Respirao

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Vamos falar agora dos inibidores dos complexos da cadeia respiratria.
O inibidor do complexo I a rotenona, sendo que esta
Interfere com a cadeia transportadora de eletres nos mitocndrios.
Especificamente, inibe a transferncia de eletres dos centros ferro-enxofre do
complexo I para a ubiquinona, no se formando ubiquinol. Isto vai interferir com
a formao de ATP. Pode levar formao de espcies reactivas de oxignio, pela
reduo deste ao radical, o que vai afetar o DNA e outros componentes do
mitocndrio.
O inibidor do complexo II o malonato de sdio, que se dissocia em malonato e
sdio. Na imagem est reperesentado o malonato. Este liga-se ao centro ativo do
succinato desidrogenase competindo com o succinato.
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O inibidor do complexo III a antimicina A que inibe a transferncia de eletres
do citocromo b para o citocromo c1. Liga-se especificamente ao complexo III.
E por ultimo, o inibidor do complexo IV o cianeto, KCN:
Esferas grandes correspondem ao CN- e as pequenas ao K+. Em soluo aquosa
dissocia-se nos dois ies. Inibe o citocromo c oxidase. O CN- liga-se ao ferro do
enzima e inibe o transporte de eletres do citocromo c para o oxignio.
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O acoplamento dos mitocndrios perdido: Quando perdida a integridade da
membrana a velocidade da respirao mantm-se mais ou menos constante
pois deixa de haver controlo respiratrio;
Na presena de alguns compostos designados por desacopladores verifica-se
um estmulo da respirao mitocondrial at se gastar todo o oxignio disponvel
e da hidrlise de ATP (no de sntese).

O CCP na forma protonada

vai difundir-se pela
membrana mitocondrial do
lado do espao
intermenbranar para a
matriz.

No lado da matriz o pH
elevado e o desacoplador sofre
desprotonao.

O que provoca a dissipao do

gradiente eletroqumico.

Assim ir actuar como um

transportador de protes ao
longo da menbrana no sentido
contrario ao que ocorre na
respirao.

Consequentemente a
velocidade da respirao
aumenta no sentido de
compensar a dissipao do
gradiente.

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Agora vamos falar um pouco acerca do electrodo de oxignio que vai ser usado
durante este trabalho experimental.
Temos um ctodo de platina onde ocorre a reaco aqui presente de reduo do
oxignio a gua
E no nodo de prata ocorre a reaco ocorre a reduo da gua.
Calibrao:
Adicionou-se 2 mL de tampo respiratrio e ditionito de sdio que reage com o
oxignio como se v na equao.
O potencial dever diminuir rapidamente ao nicio e depois mais lentamente
medida que o ditionito reage com o O2.
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Aps alguns minutos o electrodo de estabiliza e a essa estabilizao chamamos
de linha de azoto, sendo que a diferena entre esta e a linha do ar nos d a
concentrao de O2
Como se ve na tabela para uma temperatura de 25C temos 0,253uM de O2, logo,
de acordo com os clculos temos...

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Para o clculo da razo de controlo respiratrio achmos o declive das retas
correspondentes aos estados 3 e 4 atravs de dois pontos de cada uma das retas.
Usmos a escala j existente no papel e considermos o eixo do x e do y. No eixo
do y, embora a escala esteja assim, considermos ao contrrio, ou seja, onde est
o 90, ser o 10.
Calculmos depois a razo, dividindo um declive pelo outro. Fizemos apenas este
exemplo para o complexo I e apresentamos de seguida os restantes resultados.
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Temos aqui o quadro do resumos de resultados, nos trs complexos obtivemos
uma razo superior a 1 o que significa que os mitocndrios esto acoplados tanto
no inicio como no fim. Estar acoplado significa que ao adicionar adp este vai ser
fosforilado e dissipar o gradiente deste modo a cadeia tem de trabalhar mais no
sentido de compensar o gradiente.
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Podemos comparar o estado 2 com o estado 4. O estado 2 corresponde altura
em que j se adicionou substrato mas ainda no se adicionou ATP, ou seja, no
est a ocorrer respirao (de certa forma existe sempre alguma devido fuga
basal de protes). Seria de esperar que a velocidade de consumo do oxignio
fosse igual nestes dois estados, uma vez que se regressa a condies em que no
h ADP. Portanto os declives deveriam ser iguais. No entanto tal no acontece
devido existncia de ATPases endgenos que degradam o ATP libertando ADP
e Pi. Assim, no estado 4 ocorre na mesma o consumo de ADP para a produo de
ATP, embora esta seja menor do que no estado 3. Deste modo a respirao nunca
volta a ter o declive do estado 2 sem ADP.
Inchamento
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possvel detectar os solutos que atravessam a membrana do mitocndrio
atravs da medio da disperso de luz por Espectrofotometria UV-Vis

As suspenses de mitocndrios so trbidas e dispersam a luz. A disperso de

luz (light scattering) sobretudo funo da diferena entre o ndice de refraco
do contedo da matriz e do meio de suspenso, e qualquer processo que diminui
esta diferena ir diminuir a disperso de luz.
Entrada de
soluto pela
membrana
interna

Aumento de
volume da
matriz

nmatriz
aproxima-se
de nmeio

Diminuio
da
absorvncia

Diminuio
da disperso
de luz

Os mitocndrios so adequados para esta tcnica porque as suas matrizes

podem sofrer um grande aumento de volume sem rebentarem atravs do abrir
das cristas da membrana interna.
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As actividades de transporte para os sistemas de transporte de metabolitos
foram demonstradas com o uso de uma tcnica bastante simples introduzida por
Brian Chappell.
A tcnica depende destes quatro postulados.

