reta interpretao da microscopia, necessrio que o sangue seja coletado com anticoagulante adequado e entregue sem demora ao laboratrio, a m de que no ocorram alteraes artefatuais. A identidade do paciente deve ser cuidado- samente conferida antes da coleta. Isso feito pe- dindo-lhe que repita nome, sobrenome e data de nascimento; em pacientes de hospital, deve ser conferida a pulseira de identicao, que, alm desses dados, possui um nmero de registro. Para diminuir a chance de erro humano, os recipien- tes devem ser previamente rotulados. O tcnico que far a ebotomia deve conhecer e seguir as recomendaes para essa tarefa, incluindo as de identicao. Embora a identicao de pacien- tes costume, tradicionalmente, ser mais rigorosa no setor de transfuses de sangue, note-se que j foram feitos tratamentos equivocados devido a trocas de resultados de hemogramas, por isso a necessidade de igual rigor na identicao em todos os setores. Identicao mais segura dos pacientes internados pode ser obtida por meio de dispositivos eletrnicos, em que um cdigo de barras na pulseira de identicao lido com um scanner manual. Os pacientes devem sentar-se ou deitar-se de modo confortvel e ser assegurados de que o pro- cedimento provoca um desconforto mnimo, mas no de que seja indolor, porque no . prefer- vel que os pacientes apreensivos quem deitados. Cadeiras de coleta por puno venosa devem ter braos ajustveis, tanto por convenincia para o posicionamento do brao do paciente quanto para maior segurana, dicultando uma queda, se o paciente desmaiar. Observei pessoalmente um paciente sofrer fratura do crnio ao desmaiar e cair da cadeira, alm de dois outros, nenhum de- les sabidamente epilptico, sofrerem convulses durante a puno venosa. Podem no ter sido convulses epilpticas, mas decorrentes da hipo- xia cerebral durante a breve parada cardaca da reao vaso-vagal [1]. Quando as punes venosas so feitas em crianas ou em pacientes no-coope- rativos, o brao deve ser imobilizado de maneira rme, mas delicada, por um assistente. O cole- tador deve usar luvas para sua proteo; luvas de material diverso do ltex devem estar disponveis para ebotomistas e pacientes alrgicos a esse ma- terial. Para resguardar a esterilidade, a agulha no pode ser tocada. Sangue venoso perifrico No adulto, o sangue geralmente coletado de veias da fossa antecubital (Figura 1.1) com agulha e seringa ou tubo a vcuo. A veia cubital media- na a preferida, por ser mais grossa e xada aos tecidos subjacentes, mas a ceflica e a baslica so igualmente satisfatrias. Outras veias do antebra- o podem ser usadas, porm so mais mveis e di- fceis de puncionar. As veias no dorso do pulso ou da mo tm uxo escasso, e a puno facilmente provoca hematoma local; o mesmo ocorre na face anterior do pulso, onde a puno, alm disso, mais dolorosa e h mais risco de dano a estruturas vitais. Veias do p no so pontos ideais para a coleta de sangue, e raramente h necessidade de us-las. Danos locais s vezes associados a punes venosas na fossa antecubital incluem leso ao nervo cutneo antebraquial lateral [2] e puno arterial, ambas por engano; complicaes so mais freqentes puno das veias baslicas do que das demais. Na necessidade de puno em veias do C A P T U L O 1 Coleta e Distenso de Sangue para Exame 14 BARBARA J. BAIN pulso, o risco o dano aos nervos e artrias ra- diais ou ulnares. Punes das veias do p podem complicar-se com trombose, infeco ou difcil cicatrizao. Quando se escolhe uma veia, deve-se palp- la para ver se patente; neste caso, macia e compressvel. Uma veia trombosada no com- pressvel; palpa-se como um cordo. Uma artria tem a parede grossa e pulsa. Se nenhuma veia for visvel, o que comum em peles escuras ou em pessoas obesas, deve-se procur-las por palpao, com uso de garrote para distend-las. Em caso de veias muito nas, aquece-se e bate-se delica- damente no brao para produzir vasodilatao e pede-se que o paciente abra e feche a mo algu- mas vezes. Deve-se considerar que tm sido cultivadas bactrias patognicas de garrotes reusveis; pr- tica prudente usar garrotes descartveis, ao menos em pacientes sob alto risco de infeces [3]. O brao do paciente deve ser posicionado no brao da cadeira de modo que a veia escolhida - que sob tenso e com mobilidade reduzida. Deve- se desinfetar a pele com etanol a 70% ou clorexi- dina a 0,5% e deix-la secar, para no arder com a puno. O garrote deve ser aplicado com tenso suciente para distender a veia, mas no a ponto de causar desconforto; um manguito de presso ar- terial, inado presso diastlica, pode ser usado, mas um garrote comum prefervel. Se for par- ticularmente importante obter uma amostra sem hemoconcentrao, por exemplo, em paciente com suspeita de poliglobulia, o torniquete deve ser liberado logo aps a penetrao na veia; na rotina, pode ser mantido at o m da coleta. Em- bora recomende-se manter o garrote no mximo por 1 minuto, a hemoconcentrao que provoca mnima: 2% de aumento das cifras hematimtri- cas aps 2 ou 10 minutos [4]. O sangue pode ser coletado com agulha e tubo a vcuo (ver a seguir), ou com agulha ou buttery (pequena agulha com aletas) com c- nula e uma seringa. O buttery prefervel para veias muito nas e locais difceis. Agulhas de 0,9 Figura 1.1 Face anterior do brao esquerdo mostrando as veias mais adequadas para a puno venosa. Veia baslica Veia cubital mdia Veia ceflica Veia ceflica acessria CLULAS SANGNEAS 15 e 0,8 mm de calibre so prprias para adultos, e de 0,7 e 0,6 mm, para crianas ou adultos com veias muito nas. Quando se usa seringa, deve-se mover previamente o mbolo, ida e volta, para descol-lo da camisa. Depois adapta-se a agulha seringa, preferindo-se as de bico lateral, sal- vo quando de 5 mL ou menores. A proteo da agulha removida e a agulha inserida na veia, com o bisel para cima (Figura 1.2). Isso pode ser feito com um nico movimento ou com dois mo- vimentos, um para a pele e o outro para a veia, de acordo com a preferncia