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Biologia Celular I

Volume 1 - Mdulos 1 e 2
4a edio

Apoio:

Mrcia Attias
Narcisa Cunha e Silva

Fundao Cecierj / Consrcio Cederj


Rua Visconde de Niteri, 1364 Mangueira Rio de Janeiro, RJ CEP 20943-001
Tel.: (21) 2334-1569 Fax: (21) 2568-0725
Presidente
Masako Oya Masuda
Vice-presidente
Mirian Crapez
Coordenao do Curso de Biologia
UENF - Milton Kanashiro
UFRJ - Ricardo Iglesias Rios
UERJ - Cibele Schwanke

Material Didtico
Departamento de Produo

ELABORAO DE CONTEDO

Mrcia Attias
Narcisa Cunha e Silva

EDITORA

COORDENAO DE DESENVOLVIMENTO
INSTRUCIONAL

COORDENAO EDITORIAL

Tereza Queiroz

Cristine Costa Barreto

Jane Castellani

DESENVOLVIMENTO INSTRUCIONAL E
REVISO

REVISO TIPOGRFICA

Alexandre Rodrigues Alves


Ana Tereza de Andrade
Mrcio Paschoal

Eduardo Bordoni
ILUSTRAO

Equipe CEDERJ

Carmen Irene Correia de


Oliveira

CAPA

COORDENAO DE
PRODUO

PRODUO GRFICA

COORDENAO DE LINGUAGEM

Jorge Moura

Cyana Leahy-Dios

PROGRAMAO VISUAL

REVISO TCNICA

Andra Dias Fies


Vera Lopes

Ana Tereza de Andrade


Marta Abdala

COORDENAO DE
ILUSTRAO

David Amiel
Patricia Seabra

Copyright 2005, Fundao Cecierj / Consrcio Cederj


Nenhuma parte deste material poder ser reproduzida, transmitida e gravada, por qualquer meio
eletrnico, mecnico, por fotocpia e outros, sem a prvia autorizao, por escrito, da Fundao.

A885b
Attias, Mrcia
Biologia Celular I. v.1. 4.ed / Mrcia Attias.Rio de Janeiro: Fundao CECIERJ, 2010.
166p.; 19 x 26,5 cm.
ISBN: 85-7648-148-0
1. Membrana celular. 2. Microscopia ptica. 3.
Criofratura.
4. Cultura celular. I. Silva, Narcisa Cunha e. II. Ttulo.
2010/1

CDD: 571.6
Referncias Bibliogrficas e catalogao na fonte, de acordo com as normas da ABNT.

Governo do Estado do Rio de Janeiro

Governador
Srgio Cabral Filho

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RIO DE JANEIRO
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RIO DE JANEIRO
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DO RIO DE JANEIRO
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Reitor: Roberto de Souza Salles

UNIRIO - UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO


DO RIO DE JANEIRO
Reitora: Malvina Tania Tuttman

Biologia Celular I
SUMRIO

Volume 1

Mdulo 1
Aula 1 Microscopia ptica ___________________________________ 7
Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 2 Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos ___ 21


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 3 Criofratura _______________________________________ 39


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 4 Cultura de clulas _________________________________ 47


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 5 Mtodos bioqumicos para o estudo da clula _____________ 57


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 6 O uso de anticorpos na pesquisa ______________________ 75


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Mdulo 2
Aula 7 Estrutura da membrana plasmtica ____________________ 87
Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 8 Protenas de membrana ____________________________ 103


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 9 Permeabilidade da membrana _______________________ 117


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 10 As protenas transportadoras _______________________ 125


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 11 Transporte passivo ______________________________ 131


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Aula 12 Transporte ativo ________________________________ 139


Mrcia Attias / Narcisa Cunha e Silva

Gabarito ______________________________________ 153

objetivos

AULA

Microscopia ptica

Ao fim desta aula, voc dever ser capaz de:


Traar um breve histrico da microscopia.
Definir o que um microscpio.
Conceituar limite de resoluo.
Descrever os princpios de funcionamento de um microscpio
simples.
Listar os principais tipos de microscpios pticos e suas aplicaes.
Enumerar as principais etapas do preparo de amostras para
microscopia ptica.

Biologia Celular I | Microscopia ptica

INTRODUO

O primeiro problema a enfrentar no estudo das clulas o seu tamanho:


as clulas so pequenas demais para serem observadas a olho nu. Por esse
motivo, as primeiras clulas foram observadas e descritas apenas no sculo
XVII, quando foi inventado o microscpio ptico.
Voc tem idia de qual o tamanho de uma clula? As maiores clulas (algumas
amebas de vida livre, clulas de algas filamentosas) medem cerca de 0,2mm;
mas, em mdia, uma clula 10 ou 20 vezes menor do que isso.
Voc sabe qual o tamanho dos menores objetos que podemos distinguir a olho nu
(sem ajuda de instrumentos especiais)? A resposta voc vai encontrar mais adiante.
Podemos distinguir uma formiga de uma pulga, mas somos capazes de ver os
olhos desses insetos?

Figura 1.1: (a) Insetos como o mosquito Aedes so visveis a olho nu, mas para vermos
detalhes como o olho composto (b), necessitamos utilizar equipamentos especiais
(Fotos: Mrcia Attias).

HISTRICO
No sculo XVII, foram construdos os primeiros microscpios. Com
um deles, Robert Hooke (veja o boxe explicativo) observou lminas de
cortia, chamando clulas aos pequenos espaos regulares da sua estrutura
(Figura 1.2). Mais tarde, tanto Hooke quanto outros pesquisadores da
poca observaram que as clulas vivas no eram ocas como a cortia, mas
o nome original permanece at hoje. No seria injusto ou incorreto dizer
que o estudo da Biologia Celular comeou nessa poca.

CEDERJ

MDULO 1

1
a

Robert Hooke (1635-1703)


O ingls Robert Hooke foi, em pleno sculo XVII, o que hoje chamamos de homem
dos sete instrumentos, atuando com contribuies relevantes nos campos da
Fsica, Astronomia, Qumica, Biologia, Geologia, Arquitetura e Tecnologia Naval.
Foi colaborador de cientistas como Isaac Newton, seu grande rival da poca, e
Robert Boyle, a quem auxiliou na determinao das leis dos gases. Correspondeuse com Antony van Leeuwenhoek confirmando suas observaes ao microscpio.
Entre outras criaes, inventou ou melhorou instrumentos como o barmetro
e o anemmetro e um mecanismo que tornou os relgios mais precisos.
A Lei de Hooke, equao que descreve a elasticidade, empregada at hoje. Suas
contribuies nos campos da Biologia e Paleontologia no foram menos importantes.
A reputao de Hooke na histria da Biologia se deve em grande parte a sua obra
Micrographia, publicada em 1665. Hooke desenvolveu o microscpio composto
e o sistema de iluminao mostrados na Figura 1.2.a, utilizando-o para descrever
detalhadamente uma grande variedade de organismos como insetos, esponjas, penas
e aquela que parece ser sua maior contribuio, finas lminas de cortia (Figura 1.2.b).
Em desenhos detalhados, Hooke descreveu a estrutura como pequenos poros, semelhantes a
favos de mel, dando-lhes o nome de clulas (= pequenas celas, alojamentos dos monges nos
conventos). Embora as estruturas observadas correspondessem apenas s paredes celulares
de clulas vegetais j mortas, o nome prevaleceu e dele derivaram os termos Citologia e,
mais modernamente, a Biologia Celular. Sua obra permanece at hoje, embora no exista
nenhum registro de sua prpria aparncia.

Outro pioneiro da Microscopia e da


Biologia Celular foi Antony van Leewenhoek,
holands que construa seus prprios
microscpios (Figura 1.3) com apenas uma

Amostra

Parafuso de
focalizao

lente, mas com resoluo suficiente para


observar at mesmo protozorios e bactrias.
Lente
Figura 1.3: Um dos microscpios
montados por Leeuwenhoek.

CEDERJ

AULA

Figura 1.2: (a) Microscpio semelhante ao usado por Hooke.


As partes componentes so anlogas s dos microscpios usados
hoje em dia. (b) Reproduo de
um desenho feito por Hooke a
partir da observao de lminas de
cortia ao microscpio construdo
por ele. Cada um dos espaos
foi por ele chamado de clula.

Biologia Celular I | Microscopia ptica

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)


Embora tenha feito descobertas fundamentais em Biologia, como as bactrias e os protozorios
(parasitas e de vida livre), Antony van Leeuwenhoek no era um cientista convencional para seu
tempo. Ser filho de comerciantes, sem fortuna, sem educao universitria e sem dominar outros
idiomas seno o holands j seria o bastante para exclu-lo do ambiente acadmico da poca.
Ainda assim, com habilidade extraordinria para polir lentes, uma curiosidade infinda e uma mente
aberta e livre dos dogmas cientficos de sua poca (o sculo XVII), Leeuwenhoek foi o primeiro a
descrever as hemcias, os espermatozides e muito mais. Acredita-se que, inspirado pelo livro de
Hooke, Micrographia, Leeuwenhoek comeou a polir lentes e a fabricar seus microscpios, tendo
montado mais de 500 deles.
Seus microscpios (Figura 1.3), embora dotados de uma nica lente, eram capazes de aumentar
at em 200 vezes os objetos. Por outro lado, a iluminao era deficiente e sua manipulao
bastante desconfortvel para o observador. Em 1673, Leeuwenhoek comeou a enviar cartas com
suas observaes recm-criada Royal Society of London. Em 1680 foi eleito Membro Titular da
mesma, juntando-se a Robert Hooke, Isaac Newton, Henry Boyle e outros cientistas de renome
marcantes at nossos dias.

PRINCPIOS DO FUNCIONAMENTO DE UM MICROSCPIO


PTICO
Os microscpios pticos atuais (Figura 1.4) guardam grande
semelhana com os primeiros modelos usados por Hooke (Figura 1.2.a).

Lente ocular
Foco macromtrico
Foco micromtrico
Figura 1.4: Principais componentes de um microscpio
ptico simples.

Objetiva
Platina
Lente condensadora
Fonte de iluminao

Em todos os microscpios pticos, atuais e antigos, teremos uma


fonte de luz que concentrada por um sistema de lentes condensadoras
sobre uma amostra montada sobre uma lmina. O feixe luminoso atravessa
a amostra e captado por uma lente objetiva que produz uma primeira
imagem ampliada do objeto, que ser em seguida captada pela lente ocular
que projetar a imagem final na retina do observador (Figura 1.5).
10

CEDERJ

MDULO 1

1
AULA

Figura 1.5: Esquema da formao da imagem em um microscpio ptico simples.

QUANTO AUMENTA UM MICROSCPIO PTICO?


O aumento final o resultado da multiplicao do aumento dado
pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem vrias
lentes objetivas num mesmo microscpio, uma grande variedade de
aumentos pode ser facilmente atingida, bastando girar o revlver. Assim,
se utilizamos uma objetiva de 20x e uma ocular de 10x, o aumento final
ser de 200x (10x20=200). Hoje em dia no mais necessrio desenhar
as imagens observadas (como Hooke e seus contemporneos faziam):
a imagem final pode ser capturada por uma cmara fotogrfica, de vdeo
ou ainda por um sistema de computao. Uma ampliao suplementar
pode ser obtida ampliando uma fotografia da imagem observada.
Entretanto, de nada adiantaria ampliar a imagem alm de determinado
ponto, pois nenhuma informao suplementar ser obtida. Este o
princpio do limite de resoluo.

O LIMITE DE RESOLUO
Se dependssemos apenas de nossos olhos, no conseguiramos
enxergar nada que medisse menos de 0,2mm. Este o limite de resoluo
de nossos olhos (se enxergarmos muito bem, diga-se de passagem). Graas
aos microscpios pticos, pudemos distinguir objetos que medem at
1 milsimo desse valor, isto , o limite de resoluo dos microscpios
pticos de 0,2m. Naturalmente, isso depende da qualidade das lentes,
mas, principalmente, do comprimento de onda da luz utilizada. Para
saber como esse valor foi calculado, consulte o boxe a seguir.

CEDERJ

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Biologia Celular I | Microscopia ptica

O limite de resoluo
O ponto-chave da Microscopia, seja ela ptica ou eletrnica, o limite de resoluo de
um microscpio. Este conceito bastante simples: trata-se da menor distncia entre dois
pontos em que eles podem ser vistos como objetos distintos.
Complicado? Nem tanto, observe a seguir:

Os objetos A e B esto a uma distncia que nos permite separ-los como distintos, mas se
eles estiverem muito prximos, no podem ser nitidamente separados, ou seja, o poder de
resoluo dos nossos olhos no suficiente para determinar os limites de cada objeto.

A B
Esse conceito universalmente expresso na seguinte frmula:

d = 0,61

em que:
d= limite de resoluo.

= comprimento de onda da radiao utilizada; no caso do feixe luminoso do microscpio


ptico, 550nm.

= n.sen , onde n o ndice de refrao do meio (ar/gua) e q metade do ngulo


formado pelo cone de luz que entra na objetiva (Figura 1.6).

Lente objetiva

Cone de luz

Lmina contendo a amostra

Figura 1.6
Feitas as contas, d= 0,2m no microscpio ptico e, como voc deve saber, 1m = 10-6m.

12

CEDERJ

de resolver (distinguir) objetos de at 0,2nm. Caso voc no esteja


familiarizado com estas UNIDADES DE MEDIDA, consulte a Figura 1.7.
A Figura 1.7 uma escala relativa das dimenses de clulas
e estruturas subcelulares, assim como do alcance dos instrumentos
(microscpios) utilizados na sua descrio e estudo.

MDULO 1

ultrapassado com a construo de microscpios eletrnicos, capazes

As clulas e as
estruturas que
as compem so
muito pequenas
para serem medidas
em centmetros ou
milmetros, como
os objetos do nosso
cotidiano. Portanto,
para elas usamos as

AULA

Na prxima aula, voc ver que esse limite foi novamente

UNIDADES DE MEDIDA

dos micrmetros
(smbolo m)
e nanmetros
(smbolo nm).
O micrmetro vale 1
milsimo do milmetro
e o nanmetro
vale 1 milsimo do
micrmetro.
1m= 103mm
ou 106mm
ou 109nm

Figura 1.7: Escala comparada do limite de resoluo da microscopia ptica


e da eletrnica e os objetos que cada uma pode discriminar.

Se voc ainda no est convencido de que a resoluo no depende

Observao: 103 a
maneira simplificada
com que os
matemticos escrevem
as potncias de 10,
isto , igual a 1.000;
da mesma forma 106
1.000.000, e assim
por diante.

s das lentes, fique sabendo que Antony van Leeuwenhoek j observara


bactrias no sculo XVII, quando a tecnologia para construo de lentes
e microscpios era muito inferior de nossos dias, mas as propriedades
fsicas da propagao da luz eram as mesmas.
Caso voc esteja considerando ampliar indefinidamente uma
imagem observada ao microscpio ptico at conseguir enxergar a
estrutura da membrana celular, por exemplo, podemos adiantar que
isso ser to eficaz quanto ampliar uma foto 3x4 para contar quantos
clios h na plpebra superior esquerda da pessoa.
Concluindo: aumento e resoluo so coisas distintas, e o
aumento que no traz informaes adicionais sobre a amostra
chamado aumento vazio.
Por que ser que isso acontece? Tudo conseqncia da luz.

