
3*
1
Curso de Farmcia da Universidade de Caxias do Sul, Caxias do Sul, RS, Brasil.
2
Laboratrio Farmacutico Vitamed, Caxias do Sul, RS, Brasil
3
Departamento de Cincias Bsicas da Sade, Universidade Federal de Cincias da Sade de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar
metodologia analtica por espectrofotometria no UV
para a quantifcao de favonides totais, expressos em
vitexina, em cpsulas contendo extrato seco de Passifora
incarnata L. O mtodo foi desenvolvido a partir da
metodologia de doseamento de favonides totais
descrita na monografa do extrato seco de P. incarnata L,
disponvel na Farmacopeia Britnica (2010). A validao
da metodologia analtica de doseamento foi realizada de
acordo com a Anvisa RE N 899/2003 e diretrizes da
International Conference on Harmonization. O mtodo
mostrou-se seletivo, pois no houve interferncia dos
adjuvantes na leitura das absorbncias nas solues
analisadas. Apresentou coefciente de correlao linear
(r) de 0,9999, confrmando a linearidade do mtodo.
Os valores de desvio padro relativo, obtidos tanto
para preciso, nos nveis de repetibilidade e preciso
intermediria, quanto para exatido no excederam
o mximo de 15% determinado nos critrios de
aceitao para mtodos bioanalticos, considerando a
complexidade da matria-prima vegetal.
Palavras-chave: Passifora incarnata L. Validao de
metodologia analtica. Flavonoides. Espectrofotometria no
ultravioleta.
INTRODUO
A padronizao de ftoterpicos e a garantia da sua
efccia e segurana requerem mtodos analticos adequados
para a deteco e quantifcao de seus marcadores e de
substncias potencialmente txicas (Chabariberi et al.,
2009).
Os principais compostos bioativos presentes na P.
incarnata L. so os favonoides C-glicosilados derivados
de apigenina e luteolina (vitexina, isovitexina, orientina,
isoorientina, schaftosdeo, entre outros), que constituem
atualmente a melhor opo de marcadores. Tambm esto
presentes alcaloides do tipo harmano, como harmana,
harmina, harmalina, harmol, harmalol (Muller, 2005;
Muller, 2006; Witcht, 2004; Kamaldeep et al., 2004;
Newall et al., 1996).
A P. incarnata L. consta em monografas das
Farmacopeias Helvtica (Pharmacopoeia Helvtica, 1987),
Alem (Deutsches Arzneibuch, 1997), Europeia (European
Pharmacopoeia, 2005), Francesa (Pharmacope Franaise,
2007) e Britnica (British Pharmacopeia, 2011).
A Farmacopeia Britnica (British Pharmacopeia,
2011) apresenta monografa para o extrato seco de P.
incarnata L. na qual preconiza teor mnimo de 2% de
favonides totais, expressos em vitexina. A extrao de
favonoides do extrato seco de P. incarnata L. feita com
etanol 60% (v/v), seguido da reao de complexao com
soluo oxalo-brica, sendo que o teor de favonoides totais
expressos na forma de vitexina medido em UV em 401
nm (British Pharmacopeia, 2011).
O objetivo da validao de um procedimento
analtico demonstrar que apropriado para sua fnalidade
(ICH, 1996). Os testes utilizados para validao so
classifcados em quatro categorias de acordo com sua
fnalidade. Para cada categoria exigido um conjunto de
testes necessrios para validar a metodologia analtica.
Os testes quantitativos para a determinao do frmaco
em produtos farmacuticos ou matrias-primas pertencem
categoria I, em que so exigidos os parmetros de
seletividade, linearidade, intervalo, preciso, exatido e
robustez (Brasil, 2003).
O desenvolvimento de mtodos para quantifcao
dos componentes ou marcadores de ftoterpicos tem
sido acompanhado do processo de validao a fm de
disponibilizar uma metodologia alternativa para anlises
descritas em Farmacopeias ou oferecer uma proposta para
quantifcao de produtos caracterizados pela ausncia de
metodologias analticas (Costa, 2008).