do coletador e com a profundidade da veia. Com uma das mos r- mando a camisa da seringa para que a agulha no saia da veia, aspira-se o sangue tracionando o mbolo com a outra mo, de modo a desenvol- ver mnima presso negativa. No se deve aspirar mais rapidamente do que a entrada do sangue na veia, pois a parede colaba sobre o bisel e estan- ca o uxo. importante sempre liberar o garrote antes de retirar a agulha ao completar-se a co- leta. Em seguida, deve-se aplicar presso digital sobre o local puncionado, com algodo ou gaze, mantendo-se o brao esticado, na horizontal ou um pouco elevado. O adesivo s deve ser colo- cado aps presso por tempo suciente para o estancamento. A agulha deve ser destacada da seringa antes de se expelir o sangue para o continer, caso este tenha tampa removvel; necessrio cuidado para evitar ferimentos com a ponta. A agulha deve ser descartada em um receptculo especial para ob- jetos pontudos, sem recolocao do protetor. A amostra de sangue expelida delicadamente no frasco ou tubo contendo o anticoagulante e mis- turada com este, invertendo-se o continer quatro ou cinco vezes. A ejeo violenta pode causar he- mlise; evite-se, tambm, sacudir o continer. A amostra , ento, rotulada com o nome do pacien- te e com os demais dados de identicao e/ou, dependendo da rotina do servio, com um cdigo de barras, tambm aplicado requisio do exame e depois lmina com o sangue distendido. Os contineres no devem ser rotulados de antemo, longe do paciente, a m de evitar trocas. A hora da coleta deve ser anotada no rtulo; isso im- portante para permitir que o mdico relacione o resultado com as condies do paciente naquele momento e para o laboratrio vericar que no tenha havido atraso indesejvel entre a coleta e a execuo do exame. Quando o sangue coletado em tubos a v- cuo, o procedimento essencialmente o mesmo. Uma agulha bipolar atarrachada em um suporte que facilita a manipulao para a puno venosa (Figura 1.3). Alternativamente, um buttery pode ser atarrachado a um tubo a vcuo por meio de um adaptador. Uma vez penetrada a veia, o tubo a vcuo introduzido no suporte e pressionado para a frente; a ponta traseira da agulha fura a rolha e o sangue aspirado para o tubo (Figura 1.4). Os tubos a vcuo so muito convenientes quando so necessrias amostras mltiplas; nestes casos, v- rios tubos so aplicados sucessivamente. Todos os tubos devem ser estreis. Para crianas e pacientes com veias muito nas, devem ser escolhidos tubos pequenos, com menor rarefao, para evitar que a aspirao excessiva faa colabar a veia. Uma vez Figura 1.2 Tcnica de puno venosa utilizando seringa e agulha. 16 BARBARA J. BAIN cheios os tubos necessrios, a agulha retirada da veia, ainda ligada ao suporte. Para evitar ferimen- tos com a ponta da agulha, esta deve ser remo- vida do suporte com um dispositivo de segurana especco para esse m, ou ento o suporte deve ser jogado fora com a agulha. Quando se usa uma seqncia de tubos, o anticoagulante de um pode contaminar o subseqente. A heparina interfere nos testes de coagulao; o cido etilenodiami- notetractico (EDTA), na dosagem de clcio; e o uoreto, nos testes de hematologia. Recomenda- se, por isso, seguir a seqncia preconizada pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards, agora denominado Clinical and Labo- ratory Standards Institute (NCCLS), apresentada na Tabela 1.1 [5]. Se forem necessrias uma amostra grande ou vrias pequenas, e no se estiver usando um siste- ma de tubos a vcuo, o sangue pode ser coletado com um buttery fundido em um delicado tubo exvel. A extremidade livre do conduto pode ser axada sucessivamente a vrias seringas. Essa tc- nica muito til para crianas e para puno de veias nas e difceis. Figura 1.3 Tcnica de puno venosa utilizando um continer a vcuo; a extremidade distal da agu- lha foi atarraxada ao suporte, e a proximal introduzida na veia, aps removido o protetor. Figura 1.4 Tcnica de puno venosa utilizando um continer a vcuo; o continer a vcuo foi in- troduzido no suporte e impelido em direo ponta da agulha. CLULAS SANGNEAS 17 Nunca se deve coletar sangue acima de um local de infuso venosa, pela possibilidade de di- luio. A puno abaixo, entretanto, no costu- ma causar impreciso signicativa. Sangue capilar Em bebs, lactentes e adultos com veias muito difceis, pode ser necessria a coleta de sangue por picada na pele. O sangue capilar, mais provavelmente arteriolar, pode ser obtido de ferimento provocado com uma lanceta na su- perfcie plantar do calcanhar (aquecido e de- sinfetado) em bebs e crianas com menos de dois anos, na face plantar do grande artelho em crianas de at dois anos e em um dos dedos em crianas maiores e adultos. A Figura 1.5 mostra o local prprio para a picada do calcanhar em bebs ou lactentes; as faces laterais e posterior devem ser evitadas, porque o osso subjacen- te est muito prximo. Em pacientes maiores, so preferveis as superfcies palmares das fa- langes distais dos dedos, excluindo-se o quinto; a picada do lbulo da orelha deve ser evitada, porque, se o paciente tiver um defeito hemos- ttico, ser difcil aplicar presso local para o estancamento. A superfcie palmar da falange distal o local preferido do dedo, pois o osso est mais prximo pele nos demais segmentos. O dedo mdio ou o anular da mo no-domi- nante so os preferidos, pois doem menos que o indicador. Em adultos, a picada deve ultrapassar 1,5 mm de profundidade para atingir a juno entre a derme e o subcutneo, ou seja, a zona mais vascularizada, de onde o sangue ui livre- mente. Lancetas usadas para bebs a termo no devem exceder 2,4 mm, pois essa a profundi- dade da pele ao osso calcneo. Lancetas mais curtas esto disponveis e devem ser preferidas para prematuros. J foi descrita osteomielite do calcneo por puno mais profunda nesse local [6]. Deve ser evitada a repetio de picadas em um mesmo local, pelo risco de infeco. J es- to comercializadas lancetas de segurana, com lmina