CEDERJ

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Biologia Celular I | Microscopia ptica

Observe a Figura 1.8: a luz se propaga na forma de


ondas. Estas ondas colidem com as partculas que formam a
amostra, sofrendo interferncias. Assim se origina a sensao
de contraste (claro/escuro). A onda, por sua vez, representa
a luz visvel: apenas objetos at um determinado tamanho
so grandes o bastante para causar interferncia no trajeto
do raio luminoso. Objetos menores passam despercebidos,
e no causam alterao na propagao da onda.

Figura 1.8: O comprimento de onda da luz sofre interferncia de


objetos de determinado tamanho (a), enquanto objetos menores
no desviam o trajeto da luz (b). Os do primeiro tipo so visveis,
e os do segundo, no.
b

D uma paradinha!
Imagine-se andando de bicicleta numa ciclovia. Voc segue em linha reta velocidade da
luz. Voc um raio de luz! Pedrinhas, formigas e outros pequenos objetos no impedem
que voc continue deslizando suavemente, sem interferncias.
J uma chapinha de refrigerante ou um pedregulho podem fazer sua bicicleta se desviar
do trajeto e, no caso de obstculos maiores, podem impedir sua passagem. Assim se
comporta a luz ao atravessar as amostras observadas ao microscpio ptico. Agora,
chega de passear: de volta ao estudo!

OS DIFERENTES MICROSCPIOS PTICOS


Alm de pequenas, as clulas possuem outras caractersticas que
tornam difcil sua observao:
1. em geral, so transparentes;
2. so muito hidratadas e frgeis;
3. quando em rgos ou tecidos, precisam ser cortadas em lminas
finas que permitam a passagem do feixe luminoso.
Por conta disso, foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos tanto
novas tcnicas de preparo das amostras (vide boxe), que lhes conferissem
maior resistncia e contraste, quanto novas tecnologias na construo de
microscpios que permitissem a observao de clulas vivas.

14

CEDERJ

MDULO 1

1
AULA

O preparo de amostras para o microscpio ptico de campo claro


Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de clulas e tecidos precisam em
geral de um tratamento qumico que garanta sua preservao. Esse tratamento inclui vrias
etapas.
1. Fixao: o tratamento da amostra com substncias qumicas, como o formol, que preservam
sua forma original.
2. Desidratao: a substituio da gua presente dentro e fora das clulas por um solvente
orgnico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido deixando a lmina
secar quanto pode ser substitudo por parafina ou outra resina que torne o tecido rgido,
permitindo que seja fatiado.
3. Microtomia: tecidos como fgado ou msculo so muito espessos e precisam ser cortados em
fatias mais finas, que permitam a passagem parcial da luz. Uma vez embebidos em parafina,
deixa-se solidificar, e o tecido pode ser cortado (fatiado).
4. Colorao: como a maioria das clulas e seus componentes no so naturalmente coloridos, uma
srie de corantes foi testada e, devido a sua afinidade qumica por determinados componentes
celulares, so empregados, ajudando na identificao dos diferentes compartimentos celulares.
O azul de metileno um desses corantes.
Mais detalhes sobre as tcnicas de preparo de amostras para microscopia ptica, voc ter em
outra disciplina.

OS DIFERENTES MICROSCPIOS PTICOS


O resultado disso que existe hoje uma grande famlia de microscpios
pticos, cada um com suas vantagens e limitaes sobre os demais. Dentre
os de uso mais corriqueiro, essencial que voc conhea:
1. Microscpio de campo claro ou microscpio simples:
o microscpio padro representado na Figura 1.9.a. Em
geral, requer que a amostra seja fixada e corada antes da
observao (Figura 1.9.b). Entretanto, desde que a iluminao
seja ajustada fechando-se um pouco mais a passagem de luz
pela condensadora, possvel observar clulas a fresco, isto ,

sem colorao prvia (Figura 1.9.c).


Lente ocular
Foco macromtrico
Foco micromtrico
Objetiva
Platina

Condensador
Fonte de iluminao
a

Figura 1.9: Em (a), microscpio ptico de campo claro. Em (b),


hemcito (clula do sangue) de um molusco corado. Em (c), clulas
que revestem a mucosa bucal observadas sem nenhum tipo de
corante. Que estruturas voc reconhece? (Fotos b: Marco Antonio
V. Santos, c: Raul D. Machado).
CEDERJ

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Biologia Celular I | Microscopia ptica

2. Microscpio de contraste de fase: dispensa o uso de corantes,


permitindo a observao de clulas vivas (Figura 1.10). Um sistema de filtros
(anis de fase) interfere no trajeto da luz, criando um contorno claro/escuro
em torno das estruturas celulares. Esse contraste permite a observao de
clulas vivas, mas se elas estiverem muito aglomeradas, a imagem se torna
confusa, requerendo um sistema ptico mais elaborado.

Figura 1.10: A luz, ao interagir com um slido (= clula), tem sua trajetria atrasada, criando um contraste em
relao luz que no encontrou nenhum obstculo (a) (esquema esquerda). Esse o princpio do microscpio
de contraste de fase. direita (b), voc v as mesmas clulas epiteliais (retiradas da mucosa bucal) j observadas
em campo claro tal como aparecem nesse microscpio. H um halo em torno da clula e de algumas de suas
estruturas internas.

3. Microscpio de contraste interferencial: tambm utiliza filtros


para criar contraste a partir de diferenas no trajeto da luz. A imagem
final mais agradvel para o observador (Figura 1.11), mas o sistema
menos comum, pois mais caro que o contraste de fase. Tambm permite
observar clulas vivas. Quando essas clulas esto dispostas em camadas,
pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se assim cortes pticos sem
que o tecido seja cortado.

Figura 1.11: As mesmas clulas epiteliais, observadas na Figura anterior,


agora em contraste interferencial.
A imagem sombreada d noo de
relevo das estruturas celulares (Foto:
Raul D. Machado).

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CEDERJ

MDULO 1
AULA

4. Microscpio de fluorescncia: utiliza uma fonte de luz ultravioleta


e requer o uso de corantes fluorescentes (voc ver mais detalhes na Aula
6) que se ligam a componentes especficos das clulas. Esses corantes
so capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda
(ultravioleta, por exemplo) e emitir num outro, dentro do espectro visvel
(Figura 1.12). Em algumas situaes, as clulas podem ser observadas
vivas; em outras, no.
O mais comum que um modelo possa ter seus jogos de lentes
e fontes de luz alternados (intercambiados) para que se possa observar
amostras pelos trs mtodos.
5. Microscpio confocal de varredura a laser: a conjugao da
cincia da computao aos microscpios de fluorescncia trouxe uma
nova dimenso microscopia ptica.
O microscpio confocal possui, alm de uma fonte de luz visvel,
uma fonte de luz ultravioleta e uma fonte de raio laser. O feixe de laser
incide sobre a amostra; um sistema de filtros e aberturas especiais captura
sucessivamente a fluorescncia emitida de vrios planos focais.
Este conjunto de imagens capturado digitalmente, e imagens como
as da Figura 1.13.b em que voc pode ver a distribuio de microtbulos
em uma clula so geradas em programas especficos de computador.

Figura 1.12: (a) Microscpio confocal de varredura a laser do Laboratrio de Ultraestrutura Celular do Instituto de Biofsica da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ). (b) Distribuio de microtbulos em uma clula de mamfero (Foto: Tecia
Ulisses de Carvalho).

CEDERJ

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Biologia Celular I | Microscopia ptica

Alguns links interessantes apesar de serem em ingls, vale a


pena visitar esses endereos na internet.
1- Dados biogrficos de Leeuwenhoek
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html
2- Dados biogrficos de Robert Hooke
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html
3- Museu da Microscopia. Tutoriais sobre princpios de ptica. Galeria
de imagens, vdeos on line. Vale a visita
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/museum/index.html
4- Pgina da Sociedade Americana de Biologia Celular que disponibiliza
muitos links, imagens e vdeos interessantes.
http://www.ascb.org/
5- Atlas de imagens de Microscopia (ptica e eletrnica), organizado
pelo departamento de Histologia da UERJ.
http://www2.uerj.br/~micron/
6- Maravilhosas imagens de fluorescncia obtidas em microscpio de
fluorescncia confocal.
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html
7- Imagens de protistas em Microscopia ptica de contraste interferencial
e de fase. Links para imagens desses mesmos organismos em microscopia
eletrnica, mostrando como vrios mtodos de observao devem ser
conjugados na anlise de um organismo.
http://megasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html 8- Pgina da Nikkon, com tutoriais onde se pode manusear virtualmente
vrios tipos de microscpio ptico.
http://www.microscopyu.com/tutorials/
Faa sua prpria busca na internet a partir de palavras-chave como:
Microscopia
Microscope
Fluorescncia
Fluorescence
Clulas
Se quiser, faa outras buscas, com palavras que voc escolher.
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CEDERJ

MDULO 1

1
AULA

RESUMO
Os microscpios pticos comearam a ser construdos no sculo XVII, e com
eles foram observadas e batizadas as primeiras clulas. O aperfeioamento na
construo de lentes, filtros e sistemas de iluminao deu origem a uma grande
variedade de microscpios pticos. Alm dos de campo claro, que requerem que
o material seja corado, existem microscpios de contraste de fase e de contraste
interferencial, onde as clulas podem ser observadas vivas e sem colorao
especial. Os microscpios de fluorescncia permitem ver estruturas normalmente
muito finas para serem observadas com os comprimentos de onda da luz visvel.
O microscpio confocal a laser inaugurou uma nova era na microscopia ptica,
mas a observao da maior parte das estruturas que compem a clula s
possvel com um instrumento de maior poder de resoluo: o microscpio
eletrnico, tema da prxima aula.

EXERCCIOS
1. Com base no que foi estudado, calcule o aumento final de um microscpio
ptico que utilize as seguintes combinaes de lentes oculares e objetivas:
Ocular

Objetiva

5x
10x
20x

40x
20x
10x

10x

100x

Aumento final

2. Por que as clulas receberam esse nome?


3. Compare o microscpio de Hooke (Figura 1.2) com o modelo atual (Figura 1.4),
identificando as partes anlogas.
4. Qual a importncia de cada um dos componentes listados a seguir para
observao ao microscpio ptico?
fonte de luz;
lente condensadora;
espessura da amostra;
contraste da amostra.
CEDERJ

19

Biologia Celular I | Microscopia ptica

5. Em que tipo(s) de sistema ptico podemos observar clulas vivas e sem a adio
de corantes?
6. O que voc entende por microscopia de fluorescncia?
7. O que limite de resoluo? Qual o limite de resoluo do microscpio ptico?
8. Uma hemcia mede 8mm(oito milmetros ). Quando observada sob um aumento
total de 1000 vezes, quanto medir?
9. Por que, em geral, o ncleo a nica estrutura claramente visvel dentro de
uma clula observada ao microscpio ptico?
10. Converta para as unidades correspondentes:
5m =...nm
0,5mm= .. m
100m = ..nm
1000m= .mm
60nm=...m

11. Uma clula foi fotografada com 2000x de aumento no microscpio ptico. Uma
estrutura que tenha na realidade 2m aparecer com que comprimento na foto?
12. Procure determinar em que tipo de microscpio ptico foram obtidas as imagens
que esto na ltima pgina deste livro. Se conseguir identificar as amostras, melhor
ainda; caso contrrio, consulte o gabarito desta aula no final do livro.

20

CEDERJ

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:


Situar a microscopia eletrnica como instrumento bsico
no estudo da clula.
Situar a microscopia eletrnica num contexto histrico.
Reconhecer os componentes bsicos do funcionamento
de um microscpio eletrnico.
Discriminar os diferentes tipos de microscpios eletrnicos
de transmisso e de varredura.
Correlacionar os equipamentos usados e as informaes
contidas nas imagens.

AULA

Princpios de funcionamento
dos microscpios eletrnicos

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


INTRODUO

Os microscpios eletrnicos so instrumentos fundamentais no estudo da clula.


Foram desenvolvidos na primeira metade do sculo XX, sendo contemporneos
da televiso e dos aparelhos de raios-X.

HISTRICO
O sculo XX conheceu uma verdadeira "febre" a partir da
descoberta dos eltrons, feita por Thompson, em 1897. Tanto os clculos
feitos pelos fsicos tericos, quanto os experimentos feitos nos "tubos de
raios catdicos" vieram a provar a natureza ondulatria dos eltrons.
Esses pioneiros provavelmente no faziam a menor idia aonde aquelas
observaes iriam levar, mas o estudo do comportamento ondulatrio dos
eltrons resultou tanto na inveno dos aparelhos de televiso quanto na
ERNST RUSKA

de um dos instrumentos fundamentais no estudo da Biologia Celular: o

(1906-1988)

microscpio eletrnico. No ano de 1926, Bush provou que era possvel

Fsico alemo nascido


em Heidelberg, um
dos ganhadores do
Prmio Nobel de
Fsica (1986) por seu
trabalho fundamental
em ptica eletrnica
e por projetar o
primeiro microscpio
eletrnico.
Pesquisador da
Siemens-Reinigerwerke AG (19371955), diretor do
Fritz-Haber-Institut
der Max-PlanckGesellschaft,
Berlim (1955-1972)
e professor na
Universidade Tcnica
de Berlim.

focalizar um feixe de eltrons utilizando uma lente eletromagntica


circular, estabelecendo assim os fundamentos da ptica eletrnica. Com
base nesses princpios, foi iniciada em 1931 a construo do primeiro
microscpio eletrnico por um grupo liderado por Ruska. Pelo enorme
avano que a microscopia eletrnica trouxe para as cincias, Ruska
recebeu o Prmio Nobel na dcada de 80. Em 1939, a Siemens j construa
o primeiro modelo comercial de microscpio eletrnico.
Quando falamos em microscpio eletrnico, na verdade estamos
nos referindo a uma famlia de instrumentos que utiliza um feixe de
eltrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Essa famlia
composta por dois tipos de micrscopios: os microscpios eletrnicos
de transmisso e os microscpios eletrnicos de varredura. Os primeiros
se baseiam na capacidade do feixe de eltrons de atravessar a amostra,
enquanto nos segundos o feixe de eltrons percorre a superfcie da amostra
gerando um sinal que ser visualizado num monitor (Figura 2.1).
monitor
feixe de eltrons

espcime

tela de observao
espcime

(1)

sinal emitido do espcime


gerando imagem

(2)

Figura 2.1: Princpios de funcionamento do microscpio eletrnico de transmisso e do microscpio eletrnico


de varredura. No microscpio eletrnico de transmisso (1) o feixe de eletrns atravessa as reas da amostra onde
tomos mais leves esto presentes. No microscpio eletrnico de varredura (2) a interao dos eltrons com a superfcie
da amostra gera sinais que formam uma imagem num monitor de TV.
22 CEDERJ

MDULO 1

microscpio ptico no difcil determinar o formato geral da clula e a

Resposta:
Porque so pequenas,
transparentes, de
forma e tamanho
varivel

localizao do ncleo, mas no muito fcil identificar estruturas dentro


da clula. Por qu? Veja a resposta ao lado.
Mesmo assim, grande parte das estruturas intracelulares, as organelas,
j havia sido descrita ao microscpio ptico. Naturalmente, as funes e
a estrutura detalhada dessas organelas s foram esclarecidas mais tarde.
O grande salto conferido Biologia Celular depois da inveno desse instrumento
reside no grande poder de resoluo que suas imagens possuem.
d= 0,61

onde, d = limite de resoluo


= comprimento de onda da radiao, no caso
de eltrons, 0,37
= abertura da objetiva em radianos (0,5o= 0,01rad)
assim,
d = 2,2 no microscpio eletrnico e
= angstron. Sabe quantos angstrons h em 1 m? 1m = 1010

Isto , no apenas uma questo de aumentar mais as clulas e sim


de permitir que sejam observadas estruturas menores dentro delas.