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Validao de favonides totais em cpsulas de P. incarnata L
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A validao de metodologia analtica para
ftoterpicos deve ser feita de acordo com o disposto na
Resoluo RE 899/03, referente ao guia para validao de
mtodos analticos e bioanalticos, porm, os resultados
podem seguir os nveis de aceitao estipulados para
mtodos bioanalticos, considerando-se a complexidade da
matria-prima vegetal (Brasil, 2003).
A inexistncia de mtodos ofciais para a
quantifcao de cpsulas de Passifora incarnata L. justifca
o desenvolvimento e validao de mtodo analtico, de
maneira a auxiliar os laboratrios no controle de qualidade.
Desta forma, este trabalho teve como objetivo desenvolver
e validar metodologia analtica por espectrofotometria no
UV para a quantifcao de favonoides totais expressos em
vitexina, em cpsulas de Passifora incarnata L.
MATERIAL E MTODOS
Material
Reagentes e solues
Todos os reagentes utilizados foram de grau
analtico: metanol, cido frmico anidro, cido actico
glacial, cido brico e cido oxlico, etanol. Utilizou-se
gua obtida por osmose reversa.
Matria-prima e produto acabado
Extrato seco de Passifora incarnata L. 3,5%
favonoides (adjuvante de secagem: amido de milho 50%).
Lote: 300400524. Validade: 12/08/2012 (Sanrisil S.A.
Indstria e Comrcio).
Cpsulas de Passifora incarnata L. 290mg (Cada
cpsula contm 10,15mg de favonoides totais expressos
em vitexina. Excipientes: celulose microcristalina 101,
dixido de silcio coloidal, talco).
Mtodos
I. Identifcao e quantifcao de favonoides no extrato
seco de Passifora incarnata L.
Para a matria-prima (extrato seco), realizou-se
identifcao dos marcadores por cromatografa em camada
delgada (CCD) e determinao do teor de favonides
totais expressos em vitexina, por espectrofotometria no
UV-Visvel (British Pharmacopeia, 2011). Realizou-se a
confrmao do mtodo de doseamento da matria-prima
atravs da anlise de preciso (repetibilidade e preciso
intermediria). Posteriormente, compararou-se o aspecto
visual do extrato seco com o descrito na monografa
vigente. Por fm, determinou-se a umidade atravs do
mtodo gravimtrico (British Pharmacopeia, 2011).
II. Doseamento de favonoides totais em cpsulas de
Passifora incarnata L.
Pesou-se 20 cpsulas individualmente. Retirou
o contedo das cpsulas e, posteriormente, pesou-se os
respectivos invlucros vazios. O peso mdio foi determinado
pela diferena dos valores individuais obtidos entre a
cpsula cheia e o invlucro vazio. O contedo das cpsulas
foi misturado em gral de vidro.
Soluo estoque: Pesou-se em balana analtica
(Marte Modelo AY220), a partir da mistura do p das
cpsulas, o equivalente a 50 mg de extrato seco. Transferiu a
amostra para um balo volumtrico de 100 mL e adicionou-
se aproximadamente 50 mL de etanol 60%. Agitou-se
manualmente a soluo. O volume foi completado com
etanol 60% e, em seguida, fltrou-se a soluo em papel
fltro.
Soluo teste: Para bquer de 10 mL foram
transferidos 5,0 mL da soluo estoque, com auxilio de
pipeta volumtrica. O bquer foi levado para banho-maria
at completar a evaporao do solvente. Retomou o resduo
com 8,0 mL de soluo metanlica de cido actico (10
partes de metanol para 100 partes de cido actico) e
transferiu para balo volumtrico de 25 mL. Logo aps,
adicionou-se mais 3,0 mL de soluo metanlica de cido
actico no bquer para retirar completamente o resduo e
transferiu novamente para o balo volumtrico de 25 mL.
Adicionou-se 10 mL de soluo oxlo-brica (25,0 g/L
cido brico e 20,0 g/L de cido oxlico em cido frmico
anidro), e diluiu para 25 mL com cido actico glacial. Este
ltimo procedimento foi realizado em triplicata.