Os mitocndrios so osmmetros perfeitos: respondem a mudanas na

presso osmtica do meio de suspenso contraindo-se ou inchando
conforme a gua flui atravs da membrana para compensar a diferena de
actividade quando os osmlitos so adicionados (ou removidos) do meio
externo.
A membrana mitocondrial impermevel a pequenos ies como H+, K+,
Na+, NH4+, Cl-, NO3-, etc.
A membrana mitocondrial permevel a molculas pequenas sem carga
como o O2, CO2, N2, glcidos com 3 ou 4 C, etc.
Apesar de a membrana ser impermevel a pequenos ies como Ac- e NH4+,
permevel a HAc e NH3, molculas neutras.

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Centrifugao
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Acetato de potssio
No ocorre inchamento pois nao se cumpre a regra da electroneutralidade.
O potssio passa com carga positiva e o acetato passa sobre a forma neutra, logo
fica uma carga positiva e no ha inchamento.
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Malato de amnio
Inicialmente apenas ao adicionar malatoNh4 no ocorre inchamento
mitocondrial, uma vez que o malato no consegue atravessar a menbrana
mitocondrial. E deste modo, os postulados para o inchamento no so cumpridos.
Ao adicionar fosfato este vai permitir a entrada por antiporte do malato e assim
ambos os pre-requesitos so cumpridos e portanto ocorre inchamento
mitocondrial.
Tal verifica-se no grfico pela diminuio da absorvancia.
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A sublinhado no ocorre inchamento. No acetato de potssio ocorreu um erro,
porque ao comparar os declives parece que ocorreu inchamento, no entanto se
se traasse toda a recta verificava-se que no havia.

Fotossintese I
Slides 1,2 e 3
Objectivo

Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos;

Estudo da reao de Hill e dos aceitadores de electres artificiais

(Ferricianeto de potssio e DCPIP);

Medio da actividade fotoqumica do PS I atravs do bloqueio da

actividade do PS II devido adio de DCMU;

Ensaio espectrofotomtrico da reao de Hill comparao da velocidade

de reduo de DCPIP.

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Procedimento.
Vamos agora estudar o efeito do DCPIP, um aceitador artificial de electroes.
Assim, ao ser adicionado, vai aceitar os electroes do PS II havendo por isso
produo de oxignio, como se verifica pelo declive positivo do grfico.

Neste ensaio foram adicionadas quantidades crescentes de DCPIP, estando aqui

representados a forma como foram calculados os declives, ou seja a velocidade
de produo de oxignio.
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Temos agora uma tabela de resumo de resultados, onde se observa que medida
que se aumenta a quantidade de DCPIP adicionada, maior a quantidade de
dioxignio formado.
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Vamos agora fazer uma comparao dos valores obtidos experimentalmente com
os que era suposto obter de acordo com a teoria.
O dcpip recebe 2 eletres e por isso a estequiometria de 1 para .
Sabendo isto e calculando a quantidade de DCPIP adicionado, pois sabemos a
concentrao, possvel calcular o valor terico.
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Quadro resumo dos valores de quantidades de O2 obtidos experimentalmente e
esperados teoricamente. Como se observa so bastante afastados.
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Conclusao
DCPIP

Ferricianeto de potssio

Ensaio Espetrofotomtrico

A velocidade de formao
de oxignio aumenta
medida que aumenta o
volume
de
DCPIP
adicionado
O nmero de moles
oxignio
obtido
experimentalmente
foi
muito
distinto
do
esperado teoricamente

A velocidade de formao
de oxignio aumenta
medida que aumenta o
volume de Ferricianeto
adicionado
O nmero de moles
oxignio
obtido
experimentalmente
foi
muito
distinto
do
esperado teoricamente

Os ensaios comparados
no
apresentavam
o
mesmo volume de DCPIP
adicionado
Os valores foram muito
distintos
O eltrodo de oxignio
mais sensvel que o
ensaio
espetrofotomtrico

Fotossintese II
Slide 1,2,3
Objectivo
o Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos;
o Estudo do consumo de dioxignio com violognio de metilo como
aceitador artificial de electres;
o Medio da actividade de PS I com o mesmo reagente.

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Para medir apenas o PS I necessrio medir o consumo de O2 ou a reduo do
aceitador terminal, uma vez que no ocorre libertao de O2.
Essencial:

Adicionar um dador artifical de eletres ao invs do dador biolgico, a

gua.

Eliminar qualquer actividade do fotossistema II.

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Procedimento

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Assim, um meio de ensaio simples para o transporte electrnico atravs do PS I
contm violognio de metilo, azeto de sdio, DCMU para inibir o PS II e DCPIP e
ascorbato como par dador de electres. Um bloqueamento do PS II ir dar uma
menor velocidade inicial de consumo de
O2 (PS I + PS II), mas no de consumo de O2 devida apenas ao PS I.
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Podemos ver aqui os clculos do declive.
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Concluso