O microscpio eletrnico de transmisso


O microscpio eletrnico de transmisso idntico ao
microscpio ptico na montagem de seus itens bsicos (Figura 2.2),
apenas maior e invertido.
fonte de luz

filamento aquecido
(fonte de eltrons)

lente condensadora

Figura 2.2: C o m p a r a o e n t r e
o m i c r o s c p i o ptico (1) e o
microscpio eltrnico de transmisso
(2) mostrando a posio relativa e a
equivalncia de seus componentes.

espcime
lente objetiva

lente
ocular

imagem observada
diretamente

lente
projetora

imagem em tela
fluorescente

CEDERJ 23

AULA

progressos na interpretao das imagens da microscopia eletrnica. Ao

Trs sculos de microscopia ptica serviram para acelerar os

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


O que os diferencia fundamentalmente :
1 a fonte: luz visvel no microscpio ptico e feixe de eltrons
no microscpio eletrnico de transmisso;
2 o vcuo na coluna do microscpio eletrnico de transmisso;
3 as lentes: de vidro no microscpio ptico e eletromagnetos no
microscpio eletrnico de transmisso;
4 a espessura da amostra: da ordem de micrmetros (m) no
microscpio ptico e de nanmetros (nm) no microscpio eletrnico.
O feixe de eltrons gerado por um filamento de tungstnio que
aquecido; podemos comparar ao que observamos numa lmpada em
que o filamento aquecido emite o feixe luminoso (e eltrons tambm).
O vcuo, que tambm existe dentro do bulbo da lmpada,
necessrio no apenas para impedir a combusto do filamento na
presena de oxignio como tambm para impedir a coliso do feixe de
eltrons com molculas do ar. Por outro lado, esse um dos fatores que
impossibilita a observao de clulas vivas no microscpio eletrnico
de transmisso.
As lentes magnticas desviam e orientam o feixe de eltrons
da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o
feixe de luz; lembre-se de que eltrons so uma radiao de carga
negativa, sendo portanto atrados por cargas opostas e repelidos
por cargas semelhantes.
J a amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para ser
atravessada pelos eltrons. Mesmo a lmina de vidro mais fina barraria
o feixe de eltrons. Por esse motivo so usadas telas de cobre para servir
de suporte para os cortes ultrafinos (o processamento e o preparo das
amostras para observao sero descritos mais adiante).
A seguir voc v uma foto de um microscpio de transmisso;
note como ele bem maior que os microscpios pticos, a comear
pela coluna por onde passa o feixe de eltrons e onde esto distribudas
as lentes magnticas (Figura 2.3).

24 CEDERJ

MDULO 1

2
AULA

filamento
posio das
lentes magnticas
local onde
colocada a
amostra
Lupa
para observao
da imagem na tela
fluorescente

Figura 2.3: Microscpio eletrnico Zeiss 900 instalado no Instituto de


Biofsica da UFRJ.

COMO SE FORMA A IMAGEM NUM MICROSCPIO


ELETRNICO DE TRANSMISSO?
Ao interagir com a amostra, os eltrons do feixe podem (Figura 2.4):
1 passar entre os tomos sem colidir com eles;
2 ser barrados por um tomo desviando-se num grande ngulo
(desvio elstico);
3 ser levemente desviados de sua rota por um tomo (desvio
inelstico);

Figura 2.4: Possveis desvios na trajetria de um eltron ao interagir com um tomo.

CEDERJ 25

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


Destas trs possibilidades de interao resultar a imagem no
microscpio eletrnico de transmisso: os eltrons barrados ou desviados
(2) sero excludos da imagem final, resultando em pontos escuros,
enquanto os eltrons que atravessarem a amostra (1 e 3) iro colidir
com uma tela fluorescente, dando origem a pontos claros (Figura 2.5).

espcime

eltrons barrados
abertura da objetiva
eltrons transmitidos

tela
fluorescente
Figura 2.5: Formao da imagem no microscpio eletrnico de transmisso.

PREPARO DE AMOSTRAS PARA OBSERVAO AO


MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO
O ambiente no interior da coluna do microscpio eletrnico
vcuo, feixe de eltrons no nem um pouco favorvel preservao
da estrutura celular. Alm disso, a composio qumica das clulas,
basicamente tomos leves como C, H, O e N, tambm no propcia
formao de imagens no MET. Por esses motivos, assim como o
microscpio foi-se aperfeioando desde sua inveno, paralelamente
toda uma metodologia de preparao de amostras para observao ao
microscpio eletrnico de transmisso foi sendo desenvolvida.

26 CEDERJ

MDULO 1

No incio era assim:

AULA

A micrografia ao lado foi obtida em 1945 com microscpio


de transmisso utilizando espcime biolgico (um fibroblasto de
embrio de pinto). Repare que uma clula inteira e que a imagem
lembra muito o que observamos em microscopia ptica.

Cortesia de www.rockfeller.edu/rucal/journey/journey.html

O uso de substncias para preservar as estruturas


celulares, chamadas fixadores, tornou o microscpio muito
mais til. Veja na figura ao lado a imagem de uma clula vegetal
fixada com uma soluo de KMnO4. O citoplasma aparece
vazio, mas muitas estruturas j so reconhecveis. Veja no

Keith Porter e Raul D. Machado

final da aula, se voc identificou corretamente as organelas.

O uso mais recente do


glutaraldedo, do OsO4 e de
solues tampo, que mantm o
pH e a osmolaridade adequadas
boa preservao celular,
Ledbetter e K. Porter

resulta em imagens como esta,


em que a estrutura da celula
pode ser observada em toda a
sua complexidade.

CEDERJ 27

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


As etapas desse processo esto esquematizadas na Figura 2.6 e
so as seguintes:
1 Fixao: Em geral feita mergulhando as clulas ou tecidos em solues
que estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma o mais
prxima possvel da in vivo. Os mais utilizados so o formaldedo (sim, o
formol, tambm utilizado na preservao de cadveres) e o glutaraldedo,
superior ao formol e por isso mais utilizado do que este. Essas substncias,
chamadas fixadores, so empregadas diludas em tampes, que ajudam
a manter o pH e a osmolaridade da soluo fixadora o mais prximas
possvel das condies vitais. Dessa maneira evita-se a deformao ou o
rompimento das estruturas celulares.
2 Ps-fixao e contrastao: Como os seres vivos so compostos
basicamente por tomos leves que desviam pouco ou nada a passagem
do feixe de eltrons, so utilizadas solues de sais de metais pesados
(Fe, Os, Ur, Pb), que, alm de melhorarem a preservao das clulas,
aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscpio
eletrnico de transmisso. Esses sais se impregnam seletivamente nas
membranas (caso do smio e do chumbo), no DNA (caso do urnio)
ou em outros componentes celulares, facilitando a visualizao dessas
estruturas. O tetrxido de smio (OsO4) impregna-se nas membranas
funcionando como um fixador e conferindo simultneamente maior
contraste s mesmas. Por ser utilizado depois do glutaraldedo, um
ps-fixador. J os sais de chumbo e urnio geralmente so utilizados na
ltima etapa de preparao da amostra, logo antes da observao ao
microscpio eletrnico.
3 Desidratao, incluso e microtomia: A fixao confere preservao s
clulas; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas
para que o feixe de eltrons possa atravess-las tambm um obstculo
a ser superado. Para isso as amostras tm toda sua gua substituda,
inicialmente por um solvente orgnico como lcool etlico ou acetona, e
em seguida por uma resina que, inicialmente, lquida, mas nas condies
adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as amostras
sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os eltrons possam
passar nas reas em que no se impregnaram os metais pesados.

28 CEDERJ

MDULO 1

2
AULA
planta

animal

fragmento
de amostra
lavagem

lavagem

lavagem

1 fixao: ps-fixao:
OsO4
glutaraldedo

25% 50% 75% 95% 100%


desidratao:
acetona

25% 50% 75% 95% 100%


resina

centrifugao
clulas isoladas,
bactrias, etc.

incluso

polimerizao
(a 60C a resina endurece)

As sees ultrafinas
so coletadas da superfcie
da gua com telas de cobre.

ultramicrotomia
(O tecido cortado
em fatias ultrafinas)

contrastao
Antes de ser levada ao microscpio
eletrnico a amostra, j sobre a grade,
passada por solues de acetato de uranila
e citrato de chumbo, que aumentam
o contraste das clulas.

Figura 2.6: Preparo de amostra para microscpio eletrnico de transmisso.

CEDERJ 29

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


As imagens das amostras observadas ao microscpio eletrnico
de transmisso podem ser fotografadas ou gravadas digitalmente para
registro e estudo posterior (Figura 2.7).
Uma idia mais clara sobre a preparao de amostra para microscopia
eletrnica voc ter consultado a plataforma Cederj.

Figura 2.7: Corte ultrafino de um hemcito de


caramujo como o visto na Figura 1.8D. Ao microscpio eletrnico de transmisso podemos
observar que o ncleo no compacto e que diversas organelas esto dispersas no citoplasma.
(Foto Marco Antonio Vasconcelos Santos)

A microscopia eletrnica de transmisso permite a observao


D uma paradinha!

do interior da clula e de suas estruturas e organelas. Infelizmente,

Eltrons, ftons, fixadores


e microtomia... quanta
novidade, no? Neste
ponto sugerimos que voc
interrompa a leitura e
reveja os muitos conceitos
aqui apresentados, antes
de iniciar a leitura do
texto sobre microscopia
eletrnica de varredura.
Questes de autoavaliao sobre este tema
voc encontrar junto
com as de microscopia
eletrnica de varredura.
No plo voc encontrar
material em vdeo sobre
o assunto.

como a observao em geral feita em fatias muito finas das clulas,


temos sempre imagens bidimensionais de objetos que, na realidade, so
tridimensionais. Essa dificuldade foi, ao menos parcialmente contornada
pela microscopia eletrnica de varredura, onde a resoluo de detalhes da
clula se combina observao da sua estrutura tridimensional.

O MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA


No incio deste texto voc pde observar um esquema muito
simplificado, comparando as imagens obtidas num microscpio
de transmisso com o de varredura (Figura 2.1). A Figura 2.8

compara os componentes do microscpio eletrnico de varredura


com o de transmisso. No microscpio de varredura (Figura 2.8)
um filamento de tungstnio aquecido gera um feixe de eltrons,
que tambm incide sobre a amostra, mas ao invs de atravessla varre a superfcie ponto a ponto; porm, nesse caso, ao invs
de atravess-la, interage com a amostra, extraindo da superfcie
desta outros eltrons (chamados eltrons secundrios) que geram
um sinal luminoso que convertido numa imagem (Figura 2.9).
30 CEDERJ

MDULO 1

Como acabamos de comentar, o feixe de eltrons passeia sobre a

amostra, como o feixe de laser sobre o CD que voc ouve. Assim

AULA

como de cada ponto do CD extrado um sinal sonoro diferente (a


msica!), cada ponto da amostra interage de modo diferente com
o feixe de eltrons e dessas diferenas so gerados pontos mais ou
menos brilhantes que formaro a imagem. Essa imagem observada
num monitor de TV e pode ser registrada em fotografia ou num
computador. Veja tambm um modelo de microscpio eletrnico de
varredura na Figura 2.10.

foto: Mrcia Attias

Figura 2.8: Filamento aquecido (fonte de eltrons) do MET, apontar a lente objetiva do MEV.

Figura 2.9: Imagens de microscopia de varredura: A: Clulas na fase final da diviso. B: Detalhe da
regio anterior do inseto Oncopeltus fasciatus. A sensao de profundidade e relevo so as
principais caractersticas dessa modalidade de microscopia eletrnica.

CEDERJ 31

foto: Mrcia Attias

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos

Figura 2.10: Foto de microscpio eletrnico de


varredura Jeol 5310 em
operao no Instituto de
Biofsica da UFRJ.

PREPARO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA DE VARREDURA


Como, em geral, o objetivo do pesquisador ao utilizar o
microscpio eletrnico de varredura obter informaes sobre a forma
externa das amostras (sejam elas clulas, folhas, insetos, dentes, plos
etc.), estas no so cortadas em fatias. O processamento para observao
no microscpio eletrnico de varredura envolve, aps o tratamento com
solues fixadoras, a secagem do material (para remover toda a gua, j
que esse microscpio tambm opera sob vcuo) e seu revestimento com
ouro ou outro elemento condutor, para gerao do sinal (Figura 2.11).
Para maiores detalhes, consulte a plataforma Cederj.

32 CEDERJ

MDULO 1

2
AULA
4

Figura 2.11: Esquema das principais etapas do processamento de amostras


para microscopia eletrnica de varredura.

CEDERJ 33

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos


Outras imagens obtidas com o microscpio de varredura podem
ser observadas nos seguintes endereos da Internet:
http://www.ou.edu/research/eletctron/www-vl/-_links para muitas
colees de imagens, tanto de microscopia ptica quanto eletrnica.
http://www.uq.edu.au/nanoworld/images_1.html
http://www.prbc.hawaii.edu/nanoworld/~kunkel
http://www2.uerj.br/~micron/- laboratrio de microscopia e
processamento de imagens
http://www2.uerj.br/~micron/
Voc tambm pode localizar outros endereos interessantes nos
sites de busca como o:
www.google.com
www.yahoo.com
Compartilhe os resultados de sua busca com seu tutor e com os
colegas do plo.

OUTROS MICROSCPIOS ELETRNICOS


Como comentamos no incio da aula, os
microscpios eletrnicos formam uma verdadeira
famlia. De acordo com os acessrios de que so
dotados ou ainda conforme as amostras sejam
preparadas, diferentes tipos de imagem e de
informao so obtidos.

