Protocolo 0

Segurana no laboratrio

Regras:
o Nunca trabalhar sozinho;
o Nunca comer, beber;
o Conhecer a localizao do lava-olhos/duche;
o Conhecer a localizao de todas as fontes de ignio;
o Estar consciente conhecer os reagentes antes de os usar. Ler
os rtulos;
o Nunca cheiras solues ou reagentes;
o Nunca pipetar com a boca;
o Lavar imediatamente aps contacto da pele com qumicos e
lavar as mos antes de sair do laboratrio;
o Estar protegido conhecer as prticas e equipamentos que
podem aumentar a proteco (mscara, luvas, etc).
Proteco pessoal:
o Usar bata;
o No usar sapatos abertos, sandlias, chinelos;
o Usar a hotte sempre que necessrio;
o Retirar a bata e lavar todas as zonas de pele que possam ter
estado expostas a substncias toxicas antes de sair do
laboratrio.
Bancada:
o As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e
limpas;
o Os lixos devem ser perfeitamente identificados;
o Material de vidro estalado ou partido devem ser indirectamente
rejeitado.

Tecnicas de esterilizao destruio completa e todos os organismos vivos

do objecto esterilizado

Principais agentes anti-microbianos:

o Mtodos fsicos:
1. Calor
2. Radiaes
3. Filtrao
o Mtodos qumicos:
4. Desinfectantes
5. Anti-spticos

1. Esterilizao por calor

1. Calor seco
Oxidao e desnaturao de protenas;
Combusto da matria orgnica;

2.

3.

4.

Aplicaes:
o Materiais resistentes a altas Ts (ansas, vidros no
calibrados, etc)
Equipamento:
o Estufas a 160-180 (2h)
o Equipamento de incenerao ou queima directa
2. Calor hmido
Coagulao das protenas; destruio de clulas vegetativa
e esporos
Aplicaes:
o Meios de cultura e solues aquosas;
o Materiais pouco resistentes ao calor.
Equipamentos/tcnicas:
o Autoclave (atmosfera de vapor sob presso)
o Pasteurizao (aquecimento do produto por um
perodo de tempo que varia com o produto a
pasteurizar e a temperatura utilizada)
o Tindalizao (aquecimento a 100C durante 30 min
em 3 dias consecutivos, intercalado com incubao a
35C)
Esterilizao por filtrao
Remoo de microorganismos em membranas filtrantes (com
poros de 0,2 m)
Aplicaes:
o Produtos termo lbeis, volteis ou sensveis a altas
presses (ex: AB ou vitaminas).
Equipamento/ Tcnicas:
o Filtrao com funil (grandes volumes);
o Filtrao com seringa (pequenos volumes);
o Filtrao de ar ou em cmaras de fluxo laminar.
Esterilizao por radiao
1. Raios X e :
Poder ionizante e elevado poder de penetrao para objectos
volumosos
2. Raios UV:
Menos energia, radiao pouco penetrante usada para esterilizao
de superfcies
3. Ultra sons (radiao de alta frequncia):
Destruio mecnica de clulas
4. Raios Catdicos (feixes de e- de intensidade e velocidades
elevadas):
Esterilizao de material cirrgico
Esterilizao por agentes qumicos
Agentes bactericidas ou bacteriostticos (s eliminam formas
vegetativas e no as formas esporuladas)
o Sabes, sais biliares e fenis
o lcoois (desnaturao de protenas e solubilizao de
lpidos)
o Cloro (oxidao de compostos celulares)


Detergentes germicidas (misturas comerciais de vrios agentes
bactericidas e bacteriostticos)

Assepsia (ausncia de microorganismos

Limpar e desinfectar a bancada de trabalho

Lavar e desinfectar as mos no incio e no fim da aula
Usar bata limpa
Trabalhar chama ou na cmara de fluxo laminar
Esterilizar o material a utilizar

Meios de cultura (Multiplicao de microorganismos em laboratrio)

Isolamento de culturas
Manuteno e conservao de culturas
Caracterizao morfolgica, fisiolgica/bioqumica
Estudo de inibio e toxicidade
Etc

Podem ser lquidos, slidos ou semi-slidos

Agar:
o Funde-se a cerca de 80-90C;
o Solidifica abaixo de 40-45C;
o No metabolizado pela maioria dos microorganismos.

Classificao:
o Quanto composio:
Meios definidos: meios em que a composio
rigorosamente conhecida;
Meios complexos: contm ingredientes cuja composio
qumica desconhecida
o Quanto ao efeito dos microorganismos:
Meios diferenciais: distinguem entre diferentes
microorganismos que crescem no meio de cultura;
Meios selectivos: favorecem ou inibem o crescimento de
determinados organismos;
Meios enriquecidos: contm nutrientes especiais que so
necessrios para o crescimento de determinados
microorganismos
Um meio de cultura pode ser simultaneamente selectivo e diferencial.

