Tipos de Microscpios pticos mais

comuns

- microscpio
estereoscpico simples
(lupa)

- microscpio com sistema
de iluminao invertido

- microscpio ptico de
campo claro (comum, de
transmisso,
composto ou fotnico)

- microscpio ptico com
sistemas de contraste
acoplados
- de fundo escuro
- de contraste de fase
- com contraste diferencial
de interferncia
- de polarizao
- de fluorescncia

COMPONENTES
PRINCIPAIS DO
MICROSCPIO PTICO
(Base e brao)
Sistema de iluminao
Tubo de observao
Focagem
Diafragmas
Condensador
Platina
Revlver porta-objectivas
Objectivas
Oculares
Sistema de filtros
Estativo
- Ampliao

PARMETROS ESSENCIAIS
- Resoluo
-ampliaao









A.N. representa a medida da capacidade de uma lente para receber
informao (luz transmitida) de um objecto

L.R. = K . co / A.N.
K = 0,61 (constante)
A.N. = n.sin a (abertura numrica)
L.R. = limite de resoluo (ou distncia de
resoluo - d)
! = comprimento de onda da luz
a = semi-ngulo de abertura
n = ndice de refraco do meio
n = 1 (ar);
n = 1,33 (gua)




A.N. = abertura numrica
DIC = contraste interferencial diferencial
H = campo claro
D = campo escuro
Ph = contraste de fase
Pol = polarizao
ICS = Infinity ColorCorrected System
Significado das abreviaturas mais comuns
inscritas nas peas do microscpio

Ampliao total
Calcula-se segundo a frmula:
AT = Aob x Aoc (xAi)
AT = ampliao total
Aob = ampliao da objectiva
Aoc = ampliao da ocular
Ai = ampliao intermdia (=1, com iluminao vulgar)


Alguns tipos de lentes objectivas disponveis
Consoante os tipos de correco, as objectivas podem ser:
acromticas com correco da aberrao cromtica
planas com correco da curvatura da lente
com correco ao infinito (#)
plano-acromticas com correco da aberrao cromtica e de curvatura da
lente (objectivas
de grande qualidade para observao e fotografia; com excelente correco e abertura


numrica alta, proporcionando um poder de resoluo mximo, pureza cromtica e
contraste num
campo visual plano)
acroastigmticas para observaes de rotina de todos os tipos
com ris especial para campo escuro
de polarizao
de contraste de fase (CF)
de contraste interferencial diferencial (CID)
de polarizao para epi-fluorescncia utilizam a luz ultravioleta
de imerso (especiais para leo de imerso ou para glicerina ou gua)

Propriedades fsicas do espcime que contribuem
para a formao da imagem

- ABSORO
- NDICE DE REFRACO* E ESPESSURA
- DIFERENAS DE MASSA
- BIRREFRINGNCIA (anisotropia)
- FLUORESCNCIA

*Refraco: mudana de direco de uma onda devido a uma mudana
na sua velocidade

ndice de refraco: relao entre a velocidade da luz no vcuo e
a velocidade da radiao no meio considerado

FUNDO ESCURO
O condensador ilumina o objecto obliquamente
A luz que entra nas lentes e produz imagem no microscpio unicamente
a proveniente das margens ou partculas do espcime
As estruturas celulares mostram-se mais brilhantes contra um fundo
escuro

Utilidade
- localizao rpida de clulas pequenas
- observao de padres de movimento de estruturas filamentares como
flagelos bacterianos
:

POLARIZAO
> Um polarizador localizado no interior do microscpio produz luz polarizada
que passa atravs do espcime
> O analisador transforma o comportamento da luz polarizada que passa
atravs do espcime em contraste visvel na imagem
> Pode detectar-se regies nas clulas onde os seus constituintes esto
dispostos num arranjo ordenado (birrefringentes)

Luz polarizada:
vibra num nico plano perpendicular direco de propagao

Quando um objecto colocado entre o polarizador e o analisador cruzados, qualquer
efeito
deste sobre o percurso natural da luz polarizada, tornar-se- evidente.



Anisotropia: a luz polarizada ao passar atravs de um objecto anisotrpico ou
birrefringente dividida em duas componentes que vibram em planos perpendiculares
com velocidades diferentes.