O MICROSCPIO ELETRNICO DE ALTA


VOLTAGEM
Enquanto no microscpio eletrnico de
transmisso convencional o feixe de eltrons
acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observao
de amostras at 100-150 nm de espessura, no
microscpio eletrnico de transmisso de alta
voltagem a acelerao do feixe de at 1.000
KV. Isso permite a observao de amostras bem
mais espessas (at 2 m!). A maioria das clulas
mais espessa do que isso (5-20 m), mas mesmo
Figura 2.12: Microscpio eletrnico de alta voltagem (1.000 KV)
instalado na Universidade do Colorado em Boulder. (Imagem
retirada do site http://bio3d.colordo.edu/m.html).

assim aspectos importantes das clulas foram


observados nesse microscpio eletrnico de
transmisso (Figura 2.12)

34 CEDERJ

MDULO 1

MICROANLISE

AULA

De acordo com a natureza dos tomos presentes na amostra, a


coliso com os eltrons do feixe gera raios-X e outras radiaes que
podem ser captadas por detectores especiais, dando informaes sobre
a composio qumica da amostra. Esses detectores so acessrios que
podem ser adaptados ao microscpio eletrnico de transmisso ou ao
microscpio eletrnico de varredura.

VARREDURA DE ALTA RESOLUO


Nesse microscpio (Figura 2.13) o feixe emitido muito fino,
varrendo reas muito menores da amostra. Assim, detalhes que passam
despercebidos na varredura convencional podem ser resolvidos. Organelas
e filamentos do citoesqueleto (Figura 2.14), que normalmente no so
visveis ao microscpio eletrnico de varredura, podem ser vistas aqui.

Figura 2.13: Microscpio de

Foto: Celso SantAnna

varredura de alta resoluo Jeol.

Figura 2.14: Os microtbulos que formam o


citoesqueleto desse protozorio (Herpetomonas
megaseliae) no seriam visveis no microscpio
de varredura convencional.

CEDERJ 35

Biologia Celular I | Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos

VARREDURA DE PRESSO VARIVEL (AMBIENTAL)


Nesse modelo de microscpio eletrnico de varredura, a presso
na coluna varivel, sendo possvel observar amostra frescas, isto , sem
nenhum tratamento qumico e sem o processo de secagem. Potencialmente,
podem ser observadas amostras vivas nesse microscpio, mas o poder de
resoluo ainda bastante limitado.
RESUMO
O poder de resoluo da microscopia eletrnica muito maior do que os dos
microscpios pticos porque o comprimento de onda dos eltrons muito
menor do que o da luz visvel. Os princpios da microscopia eletrnica foram
estabelecidos por Ruska no incio do sculo XX. Os microscpios eletrnicos
podem ser divididos em de transmisso e de varredura. Nos primeiros, as imagens
so de cortes ultrafinos ou mostram a regio interna da clula com a estrutura
de membrana, as organelas, como mitocndrias e retculo endoplasmtico etc.
No microscpio de varredura a imagem formada quando o feixe percorre a
superfcie da amostra, arrancando de sua superfcie eltrons que iro formar
uma imagem da superfcie externa que estiver sendo "varrida".

Links de interesse:
http://www.mos.org/sln/SEM/works/slideshow/semmov.html
- animao sobre o funcionamento do MEV.
http://www.denniskunkel.com/ - imagens de microscopia ptica
e eletrnica artificialmente coloridas. Muito bonito!
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html - Maravilhosas imagens de fluorescncia obtidas em
microscpio de fluorescncia confocal.
http://mgasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html - imagens de
protistas em microscopia ptica de contraste interferencial e de fase. Links
para imagens desses mesmos organismos em microscopia eletrnica,
mostrando como vrios mtodos de observao deve ser conjugados na
anlise de um organismo.
http://www.msa.microscopy.com/ProjectMicro/Books4.html
- coleo de CD-roms selecionados com comentrios.

36 CEDERJ

MDULO 1
AULA

EXERCCIOS

1. Defina, em suas prprias palavras, o que o poder de resoluo.


2. Se uma determinada estrutura mede 100nm de dimetro, quanto medir se
observada ao microscpio eletrnico com 10.000X de aumento?
3. Se a rea de observao na tela do microscpio eletrnico mede 9x9 cm e uma
clula mede cerca de 30

de dimetro, qual o maior aumento com o qual

poderemos observar toda sua circunferncia?


4. Faa uma tabela comparando o poder de resoluo, a natureza das lentes
e o tipo de emisso do filamento do microscpio eletrnico de transmisso
em relao ao microscpio ptico.
5. A formao da imagem no microscpio de transmisso se d sobre uma tela
fluorescente. Nos pontos em que os eltrons foram barrados pelos tomos da
amostra, a imagem ____________________, enquanto os eltrons no barrados
incidem sobre a tela e fornecem _______________. tomos de elementos mais leves
tendem a ________________ mais eltrons e elementos mais pesados tendem a
____________________mais eltrons.
6. Por que necessrio que a coluna dos microscpicos eletrnicos permanea
sob vcuo?
7. As clulas so hidratadas e, mesmo sendo formadas por elementos leves
(C, H, N, O), so muito espessas para permitir a passagem de um feixe de eltrons.
Quais os principais processos a que precisam ser submetidas antes da observao
ao microscpio de transmisso?
8. No microscpio eletrnico de varredura as imagens so _______________.
O feixe de eltrons _______________ a superfcie da amostra gerando um sinal
para um monitor de TV.
9. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
transmisso: ______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
10. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
varredura:__________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

CEDERJ 37

objetivos

Ao final desta aula, o aluno dever ser capaz de:


Conhecer os princpios da criofratura.
Entender as informaes contidas numa rplica de criofratura.
Correlacionar a criofratura construo do modelo do mosaico
fluido de membrana.

AULA

Criofratura

Biologia Celular I | Criofratura


INTRODUO

Nas aulas anteriores, procuramos abordar os princpios de funcionamento


dos microscpios pticos e eletrnicos, assim como o tipo de informao e as
limitaes de sua utilizao nas Cincias Biolgicas. No caso do microscpio
eletrnico de transmisso, uma das maiores limitaes sempre foi o fato
de as observaes serem feitas a partir de cortes ultrafinos das amostras,
isto , imagens bidimensionais de estruturas (clulas) tridimensionais. Para
entendermos o tipo de dificuldade que pode resultar disso s pensarmos
num ovo cozido: se ele for fatiado, a aparncia de cada fatia ser diferente
com clara e gema, sem gema, longitudinal, transversal etc (Figura 3.1).

Figura 3.1: Podemos comparar os cortes ultrafinos de microscopia a um ovo fatiado.


Dependendo do plano e sentido do corte, cada fatia ter um aspecto (e uma informao) diferente.

Em contrapartida, a microscopia eletrnica de varredura


proporciona informaes sobre a forma da clula, mas, em princpio, no
capaz de revelar detalhes de sua estrutura interna (veja a Aula 2).
Estes aspectos puderam ser contornados com a observao de cortes
seriados, a partir dos quais se pode montar um modelo tridimensional da
clula e de suas estruturas. Entretanto, esta uma tcnica cujo princpio
simples, mas a execuo bastante trabalhosa (Figura 3.2).

Figura 3.2: Cortes em srie podem dar uma noo da forma tridimensional
de uma estrutura.

Em cortes ultrafinos, a membrana plasmtica aparece sempre


como uma estrutura trilaminar, com uma faixa clara limitada por duas
linhas mais escuras (Figura 3.3).
40 CEDERJ

H muito tempo j era sabido que a membrana plasmtica


era composta principalmente de protenas e lipdeos; entretanto, a
observao da estrutura trilaminar da membrana em cortes ultrafinos
levou concluso errada de que a estrutura da membrana seria um
sanduche de protenas recheado por uma bicamada lipdica.
Uma membrana com essa organizao seria no apenas muito rgida,
dificultando os movimentos celulares, como seria quase impossvel que
substncias passassem atravs dela: aquelas hidroflicas ficariam impedidas de
passar pela bicamada lipdica, assim como seria impossvel que as substncias
hidrofbicas atravessassem a cobertura de protenas (Figura 3.3).
Esse aspecto dificultou a determinao da real estrutura da
membrana, levando a concluses erradas acerca da distribuio de
protenas e lipdeos, porm o desenvolvimento da tcnica da criofratura
abriu um novo horizonte de informaes sobre as membranas celulares.

FUNDAMENTOS DA TCNICA
A tcnica da criofratura surgiu no sculo XX e comeou a ser
desenvolvida na dcada de 60 e a idia inicial foi reduzir ao mximo
os artefatos decorrentes da fixao qumica por aldedos. O objetivo
era parar instantaneamente a atividade celular, provocando a fixao
das clulas sem que nenhum processo de decomposio celular tivesse
tempo de acontecer.
O procedimento bsico para criofratura consiste em quatro etapas
(Figura 3.4):
1. Congelamento das clulas em nitrognio lquido;
2. Fratura das clulas;
3. Evaporao da superfcie fraturada com carbono e platina
formando um molde (chamado rplica) da superfcie fraturada;
4. Digesto dos restos celulares, de modo que apenas a rplica
metlica observada ao microscpio eletrnico de transmisso.
CEDERJ 41

MDULO 1

3
AULA

Figura 3.3: O modelo do sanduche


da membrana era rgido e no explicava os movimentos celulares e o
transporte atravs da membrana,
embora correspondesse imagem
de microscopia eletrnica de transmisso de cortes ultrafinos.
Obs.: este modelo do sanduche
errado e voc ver o modelo correto
na Aula 7 deste curso.

Biologia Celular I | Criofratura


Figura 3.4: Principais etapas do processo de

amostra

lmina

criofratura.
A A amostra congelada sobre um suporte.
B Uma lmina passa sobre a amostra conge-

suporte

lada, que assim fraturada.


b

a
C A superfcie exposta pela fratura evaporada com platina (em ngulo de 45).

carbono

platina

D Em seguida, a superfcie recebe uma camada de carbono, que forma um filme suporte
para a rplica.

E imerso em cidos para digesto da parte


orgnica da amostra.
F a rplica de platina/carbono recolhida em
uma grade para observao no microscpio eletrnico de transmisso.

Na Plataforma voc encontrar mais detalhes


sobre a metodologia e o tipo de equipamento
necessrio para a execuo desta tcnica. Queremos
agora que voc conhea o aspecto da rplica
observada ao microscpio eletrnico de transmisso
e acompanhe a interpretao das imagens.
Observe na Figura 3.5, que a platina depositada
em ngulo, ela no se deposita homogeneamente sobre
a superfcie exposta. J o carbono forma uma pelcula
de espessura uniforme. Agora lembre-se do que
dissemos na aula anterior: no microscpio eletrnico,
os eltrons do feixe tm maior chance de serem barrados
por tomos de elementos pesados, como a platina, do
que por tomos leves como o carbono. Como algumas
Figura 3.5: A platina evaporada em ngulo
se deposita apenas em algumas partes da
superfcie fraturada. O carbono forma um
filme contnuo sobre a superfcie fraturada.
42 CEDERJ

regies possuem platina e carbono e outras s carbono,


mas os eltrons do feixe sero barrados na primeira e
atravessaro a segunda.

MDULO 1
AULA

AS PARTCULAS INTRAMEMBRANOSAS CORRESPONDEM A


PROTENAS DA MEMBRANA
Em 1966, foi possvel demonstrar que quando a fratura expe
a membrana plasmtica, em geral so separados os dois folhetos que
compem a bicamada lipdica, isto , a fratura ocorre, preferencialmente,
no plano mdio da membrana (Figura 3.6). Tambm ficou provado que
as partculas que apareciam nas rplicas correspondiam s protenas
integrais da membrana. Como? Muito simples: foram feitas rplicas
de lipossomas (vesculas formadas apenas por bicamadas lipdicas) e
de membranas extradas de hemcias, observou-se ento que apenas as
ltimas possuam partculas, o que equivale a dizer que quando no havia
protenas nas membranas, tambm no havia partculas nas rplicas. Essa
foi uma das evidncias mais importantes para a sustentao do modelo
do mosaico fluido, proposto por Singer e Nicolson em 1972.

Figura 3.6: O plano de fratura


preferencial divide os folhetos
da bicamada lipdica. Podem ser
observados o folheto voltado para
o citoplasma (face P) ou o lado
voltado para o meio extracelular
(face E) da membrana.

Tambm de acordo com o tipo de protena, algumas ficavam


agarradas ao folheto voltado para o lado externo da clula, a face E da
membrana, e outras partculas ao lado voltado para o protoplasma, a face
P. Numa mesma rplica existem clulas que foram fraturadas de diversos
modos, de modo que sero observadas faces P, faces E e aspectos do
citoplasma de vrias clulas semelhantes. Na Figura 3.7 voc pode observar
uma hemcia, um tipo de clula em que a nica membrana a plasmtica.
De acordo com a clivagem, pode ser exposta a face P ou a face E dessa
membrana. O resultado disso pode ser observado nas Figura 3.8.
CEDERJ 43

Biologia Celular I | Criofratura

Figura 3.7: Esquema de uma hemcia sendo fraturada. Conforme o plano de fratura
pode ser exposta a face P, cncava, ou a face E, convexa.

Figura 3.8: Faces P e E de uma preparao de membranas. Vesculas


maiores (V1) e menores (V2). Foto: Mrcia Attias

INTERPRETAO DAS RPLICAS


Como no se pode prever onde a lmina vai clivar a clula, por vezes
exposto o citoplasma e as organelas (Figura 3.9), enquanto outras vezes
a clivagem ocorre ao longo da membrana, resultando em reas recobertas
por partculas que podem ou no seguir um padro (Figura 3.10).

Figura 3.9: Quando a clula


fraturada em seu plano
mdio, expondo o meio
citoplasmtico, possvel
reconhecer estruturas como
o ncleo (N) que, alm de ser
relativamente grande, possui
um envoltrio duplo e complexos de poro, mitocndrias
(m), cisternas do complexo de
Golgi (cg) e vesculas (V).
foto: Mrcia Attias.

44 CEDERJ

MDULO 1

3
AULA

Figura 3.10: Quando a fratura expe


a superfcie da clula, observamos
vrias partculas intramembranosas,
que correspondem s protenas da
membrana.
Nesta foto, as partculas intramembranosas formam linhas paralelas entre
si (setas), mas isso no comum nas
membranas celulares.
foto: Mrcia Attias.

CONCLUSO
A criofratura continua sendo uma tcnica importante no estudo
das clulas. Atualmente, muitas variaes foram introduzidas, permitindo
a observao no apenas do miolo da membrana, mas tambm das
faces voltadas para o citoplasma ou para o meio extracelular e tambm
de estruturas citoplasmticas, como o citoesqueleto.

