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A
B
C
D
1
12
controle
positivo
303
controle
negativo
304
E
F
301
305
G
H
302
306
10
11
+ H2SO4
Ag. HIV
90 a 37C
Ac. Anti-HIV
Conjugado
60 a 37C
OPD
15 a 20-25C
Bloqueio
Leitura
No momento do teste:
6. Para cada amostra de soro utilizada uma fita em separado. As fitas de nitrocelulose so
incubadas na presena do soro ou plasma dos pacientes, assim como, com os soros controles, por
o
2 hs a 37 C.
7. A seguir, as fitas so lavadas, por 3 vezes, com tampo fosfato (PBS-Tween 20).
8. Para detectar a presena dos anticorpos, adicionado soro detector: soro de cabra anti IgG
o
humana, conjugado peroxidase e as fitas so incubadas por 30 min. a 37 C, e lavadas.
9. A reao revelada com soluo de substrato: tampo citrato contendo H2O2 e 4-cloro-1-naftol
(cromgeno), por 10 a 15 minutos temperatura ambiente, e lavadas com gua.
10. Para leitura da reao feita analise das bandas proteicas reveladas, e a presena ou ausncia de
anticorpos para HIV determinada pela comparao de cada fita de nitrocelulose teste com os
padres de bandas dos controles positivos Cada banda visualizada na fita teste deve ser
relacionada com um peso molecular das protenas virais, baseando-se em sua posio e por
comparao com a fita contendo o controle positivo altamente reativo (forte).
Resultados do Western-blot
Exemplos:
Fortemente positivos
Fracamente positivos
Negativo
gp160
gp120
p55
p51
p65
gp41
p39
p24
p18
Controle de soro
Banda especfica de HIV-2
Padro observado
Nenhuma banda presente
Uma bandas presente em gp41 ou gp120/160, e a banda p24
presente. Normalmente gp 120/160 e gp 41 apresentam-se difusas.
Bandas presentes com padro diferente do esperado.
Resultado
Negativo.
Positivo para HIV-1.
Indeterminado.