Soluo de compensao (branco): Para bquer
de 10 mL foram transferidos 5,0 mL da soluo estoque,
com auxilio de pipeta volumtrica. O bquer foi levado
para banho-maria at completa evaporao do solvente.
Retomou-se o resduo com 8,0 mL de soluo metanlica
de cido actico (10 partes de metanol para 100 partes de
cido actico) e transferiu para balo volumtrico de 25
mL. Adicionou-se 3,0 mL de soluo metanlica de cido
actico no bquer para retirar completamente o resduo e
transferiu-se novamente para o balo volumtrico de 25
mL. Posteriormente, adicionou-se 10 mL de cido frmico
anidro e diluiu-se para 25 mL com cido actico glacial.
Ambas as solues foram mantidas em repouso por
30 minutos. Com auxlio de espectrofotmetro UV - visvel
(1650PC Shimadzu) obteve-se o espectro de absoro da
amostra. As medidas das absorbncias foram realizadas em
401 nm, usando a soluo de compensao para zerar o
aparelho.
Calculou-se o teor percentual de favonoides totais,
expressos em vitexina, a partir da seguinte equao:
Onde: A a absorbncia medida em 401 nm, e m a
massa da amostra analisada em g.
III. Validao da metodologia quantitativa
Seletividade: Foi avaliada a partir da anlise
dos espectros de absoro das solues, obtidos em
espectrofotmetro, empregando-se uma faixa de
comprimento de onda de 350 a 500 nm. Foram obtidos
espectros de absoro da soluo teste (extrato seco +
adjuvantes), soluo do analito (extrato seco) e de uma
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Validao de favonides totais em cpsulas de P. incarnata L
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soluo preparada somente com os adjuvantes das cpsulas
mantendo-se as propores de cada um deles.
Linearidade: Para construo da curva de calibrao,
preparou-se cinco concentraes diferentes do analito
(extrato seco), no intervalo de 50% a 150% da concentrao
terica do teste, equivalentes a 0,05 mg/mL, 0,075 mg/mL,
0,1 mg/mL, 0,125 mg/mL e 0,150 mg/mL, em triplicata.
Aps realizao do procedimento conforme o item II, as
absorbncias foram medidas em espectrofotmetro a 401
nm. Realizou-se a anlise de regresso linear, obtendo-se a
equao da reta e o coefciente de correlao linear da reta.
A linearidade foi avaliada atravs do tratamento dos dados
por regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados
dos pontos mdios de trs curvas de calibrao do extrato
seco.
Preciso: A preciso foi avaliada em nveis de
repetibilidade e de preciso intermediria. A repetibilidade
foi avaliada pela anlise de trs concentraes (75, 100,
125%) realizadas em triplicata. A preciso intermediria foi
determinada em dois dias e por dois analistas diferentes,
em triplicata, nas trs concentraes utilizadas na
repetibilidade. Os valores de desvio padro relativo foram
utilizados para avaliar este parmetro.
Exatido: A exatido do mtodo foi avaliada a
partir da adio do analito (extrato seco) na amostra, em
trs concentraes, baixa, mdia e alta (75, 100, 125%,
respectivamente). Calculou-se a taxa de recuperao das
quantidades de analito adicionadas na amostra.
RESULTADOS
Identifcao e quantifcao de favonoides no extrato
seco de Passifora incarnata L.
O extrato seco analisado apresentou-se como um
p de aspecto homogneo e colorao marrom esverdeada,
de acordo com as caractersticas determinadas para o
mesmo. No perfl cromatogrfco obtido por CCD para a
soluo teste (extrato seco), observaram-se quatro zonas
fuorescentes de colorao amarelo (Rf 0,31), verde (Rf
0,81), amarelo (Rf 0,87) e verde (Rf 0,92). Para as solues
de referncia verifcou-se Rf 0,91 e colorao verde para
vitexina, Rf 0,63 e colorao amarela alaranjada para
rutina e Rf de aproximadamente 0,86 e colorao amarelo
alaranjada para o hiperosdeo.