RESUMO
A tcnica de criofratura consiste em fraturar clulas ou tecidos depois de
congelados.
A fratura tem grande probabilidade de ocorrer entre as duas camadas de
fosfolipdeos que formam as membranas, expondo uma matriz homognea (os
lipdeos) com partculas de diversos tamanhos nela inseridas. Essas partculas
intramembranosas correspondem a protenas que atravessam a bicamada
lipdica.
A rplica pode expor tanto a face da membrana em contato com o meio
extracelular face E como a face em contato com o protoplasma face P.
Para que a face fraturada possa ser observada ao microscpio eletrnico de
transmisso feita uma rplica em carbono e platina da mesma.
Esta metodologia foi importante para a construo do modelo do mosaico
fluido da membrana.

CEDERJ 45

Biologia Celular I | Criofratura

EXERCCIOS
1. Liste as etapas do procedimento para criofratura, explicando os objetivos de
cada uma.
2. Qual a parte da membrana que exposta a fratura?
___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. A que correspondem as partculas intramembranosas observadas nas rplicas?
___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
4. Qual a contribuio da criofratura na elaborao do modelo do mosaico fluido?
___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________

46 CEDERJ

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:


Conhecer os fundamentos do cultivo de clulas:
Dados histricos;
Os objetivos do cultivo de clulas;
Princpios tcnicos;
Linhagens celulares;
Principais aplicaes e perspectivas:
Produo de heterocrions
Emprego em pesquisa e diagnstico
Clulas-tronco

AULA

Cultura de clulas

Biologia Celular I | Cultura de clulas


INTRODUO

No incio do sculo XX, alguns pesquisadores desejavam estudar a diferenciao


de clulas nervosas. Para tanto, removeram algumas clulas de espinha dorsal de
uma cobaia e as colocaram numa cmara de vidro, mida e mantida a 37 graus
com plasma sangneo. De tempos em tempos, essa cmara era observada ao
microscpio. Nessas condies as clulas no apenas sobreviveram como se
diferenciaram, assumindo o aspecto estrelado dos neurnios. Esse foi o incio
da tcnica de cultura de clulas.

O QUE CULTIVAR CLULAS?


Cultivar clulas, em princpio, consiste em manter vivas clulas
retiradas de um organismo. Geralmente isso feito em tubos de ensaio,
garrafas ou placas de Petri (Figura 4.1). Hoje em dia esses recipientes
tambm podem ser feitos de plstico transparente mas, originalmente,
eram sempre de vidro. Da a expresso in vitro, que significa um
experimento ou observao feita em clulas crescidas fora de um
organismo. Por outro lado, observaes ou experimentos que so
conduzidos em animais so ditos in vivo.

Figura 4.1: Alg u n s t i p o s c e l u l a r e s s p o d e m s e r m a n t i d o s e m a n i m a i s


hospedeiros (a). Outras vezes as clulas so aspiradas do organismo doador e
passam a se multiplicar em placas de Petri, garrafas ou tubos (b).

Como se faz uma cultura?


As culturas podem ser preparadas diretamente de tecidos retirados
de um animal. Nesse caso, so chamadas de culturas primrias. Grupos de
clulas que so retirados das culturas primrias e continuam a crescer in
vitro, do origem a culturas secundrias (Figura 4.2). Esse processo pode
ser repetido vrias vezes, mantendo as clulas por semanas ou meses.
48 CEDERJ

MDULO 1
AULA

Figura 4.2: Clulas extradas de


um organismo e colocada em
cultivo formam a cultura primria.
Se algumas clulas dessa cultura
primria forem transferidas
para novo meio de cultura e nele
crescerem, constituiro culturas
secundrias que podero tornar-se
"imortais".

Do que precisa uma clula em cultura?


Para que uma clula sobreviva in vitro devem ser garantidas
condies de temperatura e umidade semelhantes s do organismo onde ela
se originou. Alm disso, o ambiente precisa ser mantido livre de bactrias,
fungos e outros microorganismos que podem contaminar a cultura de
clulas. As clulas tambm precisam nutrir-se; portanto, o meio de cultura
deve conter todos os nutrientes necessrios para o metabolismo de cada tipo
celular em cultivo. As clulas em cultura tambm produzem excrees que
modificam a acidez do meio e podem intoxicar e matar as clulas em cultivo.

Clulas em cultura requerem


cuidados com alimentao,
temperatura e limpeza comparveis aos de um beb.

Tais substncias precisam ser removidas, seja pela substituio peridica do


meio de cultura, seja pela transferncia de grupos de clulas para placas ou
garrafas com meio novo.

O que o meio de cultura?


O meio de cultura uma mistura de molculas necessrias

C entre ns...
Que bela sopa esse tal
meio de cultura, no?

nutrio da clula. Originalmente era utilizado o soro de animais como


cavalo ou boi. Tambm foi muito empregado o extrato de embries
de galinha. Atualmente existem muitas frmulas quimicamente
definidas, em que se pode avaliar o efeito da omisso ou adio
de determinado componente sobre o comportamento das
clulas. Alm de aminocidos, acares, vitaminas e sais
minerais, geralmente entram na composio dos meios
de cultura protenas do soro, antibiticos e fungicidas,
estes dois ltimos para diminuir o risco de contaminao.
O meio de cultura deve ter osmolaridade e pH adequados
para o tipo celular em estudo.
CEDERJ 49

Biologia Celular I | Cultura de clulas

!
Se voc no lembra o que
osmolaridade ou pH,
consulte o material da
disciplina Bioqumica I.

POR QUANTO TEMPO UMA CULTURA PODE SER MANTIDA?


Num organismo, cada tipo celular programado para um
determinado nmero de divises e tempo de vida. Por exemplo, as clulas
de nossa pele esto constantemente se renovando, graas a divises das
clulas das camadas mais profundas. Essas culturas mantm in vitro as
mesmas caractersticas dos tecidos de onde se originaram. Assim, os
fibroblastos (Figura 4.3), clulas do tecido conjuntivo, secretam colgeno;
clulas cardacas retiradas de embries se contraem, como no msculo
cardaco e as clulas epiteliais retiradas das camadas de crescimento da
pele aderem entre si e formam uma camada sobre a placa de cultivo. Poder
contar com uma populao celular homognea uma grande vantagem
para testar os efeitos de diferentes condies experimentais sobre clulas,
pois estas preservam as caractersticas biolgicas dos tecidos que lhes
deram origem. Um grande entrave a limitao do nmero de subculturas
secundrias. Felizmente, tal limitao pode ser amenizada pelo uso de
linhagens celulares estabelecidas.

Figura 4.3: Aspecto em microscopia eletrnica de varredura de uma cultura de clulas


epiteliais em cultivo sobre uma lamnula de vidro. Note que algumas clulas ainda
esto arredondadas e outras espalhadas sobre a superfcie, fazendo contatos entre si.
Pequenas microvilosidades emergem da superfcie das clulas.

O QUE SO LINHAGENS CELULARES ESTABELECIDAS?


Eventualmente, alguns tipos celulares sofrem modificao gentica
que torna ilimitada sua capacidade de proliferao. Ao contrrio das clulas
cancerosas, que tambm se multiplicam indefinidamente, essas linhagens
celulares conservam vrias das caractersticas das clulas que lhes deram
origem, como a capacidade de adeso, no caso de clulas epiteliais.
50 CEDERJ

MDULO 1

Alm das linhagens naturalmente transformadas, a transformao

pode ser induzida por mtodos qumicos ou infeces virais. Algumas

AULA

linhagens transformadas, se reintroduzidas em animais, podem induzir


tumores, assim como algumas linhagens estabelecidas tiveram origem
em tumores malignos.
As linhagens celulares tornaram possvel obter uma grande
quantidade de clulas homogneas para experimentos. Tambm podem
ser armazenadas por longos perodos em baixa temperatura, em nitrognio
lquido, sendo descongeladas e recolocadas em cultivo quando necessrio.
Existem verdadeiros bancos de clulas em diversos laboratrios.
A seguir, algumas das linhagens celulares mais usadas.
Linhagem

Origem

MDCK (Madin-Darbin canine kidney) Epitlio de rim de


cachorro
PtK1

Epitlio de rato canguru

HeLa

Epitlio humano

3T3

Fibroblasto de camundongo

CHO (chinese hamster ovary)

Ovrio de hamster

UMA LINHAGEM UM CLONE?


No. Uma linhagem formada a partir de um
grupo de clulas extradas de um organismo. Estas,
embora sejam muito semelhantes, no so idnticas.
Porm, uma cultura derivada da multiplicao de
uma nica clula um clone (Figura 4.4). Vrios
clones podem ser obtidos de linhagens celulares j
estabelecidas. Um exemplo so as clulas CHO a
partir das quais foram originados vrios clones com
caractersticas especficas.

Figura 4.4: Numa cultura de clulas podem conviver


diversas variantes de um mesmo tipo celular (clulas B1,
B2 e B3). Se for produzida uma cultura exclusivamente
a partir das clulas B2, esta ser um clone de B2 e
produzir as protenas especficas de B2, como os
componentes da superfcie esquematizados.

CEDERJ 51

Biologia Celular I | Cultura de clulas

AS CARACTERSTICAS DE DUAS CLULAS PODEM SER


COMBINADAS?
Sim. A fuso entre duas clulas de origens diferentes pode ser
(hibridoma vem do
radical hibrid, que
quer dizer mistura,
e a terminao oma,
que designa tumores
em geral.)

induzida, levando unio em uma nica clula onde o ncleo contm


o DNA das duas clulas (Figura 4.5). As clulas resultantes dessa fuso
contm dois ncleos e so chamadas heterocrions (hetero = diferente,
karyon = ncleo). Quando acontece dos dois ncleos se fundirem num s,
dizemos que formou-se um hibridoma (Figura 4.5). Um tipo de hibridoma
muito interessante o que rene o poder de rpida multiplicao de uma
clula cancerosa capacidade de secretar anticorpos dos linfcitos B.
As clulas que renem essas duas caractersticas em geral so selecionadas
e clonadas para produo de anticorpos em grandes quantidades. Para
que produzir anticorpos em laboratrio? Isso o assunto da Aula 6.

Suspenso de dois tipos


celulares em presena de
um agente de fuso

Fuso de clulas e formao


de heterocrions em cultivo

O meio s permite a proliferao


dos heterocrions, que sero
ento clonados

Fibroblasto
humano

Tumor de
camundongo

Figura 4.5: Etapas da produo de um heterocrion.

!
O que so linfcitos B?
So um tipo de glbulo branco do sangue que
produz e secreta anticorpos que aderem aos
organismos invasores (bactrias, vrus etc.) .
Qualquer molcula ou organismo estranho
denominado antgeno. Veja o esquema ao lado.

52 CEDERJ

Heterocrion

Trs clones de clulas


hbridas. Cada um retm
algumas caractersticas
das clulas originais

Clula hbrida (hibridoma)

MDULO 1

O QUE SO CLULAS-TRONCO?

AULA

Por definio, clula-tronco uma clula capaz de se multiplicar


e se diferenciar em qualquer tipo celular. Por isso mesmo chamada
pluripotente. Ao se dividir, uma clula pluripotente pode dar origem a
duas clulas iguais a ela ou, ento, a uma clula ainda pluripotente e a
outra mais diferenciada, que chamada multipotente, pois pode dividirse e diferenciar-se em vrios tipos celulares dentro de uma categoria.
O que induz ou no essa diferenciao a prpria programao gentica
da clula, alm de fatores qumicos presentes no meio extracelular.
J sabido que todas as clulas sangneas se diferenciam a partir de
um nico tipo celular primordial (Figura 4.6).
Empregando as tcnicas de cultura de clulas, os pesquisadores
esto procurando obter clulas-tronco e induzir in vitro sua diferenciao.
O domnio dessa tecnologia pode representar a cura para diversos tipos
de leucemia, pois as clulas que se tornam cancerosas so de um tipo
mais diferenciado. Alm disso, ser possvel a fabricao de sangue a
partir de clulas-tronco do prprio paciente para utilizao em cirurgias,
sem a necessidade de doadores.
Em projetos ainda mais ambiciosos, existe a perspectiva de
regenerar rgos inteiros, como o fgado e o corao, que poderiam ser
utilizados em implantes, e at mesmo a possibilidade de recompor nervos
lesados e recuperar pessoas paraplgicas ou tetraplgicas. Como podemos
notar, embora as pesquisas ainda estejam comeando, as possibilidades
so imensas.

!
A cultura de clulas j est entre ns.
Ao contrrio do que voc possa pensar, a cultura de clulas j faz parte do
nosso dia-a-dia. Quer ver?
1- Os chamados bebs de proveta resultam da fecundao in vitro de um
vulo por um espermatozide. Essa clula-ovo mantida em condies
controladas de cultivo durante as primeiras divises, quando ento
implantada no tero materno para prosseguir seu desenvolvimento.
2- No tratamento de queimados tm sido utilizados fibroblastos que, em
meio de cultura definido, so estimulados a se multiplicar e diferenciar-se
em clulas epiteliais. Essa pele artificial usada em implantes na superfcie
destruda pela queimadura.

CEDERJ 53

Biologia Celular I | Cultura de clulas

Figura 4.6: De um nico tipo celular, pluripotente,


tm origem todas as clulas sanguneas. As clulas
multipotentes que migram para a medula ssea do
origem linhagem mielide que inclui os glbulos
vermelhos, plaquetas e vrios tipos de leuccitos.
As clulas multipotentes que migram para os rgos
linfticos do origem aos linfcitos, leuccitos
responsveis pela fabricao de anticorpos.

RESUMO
Clulas retiradas de organismos, em geral embries ou recm-nascidos,
podem ser cultivadas em frascos ou placas de vidro ou plstico. Essas
clulas precisam ser mantidas em meio que contenha nutrientes e fatores
de crescimento, alm de temperatura, pH e osmolaridade adequados.
Embora a maioria das clulas s possa ser mantida por um nmero
de geraes limitado, existem linhagens de clulas transformadas que
podem ser multiplicadas indefinidamente. Clones de uma nica clula
com caractersticas especficas podem ser produzidos a partir de uma
cultura, assim como dois tipos celulares podem ter suas caractersticas
combinadas num heterocrion, ou hibridoma. O cultivo de clulastronco, clulas pluripotentes que do origem a todos os tipos celulares
durante o desenvolvimento do embrio, so uma esperana da Cincia na
regenerao de rgos e cura de vrios tipos de leucemia.

54 CEDERJ

MDULO 1
AULA

EXERCCIOS

1. Quais os requisitos bsicos para manuteno de clulas em cultura?


2. O que voc entende por clulas in vitro? E in vivo?
3. O que uma cultura primria?
4. Diferencie uma clula transformada de uma clula cancerosa.
5. O que um hibridoma?
6. Da fuso de uma clula tumoral com uma clula secretora foram obtidos
heterocrions com as seguintes caractersticas:
a. Clulas com baixa capacidade de diviso, mas alta atividade secretora
b. Clulas com alta capacidade de diviso e baixa atividade secretora
c. Clulas com alta capacidade de diviso e alta atividade secretora
d. Clulas com baixa capacidade de diviso e baixa atividade secretora
Qual desses heterocrions ser mais interessante? Justifique sua resposta.
7. O que so clulas-tronco?