que se retrai permanentemente aps a primeira utilizao, de modo a diminuir o ris- co de ferimento acidental aos coletadores. H tamanhos apropriados para adultos e crianas, para bebs a termo e prematuros. Amostras capilares devem ser obtidas de reas aquecidas para aumentar o uxo de sangue. Se a rea estiver fria, deve ser aquecida com uma compressa impregnada com gua aquecida (a no mais de 42 o C). A pele deve ser desinfetada com isopropanol a 70% e seca com gaze estril, pois traos de lcool podem causar hemlise. A primeira gota de sangue pode estar diluda com uidos teciduais e deve ser removida com gaze estril. Uma presso delicada favorece a sada do sangue, mas a compresso enrgica, massagean- do-se a rea, inaceitvel, porque dilui o sangue com uidos teciduais. O sangue capilar pode ser coletado em pi- petas reutilizveis, de vidro (no recomendadas Sim No Sim Figura 1.5 reas do p do beb, ou do lactente, adequadas para a obteno de sangue capilar. Tabela 1.1 Ordem recomendada na coleta de amostras de sangue Tubos de hemocultura Tubos secos para amostras de soro Tubos com citrato de sdio Tubos com gel separador/tubos secos para amostras de soro Tubos com heparina/tubos com heparina e gel sepa- rador Tubos com EDTA Tubos com uoreto para glicose 18 BARBARA J. BAIN pela necessidade de limpeza e esterilizao), ou em tubos capilares de vidro. Tubos capilares com EDTA so satisfatrios; tubos heparinizados so inadequados para hemograma, porque a heparina altera a morfologia e a colorao dos glbulos. Existem, no comrcio, pipetas descartveis, j com diluente, apropriadas para contagens auto- mticas ou manuais. O uso de tubos capilares perigoso para o coletador, pois ele pode ferir-se caso os tubos quebrem [7]. Tambm h necessida- de de cuidado no uso de lancetas com mola, pois j foi descrita transmisso de hepatite B de um a outro paciente por falta de troca da plataforma e da lanceta entre pacientes [8]. A despeito des- se risco, elas so recomendadas, pois asseguram uma penetrao de profundidade padronizada. Um equipamento comercializado, o Tenderfoot, parece causar menores hematomas e menos he- mlise nas amostras capilares em comparao com os demais [9,10]. Contagens de plaquetas em sangue capilar apresentam resultado mais baixo do que em san- gue venoso [11]; outros parmetros tambm va- riam (ver Captulo 5). A preciso da dosagem de hemoglobina em gota nica de sangue capilar insatisfatria; recomenda-se que vrias gotas se- jam coletadas em tubo com EDTA [12]. Sangue do cordo umbilical Amostras de sangue podem ser coletadas do cor- do umbilical imediatamente aps o nascimento. prefervel a utilizao de seringa e agulha de- pois de realizada a limpeza do sangue da superf- cie com uma gaze. Espremer o cordo, para obter sangue da extremidade cortada, contamina-o com gelia de Wharton, que causa aglutinao dos eritrcitos. Os parmetros hematolgicos do sangue do cordo no so necessariamente os mesmos do sangue capilar ou venoso do recm- nascido. Coleta de outros locais s vezes, necessrio coletar sangue da veia fe- moral ou de cnulas venosas em diversas locali- zaes. Quando se coleta sangue de uma cnula, uma primeira poro deve ser descartada, porque vem diluda com uido de infuso e contaminada com heparina. Em crianas pequenas, pode ser coletado sangue de veias do escalpo e das jugu- lares externas. Anticoagulantes e contineres O anticoagulante preferido para hemograma um dos sais do EDTA. Tm sido usados o K 2 EDTA, o K 3 EDTA e o Na 2 EDTA. O recomendado pelo In- ternational Committee (agora Counsil) (ICSH) o K 2 EDTA, tanto em forma seca como em solu- o, em concentrao nal entre 1,5 e 2,2 mg/mL [13]. A soluo tem a vantagem de permitir uma mistura mais rpida e uma menor freqncia de coagulao indesejada; em tubos a vcuo, a parede coberta pelo EDTA, e a mistura lenta no pro- blema. Ao usar-se o EDTA em soluo, algumas determinaes so afetadas pela diluio, princi- palmente se for coletado um volume escasso de sangue. O excesso de EDTA tem efeito prejudicial na morfologia dos eritrcitos em distenses cora- das. O Na 2 EDTA menos solvel do que os sais potssicos; o K 3 EDTA causa desidratao dos eri- trcitos e baixa o micro-hematcrito (ver p. 36). Muitos laboratrios usam instrumentos de contagem de glbulos com um dispositivo aspira- dor das amostras, que perfura as tampas de borra- cha e reduz a indesejvel manipulao do sangue. Para us-los, h necessidade de escolha de tubos com rolha de borracha apropriada, que no vaze pelo pertuito. Padronizao dos procedimentos Procedimentos operacionais padronizados para a puno venosa [5] e para a proteo dos coleta- dores e laboratoristas contra risco biolgico [14] foram publicados pelo NCCLS, nos Estados Uni- dos. Recomenda-se que as precaues estandar- dizadas propostas pelos Centers for Disease Con- trol (CDC), antes designadas como precaues universais, sejam aplicadas ebotomia: todas as amostras de sangue devem ser consideradas como CLULAS SANGNEAS 19 potencialmente infectantes. So feitas as seguin- tes recomendaes especcas [14]: 1 O uso de luvas deve ser recomendado a todos os coletadores e particularmente importante se o coletador tiver qualquer ferimento na pele, se o paciente no for cooperativo, se o coletador for inexperiente ou se o sangue estiver sendo cole- tado por picada na pele. 2 As luvas devem ser trocadas a cada paciente subseqente. 3 O sistema agulha-tubo a vcuo prefervel ao seringa-agulha. 