A confrmao do mtodo analtico de doseamento
para o extrato seco foi realizada pelo teste de preciso
(repetibilidade e preciso intermediria), na qual se obteve
em todas as amostras analisadas DPR < 4%. O extrato seco
apresentou 6,07+ 0,27 % de umidade.
Validao da metodologia quantitativa
Seletividade: Os espectros de absoro referentes
s varreduras das solues analisadas para seletividade
do mtodo foram sobrepostos e esto representados na
Figura 1. Pode-se observar que a soluo contendo apenas
os adjuvantes utilizados na formulao das cpsulas no
apresentou picos de absoro no comprimento de onda de
401 nm, utilizado para quantifcar o teor de favonoides totais
expressos em vitexina. Da mesma forma, observa-se que os
picos resultantes para a soluo teste, (adjuvantes+extrato
seco) e soluo do analito (extrato seco), mostram-se
praticamente iguais, evidenciando novamente que no h
interferncia signifcativa dos componentes da matriz na
leitura das solues.
Linearidade: A partir das absorbncias foi
construdo grfco de concentrao versus absorbncia
mdia (Figura 2) e obteve-se a equao da reta pela
regresso linear, usando o mtodo dos mnimos quadrados,
bem como o seu correspondente coefciente de correlao
linear (r) (Tabela 1).
Preciso: Os resultados obtidos com o parmetro
repetibilidade esto dispostos na Tabela 2. Na preciso
intermediria, os resultados obtidos para o analista A e B
em diferentes dias esto expressos na Tabela 3. A Tabela
4 apresenta os resultados obtidos no Dia 1 e Dia 2 por
analistas diferentes (A e B).
Exatido: Os resultados de recuperao do
analito (extrato seco) adicionado matriz, nas diferentes
concentraes, esto representados na Tabela 5.
Figura 1. Espectros de absoro obtidos para soluo de adjuvantes, soluo teste (adjvantes + extrato seco de Passifora incarnata L) e
soluo do analito (extrato seco de Passifora incarnata L., empregando uma faixa de comprimento de onda de 350 a 500 nm.
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Figura 2. Curva de calibrao do mtodo realizado para o extrato seco de Passifora incarnata L. obtida pela anlise das solues do analito
(extrato seco) nas concentraes de 50 a 150% da concentrao terica do teste versus absorbncia mdia.
Tabela 1. Resultados do tratamento estatstico da curva
de linearidade do extrato seco de Passifora incarnata L.,
apresentando os parmetros de coefciente angular, coefciente de
correlao e equao da reta.
Tabela 2. Resultados da avaliao do parmetro de repetibilidade
do mtodo de doseamento para cpsulas de Passifora incarnata L.
nas diferentes concentraes.
TFT(%): Teor de favonoides totais expressos em vitexina; DP: Desvio padro; DPR(%): Desvio
padro relativo
Tabela 3. Resultados da avaliao da preciso intermediria do
mtodo de doseamento para cpsulas de Passifora incarnata L.
obtidos para o analista A e analista B em 2 dias diferentes.Tabela
Analista A Analista B
Dia 1 Dia 2 Dia 1 Dia 2
Conc. TFT(%) TFT(%) DPR(%) TFT(%) TFT(%) DPR(%)
75% 2,4149 2,5950 5,0829 2,4991 2,4560 1,2302
100% 3,3078 3,3686 1,2861 3,3158 3,3971 1,7126
125% 3,9068 3,9254 0,3358 3,8713 3,9471 1,3719
Tabela 4. Resultados da avaliao da preciso intermediria do
mtodo de doseamento para cpsulas de Passifora incarnata L.
obtidos no Dia 1 e Dia 2 com 2 diferentes analistas.