1. A energia absorvida por um tomo que se torna excitado.
2. O electro salta para um nvel de energia mais elevada.
3. Quando o electro regressa ao seu estado fundamental emite um
foto
Autofluorescncia ou fluorescncia natural, ou
fluorescncia primria:
produzida por substncias normalmente presentes num
determinado tecido ou clula
Fluorescncia secundria, induzida por colorao com
corantes fluorescentes chamados fluorforos





Microscopio confocAL

>Um pequeno ponto de luz (laser) focado no espcime a
uma determinada profundidade
> Um orifcio muito pequeno colocado no detector
(abertura confocal) precisamente onde os raios emitidos
pelo ponto iluminado do espcime esto focados
> A fluorescncia emitida (que atravessa a abertura
confocal) recolhida usando um detector (cmara de
vdeo)
> O varrimento do espcime permite gerar uma imagem
bidimensional
> As imagens obtidas a diferentes profundidades so
usadas para reconstruir uma imagem tridimensional












Microscopia electrnica transmisa
> Os electres so produzidos pelo aquecimento, num tubo de vcuo, de um
filamento de tungstnio - o
ctodo - que emite electres.
> Os electres so acelerados por uma diferena de potencial de 60 000 V
existente entre o ctodo e o
nodo e tm um comprimento de onda de 0,005 nm.
O nodo uma placa perfurada no centro e s permite a passagem de parte
dos electres, formando um
feixe. Estes passam por uma bobina ou lente magntica tambm chamada
condensador, que dirige um
feixe uniforme numa trajectria rectilnea incidindo no objecto.
> Depois de atravessarem o objecto, onde muitos electres so desviados, o
feixe passa por outra bobina que
corresponde objectiva do microscpio ptico.
> A imagem fornecida pela objectiva amplificada por outro campo
electromagntico (projector).
> Essa imagem ampliada pode ser visualizada numa tela fosforescente
sensvel aos electres que incidem
sobre ela. Esta tela em que a imagem se forma uma placa revestida por
sulfato de zinco (ZnS),
substncia que emite luz ao ser excitada pelos electres. A as imagens podem
ser fotografadas para
posteriormente serem estudadas em detalhe. >

Os tecidos so cortados em seces ultra-finas e fixadas com
sais de metais pesados (como tetrxido de smio, acetato de
uranilo e citrato de chumbo) que reagem com os lpidos, protenas


e cidos nucleicos.
>! Estes ies de metais pesados ligam-se a uma variedade de
estruturas celulares e, como so electrodensos, aparecem a preto
na imagem final.


MEV - SEM
> O feixe de e- produzido por um filamento
metlico
aquecido e segue um trajecto vertical atravs
da
coluna do microscpio
> As lentes electromagnticas focam e
direccionam o
feixe para a amostra
> Quando o feixe de e- atinge a amostra,
outros e-
(secundrios) so ejectados
> Os detectores colhem estes e- secundrios e
convertem-nos num sinal que enviado para
um
ecr para formar a imagem
M.E.V.


O microscpio electrnico de varrimento (M.E.V). permite examinar a estrutura
superficial de espcimes com uma ampliao bastante superior do M.O., oferecendo
um efeito tridimensional da imagem.

O M.E.V. varre a superfcie dos espcimes com um feixe de electres focado, numa
cmara com vcuo.

So emitidos electres secundrios a partir da superfcie do espcime, aps
metalizao, os quais so colectados e usados de modo a formar uma imagem de alta
resoluo, com grande profundidade de campo, mostrando admiravelmente os
pormenores da superfcie e produzindo um efeito de relevo.

O material biolgico requer um tratamento prvio especial (fixao) para prevenir o
seu colapso quando submetido ao vcuo do microscpio. Para se produzir vcuo o
material tem que estar perfeitamente seco mas a conduo dos electres fraca. Por
isso necessrio proceder sua metalizao.

Preparao
> O material no necessita de ser seccionado para ser observado
no MEV; podem ser observados objectos com 1 cm de espessura.
> necessria a fixao com glutaraldedo, ou outro fixador,
seguida de desidratao.
> O material corberto por uma fina camada condutora, em geral
ouro, nquel ou platina, depositados por pulverizao, sob vcuo.
este material que vai emitir electres secundrios, os quais iro
ser posteriormente detectados.

FIXAO
Para evitar a destruio do material devido desidratao este previamente
preservado com diferentes fixadores.
Os fixadores so compostos em que as molculas estabelecem ligaes
cruzadas criando uma estrutura tridimensional estvel.
Fixadores para M.E.
>!Glutaraldedo - promove ligaes cruzadas
entre as mollulas proteicas.
>!Tetrxido de smio - liga e estabiliza a
bicamada lipdica assim como as protenas;
adicionalmente, actua como contrastante.

> DESIDRATAO
O material biolgico contm uma elevada quantidade de!gua que tem de
ser removida uma vez que o ME opera!sob vcuo.
!!!!
- O tecido desidratado em lcool ou acetona.