4 Se for necessrio usar seringa-agulha e trans- ferncia do sangue para um tubo, a tampa no deve ser retirada, mas perfurada, e o sangue, as- pirado pelo vcuo. Para evitar ferimentos com a agulha, o tubo no deve ser segurado na mo durante o procedimento, mas colocado em uma estante. Ferimentos acidentais com agulha Devem ser tomadas precaues para evit-los. A hepatite B facilmente transmitida pela pica- da acidental com a agulha, principalmente se o paciente for Hbe-positivo. A estatstica global de 7 a 30% de contgio em acidentes envolven- do pacientes infectados; no caso de positividade Hbe, a freqncia de transmisso da ordem de 20% se o tcnico receber imunoglobulina anti- hepatite B aps o acidente e de 30 a 40% se no a receber [15,16]. A freqncia publicada para a transmisso da hepatite C de 0 a 7%, com m- dia de 1,8% [17], mas, com o uso de tcnicas su- persensveis, sobe a 10% [18]. S h transmisso se o paciente for positivo para o RNA viral [17]. O HIV muito menos transmissvel do que os vrus da hepatite, mas sempre h risco: em 3.430 casos de picada de agulha relatados at 1993, a transmissibilidade global foi de 0,46% [19]. Outras infeces potencialmente transmissveis por esse tipo de acidente incluem malria, crip- tococose, tuberculose, febre hemorrgica viral e dengue [20-24]. O risco de ferimento e contgio tambm existe no uso de tubos capilares, e mtodos alter- nativos de coleta so recomendados, nos Esta- dos Unidos, pela Food and Drug Administration (FDA) [7]. Pela impossibilidade de eliminar de maneira denitiva os acidentes de picada de agulha, todos os hospitais e laboratrios devem ter uma polti- ca para essa eventualidade. A responsabilidade deve ser compartilhada pela direo dos labora- trios e pelos servios de segurana ocupacional. Deve-se oferecer vacina anti-HBV para todos os funcionrios em risco, conferindo-se a resposta sorolgica; se houver um acidente, verica-se o ttulo de anticorpos e se faz uma dose booster se necessrio [14]. Tcnicos com resposta insu- ciente vacina, e os que no aceitaram faz- la, devem receber imunoglobulina anti-hepatite B e novo oferecimento da vacina. A prolaxia anti-retroviral deve ser oferecida aos que forem expostos ao risco de infeco pelo HIV por pica- da de agulha. Ela deve ser iniciada nas primeiras horas aps a exposio e causa signicativa dimi- nuio, mas no eliminao, do risco de contgio [25]. A prolaxia com duas ou trs drogas (zido- vudina + lamivudina indinavir ou nelnavir) provavelmente superior zidovudina pura. As recomendaes do CDC podem ser lidas no we- bsite (http://www.cdc.gov). O uso de nevirapina no recomendado devido possibilidade de toxicidade grave [26]. Ainda no conhecida prolaxia ps-exposio ecaz para hepatite C [17], mas, se existir infeco aguda, h consen- so na indicao de interferon no seu tratamento. H indcios de eccia com interferon alfa-2b em dose de 5 milhes de unidade por dia durante quatro semanas, depois 3 vezes por semana por mais 20 semanas [27]. Se no houver exame prvio rotineiro para anti-HIV em todos os funcionrios, os servios de sade do trabalho devem pedir o armazenamento de amostras de soro congelado por ocasio do in- gresso, para teste anti-HIV no caso de um aciden- te posterior; se essa orientao no for seguida, o pedido deve ser renovado na eventualidade de acidente com agulha de paciente soropositivo ou de estado sorolgico desconhecido. 20 BARBARA J. BAIN Preparo de distenso de sangue A distenso de sangue para exame microscpi- co pode ser feita de sangue sem anticoagulante (sangue nativo) venoso ou capilar ou de san- gue anticoagulado com EDTA. A quelao do clcio pelo EDTA impede a agregao plaquet- ria, fazendo com que as plaquetas se distribuam de modo homogneo na distenso e seu nmero possa ser estimado microscopia (Figura 1.6). Distenses de sangue capilar mostram agregao plaquetria proeminente (Figura 1.7) e de san- gue venoso nativo mostram pequenos agregados (Figura 1.8). Distenses de sangue nativo veno- so ou de sangue capilar so isentas de artefatos provocados pela conservao e pelo anticoagu- lante. Alguns laboratrios ainda usam essas dis- tenses como rotina; entretanto, o uso obriga- trio para investigar alteraes como a crenao dos eritrcitos ou a agregao de leuccitos ou plaquetas, que pode ser induzida pela conserva- o ou pelo EDTA. Por outro lado, distenses feitas quando o sangue anticoagulado chega ao laboratrio tm a vantagem de mostrar artefa- tos que inuenciaro a validade dos resultados dos contadores eletrnicos, como a presena de Figura 1.6 Distenso feita com sangue anticoagulado pelo EDTA, mostrando a distribuio uniforme das plaquetas. Figura 1.7 Distenso feita com sangue capilar no-anticoagulado, mostrando a agregao plaquetria que habitualmente ocorre. CLULAS SANGNEAS 21 lamentos de brina, agregados plaquetrios ou crioaglutinao dos eritrcitos. A boa prtica la- boratorial inclui a anotao da data e da hora da chegada da amostra e a distenso de lmina ime- diatamente aps o recebimento. Desse modo, ca registrado o tempo decorrido em trnsito e pode ser conrmada a atribuio de alteraes morfolgicas ao armazenamento prolongado de sangue anticoagulado com EDTA (artefato de armazenamento, ver p. 75). Distenso manual em lmina As lminas de vidro devem estar limpas e de- sengorduradas; no podem ser porosas, pois isso aumenta a colorao de fundo [28]. necessria uma lmina distensora com quinas cortadas para que a distenso seja mais estreita do que a lmina. Se for prevista uma cobertura com lamnula, a l- mina distensora tambm deve ser mais estreita do que a lamnula, para que esta cubra os bordos da distenso e seja facilmente examinada ao micros- cpio. Uma distensora com bordas lisas e fcil de manipular preparada quebrando-se as quinas de uma lmina lapidada aps marc-las com ponteira de diamante. O laboratorista que distende as lminas deve usar luvas. Uma gota de sangue (nativo ou antico- agulado) colocada prximo extremidade da l- mina. Sangue anticoagulado, de frascos com rolha, pode ser retirado com um tubo capilar descartvel. H um bico plstico prprio para perfurar a tampa dos tubos a vcuo e obter a gota de sangue. A l- mina distensora aplicada a um ngulo de 25 a 30 o