Protocolo 1 Colorao de componentes da clula

Tcnicas de colorao:
As tcnicas de colorao permitem revelar a forma, a dimenso e os
componentes das clulas bacterianas, bem como alguns aspectos
bioqumicos da sua estrutura.
Permite observar clulas bacterianas em microscopia de campo claro.
fundamental para a taxonomia e identificao de bactrias.

Colorao Gram:
Gram positivo: bactrias com parede celular estruturalmente simples
colorao azul/ violeta (complexo violeta cristal iodo)
Gram negativo: bactria com parede celular estruturalmente simples
contm uma membrana perifrica - colorao vermelha/rosa
(safranina)
Lugol Diluido soluo de I2 em equilbrio com KI (Iodeto de potssio).
utilizado como desinfectante e antissptico. Na microbiologia este
empregue na colorao Gram.
Violeta de cristal (20 S) Lugol (iodo)(1 min.) lcool 95% (20 segundos)
Safranina (1 min.)

Colorao de Endsporos:
Endsporos estruturas resistentes s condies adversas do meio. Podem
ser: Centrais; Terminais; Sub terminais.

Bacillus: gnero de bactrias firmicutes, em forma de bastonete. Seres

aerbios obrigatrios e anaerbios facultativos.
Verde malaquite: substncia txica usada como corante. um corante
triarilmetano.
Verde malaquite 5% (5 min.) gua (lavar) Safranina (45 min.) gua
(lavar)

Protocolo 2 Isolamento de microorganismos,

tcnicas de sementeira e contagem de bactrias
Tcnicas de sementeira:
Sementeira superfcie:
o A sementeira feita em meio slido distribuindo em placas de
petri;
o As colnias desenvolvem-se apenas superfcie do meio de
cultura;
o Facilita o crescimento das bactrias anaerbias.
Sementeira por incorporao:
o A sementeira feita em meio slido fundido (a cerca de 45C);
o As colonias desenvolvem-se no interior e superfcie do meio
de cultura;
o Facilita o crescimento de bactrias aerbicas e anaerbicas
facultativas.

Determinao de UFCs:
Contagem de colnias em placas de petri;
Colnias resultam de uma clula bacteriana isolada, de um agregado
de clulas ou de uma partcula contendo clulas aderentes;
O teor de microorganismos determinados por contagem de colnias
expresso em unidades formadoras de colnias por mL de amostra
(UFC/mL)
So contadas colnias isoladas em placas c/ 30-300 colnias;
Os lquidos de diluio devem manter a viabilidade das clulas.
Teor em microorganismos:
o UFC/mL = (n colnias * factor de diluio)/ volume inoculado

Isolamento de colnias:
Riscado por exausto:

Protocolo 3 Curva de Crescimento

Curva de Crescimento:

Protocolo 4 A caracterizao fisiolgica e

bioqumica de bactrias Gram Pesquisa-se a capacidade de as bactrias utilizarem e
transformarem/degradarem carbohidratos, lpidos, protenas,
aminocidos, cidos nucleicos e tipo de produtos formados
Pesquisa da capacidade de decompor H2O2 (presena de catalase)
o Algumas bactrias reduzem O2 e produzem H2O2 (txico);

Mecanismo de proteco, presente (normalmente) em aerbio

e anaerbios facultativos, que catalizam a decomposio
daquelas molculas (Ex: + Staphylococcus; - Enterococcus)
H2O2 2O2 + 2 H2O

Teste da oxidase na pesquisa de presena de citocromo oxidase

o A enzima citocromo oxidase a ltima enzima da cadeia
transportadora de electres utilizando o O 2 como aceitador e
electres.
o Neste teste utiliza-se um dador artificial de electres, a
tetrametil-p-fenilenodiamina usado para reduzir o citocromo
oxidase.
o Enzima presente violeta; Enzima ausente no h mudana
de cor.
Sistemas miniaturizados de multitestes
Enteropluri-teste:
o

Identificao de Enterobactrias (utilizar em gram- e oxidase-)

Os compartimentos que requerem aerobiose possuem

pequenas aberturas que devem ser obturadas aps inoculao
do microorganismo.
Os compartimentos que requerem anaerobiose possuem uma
camada de cera sobre o meio.

Staf system 18R

o
o

Identificao de Staphylococcus spp.; (gram + includas no

gnero staphylococcus)
Possui 18 compartimentos contendo substratos para a
caracterizao bioqumica dos microorganismos;
Substancia 1 permite verificar a capacidade de
descarboxilar a arginina; 2 e 5 hidrlise
respectivamente da ureia e do O-nitrofenilgalactopiranose; 3 a produo de acetona; 4 a
reduo de nitrato; 6 a resistncia novobiocina
e 7 a 18 a capacidade de reduzir o respectivo
substrato.
A identificao do microorganismo feita com base num
numrico resultante da leitura e interpretao dos resultados

o
o

aps a inoculao da galeria e incobao a 36 (+/- 1C)

durante 18-24h.
O cdigo gerado a partir da leitura dos resultados das
reaces mais e menos.
A identificao da espcie alvo feita por consulta de base de
dados.

