Universidade Federal de Gois

Instituto de Cincias Biolgicas

Departamento de Morfologia

Disciplina: Biologia Celular

MTODOS DE ESTUDO DAS CLULAS

Profa. Mara Rubia Marques

2015

MICROSCOPIA
Microscpio um instrumento que produz imagens
ampliadas de objetos de tal ordem pequenos que no
podem ser vistos a olho nu.

Tipos de microscopia:
Microscopia de Luz - o espcime atravessado por feixes de luz.
Microscopia Eletrnica - o espcime atravessado por eltrons.

PODER DE RESOLUO
Menor distncia entre duas partculas para que sejam vistas
como unidades separadas.
ML

MET

0,2 m

3 nm

PODER DE RESOLUO
1 cm = 10-2 m
1 mm = 10-3 m
1m = 10-6 m
1 nm = 10-9 m
1 = 10-10 m

Clula animal tpica: 10 a 20 m

(1/5 da menor partcula visvel a olho nu).

MICROSCPIO ELETRNICO
Varredura

Transmisso

MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA

uma tcnica que permite a
visualizao
das
superfcies
de
espcimes no seccionados. A amostra
fixada, dessecada e revestida com a
camada fina de um metal pesado. A
micrografia obtida tem um aspecto
tridimensional.

http://universoemequilibrio.blogspot.com/2009_02_01_archive.html

http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/varredura.htm

MICROSCPIO
ELETRNICO
DE TRANSMISSO

MICROSCOPIA
DE
LUZ

MICROSCPIO DE LUZ MODERNO

Vrias lentes na objetiva e na ocular

1 Condensadora
2 Objetiva
3 Ocular
4 Fonte luminosa
5

5 Platina
6 Charriot
7 Macro e micromanipuladores

MODALIDADES DE OBSERVAO NA MICROSCOPIA DE LUZ

1. Campo claro
2. Campo escuro
3. Contraste de fase
4. Contraste interferencial
5. Polarizao
6. Fluorescncia
7. Microscpio invertido
8. Microscpio estereoscpico (lupa)
9. Confocal a laser

Campo claro

A luz atravessa o material analisado.

Campo Escuro

Um sistema especial de condensador

faz com que a luz fique de tal forma
inclinada que no atravessa o
material. Apenas os feixes desviados
pelo objeto so observados.

Contraste de fase

Anis na lente condensadora e

objetivas promovem retardo ptico
no caminho do feixe luminoso.

Contraste Interdiferencial
(Normarski)

Prismas pticos no caminho da luz

modificam a fase de onda luminosa.

Polarizao

Cndilo mandibular e disco articular. Corante: Picrossrus

Dois filtros (polarizador e analisador) que selecionam apenas um plano de

direo de vibrao da luz: plano de luz polarizada (PPL).

Fluorescncia
As substncias absorvem a luz em
um comprimento de onda e
emitem luz com comprimentos
maiores.
Fonte luminosa: luz de mercrio
Filtros: De excitao / barragem.
Componentes autofluorescentes:
colageno,
lignina,
clorofila,
elastina.
Fluorocromos

permitem
localizao de estruturas.

Clulas cancerosas coradas com Orange de

acridina.
RNA vermelho
DNA - amarelo

Confocal a laser

Cortesia de M. F. Santos

Microscpio invertido

Sans e Quevedo, 2007

O microscpio invertido tem o sistema de iluminao acima do estgio e o sistema de lentes

embaixo. Permitem a visualizao atravs de espcimes espessos, como placas de cultivo de
clulas, pela proximidade da lente ao fundo da placa.

Microscpio estereoscpico

Observao de objetos opacos por onde a luz

no passa, tais como: cristais, fsseis e moedas.

TIPOS DE PREPARO HISTOLGICO

Preparos a fresco (temporrio) vantagens / desvantagens

Preparos permanentes vantagens / desvantagens.

TCNICAS DE PREPARAO DE ESTUDO

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

COLETA DO MATERIAL
FIXAO
DESIDRATAO
DIAFANIZAO
INCLUSO/EMBEBIO
MICROTOMIA
COLORAO

TCNICAS DE PREPARAO DE ESTUDO

http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg

COLETA
Tipos de coleta: Bipsia cirrgica
Bipsia endoscpica
Bipsia por agulha
Cirurgias amplas
Necrpsia

Tamanho do material: A amostra deve ser fragmentada a fim de permitir

a penetrao do fixador por toda sua extenso. De 0,5 a 1 cm.

FIXAO
A fim de conservar as clulas ou tecidos no estado em que se
encontravam em vida. O volume do fixador deve ser no mnimo 10X o
volume do material fixado.

Qualidades dos fixadores:

1. Alto poder de penetrao
2. Manter as caractersticas do tecido e conservar os detalhes estruturais
da clula
3. Favorecer a observao das estruturas
4. Conservar ou aumentar a afinidade dos tecidos pelos corantes.

FIXAO

Formol 10% fixador mais comum na MO.

Tempo de fixao: conforme tamanho e natureza da pea. Em geral de
12 a 24 horas.

PROCESSAMENTO
Incluso da amostra em um material que permita a realizao de cortes
finos desta amostra. Geralmente em Parafina ou seus derivados.

- Desidratao ( lcool)
- Diafanizao (Xilol)

- Incluso (parafina lquida a 58-600C)

LCOOL

XILOL

PARAFINA

DESIDRATAO

DIAFANIZAO

INCLUSO

MICROTOMIA
Micrtomo rotativo tipo Minot
Espessura de 3 a 7 m

CONFECO DE CORTES HISTOLGICOS

Distenso do
corte em
gua fria

Distenso do
corte em gua
quente 400 C

PROCESSAMENTO PARA COLORAO

1. DESPARAFINIZAO: Retirada da parafina do material
Xilol I ... 20 min
Xilol II ... 20 min
Xilol III ... 20min
2. HIDRATAO

lcool a 100% I ... 1 min

lcool a 100% II ... 1 min
lcool a 100% III ... 1 min
lcool a 95% ... 1 min
lcool a 70% ... 1 min
lcool a 50% ... 1 min
Dois banhos em gua destilada de 05 min cada.

PROCESSAMENTO PARA COLORAO

3. COLORAO

Hematoxilina e eosina (HE) o corante de

rotina

PROCESSAMENTO PARA COLORAO

4. MONTAGEM DA LMINA
lcool a 95% ... 1 min
lcool a 100% I ... 1 min
lcool a 100% II ... 1 min
lcool a 100% III ... 1 min
Xilol I ... 1 min
Xilol II ... 1 min
Xilol III ... 1 min iniciar a montagem.
Proteo por Lamnulas de vidro
Meios de montagem: Blsamo do canad, Permount, Entelan