na frente da gota de sangue e recuada at toc-la (Figura 1.9). Uma vez espalhado o sangue ao longo da borda posterior da distensora, esta impelida para a frente com um movimento suave e uni- forme, de modo a distender uma na pelcula de sangue sobre a lmina. Se o ngulo da distensora for muito obtuso, ou o movimento muito rpido, a distenso ser muito curta. O operador experiente aprende a diferenciar o sangue com hematcrito (Hct) acima do normal, que viscoso e exige um ngulo mais agudo para distenses satisfatrias, do sangue com baixo Hct, que requer um ngulo mais obtuso. A tcnica de distenso deve produzir uma pelcula de sangue com uma cauda reta; uma dis- tenso em forma da impresso de um polegar far o observador mover-se de uma rea tima para iden- ticao das clulas para outras reas demasiada- mente espessas. importante limpar a distensora com um pano seco ou com gaze aps cada utiliza- o, caso contrrio podero ser transferidas clulas de uma distenso para outra (Figura 1.10). medida que as distenses so feitas, devem ser rotuladas com o nome do paciente e a data, ou com um nmero de identicao. Quando em pequeno nmero, as lminas podem ser rotuladas com um marcador de diamante, ou pela escrita a lpis na parte espessa da distenso. O mtodo mais rpido de rotular um grande nmero de Figura 1.8 Distenso feita com sangue no-anticoagulado, mos- trando pequeno grau de agregao plaquetria. 22 BARBARA J. BAIN lminas implica o uso de uma caneta com tinta resistente ao metanol ou a escrita a lpis na ex- tremidade fosca da lmina. Lminas opacicadas nas duas faces de uma extremidade so prticas, pois evitam a perda de tempo na escolha da face que deve ser voltada para cima. A secagem das lminas deve ser rpida; um ventilador, comum ou com ar aquecido, til para esse m. Se as distenses secarem lentamente, haver contrao das clulas, com apario de bolhas e vilosidades citoplasmticas, linfcitos bipolares, ncleos hi- percromticos e desapario dos nuclolos [28]; essas alteraes podem ocorrer tanto em clulas normais como em clulas neoplsicas, de modo a torn-las inaparentes. A Figura 1.11 mostra uma distenso bem-fei- ta, comparada com distenses insatisfatrias por tcnica defeituosa. Exceto especicao em contrrio, este livro discute a morfologia observada em distenses preparadas conforme o descrito anteriormente. A maioria das fotograas de distenses manu- ais, preparadas com sangue recm-coletado, anti- coagulado com EDTA. Figura 1.9 Mtodo de distenso do sangue. CLULAS SANGNEAS 23 Outros mtodos de distenso e preparao de lminas Distenses automatizadas Distenses podem ser feitas por equipamentos mecnicos, integrados a mquinas de colorao ou a contadores automatizados. Distenses com a espessura de uma clula podem ser obtidas por centrifugao em um equipamento especial, mas esse mtodo no se difundiu. Distenses de sangues com Hct muito alto Se o sangue tiver Hct muito alto, como Hct > 60% e Hb > 20 g/dL, pode ser impossvel fazer uma boa distenso, mesmo corrigindo-se o ngulo e a velocidade da distensora. A mistura da gota de sangue com uma gota de soluo salina, plas- ma AB ou plasma autlogo reduz a viscosidade e permite uma distenso apropriada observao da morfologia eritride. Distenses da camada de leuccitos Distenses da camada de leuccitos (buffy coat) so teis por concentrarem as clulas nucleadas e facilitarem a pesquisa de clulas anormais de bai- xa freqncia ou de bactrias. O tubo de sangue Figura 1.11 Distenses sangneas satisfatrias e insa- tisfatrias: (a) a presso desigual produziu sulcos; (b) muito larga e longa as margens e a cauda no podem ser exa- minadas adequadamente; (c) muito longa e riscada por um distensor de superfcie irregular; (d) muito espessa e curta, devido distenso com ngulo ou velocidade errados; (e) a distribuio uniforme das clulas sagneas foi interrompida porque a lmina estava engordurada; (f) satisfatria. Figura 1.10 Clulas blsticas de um paciente com leucemia aguda inadvertidamente transferidas para a lmina de outro paciente pelo uso de um distensor limpo de modo ina- dequado. 24 BARBARA J. BAIN centrifugado, e uma gota da camada de leucci- tos, entre o plasma e a massa eritride, mistura- da com uma gota de plasma autlogo e distendida da forma usual. Preparao de gota espessa A pesquisa de parasitos da malria e de outros hematozorios requer exame de gota espessa, com hemlise antes do exame. Os parasitos - cam mais concentrados, acelerando a pesquisa. A gota espessa preparada colocando-se no centro da lmina algumas gotas do sangue, na- tivo ou anticoagulado, e misturando-as com um palito, de modo a formar um pool, de espessura tal que se possa ler atravs do sangue um texto datilografado (Figura 1.12). A gota espessa no xada; aps a secagem, colocada diretamente na soluo aquosa de Giemsa para que haja he- mlise, permitindo a visualizao mais clara dos parasitos. Preparaes a fresco Preparaes midas, no-coradas (a fresco), so teis para a pesquisa de parasitos mveis, como microlrias, que podem ser vistas agitando-se entre os eritrcitos. Uma gota de sangue antico- agulado colocada entre lmina e lamnula e ob- servada ao microscpio. Fixao, colorao e montagem Fixao Aps a secagem ao ar, as distenses so xadas em metanol absoluto durante 10 a 20 minutos. A presena, mesmo pequena, de gua no metanol prejudica a xao e causa alteraes artefatuais caractersticas (Figura 1.13) que impossibilitam a apreciao morfolgica da srie eritride; ao exa- me pouco cuidadoso, tm-se uma falsa impresso de hipocromia. Em climas quentes e midos, pode ser necessria a troca do metanol algumas vezes por dia. A condensao nas lminas produz altera- es similares; em climas midos, convm x-las assim que estiverem secas. Um ventilador aque- cido til para acelerar a secagem. Em qualquer circunstncia, deve ser evitado atraso na xao, pois isso altera as caractersticas da colorao, que passa a mostrar uma tonalidade turquesa. Colorao No h consenso entre os laboratrios quanto escolha do melhor corante, mas todos os corantes em uso baseiam-se no de Romanowsky, protozoo- logista russo do nal do sculo XIX [29]. Trata-se de uma mistura do antigo azul-de-metileno e de eosina para corar o ncleo e o citoplasma do para- sito da malria em