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ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA DA SAUDE DE LISBOA


Trabalho laboratorial de Bioqumica I
Cursos de ACSP, de DTN e de FM
EFEITO DO pH NA ACTIVIDADE DO ENZIMA LACASE
E CONSTRUCAO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN
(Grupos de 2-3 alunos)

QUESTIONRIO INICIAL
1. Qual a definio de Km e Vmx?
2. Qual o efeito do pH na actividade enzimtica? De que modo exercido tal efeito?
3. Que tipo de reaco catalisada pelas lacases? Represente esquematicamente uma reaco desse
tipo.
5. Como ir preparar uma soluo 0,1M de catecol?
6. Tendo em conta que o meio de reaco ser de 1 mL e que ir adicionar 20L de 4MC (4-metil
catecol), qual a concentrao de 4MC que ir adicionar ao meio de reaco?

OBJECTIVO
1. Medio da actividade enzimtica do enzima lacase. Estudar o efeito de diferentes pH na
actividade enzimtica. Construo do grfico de actividade em funo do pH.
2. Construo do grfico de actividade de Michaelis-Menten em condies controlo.
3. Construo do grfico de actividade de Michaelis-Menten em presena de inibidor.
4. Construo do grfico de actividade de Michaelis-Menten em presena de outro inibidor.
5. Linearizao dos grficos de actividade de Michaelis-Menten segundo Lineweaver-Burk.
6. Determinao dos V
max
e K
M.
7. Determinao do tipo de inibio.

INTRODUO
As polifenol oxidases so enzimas largamente distribudos nos seres vivos, que catalisam a
hidroxilao e/ou a oxidao de substratos fenlicos pelo oxignio molecular (Mayer e Harel,
1979).
As polifenol oxidases separam-se em duas classes de acordo com o tipo de fenol que oxidam: 1,4-
difenol: O
2
oxidoredutase (lacase, EC 1.10.3.2.); e 1,2-difenol: O
2
oxidoredutase (catecol oxidase,
EC 1.10.3.1.). A catecol oxidase tambm referida sob o nome de monofenol monooxigenase
(tirosinase, EC 1.14.18.1.), dado que tambm catalisa a hidroxilao de monofenis (Mayer, 1987).
A distino entre as duas categorias de enzimas foi efectuada com base nos substratos oxidados (a
2

catecol oxidase no oxida 1,4-difenis), no facto da lacase no ser inibida pelo monxido de
carbono ou pela fenilhidrazina (Keilin e Mann, 1938) e, sobretudo, com base no nmero de tomos
de cobre presentes na protena (a lacase contm 4 e a catecolase apenas 2) (Reinhammar e
Malmstrm, 1981). Como o enzima muito lbil s variaes de pH, pelo que a sua actividade
varia consoante o pH do meio em que se processa a reaco. O enzima uma protena monomrica
que contm cerca de 45% (m/v) de glcido e 4 tomos de cobre por molcula (massa molar de
97kDa). O coeficiente de absoro molar para o 4MC, a 395 nm de 1.4x10
3
M
-1
.cm
-1
.
Estas enzimas apresentam funes variadas: podem ser utilizadas na indstria alimentar, como
agente protector da oxidao, na bioremediao porque degradam compostos poluentes ou na
indstria de papel porque degradam da lenhina, deixando a celulose intacta, sem necessidade de uso
de produtos qumicos muito txicos para o meio ambiente.



Michaelis e Menten verificaram que a representao da velocidade (inicial) da reaco catalizada
por um enzima (actividade enzimtica) em funo da concentrao de substrato originava uma
curva hiperblica, cuja equao seria v
0
=V[S]
0
/(Km+[S]
0
).

v0 a actividade enzimtica; [S]
0
a concentrao inicial do substrato; V a velocidade mxima
obtida em condies saturantes de substrato; Km a constante de dissociao do v0 a actividade
3

enzimtica; [S]
0
a concentrao inicial do substrato; V a velocidade mxima obtida em
condies saturantes de substrato; Km a constante de dissociao do enzima e do substrato.