INFORMAES SOBRE A PRXIMA AULA


Nas aulas seguintes, vamos estudar como o cultivo de clulas fornece
matria-prima para as tcnicas de fracionamento celular e a importncia na
localizao e identificao de componentes celulares ao microscpio ptico
e eletrnico.

CEDERJ 55

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:


Entender como se obtm preparaes de organelas isoladas,
que assim podem ser estudadas fora do contexto celular.
Entender os princpios, e assim os resultados obtidos por
metodologias cromatogrficas e eletroforticas.

AULA

Mtodos bioqumicos
para o estudo da clula

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula

I) FRACIONAMENTO CELULAR
HISTRICO
Nas primeiras dcadas do sculo XX, j havia muita informao
sobre as reaes qumicas ligadas ao metabolismo celular. Nessa poca
tambm os primeiros microscpios pticos j tinham sido criados,
levando ao conhecimento de que uma clula no parecia ter s um ncleo
em seu interior, mas tambm outros componentes menores, cujo tamanho
estava quase fora da capacidade de observao daqueles microscpios.
A questo era como correlacionar esses conhecimentos anteriormente
acumulados usando diferentes abordagens.
Um bioqumico no era capaz de responder em que local da
clula se passava determinada reao enzimtica que ele conseguia
medir no espectrofotmetro. Algumas vezes, era mesmo necessrio
romper as clulas da preparao, fazendo um extrato para que certas
reaes pudessem ocorrer in vitro e serem medidas. Isso mostrava que as
enzimas que se queriam medir nesse ensaio estavam confinadas em algum
compartimento intracelular, a que os reagentes adicionados externamente
no tinham acesso.
De modo recproco, um morfologista no era capaz de responder
que etapas do metabolismo celular ocorriam nas vrias partes da clula
que ele podia ver, especialmente ao se aproximar a metade do sculo, em
que os microscpios eletrnicos comeavam a ser usados para observar
material biolgico.
Nessa poca, dois grupos trabalhavam intensamente para conhecer
melhor o contedo das clulas: o do Dr. Keith Porter, no Instituto
Rockefeller, em Nova York, Estados Unidos, e o grupo da Universidade
de Louvain, Blgica, formado por Albert Claude, George Hogeboom e,
pouco depois, Christian De Duve.
O grupo do Dr. Porter estava criando, com sucesso, mtodos
adequados ao preparo de material biolgico para observao de
amostras biolgicas ao microscpio eletrnico, mtodos que, alis, so
usados at hoje (veja Aula 2). A nova metodologia mostrou, no interior
de clulas eucariticas, muitos compartimentos internos envolvidos por
membrana, muitos grnulos e muitos filamentos. O grupo da Blgica
estava, desde meados da dcada de 30, realizando experimentos em que
clulas de fgado de rato eram rompidas e seu contedo assim liberado
era separado por centrifugao em vrias fraes, ditas subcelulares.

58 CEDERJ

MDULO 1

Depois de separada, cada frao era observada ao microscpio ptico

e ensaiada em vrias caractersticas bioqumicas. Assim, em 1940, o

AULA

grupo belga publicou um trabalho muito importante em que descrevia


os primeiros resultados de fracionamento celular: as clulas do fgado
de rato rompidas podiam ser divididas em quatro fraes. A frao
mais densa continha os ncleos; a prxima, em ordem decrescente de
densidade, era formada por grandes grnulos e consumia oxignio
produzindo CO2; a seguinte era formada por pequenos grnulos e
hidrolisava protenas em pH cido; a menos densa continha protenas
solveis, sendo provavelmente o citoplasma.
Como correlacionar as fraes descritas por Claude e colaboradores
com as observaes de Porter ao microscpio eletrnico? A sada foi a
colaborao direta entre os dois grupos, dando um novo impulso ao
conhecimento do contedo celular e levando descrio de vrias organelas.
importante destacar que o avano espetacular da Biologia Celular nesse
perodo no foi s resultado do esforo de mdicos, bilogos, qumicos
e fsicos. Houve importante colaborao de engenheiros e tcnicos que
trabalhavam nas oficinas das universidades e dos institutos de pesquisa. A
ultracentrfuga e o ultramicrtomo, por exemplo, foram criados nas oficinas
do Instituto Rockefeller nesse perodo.

Preparando a amostra
Para obter preparaes de organelas isoladas e purificadas
preciso evidentemente romper as clulas. No entanto, se nossa amostra
formada por clulas de diferentes tipos, devemos pensar que depois de
rompermos as clulas no temos mais condies de identificar de que tipo
celular veio uma mitocndria, por exemplo. Por isso, antes de comear
a pensar em como romper as clulas, temos de pensar em como tornar
a amostra uma preparao homognea, ou seja, formada por apenas
um tipo celular. Essa tarefa vai ser diferente para cada tipo de material.
Vamos considerar alguns exemplos:
Exemplo 1 Amostra de exsudato peritonial. Para obter
amostras de clulas do sistema imune que residem aderidas na parede
interna do peritnio, injetamos pequena quantidade de lquido nessa
cavidade de um animal anestesiado (geralmente um camundongo) e
massageamos levemente para que as clulas se soltem da parede. Em
seguida, retiramos o lquido que vem com uma mistura de clulas.
esse lquido que chamamos de exsudato ou lavado peritoneal. A mistura
CEDERJ 59

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula


formada principalmente por macrfagos e vrias classes de linfcito.
Eventualmente, dependendo das condies fisiolgicas do animal,
tambm pode haver nmero significativo de neutrfilos. Para vrias linhas
de pesquisa na rea de Parasitologia, necessrio estudar a interao
de patgenos com macrfagos, j que estas clulas so as primeiras a
interagir com agentes invasores de nosso organismo.
Para separar os macrfagos das outras clulas dessa preparao e
fazer uma cultura primria (veja aula de Cultura de Clulas), podemos
explorar uma atividade biolgica natural, a adeso a substratos. Todas
as clulas retiradas no exsudato aderem a substratos, mas fazem isso
em velocidades diferentes. Os macrfagos aderem a substratos como
vidro ou plstico em cerca de 15 minutos, se estiverem em meio de
cultura e a 37oC, enquanto os linfcitos levam mais de meia hora nas
mesmas condies. Assim, podemos obter uma preparao homognea
de macrfagos usando a sua atividade biolgica natural. Mas, na maioria
das vezes, isso no possvel. Veja os prximos exemplos.
Exemplo 2 Separao de clulas do sangue. As hemcias e os
leuccitos circulantes (linfcitos, neutrfilos, moncitos, eosinfilos,
basfilos etc.) podem ser separados uns dos outros e do plasma por
diferena de densidade. Se deixarmos um tubo com sangue heparinizado
em repouso sobre a bancada, depois de algum tempo haver separao
de seus elementos, que se depositaro no fundo do tubo. A deposio
dos elementos do sangue nessas condies ser muito lenta.

!
Ateno! No confunda com o processo de coagulao! Faz parte do plasma
sangneo uma srie de protenas da coagulao: quando retiramos sangue
de um vaso, ou lesamos um vaso, forma-se uma rede protica cujo principal
componente a fibrina, que retm todas as clulas e deixa escapar o lquido. A
rede protica contendo as clulas chamada de cogulo e o lquido chamado
de soro. Assim, a diferena entre plasma e soro que o primeiro ainda contm
as protenas da coagulao e o segundo no. Esse processo fisiolgico e pode
ser inibido in vitro por algumas substncias como heparina e citrato de sdio,
entre outras. Quando retiramos sangue para exame, por exemplo, o processo
de coagulao inibido para que, alm do plasma, as clulas tambm possam
ser examinadas.

60 CEDERJ

MDULO 1

Se o tubo com sangue heparinizado for centrifugado, essa deposio

ocorrer em poucos minutos, colocando as hemcias no fundo porque so

AULA

mais densas; sobre elas se forma uma fina camada esbranquiada (buffy coat)
que contm os leuccitos e, no sobrenadante, o plasma sem clulas.
Que fique clara ento a definio dos termos: precipitado o
material que se depositou no fundo no tubo que foi centrifugado e
sobrenadante o material que no se depositou. Na linguagem de
laboratrio, ns nos referimos ao precipitado de uma centrifugao pelo
nome em ingls, pellet, talvez para no confundir com o precipitado
resultante de uma reao qumica. Esse mtodo bom para separar
as hemcias das outras clulas do sangue, porque a densidade dela
muito diferente. Mas como fazer para separar clulas de densidade
muito prxima?
Exemplo 3 Nos ltimos anos, tem sido necessrio separar as
diferentes classes de linfcito para realizar estudos de interao com o
vrus HIV ou mesmo procedimentos clnicos em que apenas a classe de
linfcito que o vrus infecta tratada e depois devolvida circulao
sangnea do paciente.
Apesar de exercerem funes bastante diversas na defesa de um
organismo (voc vai aprender mais adiante no curso), as diferenas entre
as classes de linfcitos que nos permitem separ-los so principalmente
molculas de sua membrana plasmtica expostas ao meio extracelular.
Quando essas molculas foram descritas e foram produzidos anticorpos
contra elas, uma importante ferramenta ficou disponvel. Assim, podemos
incubar a mistura de linfcitos com anticorpos que s reconhecem uma
das classes. Se esses anticorpos estiverem conjugados com fluorocromos,
podemos separar os linfcitos em um aparelho que reconhea molculas
fluorescentes. Veja na Figura 5.1 um esquema deste aparelho, o citmetro
de fluxo, ou FACS (fluorescence activated cell sorter).
Colocamos a mistura de linfcitos que j foram incubados com
anticorpos fluorescentes numa entrada do aparelho que parece um funil.
A ponta do funil muito fina e est submetida a uma vibrao que faz
com que pinguem gotculas regulares e de tamanho to pequeno que
s comportam uma clula (ou nenhuma). As gotculas passam em fila
indiana entre um laser (que vai excitar o fluorocromo) e um detector
(que vai ler se aquela gota tem clula, de que volume, se ela fluorescente
ou no, e qual a intensidade da fluorescncia). Associado ao detector h
um sistema que coloca carga negativa nas gotas que contm uma clula
CEDERJ 61

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula


fluorescente (colocando ons no lquido da gota, no nas clulas) e positiva
nas que contm clulas no fluorescentes. As gotas que contm mais de
uma ou nenhuma clula no recebem carga. Todas as gotas passaro
por um campo eltrico que desviar as
gotas positivas para um recipiente e as
negativas para outro, separando assim
os linfcitos marcados em um recipiente
e as outras clulas em outro recipiente.
Os citmetros de fluxo eram aparelhos
raros (e caros!) no incio da dcada de 90,
mas hoje j so encontrados em vrios
institutos de pesquisa, nos grandes
hospitais e em alguns laboratrios de
anlises clnicas.
Exemplo 4 E se ns quisssemos
trabalhar com um rgo como o fgado?
Para conseguir uma preparao homognea de hepatcitos, por exemplo, seria
necessrio primeiro soltar as clulas que
esto unidas entre si e matriz extracelular
(voc vai saber detalhes desse assunto
Figura 5.1: Citmetro de fluxo (FACS).

em Biologia Celular II). A unio das


clulas com a matriz e com outras clulas
pode ser de vrios tipos, mas tem duas

caractersticas em comum: so ligaes proticas, estabilizadas por clcio.


Se quisermos solt-las, ento vamos retirar o clcio, usando quelantes
(substncias que ligam ons metlicos, tornando-os indisponveis para
outras ligaes) como EDTA ou EGTA, e quebrar as ligaes proticas,
usando enzimas proteolticas, como a tripsina. Esses tratamentos devem
ser controlados para no romper as prprias clulas. Depois de soltas,
as clulas podem ser separadas por diferena de densidade, usando
centrifugao.
Assim, de alguma das maneiras acima, conseguimos uma
preparao homognea, o que nos permite comear o fracionamento
celular propriamente dito, rompendo as clulas.

62 CEDERJ

MDULO 1

Rompimento celular

AULA

No fracionamento celular, o que se deseja fazer romper a


membrana plasmtica sem romper as membranas das organelas. difcil
conseguir isso, e para cada tipo celular existem mtodos de rompimento
mais adequados que outros. Alm disso, as clulas de uma preparao
no se rompem todas simultaneamente; o processo progressivo e
precisa ser acompanhado ao microscpio ptico. Dentre os mtodos
mais usados esto:
a) choque osmtico: as clulas so colocadas em meio hiposmtico,
aumentando de volume at arrebentar. o mtodo de escolha para
romper hemcias, por exemplo. Em outras clulas, temos de nos
preocupar em restaurar a osmolaridade ideal rapidamente para
que as membranas das organelas no se rompam tambm.
b) choque trmico: as clulas devem ser congeladas e descongeladas
rapidamente, alternando-se, por exemplo, imerso em nitrognio
lquido (-196oC) e banho de 37oC.
c) macerao: pode ser realizada com homogeneizadores parecidos
com um liquidificador, ou de modo mais delicado com homogeneizadores de vidro, que se parecem com um copo onde um mbolo
entra justo, forando as clulas a sofrer o atrito entre os vidros.
Seguindo o mesmo princpio, alguns pesquisadores usam pequenas
prolas de vidro misturadas preparao. Agitando a preparao,
as prolas se chocam, rompendo as clulas.
d) sonicao: todas as estruturas, biolgicas ou no, possuem uma
freqncia de ressonncia caracterstica. Uma vibrao nessa
freqncia que tenha grande intensidade pode romper a estrutura.
a mesma histria da ponte que vibra com a marcha dos soldados
ou do estdio lotado que vibra com os gritos e pulos da torcida.
Teoricamente, possvel usar ultra-som com uma freqncia de
vibrao e intensidade adequadas para romper apenas a membrana
plasmtica e deixar as estruturas intracelulares intactas. Na prtica
porm, os sonicadores (aparelhos que emitem ultra-som) no tm
um controle de intensidade, freqncia e amplitude to bom que
permita esse ajuste. Mesmo assim, a sonicao um dos melhores
mtodos para o rompimento de clulas.

CEDERJ 63

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula


e)

tratamento com detergente no inico: como as molculas de


detergente no inico so anfipticas, elas conseguem substituir
as molculas de fosfolipdio na membrana plasmtica, causando
o rompimento. Os detergentes so usados em concentrao
muito baixa e por pouco tempo.
Depois do rompimento, os fragmentos de membrana logo se

resselam para esconder da gua a poro hidrofbica da bicamada


lipdica, formando pequenas vesculas. Os fragmentos de membrana
podem resselar mantendo para fora o folheto da membrana que estava
voltado para o meio extracelular, formando vesculas do lado direito (insidein), ou do lado do avesso (inside-out) quando o folheto que era virado para
o citoplasma fica voltado para fora na vescula resselada (Figura 5.2).

vesculas inside-in

vesculas inside-out
Figura 5.2: Esquema da produo de vesculas de membrana.