prpura e azul, respectivamente. Subseqentemente, Giemsa modicou o mtodo, combinando azur e eosina. O corante mais usado no Reino Unido uma combinao de corantes conhecida como May-Grnwald-Giemsa (MGG), enquanto na Amrica do Norte o de Wright, que contm azul-de-metileno policromado isto , aquecido de modo a produzir anlogos e eosina. s vezes, usada uma combinao Wright-Gie- msa, que d melhores resultados. Demonstrou-se por cromatograa que os corantes preparados pe- Figura 1.12 Gota espessa para a pesquisa de parasitos da malria: (a) no-corada, mostrando a espessura correta do sangue; (b) distenso corada, sem xao, causando lise dos eritrcitos. CLULAS SANGNEAS 25 los mtodos qumicos tradicionais no so puros; eles so vendidos com a mesma denominao, mas contm mistura varivel de 5 a 10 corantes [30]. H signicativa variao, inclusive entre lo- tes de um mesmo fabricante. Os componentes essenciais dos corantes de Romanowsky so um componente bsico (cati- nico), como o azur-B, que confere cor azul ou azul- violeta aos cidos nuclicos (xa-se aos grupos fos- fato do DNA e do RNA), s nucleoprotenas, aos grnulos dos baslos e, fracamente, aos grnulos dos eosinlos, alm de um corante cido (anini- co), como a eosina, que confere cor laranja he- moglobina e aos grnulos dos eosinlos e, combi- nando-se com protenas nucleares, contribui para a cor do ncleo. A combinao azur-B e eosina um corante de Romanowsky satisfatrio [29], da mes- ma forma que a mistura de azur-B, azul-de-metile- no e eosina [30]. O mtodo de referncia do ICSH para o corante de Romanowsky [31], que utiliza o azur-B puro e a eosina Y, fornece excelentes resul- tados, mas corantes puros so muito caros para uso rotineiro. Obtm-se uma colorao satisfatria e reprodutvel com corantes comerciais de boa qua- lidade e uma mquina automatizada de colorao. Esse mtodo foi usado para a colorao da maioria das lminas fotografadas para este livro. Tradicionalmente, o citoplasma que se cora em azul e os grnulos que se coram em prpura so ditos baslos, enquanto os grnulos que se coram de violeta ou prpura-rosado, azurlos. Na verda- de, tais tonalidades so obtidas pela tomada de um nico corante bsico, como o azur-B ou o azur-A. Os termos acidlo e eosinlo referem-se cap- tao do corante cido, eosina, embora acidlo seja costumeiramente usado para os componentes celulares que se coram de rosa, e eosinlo, para os que se coram de laranja. A Tabela 1.2 mostra a va- riedade de cores que um corante de Romanowsky deve produzir. A colorao deve ser feita no pH correto. Quando o pH muito baixo, os componentes baslos no se coram de maneira adequada; os leuccitos cam plidos, com grnulos eosinlos de um vermelho brilhante. Quando o pH mui- to alto, h captao excessiva do corante bsico, com uma colorao excessiva generalizada; tor- na-se difcil distinguir a policromatolia dos eri- trcitos, os grnulos dos eosinlos coram-se em azul-escuro ou cinza e os grnulos dos neutrlos coram-se demais, simulando granulaes txicas. Solues de corantes podem necessitar de l- trao logo antes do uso para evitar depsito de corante nas distenses, o qual pode ser confundido com incluses nos eritrcitos. As mquinas auto- mticas de colorao com tcnica de imerso, em que as lminas so integralmente mergulhadas no corante, fornecem melhores resultados do que as mquinas que cobrem as lminas com uma na ca- mada de corante, em posio horizontal; nestas h Figura 1.13 Alteraes artefa- tuais produzidas pela pesena de 5% de gua no metanol usando a xao. 26 BARBARA J. BAIN mais probabilidade de haver depsito de corante, e, se as distenses forem muito longas ou mal posi- cionadas, algumas partes podem car sem corar. Distenses coradas em MGG podem ser descoradas; basta cobri-las com lcool metlico, depois lav-las com gua, repetidamente, at o desaparecimento da colorao. O procedimento pode ser til quando se dispuser de apenas uma lmina e houver necessidade de outra colorao, por exemplo, colorao de Perls, para ferro. Colorao para pesquisa de parasitos da malria A deteco mais fcil quando as distenses san- gneas so coradas com Giemsa (ou Leishman), em pH 7,2; os eritrcitos parasitados pelos Plas- modium vivax e ovale coram-se diferentemente dos eritrcitos no-parasitados e so identicados com mais facilidade. As incluses presentes nas clulas parasitadas so igualmente bem visveis (ver p. 157). Montagem Quando h convenincia em arquivar as lminas, a montagem protege-as de ranhuras e do acmulo de p. Conforme j mencionado, a lamnula deve ser sucientemente larga para cobrir os bordos da distenso. Usa-se um mountant neutro, miscvel com xilol. Como alternativa para a montagem, as lmi- nas podem ser cobertas com poliestireno ou resina acrlica. Quando as lminas no precisam ser arqui- vadas, podem ser cobertas com uma na camada de leo, a m de permitir exame microscpico em pequeno aumento, antes da adio de gota de leo para exame com a lente de imerso. Arquivo de lminas O atendimento ideal dos pacientes e a educao continuada da equipe de hematologia exigem que as lminas de sangue sejam guardadas por longo perodo se possvel, anos. Lamentavelmente, o nmero considervel de amostras de sangue que chega aos grandes laboratrios limita a durabili- dade do arquivo. O mtodo mais econmico de arquivar lminas disp-las verticalmente, uma encostada outra, em gavetas metlicas longas e estreitas. Os rtulos, com nome do paciente, data e nmero do registro, devem ser colocados de modo a permitir fcil leitura. As lminas recm- montadas devem ser estocadas em bandejas de pa- pelo, ou dispostas em prateleiras, separadas umas das outras por alas de arame, at que o mountant tenha secado e endurecido; nessa ocasio, as l- minas podem ser dispostas encostadas umas s outras por economia de espao. Lminas de vidro so pesadas; arquivos muito grandes podem exigir reforo do assoalho da sala. Lminas de distenses de medula ssea de- vem ser arquivadas permanentemente; junto com elas, devem