MATERIAL E REAGENTES

Material:
5 gobelts de 50mL para os 5 pH. Mais 1 copo de 50mL por grupo
Espectrofotmetro em modo cintico, 30s de durao, 100ms de intervalo de leitura.
Pipetas automticas de 1000, 200 e 20

Solues:
4-metilcatecol 0.1M em gua (substrato)
cido saliclico 0.1M em etOH 70% (inibidor 1)
cido benzico 0.1M em etOH 70% (inibidor 2)
Tampo fosfatos, 0.1M. pH 4.0, 5.0, 5.5, 6.0 e 7.0
Lacase de Trametes versicolor (6mg/mL, 23.3U/mg)

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Orientao ->
No laboratrio Junto ao espectrofotmetro Casa
Cuvette Tp/L 4MC/L
de
0.1M
c.
Saliclico
/ L de
0.1M
c.
Benzico
/ L de
0.1M
H
o
m
o
g
e
n
i
z
a
r

(
i
n
v
e
r
s

o

d
e

c
u
v
e
t
t
e

c
/

p
a
r
a
f
i
l
m
)

C
a
d
a

c
u
v
e
t
t
e


c
o
l
o
c
a
d
a

n
o

e
s
p
e
c
t
r
o
f
o
t

m
e
t
r
o


v
e
z

Lacase
/ L de 6
mg/mL
A
g
i
t
a
r

d
e
n
t
r
o

d
o

e
s
p
e
c
t
r
o
f
o
t

m
e
t
r
o

c
o
m

a

p
o
n
t
a

d
a

p
i
p
e
t
a

u
s
a
d
a

p
a
r
a

m
e
d
i
r

a

L
a
c
a
s
e

M
e
d
i
r

a

A
3
9
5

d
u
r
a
n
t
e

3
0

s
e
g
u
n
d
o
s

A/t V
0
[4MC]
0
/
M
G
r
u
p
o

I

4.0 950 20 50
5.0 950 20 50
5.5 950 20 50
6.0 950 20 50
7.0 950 20 50
G
r
u
p
o

I
I

950 2 50
950 5 50
950 7 50
950 10 50
950 15 50
950 20 50
G
r
u
p
o

I
I
I

950 2 5 50
950 5 5 50
950 7 5 50
950 10 5 50
4

950 15 5 50
950 20 5 50
G
r
u
p
o

I
V

950 2 10 50
950 5 10 50
950 7 10 50
950 10 10 50
950 15 10 50
950 20 10 50
G
r
u
p
o

V

950 2 5 50
950 5 5 50
950 7 5 50
950 10 5 50
950 15 5 50
950 20 5 50
G
r
u
p
o

V
I

950 2 10 50
950 5 10 50
950 7 10 50
950 10 10 50
950 15 10 50
950 20 10 50

1. No laboratrio, pipetar para uma cuvette de espectrofotmetro de 1mL, 950L do tampo
respectivo. Repetir para tantas cuvettes quanto for indicado.
2. Adicionar o volume indicado na tabela de 4MC, c. saliclico e/ou c. benzico.
3. Tapar com Parafilm e homogeneizar por inverso. Retirar o Parafilm.
4. Levar o suporte com as cuvettes para junto do Espectrofotmetro.
5. Uma a uma, executar as cinticas. Colocar cada cuvette no espectrofotmetro e iniciar a cintica
adicionando, o mais rapidamente possvel, 50L de soluo de enzima. Agitar e iniciar a reaco.
Deixar correr durante 30 segundos. Anotar o valor de A/t.

Tratamento de resultados:
1. Transformar todos os valores de A/t em v
0
e terminar de preencher a tabela.
2. Construir os grficos em papel milimtrico:
3. v
0
vs pH
4. v
0
vs [4MC]
0
, sem inibidores
5. v
0
vs [4MC]
0
, com cido saliclico
6. v
0
vs [4MC]
0
, com cido benzico
7. Construir tabela com 1/v
0
e 1/[4MC]
0
, nas condies todas exceto os diferentes pH
8. Construir os grficos de Lineweaver Burk (9, 10, 11) em papel milimtrico. Determinar V
max

e K
M
. Determinar k
cat
.
9. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, sem inibidores
5

10. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, com cido saliclico
11. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, com cido benzico

Anlise de resultados
Qual o melhor pH
Que tipo de inibidores se trata?
Qual o melhor inibidor?

BIBLIOGRAFIA
Goncalves M.L.S. (1983). Mtodos instrumentais para anlise de solues- Anlise
Quantitativa. Fundao Calouste Gulbenkian. Lisboa.
Mayer AM (1987). Polyphenoloxidases in plants - Recent progress. Phytochem. 26, 11-20.
Mayer AM e Harel E (1979). Polyphenoloxidases in plants. Phytochem. 18, 193-211.
Pombeiro, A.J.L.O. (1980). Tcnicas e Operaes Unitrias em Qumica Laboratorial.
Fundao Calouste Gulbenkian. Lisboa.
Reinhammar B e Malmstrom BG (1981). Blue copper-containing oxidases In Copper
proteins. pp 109-147. Spiro TG (ed), Wiley Interscience, New York.