Com o rompimento adequado, conseguimos obter um


homogeneizado total, isto , uma preparao em que a maioria das
clulas est rompida, as organelas esto ntegras mas espalhadas
na preparao, e o contedo solvel do citoplasma est misturado
com o lquido onde as clulas foram rompidas.

Centrifugao diferencial
A maneira de separar o contedo celular em vrias fraes
explorar as diferenas de densidade (relao massa/volume) entre os
componentes celulares, usando uma ultracentrfuga.
Centrifugando o homogeneizado a baixa velocidade (cerca de
1.000g, 10 min), conseguiremos colocar no pellet os componentes mais
densos da mistura, que so as clulas no rompidas e os ncleos. Se
vertermos o sobrenadante em um novo tubo de centrfuga, podemos
centrifug-lo a uma velocidade maior (cerca de 10.000g, 10 min) e assim
colocar no pellet mitocndrias, peroxissomos, lisossomos (e cloroplastos,
se estivermos trabalhando com vegetais). Se mais uma vez passarmos
o sobrenadante para um novo tubo e centrifugarmos em velocidade
64 CEDERJ

MDULO 1

ainda maior (cerca de 20.000g, 30 min), poderemos peletar a chamada

frao microssomal, formada por vesculas de origem variada, como a

AULA

membrana plasmtica, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi e


os endossomos. Desta vez, o sobrenadante contm ribossomos, partculas
virais (se houver), e macromolculas, como DNA e grandes complexos
enzimticos. Esses componentes tambm so centrifugveis, mas para peletlos so necessrias altssimas velocidades (200.000g) por muitas horas.
O sobrenadante final, ou frao sobrenadante, uma soluo verdadeira,
que contm os componentes solveis do citoplasma (Figura 5.3).

!
Uma centrfuga um aparelho em que um motor faz um eixo girar em grande velocidade (como numa mquina de
furar). Essa velocidade medida em rpm (rotaes por minuto). Ao eixo que gira se adapta uma pea, o rotor, onde
colocaremos tubos com o material a ser centrifugado. Durante a centrifugao, forma-se um campo gravitacional
cuja intensidade (medida em gravidades - g) proporcional velocidade da centrifugao. Assim, a fora centrfuga
empurra o material para o fundo do tubo numa velocidade que depende da centrifugao, da densidade do
material e do meio em que ele se encontra.
Veja se voc entendeu: a medida rpm se refere
velocidade com que o rotor gira. A medida g
Material em
se refere intensidade do campo gravitacional
Cmara blindada
Sedimentao
formado durante a centrifugao.
Dentre os diferentes componentes de uma
amostra submetidos s mesmas condies
de centrifugao, os mais densos vo para o
fundo primeiro, os de densidade intermediria
depois, e por fim os de menor densidade.
Claro que a prpria densidade do lquido em
que os componentes celulares esto suspensos
tambm influencia. As primeiras centrfugas
tinham eixo horizontal e foi um grande
avano quando foram construdas centrfugas
cujo eixo girava na vertical.
As mais simples so ditas centrfugas clnicas, por
serem muito usadas em laboratrios de anlises
clnicas (existe uma no laboratrio de aulas
prticas no plo; observe-a melhor) para separar
os componentes do sangue (veja exemplo 2,
anteriormente). Essas centrfugas atingem
velocidades de at 3.000 rpm. No entanto,
para separar componentes de densidade
menor, como organelas, necessrio um campo
gravitacional mais intenso, que s conseguido
Vcuo
em centrifugaes de velocidade muito maior.
Isso s foi possvel quando se construram as
Refrigerao
primeiras ultracentrfugas, na dcada de 30.
Nesses equipamentos, o rotor gira numa cmara
blindada, refrigerada e sem ar (no vcuo),
diminuindo assim as foras de atrito.

CEDERJ 65

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula

Figura 5.3: Esquema de uma


centrifugao diferencial.

Voc j deve ter notado que apenas com a centrifugao diferencial


no podemos obter organelas totalmente isoladas das demais. Isso acontece
porque a diferena de densidade entre lisossomos e peroxissomos, por
exemplo, no muito grande. Alm disso, nem todas as organelas do
mesmo tipo tm exatamente a mesma densidade, h pequenas variaes.
Para resolver isso, podemos recorrer a um tipo de centrifugao em que,
alm de variar a velocidade e o tempo de centrifugao, podemos variar
tambm a densidade do meio em que as organelas so centrifugadas. Depois
de fazer centrifugao diferencial, retomamos o pellet e o colocamos sobre
um gradiente de densidade previamente montado num tubo de centrfuga
(Figura 5.4). Para montar esse gradiente, usamos solues concentradas
de densidade conhecida, como sacarose para separar organelas, cloreto de
csio para separar DNA e outros meios especiais que variam de densidade
sem exercer efeito osmtico.

Figura 5.4
66 CEDERJ

MDULO 1

Neste tipo de centrifugao, o material que est a caminho do

fundo do tubo encontra densidades cada vez maiores do lquido, tendo

AULA

cada vez mais dificuldade de prosseguir. Quando um componente da


mistura de organelas encontrar uma regio do gradiente que tenha
densidade igual sua, entrar em equilbrio, formando uma banda.
Essa banda poder ser recolhida cuidadosamente com uma pipeta ou
uma seringa e, assim, finalmente, temos uma organela purificada.
O sucesso de um protocolo de fracionamento celular pode ser
avaliado de duas maneiras:
a) por microscopia eletrnica, processando cada etapa e
observando no microscpio que componentes da clula esto presentes
naquela frao e se esses componentes esto bem conservados ou se o
fracionamento os danificou;
b) pela dosagem de enzimas marcadoras em todas as fraes;
para uma enzima ser considerada marcadora de uma organela, preciso
que ela esteja presente apenas nessa organela e em nenhum outro lugar
da clula e que seja encontrada nessa organela em todos os tipos
celulares. Essas enzimas foram estabelecidas nos primeiros trabalhos
de fracionamento celular e depois confirmadas por citoqumica (veja
na prxima aula).
A partir de fraes subcelulares contendo organelas purificadas, ou
at mesmo de clulas inteiras, podemos purificar as macromolculas que
desejamos estudar. Existem vrias metodologias, cada uma mais apropriada
para protenas ou lipdeos ou cidos nuclicos ou acares. Para exemplificar,
vamos ver a seguir os princpios das metodologias bioqumicas mais usadas
em Biologia Celular: cromatografias e eletroforese.

CEDERJ 67

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula

II) CROMATOGRAFIA
a) Cromatografia de partio
A cromatografia de partio adequada para separao de molculas
pequenas, como lipdeos e aminocidos. Pode ser feita em papel ou numa fina
camada de material inerte, como celulose ou slica, aplicada sobre uma superfcie
de vidro. Nesses suportes possvel conseguir particionar a amostra entre duas
fases lquidas, uma mvel e outra estacionria. Veja como funciona: colocamos
um papel ligeiramente umedecido em gua num recipiente, em contato com
um solvente orgnico (veja a Figura 5.5); o solvente subir pelo papel por
capilaridade, enquanto a gua continuar imvel.
Quando o solvente chegar perto da borda superior do papel,
retiramos do recipiente, deixamos o papel secar e borrifamos com corante
adequado para o que desejamos: para fosfolipdeos ou para aminocidos,
por exemplo. Logo veremos que os componentes da amostra foram
separados. Essa separao ocorreu porque cada componente da amostra
tem afinidade diferente, pelo solvente ou pela gua. Assim, quem tiver
mais afinidade com o solvente vai se deslocar mais e quem tiver mais
afinidade pela gua, que est imobilizada no papel, vai se deslocar mais
devagar ou mesmo ficar parado. Dizemos que os componentes da amostra
particionaram entre a agua e o solvente.

papel

direo do
solvente

componentes
separados

aplicao da
amostra

Figura 5.5: Cromatografia de partio.

!
Voc pode fazer essa cromatografia em casa: use um pedao de papel daqueles de coar caf
e pingue tinta de caneta-tinteiro azul ou preta perto de uma das bordas do papel. Mergulhe
essa borda em um pouco de acetona e veja que, medida que a acetona sobe pelo papel,
ela arrasta os componentes da tinta, uns mais e outros menos, separando uma mancha
vermelha, uma amarela e outra esverdeada.
68 CEDERJ

MDULO 1

b) Cromatografias em coluna

AULA

Nestes tipos de cromatografia, usamos uma coluna de vidro (ou


plstico, ou metal) que foi preenchida com uma resina que exercer
um efeito de separao na amostra que a percorrer. Veja na Figura
5.6 como funciona.

Figura 5.6: Cromatografia em coluna.

A amostra aplicada sobre a resina, que j foi previamente


preparada na soluo-tampo adequada. Em seguida, esse mesmo
tampo adicionado continuamente sobre a resina, e recolhido na sada
da coluna, obrigando a amostra a percorrer a resina e sofrer seus efeitos
de separao. Esse processo (chamado eluio) pode levar de minutos,
se a coluna for pequena, a dias, se a coluna for grande. Atualmente,
mesmo as maiores colunas podem ser eludas em minutos graas a uma
tecnologia de eluio sob alta presso, a que se deu o nome de HPLC
(high performance liquid chromatography).
Os efeitos de separao numa cromatografia dependem da
natureza da resina e podem ser de trs tipos:
filtrao em gel: a resina formada por esferas muito pequenas,
perfuradas por poros de tamanho definido (Figura 5.7). Conforme o
lquido vai escoando, os componentes maiores da amostra, de dimetro
maior que a abertura dos poros da resina, passam direto e saem logo
da coluna, enquanto os menores caem nos canais da resina e demoram
a sair. Assim, obtm-se uma separao por tamanho, muito usada para
separar protenas de diferentes pesos moleculares.

CEDERJ 69

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula


direo de eluio

Figura 5.7 Resina de


filtragem em gel.

esfera de
resina
componentes menor da
amostra
componentes maior da
amostra

troca inica: as amostras percorrem uma resina formada por


microesferas sem poros, mas que tm carga em sua superfcie (Figura 5.8),
prendendo os componentes da amostra que tm carga contrria. Se forem
justamente esses os componentes desejados, possvel deslig-los da
resina com variaes de pH ou de fora inica da resina.
direo de eluio

Figura 5.8: Resina de


troca inica.

resina carregada
positivamente

componentes negativos
da amostra ficam presos
componentes positivos
da amostra passam direto

afinidade: a resina est revestida com um ligante especfico para o


componente da amostra que se deseja separar: um anticorpo (veja prxima
aula), por exemplo (Figura 5.9). O mesmo recurso de variao de pH ou
fora inica usado para soltar a molcula da coluna.
Figura 5.9: Cromatografia
de afinidade.

direo de eluio
resina acoplada
ao anticorpo

o componente reconhecido pelo


anticorpo fica preso

70 CEDERJ

o componente no reconhecido
pelo anticorpo passa direto
anticorpo fica preso

MDULO 1

Se voc achou a cromatografia de afinidade mais eficiente que a de

filtrao em gel ou a de troca inica, acertou. Mas para que ela funcione

AULA

bem preciso que haja um ligante especfico para acoplar resina e


que a amostra no esteja muito sobrecarregada de contaminantes. Por
isso, geralmente usam-se as outras duas cromatografias para dar uma
limpada na amostra e s ento se usa a cromatografia de afinidade
para purificar a protena que queremos.

III) ELETROFORESE
A tcnica bioqumica mais usada em Biologia Celular certamente
a eletroforese. Ela se baseia no estudo do comportamento de uma molcula
num campo eltrico. As macromolculas so geralmente carregadas (reveja,
em Bioqumica I): os cidos nuclicos so negativos e as protenas podem
ser negativas ou positivas, dependendo do pH em que se encontram. Por
isso, quando colocados num campo eltrico, os cidos nuclicos sempre vo
para o plo positivo e as protenas, para o positivo ou negativo, dependendo
do pH. Mas a eletroforese no feita com as molculas soltas no lquido
(apesar de ter sido inventada assim, h muitos anos). Usamos um suporte
slido, que geralmente um gel poroso.
Para cidos nuclicos, que so muito grandes, usamos amido (isso
mesmo, um mingau!) ou agarose (parece uma gelatina), que formam gis
de poro grande; e para protenas, que no so to grandes, usamos um gel
prprio para eletroforese, a poliacrilamida. Todos esses materiais permitem
que, ao prepar-los, possamos escolher o tamanho do poro do gel por onde
passaro as molculas, a caminho do plo que tem carga oposta sua.
A carga dos cidos nuclicos proporcional ao seu tamanho; quanto
maior a molcula, mais negativa. J as protenas no, existem protenas
grandes e muito carregadas, grandes e pouco carregadas, pequenas e muito
carregadas e pequenas e pouco carregadas, dificultando bastante a anlise
do resultado. Alm disso, como percorrem os poros de um gel, a forma da
molcula vai fazer diferena: uma protena em forma de basto vai passar
pelos poros com mais dificuldade se estiver de lado. Por isso, as protenas
so desnaturadas antes de serem aplicadas ao gel (Figura 5.11). Assim, as
diferenas de forma no influenciam mais a corrida eletrofortica, apenas
a carga e o tamanho da molcula contam.

CEDERJ 71

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula

Figura 5.10: Cuba de


eletroforese vertical.