Dia 1 Dia 2
Analista A Analista B Analista A Analista B
Conc. TFT(%) TFT(%) DPR(%) TFT(%) TFT(%) DPR(%)
75% 2,4149 2,4991 2,4221 2,5950 2,4560 3,8920
100% 3,3078 3,3158 0,1703 3,3686 3,3971 0,5969
125% 3,9068 3,8713 0,6448 3,9254 3,9471 0,3913
TFT(%): Teor de favonoides totais expressos em vitexina; DP: Desvio padro; DPR(%): Desvio
padro relativo
Tabela 5. Resultados da recuperao realizado para as
concentraes de 75%, 100% e 125% de extrato seco de Passifora
incarnata L. adicionadas matriz
Conc. TFT Terico(%) TFT Real(%) Recuperao(%) DPR(%)
75% 2,417 2,512 103,91 1,4481
100% 3,234 3,325 102,83 0,9051
125% 3,862 3,867 100,13 0,9085
TFT(%): Teor de favonoides totais expressos em vitexina; DPR(%): Desvio padro
relativo
TFT(%): Teor de favonoides totais expressos em vitexina; DP: Desvio padro; DPR(%): Desvio
padro relativo
DISCUSSO
O excesso de gua em matrias-primas vegetais
possibilita a ao de enzimas, alm de propiciar o
desenvolvimento de fungos e bactrias (Borges et al.,
2005). O extrato seco apresentou um teor de umidade de
6,07%, acima do preconizado em monografa (British
Pharmacopeia, 2011) que admite no mximo 5% de
umidade.
Durante a realizao das anlises, observou-se
que o extrato seco de Passifora incarnata L. apresentou
comportamento bastante higroscpico, por se aderir
Parmetros Valores obtidos
Coefciente angular (a) 1,9412
Coefciente angular (b) 0,0101
Conc. TFT (%) Mdia TFT (%) DP DPR (%)
2,4751
75% 2,4425 2,4560 0,0170 0,6933
2,4503
3,3587
100% 3,4019 3,3971 0,0363 1,0679
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Validao de favonides totais em cpsulas de P. incarnata L
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facilmente s paredes do frasco e esptulas utilizadas.
Considerando a infuncia da umidade dos materiais slidos
em seu comportamento tecnolgico e na sua estabilidade,
essa caracterstica de higroscopicidade observada deve ser
bem avaliada, principalmente na seleo das operaes
produtivas e na manipulao e seleo das condies de
armazenamento, em nvel de ambiente e de material de
acondicionamento e embalagem (Mendez et al., 2011).
A otimizao dos parmetros de secagem como
temperaturas de entrada e de sada e velocidade de fuxo de
alimentao, concentrao e tipo de adjuvante tecnolgico,
assim como os teores de resduo seco do extrato fudo a
ser submetido a secagem so fatores indispensveis para
obteno de extratos secos com melhores caractersticas
fsico-qumicas e aumento do rendimento da operao. O uso
de adjuvantes tecnolgicos infuencia de maneira decisiva
no aumento do rendimento do processo de secagem, alm
de contribuir positivamente sobre a recomposio em gua
do produto (Vasconcelos et al.,2005).
A fm de melhorar esse parmetro aconselhvel
que o extrato seco seja acondicionado em local seco
e arejado, com controle de umidade ambiental, pois a
umidade residual pode infuenciar em alguns fatores
tecnolgicos como a obteno de uma mistura no uniforme,
difculdade no processo de tamisao, fuxo inadequado,
problemas durante a encapsulao e instabilidade da forma
farmacutica fnal.
Produtos intermedirios, como extratos vegetais,
so considerados matrizes complexas, e podem ser tratados
como nos bioanalticos, ou seja, sua composio to
complexa quanto composio das matrizes biolgicas
(Costa, 2008). Desta maneira, os parmetros de validao
do mtodo de doseamento de cpsulas de Passifora
incarnata L. foram avaliados empregando os critrios de
aceitao para mtodos bioanalticos.
A complexidade de sua composio favorece a
grande variabilidade na qualidade das drogas obtidas a
partir de uma mesma espcie vegetal. Tal caracterstica
est relacionada com diversos fatores, referentes s
condies do local de plantio, processo de coleta, manuseio
e processamento da matria-prima vegetal. Desta forma,
as matrias-primas vegetais apresentam, com freqncia,
grandes variaes entre fornecedores, justifcando a
necessidade de padronizao destes produtos (Fischer,
2007).