ser arquivadas lminas do sangue res- pectivo, para eventual reviso. necessrio que o laboratrio mantenha tambm um arquivo per- Tabela 1.2 Colorao caracterstica de diferentes componentes celulares com corante de Romanowsky Colorao dos componentes celulares Cor Cromatina (incluindo os corpos de Howell-Jolly) Prpura Grnulos promielocticos e bastes de Auer Vermelho-purpreo Citoplasma dos linfcitos Azul Citoplasma dos moncitos Azul-acinzentado Citoplasma rico em RNA (isto , citoplasma baslo) Azul-escuro Corpos de Dhle Azul-acinzentado Grnulos especcos dos neutrlos, grnulos dos linfcitos, granulmero das plaquetas Prpura-claro ou rosa Grnulos especcos dos baslos Prpura-escuro Grnulos especcos dos eosinlos Laranja Eritrcitos Rosa CLULAS SANGNEAS 27 manente de distenses de sangue para uso didti- co, incluindo casos de condies raras e exemplos tpicos de todas as condies comuns. Instalao e uso do microscpio Todo o pessoal tcnico deve aprender a lidar com o microscpio desde o comeo do treinamento. Um microscpio binocular deve ser instalado e usado como segue. 1 Para mover ou levantar o microscpio segure- o sempre pelo brao (Figura 1.14). Sente-se bancada do microscpio e certique-se de que a altura est correta para uma observao confor- tvel; ajuste a altura da cadeira ou do microsc- pio na bancada se for necessrio. 2 Conecte-o tomada e ligue o interruptor de for- necimento de corrente. 3 Ligue a iluminao do microscpio. 4 Gire o restato at que a intensidade luminosa esteja satisfatria. 5 Baixe a platina e gire o revlver de objetivas at posicionar a de aumento 10 ; ele faz um click quando chega ao local correto. 6 Escolha uma lmina e coloque-a na platina; cui- de se a distenso est para cima. Segure a lmina pelos bordos. Fixe-a com os retentores prprios. 7 Suba o condensador at o trmino do percurso. 8 Abra ao mximo o diafragma de campo e o dia- fragma ris do condensador. 9 Mova a platina at a distenso posicionar-se sob a objetiva, no trajeto do raio luminoso. 10 Suba a platina, olhando a lmina pelo lado, no pelas oculares, at que a lmina quase toque a objetiva. 11 Ajuste a posio das oculares de modo a que correspondam sua distncia interpupilar; olhe Anel para ajustar a ocular esquerda Ocular Revlver de objetivas Objetiva Retentor de lminas Platina Lente do condensador Alavanca de abertura do diafragma ris do condensador Parafusos de centralizao Elevador do condensador Dispositivo para mover a platina Anel do diafragma ris de campo Dispositivo de iluminao (pode estar localizado na parte traseira do microscpio) Brao (ou estativa) Foco macromtrico Foco micromtrico Figura 1.14 Desenho de um microscpio mostrando o nome de suas partes componentes. 28 BARBARA J. BAIN pelas oculares, assegurando-se de que a ilumina- o est com intensidade confortvel. 12 Baixe a platina com a lmina, usando o dispo- sitivo de foco macromtrico, at a preparao entrar em foco. 13 Usando o foco macromtrico, depois o micro- mtrico, obtenha o melhor foco possvel para a observao com seu olho direito; depois, sem mover a platina, obtenha o melhor foco para o olho esquerdo, usando para isso o anel de ajuste da ocular esquerda. H microscpios com anel de foco em ambas as oculares. 14 Feche completamente o diafragma ris de cam- po. Ele est prximo lmpada e controla a rea de iluminao. 15 Baixe o condensador at que o bordo do diafrag- ma ris de campo entre em foco. Ajuste o foco movendo o condensador at que os bordos do dia- fragma apaream levemente azulados em vez de levemente avermelhados (iluminao de Khler). Conra se a abertura do diafragma ris de campo est centrada; se no estiver, centralize-a usando os parafusos de centralizao no condensador. 16 Abra o diafragma ris de campo at que todo o campo circular que iluminado, mas no mais do que isso. Se ele for aberto excessivamente, entrar luz indesejvel no campo de viso. Isso particu- larmente importante para fotograa; nessa even- tualidade convm at fechar mais o diafragma at que s haja iluminao no contorno a fotografar. 17 Usando a alavanca apropriada (ou anel, em alguns microscpios), feche a abertura do diafragma do condensador at 70 a 80% da abertura numrica (anotada na objetiva em uso). Uma escala no con- densador, prxima alavanca (ou anel) permite tal procedimento. A abertura do diafragma con- trola a abertura angular do cone de luz que alcana as lentes do condensador. Quanto mais fechada aquela abertura, menos luz e menor resoluo, mas maior contraste e profundidade do foco. Para um foco timo, a abertura do condensador deve ser refeita para cada objetiva que entre em uso. 18 Examine a lmina com a objetiva* 10 , depois gire para uma objetiva de 40 . Reajuste o foco e a abertura do diafragma ris do condensador e ajuste o diafragma ris de campo de modo a iluminar somente o campo de viso. Reexamine a lmina com esse aumento. 19 Antes de usar uma objetiva de imerso, gire para fora a objetiva seca que estava em uso e coloque uma gota de leo de imerso no cen- tro da lmina. Gire e posicione a objetiva de imerso, por exemplo, de 60 ou 100 , e fo- que usando o macro, depois o micromtrico, e reajuste a abertura do condensador. Cuide para no rotar para a preparao outra objetiva, que no a de imerso, quando houver leo na lmi- na; na dvida, conra a anotao na lateral da objetiva. No use leo em excesso e no mis- ture leos de duas qualidades diferentes. No encha em excesso o frasco de leo ou ele ir sujar seus dedos. 