B. Efeito de antisspticos, desinfectantes e AB

Mtodo de Kirby-Baver
AB penicilina, tetracielina,
ciprofloxacina, eritromicina, etc.

Am.+

cido

clavulnico,

cloranfenicol,

Antisspticos lcool, betadine.

Desinfectantes lixivia, amukina, det. Lquido, mel.

C. Deteco da produo de enzimas extracelulares

Hidrlise de casena, lpidos, polissacardeos.
Pesquisa da produo de hidroclases que desdobram molculas orgnicas
em molculas de menores dimenses. Ex: Amido (Amilose/ amilopectina)
( amlases) dextrinas, glucose, maltose.

Protocolo 5 Observao de estruturas de fungos

filamentosos
Micologia: cincia que estuda os fungos.
Reino: Fungi

Zygomycota;
Dicaryomycota
Basidiomycotina
Ascomycotina
Imperfecti

Eucariotas:
cogumelos

Ex: Leveduras, bolores, mofos, murro e

Unicelulares
Filamentosos (Hifas, miclio)
H. vegetativas, H. areas
Plasmalina Esterois, lpidos, glicoprotenas

Parede celular (polissacardeos, quitina, glucanos, mananas,

protenas, lpidos)
Clulas uni-, bi-, polinucleadas, cenoctica
Septos parciais, completos (hifas septadas)

Leveduras: (fungos unicelulares)

Unicelulares, sub-esfrica, elipside, voide, irregular

Multiplicao (gemulao, fisso)

Fungos Filamentosos (Hifas, miclio):

Estruturas tubulares, ramificadas, de dimetro a
comprimentos variveis.
Crescimento por alongamento da extremidade apical
Miclio vegetativo (hifas que mergulhas no meio onde
se desenvolvem)
Miclio areo (projectam-se para cima do meio, sendo
frequentemente reprodutor)

Miclio no septado, formao de septos

Estruturas reprodutoras
Septos totais, incompletos ou complexos

Fungos dimrficos (fungos ou leveduras)

Crescem como fungos filamentosos em meios como Sabouraud

dextrose Agar a 25-30C;
Crescem como leveduras em meios como Brain Heart infusion Agar
a 35-37C.

Reproduo:

Assexuada:
o Gemulao;
o Fragmentao;
o Produo de esporos.
Sexuada

Importncia:

Decomposio de matria orgnica;

Fermentao;
Biossntese;
Alimentao;

Investigao cientifica (crescimento rpido, fcil reproduo e

cultura)
Agricultura;
Sade

Cultura:

Crescem em meios de cultura vulgares (PDA, Sabouraud dextrose

agar)
Crescimentos lento, 2-3 semana (T ambiente)
pH cido, AB (cicloeximida suprime desenvolvimento de fungos
saprfitas), cloranfenicol (inibir o crescimento bacteriano)

Identificao:

Morofologia
Aspecto
Superficie
Forma
Cor
Estruturas vegetativas e reprodutoras
Fisiolgia, bioqumica

Implica:

Manipular culturas utilizando tcnicas de segurana microbiolgica

Indicao de recomendaes (procedimentos)
Colheita adequada
Envio imediatamente para o laboratrio
Processamento rpido
Exame microscpico

Isolamento:
Meio Sabouraud dextrose agar
Cicloheximida inibe o crescimento rpido de saprfitos
Cloranfenicol/ Gentamicina Contaminao bacteriana
Leveduras:

Exame cultural:
o Lisas, glabras, hmidas/secas, brancas/creme, rosadas/
laranjas
Exame microscpico:
o Usar placa CORNMEAL TWEEN 80 AGAR e o mtodo de
DALMAU (1/4 superfcie da placa, Fazer pente duplo, cobrir
com lamela, Icubar temperatura ambiente 3 dias na
obscuridade, observar)
Identificao:
o Produo de tubos germinativos

o
o

Inoculo; 0,5-1,0 mL soro; 35-37C; Observar ao microscpio

Assimilao e fermentao de aucares

Bolores:

Exame cultural
Exame microscpico:
o Cultura em placa de petri;
o Preparao extempornea
Lmina, lamela azul de algodo e lactofenol
Exame directo:
o Meio de montagem, aquecimento
Hidrxido de potssio (10%)
o Pesquisa de Hifas, esporos

Candida (C. albicans)

Cultura, assimilao de carbohidratos

Formao de tubos germinativos (2-3h sem soro)

Exame Cultural
Anotar:

Textura e cor da superfcie da colnia

Cor da face reversa
Libertao de pigmentos para o meio

Aspergillas spp.

Hifas
Conidiforo, vescula, condios