Segundo a RDC 899/2003, o critrio mnimo
aceitvel do coefciente de correlao linear (r) da curva de
calibrao deve ser superior ou igual a 0,98 (Brasil, 2003).
Obteve-se para o extrato seco um valor mdio de 0,9999
considerando o mtodo como linear, ou seja, a curva obtida
demonstrou que as absorbncias determinadas no mtodo
por espectrofotometria de absoro no ultravioleta foram
diretamente proporcionais s concentraes das solues,
no intervalo correspondente a 50% e 150% da concentrao
de trabalho.
O mtodo analtico mostrou-se seletivo, pois foi
verifcado atravs dos espectros de absoro, que os
componentes da matriz (adjuvantes) no absorvem no
comprimento de onda 401nm, e, portanto no interferem
na determinao do analito. Desta forma, conclui-se que
o mtodo avaliado capaz de determinar a quantidade de
favonoides totais em presena de componentes da matriz
(ICH, 1996; Brasil, 2003).
No parmetro de preciso, o mtodo apresentou
uma boa repetibilidade, visto que o DPR(%) foi inferior ao
especifcado de 15%. Em relao preciso intermediria,
os valores de DPR(%) tambm se apresentaram dentro
dos limites de aceitao. Demonstrou-se que o mtodo
preciso, ou seja, capaz de proporcionar resultados
prximos de uma srie de medidas de uma amostragem
mltipla de uma mesma amostra (ICH, 1996; Brasil, 2003).
A exatido foi demonstrada atravs do percentual
de recuperao. Para as concentraes de 75%, 100% e
125% obtiveram-se recuperao de 103,91%, 102,83%
e 100,13%, e DPR de 1,4481%, 0,9051% e 0,9585%
respectivamente. Os resultados obtidos esto acordo
com o preconizado em guias nacionais (Brasil, 2003) e
internacionais (ICH, 1996) em que o DPR (%) no deve
exceder 15% para mtodos quantitativos. Em relao
recuperao do analito, porcentagens prximas a 100% so
desejveis, porm, admitem-se valores menores desde que
a recuperao seja precisa e exata. Desta maneira, o mtodo
demonstrou-se exato para a fnalidade determinada.
ABSTRACT
Validation of analytical method for assay of total
favonoids in capsules containing dry extract of
Passifora incarnata L.
The aim of this study was to develop and validate
an analytical method using UV spectrophotometry
to determine total favonoids, expressed in vitexin,
in capsules containing a dry extract of Passifora
incarnata L. The analytical method was based on the
spectrophotometric assay described in the British
Pharmacopoeia (2010), for the dry extract of P. incarnata
L. The validation of this method of quantitation was
done in accordance with ANVISA resolution 899/2003
and the International Conference on Harmonization
guidelines. The method was selective, because there
was no interference from additives in the reading of
the absorbance of solutions analyzed. It showed a
linear regression correlation coeffcient (r) of 0.9999,
confrming the linearity of the method. The values of
relative standard deviation calculated for precision
(both repeatability and intermediate precision) and for
accuracy did not exceed the maximum of 15% allowed
in the acceptance criteria for bioanalytical methods,
considering the complexity of the plant raw material.
Keywords: Passifora incarnata L. Analytical methodology
validation. Flavonoids. UV spectrophotometry
REFERNCIAS
Borges DB, Farias MR, Simes CMO, Schenkel EP.
Comparao das metodologias da Farmacopeia Brasileira
para determinao de gua em matrias-primas vegetais,
e validao da determinao de gua em analisador de
umidade para Calendula offcinalis L., Foeniculum vulgare
Miller, Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reissek e Passifora
alata Curtis. Rev Bras Farmacogn. 2005;15(3):229-36.
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Validao de favonides totais em cpsulas de P. incarnata L
Rev Cinc Farm Bsica Apl., 2012;33(3):341-346
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Recebido em 8 de agosto de 2011.
Aceito para publicao em 6 de junho de 2012.