20 Depois de examinar uma lmina com uma ob- jetiva de imerso, limpe delicadamente o leo da objetiva e da lmina. Se a lmina tiver sido recentemente montada, remova o leo com cui- dado para no remover a lamnula, e apenas o suciente para que, se uma lente seca for usada, no seja contaminada com leo. A remoo de leo das lminas no exige papel prprio para lentes; lenos de papel comuns (tissue) so sa- tisfatrios. Lminas sem montagem no so re- comendadas, mas, se forem preferidas e usadas, deve-se tomar cuidado para minimizar os arra- nhes distenso durante a remoo do leo. 21 Quando terminar o trabalho, recoloque em posio a objetiva de menor aumento presente no revlver e baixe a platina. Remova traos de leo das lentes usando metanol e papel para lentes (lens tissue). Gire o restato ao mnimo antes de desligar a iluminao do microscpio. Nunca deixe o microscpio ligado ao afastar-se do posto de trabalho; naqueles de baixa quali- dade, a lmpada ca muito prxima do diafrag- ma de campo, e o calor prolongado causa dano s suas folhas. 22 Conserve o microscpio limpo. O p deve ser removido com uma escova pequena. As lentes s devem ser limpas com o papel apropriado; este pode ser umedecido com metanol (ou com mistura de trs partes de metanol e sete partes de ter). 23 Cubra o microscpio com a capa apropriada quando fora de uso. * Nota: microscpios usados em laboratrios de hematologia geralmente no tm objetivas 4 , a no ser que tambm se- jam usados para exames histopatolgicos. Se for preciso usar uma objetiva 4 , como para examinar uma bipsia de me- dula, gire a lente do condensador para fora antes de olhar a lmina. CLULAS SANGNEAS 29 Identicao e preveno de problemas 1 Se no houver luz, conra se o feixe luminoso no est voltado para uma cmara. 2 Se voc no conseguir focar a distenso, conra se a lmina no foi colocada com a face inver- tida e, se for montada, veja se no foram colo- cadas duas lamnulas em vez de uma. Alguns microscpios tm uma parada forada (stop) no macromtrico; libere-o se necessrio. Rara- mente pode suceder que uma lmina de vidro excessivamente grosso no permita o foco com objetiva de grande aumento se estiver monta- da; lamnulas excessivamente espessas causam o mesmo problema. 3 Se voc no puder ver a imagem com clareza, limpe a lmina com papel e metanol. Pacoti- nhos de gaze com metanol, usados na desinfec- o da coleta, so convenientes para a limpeza de lminas; o uso evita a necessidade de ter uma garrafa de metanol na sala de microscopia. Se a limpeza da lmina no resolver, limpe a objeti- va com o papel apropriado e metanol. No use xilol, salvo se o metanol for insuciente para a limpeza da lente. 4 Se voc usar culos, notar ser impossvel tra- balhar ao microscpio com lentes bifocais ou multifocais. As lentes plsticas modernas de culos arranham-se facilmente; em especial se tiverem uma cobertura anti-reexiva. Certi- que-se de que as oculares tm uma guarda de borracha se quiser trabalhar de culos com esses tipos de lentes. Exame de uma distenso de sangue 1 Conra o rtulo da lmina (identidade do pa- ciente e data). 2 Examine a distenso macroscopicamente para caractersticas anormais. 3 Ajuste o microscpio como recm-descrito e examine microscopicamente, percorrendo os bordos, a cauda e depois toda a distenso, com pequeno aumento (objetiva 10 ). 4 Depois examine toda a distenso com uma objetiva 40 ou 50 . a parte mais impor- tante do exame; possvel examinar a disten- so quase completamente para notar alguma rara clula anormal. Seja sistemtico: olhe especicamente os eritrcitos, os leuccitos e as plaquetas. 5 Examine com a objetiva de imerso s se houver uma razo particular para isso. Teste seus conhecimentos Questes de mltipla escolha (De uma a cinco respostas podem estar corretas.) 1.1 O sangue para hemograma deve ser anticoagu- lado com: (a) Heparina (b) Citrato (c) Clcio (d) Fluoreto (e) Um sal sdico ou potssico de EDTA 1.2 Uma picada acidental de agulha contaminada pode transmitir: (a) Hepatite B (b) Hepatite C (c) HIV (d) Malria (e) Dengue 1.3 A prtica correta da ebotomia exige: (a) Rotular cuidadosamente os tubos necessrios antes de dirigir-se ao leito do paciente. (b) Sacudir energicamente o sangue para garantir a dissoluo do anticoagulante. (c) Segurar com rmeza o tubo a vcuo para a amostra com a mo no-dominante quando for transferir para ele o sangue da seringa com agulha. (d) Anotar nome e sobrenome e data e hora da coleta no rtulo dos tubos com as amostras de sangue. (e) Usar luvas no procedimento. 1.4 Amostras de sangue capilar, coletadas por pi- cada na pele: (a) Costumam mostrar contagens de plaquetas mais altas do que o sangue venoso. (b) Preferencialmente devem ser coletadas da face posterior ou das laterais do calcanhar. (c) Se coletadas do lbulo da orelha, podem causar sangramento persistente. (d) Exigem picada de 1,5 mm de profundidade, ao menos. (e) Devem ter a primeira gota de sangue desprezada. 30 BARBARA J. BAIN Questes de correlao mltipla Somente uma resposta est correta. Questo 1.1. (Tema: distenses de sangue coradas com corantes de Romanowsky) Opes (a) Azul-acinzentado (b) Azul-escuro (c) Roxo-escuro (d) Laranja (e) Rosa (f) Vermelho (g) Negro (h) Verde-azulado Para cada estrutura, escolha o(s) termo(s) mais acurado(s) da lista anterior para descrever as cores em uma distenso bem corada. Cada opo pode ser usada uma ou mais vezes, ou nenhuma. Estrutura celular Opo apropriada 1. Corpos de Howell-Jolly 2. Corpos de Dhle 3. Corpos de Pappenheimmer 4. Citoplasma de um linfcito atpico 5. Grnulos baslos Referncias bibliogrcas 1 Roddy SM, Ashwal S and Schneider S (1983) Veni- puncture fits: a form of reflex anoxic seizure. Pediat- rics, 72, 715-717. 2 Sander HWE, Conigliari MF and Masdeu JC (1998) Antecubital phlebotomy complicated by lateral an- tebrachial cutaneous neuropathy. N Engl J Med, 339, 2024. 3 Golder M, Chan CL, OShea S, Corbett K, Chrystie IL and French G (2000) Potential risk of cross-infec- tion during peripheral-venous access by contamina- tion of tourniquets. Lancet, 355, 44. 4 Mull JD and Murphy WR (1993) Effects of toumi- quet-induced stasis on blood determinations. Am J Clin Pathol, 39, 134-136. 5 NCCLS. H3-A4 Procedure for the collection of diag- nostic blood specimens by venipuncture, approved stan- dard, 4th edn. NCCLS, Wayne, PA, 1998. 6 Hammond KB (1980) Blood specimen collection from infants by skin puncture. 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