!
Para desnaturar uma protena, podemos ferv-la e, alm disso, so
usados dois reagentes: a) o dodecil sulfato de sdio (SDS), um detergente
inico que, alm de desnaturar, adiciona cargas negativas s ligaes
peptdicas, tornando a carga da protena sempre negativa e proporcional
ao seu tamanho (claro, porque quanto maior a protena, mais ligaes
peptdicas ela tem!); b) o 2-mercaptoetanol, poderoso agente redutor que
adiciona hidrognios s pontes dissulfeto, desfazendo-as (Figura 5.11).

protenas com duas


subunidades (A e B) unidas
por pontes dissulfeto

S S

Reveja, em Bioqumica I:
uma
protena
desnaturada aquela que
perdeu suas estruturas
terciria e secundria,
ficando s com a primria,
ou seja, os aminocidos
ligados covalentemente
e enovelados ao acaso, o
que faz com que todas as
protenas desnaturadas
sejam aproximadamente
globulares.

protenas com uma


subunidade

SH
SH
C
A

ELETROFORESE

B
sentido da corrida
C

A
Figura 5.11: Preparao das
protenas para ele-troforese.
72 CEDERJ

cada banda corresponde


a uma cadeia protica

MDULO 1

A eletroforese em condies desnaturantes e redutoras (conhecida

pela sigla SDS-PAGE, de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

AULA

electrophoresis) , portanto, uma tcnica que separa protenas de acordo


com seu tamanho, ou massa molecular. Depois que a corrida eletrofortica
terminou, o gel descolado dos vidros da cuba e corado com o corante
desejado. O mais comum, o azul de Comassie, s cora protenas. Uma
das aplicaes de SDS-PAGE pode ser procurar quantas protenas fazem
parte de uma amostra. Veja na Figura 5.12 a foto de um gel em que
foram aplicadas como amostras as etapas de purificao de uma protena.
Da esquerda para a direita, a amostra est cada vez mais purificada.
s vezes necessitamos testar se uma protena que foi

separada num gel reconhecida por um anticorpo especfico,


seja produzido no laboratrio ou mesmo presente no soro de

molecular
weight
100,000

paciente (veja na prxima aula). Nesse caso, preciso retirar as


protenas do gel, j que o anticorpo no desnaturado (para poder
funcionar no podemos desnatur-lo!) uma molcula grande
demais para entrar no gel. Ao mesmo tempo, no queremos

40,000

misturar de novo as protenas. A tcnica de eletrotransferncia


(ou Western blot.) veio resolver esse problema. Depois de
correr o gel como descrito anteriormente, colocamos o gel
em contato com um papel especial, a nitrocelulose, que tem
a capacidade de ligar protenas (chamamos de membrana,
mas um papel), e fazemos passar a corrente eltrica desta
vez no sentido perpendicular ao gel (veja na Figura 5.13).
As protenas vo sair do gel ainda do jeito que estavam separadas

15,000

e grudar na nitrocelulose, ficando expostas para


Figura 5.12: Gel de SDS-PAGE
do acompanhamento de purificao de uma protena. A mesma
quantidade de protena total foi
aplicada em todas as amostras.

qualquer ensaio.

sentido da corrente
eltrica

gel

nitrocelulose
Figura 5.13: Eletrotransferncia.

gel

nitrocelulose

CEDERJ 73

Biologia Celular I | Mtodos bioqumicos para o estudo da clula


Tambm os cidos nuclicos separados por eletroforese tm de
ser transferidos para um papel de nitrocelulose se for preciso testar, por
exemplo, se um fragmento de RNA (chamado sonda) complementar
a algum fragmento de DNA presente no gel. Voc vai saber mais sobre
isso em outras matrias do curso.
Outras metodologias de Bioqumica vm sendo cada vez mais
usadas em Biologia Celular para que se possa conhecer a composio
de um determinada organela, por exemplo. Se for necessrio para o seu
entendimento, essas tcnicas mais sofisticadas (e menos usadas tambm)
sero explicadas quando oportuno.

QUESTIONRIO
1. Por que preciso uma preparao homognea para comear um
fracionamento celular?
2. Quais so os mtodos mais usados para romper clulas?
3. Como se separam organelas de um homogeneizado?
4. O que centrifugao em gradiente de densidade?
5. Qual o princpio de separao da cromatografia de partio?
6. Qual o princpio de separao da cromatografia de filtrao em gel?
7. Qual o princpio de separao da cromatografia de troca inica?
8. Qual o princpio de separao da cromatografia de afinidade?
9. Quais as aplicaes da tcnica de eletroforese?
10. Quais as aplicaes da tcnica de eletrotransferncia ou Western blot.?

74 CEDERJ

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:


Saber o que um anticorpo.
Conhecer os principais mtodos que utilizam anticorpos:
Em microscopia ptica (fluorescncia);
Em microscopia eletrnica.

AULA

O uso de anticorpos na
pesquisa

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa

INTRODUO

Apesar de muito pequenas, da dependerem de microscpios para serem


vistas, as clulas so muito complexas. Entre acares, lipdeos, enzimas
e protenas em geral, um enorme nmero de molculas teve e ainda tem
de ser identificado em termos estruturais e funcionais. Por isso mesmo a
Bioqumica uma ferramenta to importante no estudo das clulas que
acabou por tornar-se uma vertente especfica das Cincias Biolgicas.
Voc j foi apresentado aos mtodos bioqumicos de estudo da clula na disciplina
de Bioqumica. Alm disso, a Aula 5 trata especificamente de alguns mtodos
rotineiramente empregados em Biologia Celular. Associar a identificao de
molculas especficas sua localizao celular sempre foi uma meta perseguida
pelos pesquisadores. Dessa busca tiveram origem os mtodos histoqumicos e
citoqumicos usados, respectivamente, para identificar determinados grupos de
substncias em tecidos e clulas.
Os mtodos citoqumicos procuram identificar determinada classe de substncias
no compartimento celular onde esto presentes. Assim, existem mtodos
especficos para localizao de carboidratos, lipdeos e diversas enzimas.
As enzimas caractersticas de um determinado compartimento so
usadas para identific-lo. Por exemplo, a fosfatase cida a enzima
caracterstica dos lisossomas, e sua presena permite distinguir essa
organela de outros tipos de vesculas citoplasmticas. Na tabela
a seguir, esto relacionadas algumas estruturas celulares e suas
enzimas caractersticas.

76 CEDERJ

Estrutura

Enzima caracterstica

Complexo de Golgi

Nucleosdeo difosfatase

Complexo de Golgi

Tiamino-pirofosfatase

Lisossoma, retculo
endoplasmtico

Fosfatase cida

Membrana plasmtica

Fosfatase alcalina

Membrana plasmtica

5nucleotidase

Mitocndria

Citocromo oxidase

Peroxissomos

Peroxidase

Peroxissomos

Catalase

Retculo endoplasmtico

Glicose-6-fosfatase

MDULO 1

6
AULA

Como voc pode notar, algumas enzimas esto presentes em


mais de um compartimento, como a fosfatase cida, enquanto algumas
organelas possuem mais de uma enzima marcadora para sua localizao.
A quantidade de enzima e sua susceptibilidade ao processamento em
laboratrio tornam difcil a aplicao de alguns mtodos citoqumicos em
vrias situaes. Essas dificuldades foram em grande parte contornadas
com o desenvolvimento de mtodos que utilizam anticorpos para a
marcao de molculas e estruturas celulares.

O QUE SO ANTICORPOS
Anticorpos, tambm chamados imunoglobulinas, so uma classe
de protenas produzida pelo sistema imune em resposta presena de
uma molcula estranha ao organismo. As molculas capazes de estimular
a produo de anticorpos so chamadas antgenos. A Figura 6.1 resume
a estrutura de uma imunoglobulina.

brao

cauda

Figura 6.1: Anticorpos so protenas em forma de Y.


Os braos do Y ligam-se a molculas consideradas
estranhas ao organismo. A cauda do Y ser
reconhecida por uma clula encarregada de destruir o
organismo ou molcula invasora.

5nm

Sistema imune
Todos os animais, mesmo os mais simples, possuem
clulas especializadas na defesa do organismo contra vrus,
bactrias ou mesmo molculas estranhas. No caso dos
mamferos o sistema imune constitudo pelos chamados
glbulos brancos que, na verdade, incluem vrios tipos
celulares. Destes, os linfcitos B so responsveis pela
produo de anticorpos. Os linfcitos podem ser do tipo
T ou do tipo B, de acordo com sua origem. Os do tipo T
passam pelo timo, uma glndula localizada sobre o osso esterno.
Nas aves os linfcitos B se originam da bursa de Fabricius, da
seu nome. Nos mamferos, eles se formam e amadurecem na
medula ssea. Os linfcitos B sintetizam anticorpos que tanto
so expostos em sua superfcie, quanto secretados para o meio
extracelular (no caso, o sangue). Os anticorpos utilizados como
marcadores celulares so provenientes de linfcitos B.

anticorpos
secretados

anticorpos expostos
na superfcie

CEDERJ 77

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa

POR QUE PRODUZIR ANTICORPOS EM CULTURAS DE


CLULAS?
Os anticorpos se ligam fortemente s molculas contra as quais foram
produzidos, inativando-as ou marcando-as para destruio (Figura 6.2).

Fagocitose
Figura 6.2: Uma bactria com
vrios anticorpos aderidos
sua superfcie reconhecida
e ingerida (fagocitada), sendo
assim destruda.

ANTICORPOS COMO INSTRUMENTOS DE PESQUISA


Quando uma molcula estranha, como uma protena vinda de
outra espcie, injetada em um animal, os linfcitos B deste produziro
ANTGENO
qualquer molcula
estranha, contra a
qual o organismo
de um indivduo
passa a produzir
anticorpos.

grande quantidade de anticorpos capazes de se ligar (= reconhecer) a essa


molcula estranha (Figura 6.3). O soro do animal inoculado, agora rico
nesses anticorpos, pode ser usado para detectar essa molcula estranha
em outras clulas ou animais em que ela esse ja presente. Isto , os
anticorpos podem ser usados para identificar a presena da molcula em
outras clulas. Embora a Figura 6.3 represente um camundongo, ratos,
coelhos, cabras e cavalos tambm so muito utilizados na produo de
anticorpos. Naturalmente, quanto maior o animal, maior o volume de
soro imune que pode ser obtido do mesmo.

Figura 6.3: Anticorpos podem ser produzidos


em laboratrio injetando-se determinados
antgeno sem um animal. Os linfcitos B
reconhecero e passaro a secretar grande
quantidade de anticorpos contra esses
antgenos. Aspirando o sangue do animal,
o soro estar enriquecido em anticorpos
contra esse antgeno.

78 CEDERJ

MDULO 1

6
AULA

Nesse ponto, surgem duas questes:


1. Na extrao do soro, muitas vezes o animal sacrificado e,
naqueles que sobrevivem, a concentrao daquele anticorpo diminui
bastante depois de algum tempo; portanto, por maior que seja a
quantidade de soro imune obtida contra uma molcula de interesse, o
que fazer quando ele acaba?
2. Um antgeno, ainda que seja uma molcula e no uma bactria
ou vrus inteiro, ser reconhecido por vrios linfcitos B. A partir da,
todos esses linfcitos vo comear a se dividir e secretar anticorpos
capazes de reconhecer aquele antgeno. Como cada um desses linfcitos
estimulados a se dividir est gerando um clone (veja aula de cultura de
clulas), os anticorpos produzidos por esse animal so chamados de

policlonais (Figura 6.4)


B3

B1

B2
a
b
c

Figura 6.4: Diversas regies de


uma molcula (a) so reconhecidas
como antgenos por diferentes
linfcitos (b). O soro imune
chamado policlonal por ser uma
mistura de anticorpos gerados
por diversos clones de linfcitos,
capazes de se ligar a diferentes
pores do antgeno (c).

OS ANTICORPOS MONOCLONAIS
A produo contnua de anticorpos de um nico tipo e com
especificidade para uma determinada regio da molcula possvel a
partir do cultivo de hibridomas, culturas celulares resultantes da fuso de
dois tipos celulares distintos que conjugam, caractersticas interessantes
das duas linhagens originais (veja Aula 4). Como esses anticorpos so
originados de um clone celular, so chamados monoclonais. Alm da
especificidade, outra vantagem dos anticorpos monoclonais que, como
provm de linhagens celulares que podem ser mantidas permanentemente
em cultivo, sua produo mantida por tempo indeterminado. Como
desvantagem, h o fato de que nem todos os hibridomas secretam
anticorpos interessantes e a seleo das linhagens teis bastante
trabalhosa (Figura 6.5). Tambm pode acontecer de um hibridoma se
perder por problemas durante o cultivo, como contaminao ou falha
humana. As principais etapas do processo de produo de anticorpos
monoclonais esto esquematizadas na Figura 6.5.
CEDERJ 79

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa


Camundongo inoculado com
antgeno X

Linfcitos

Linhagem tumoral
de linfcitos B

Clulas
que produzem anticorpo
anti-X (vivem poucos dias)
Fuso
Produtos plaqueados em muitos pocinhos

Clulas
que se multiplicam
indefinidamente

Formao de heterocrions
e hibridomas
Secreo de anti-X

Meio que s permite o crescimento das clulas que formaram hibridomas

Teste do sobrenadante para secreo de anti-X

As clulas do poo onde anti-X est sendo


secretado so separadas e apenas os clones
secretores so mantidos.

Clones positivos para anti-X constituem


fontes permanentes desse anticorpo.

Figura 6.5: A produo de anticorpos monoclonais depende de


hibridomas que conjuguem a capacidade de multiplicao infinda
de clulas tumorais secreo de anticorpos especficos.

ONDE E COMO SO USADOS OS


ANTICORPOS PRODUZIDOS EM LABORATRIO
Os anticorpos tornaram-se ferramentas indispensveis no dia-adia da Biologia Celular. Localizar molculas e determinar sua funo
celular tornou-se muito mais rpido e preciso com o uso de anticorpos.
Os anticorpos so utilizados para mostrar a distribuio de molculas
dentro e fora da clula. Em outras palavras: so utilizados como
marcadores moleculares.
Quando as molculas s quais se ligam se encontram na superfcie
da clula, os anticorpos em geral provocam a aglutinao entre as mesmas
(Figura 6.6). Quanto mais molculas daquele tipo existirem na superfcie, menor
ser a concentrao do anticorpo necessria para que as clulas se aglutinem.
Figura 6.6: Clulas em suspenso aglutinam-se em
presena de anticorpos que reconhecem molculas
em sua superfcie, pois cada braodo anticorpo
pode ligar-se a uma clula, estabelecendo ligaes
cruzadas. Esta uma das maneiras que o organismo
tem de imobilizar e destruir bactrias invasoras.
80 CEDERJ

MDULO 1

6
AULA

A utilizao de anticorpos pr-fabricados no chega a ser uma


novidade. Todos sabemos que em caso de mordida de cobra utilizado o
soro antiofdico, assim como o soro antitetnico aplicado para reverter,
ainda no incio, um quadro de ttano. Esses soros so produzidos pela
contnua injeo de toxinas ofdicas e tetnicas, respectivamente, em
animais, geralmente cavalos. Periodicamente esses animais so sangrados
e o soro rico em anticorpos, purificado. Dessa forma, numa situao em
que o sistema imune do indivduo no teria tempo de desenvolver uma
resposta que neutralizasse essas toxinas, ele recebe uma dose concentrada
de anticorpos pr-produzidos.

A LIGAO ANTGENO-ANTICORPO PODE SER


VISUALIZADA?
As propriedades de ligao especficas entre anticorpos e molculas
tm sido aproveitadas em vrias metodologias de estudo da clula.
Quando acoplados a uma molcula capaz de emitir cor, a presena dos
anticorpos ligados a antgenos pode ser observada. Anticorpos conjugados
a molculas fluorescentes podem ser utilizados para observao de vrios
componentes celulares ao microscpio ptico de fluorescncia ou, na sua
verso mais sofisticada, ao microscpio confocal a laser (Figura 6.7),
ambos citados na Aula 1. Esses mesmos anticorpos podem ser conjugados
a partculas eletrondensas como a protena ferritina ou ouro coloidal
(Figura 6.8). Nesse caso, a visualizao pode ser feita no microscpio

Foto: Tcia V. de Carvalho

eletrnico de transmisso.

Figura 6.7: Esta clula foi incubada na


presena de um anticorpo fluorescente
contra tubulina, mostrando feixes de
microtbulos que se irradiam a partir do
centro celular.

Figura 6.8: Essa clula foi tratada com anticorpo


conjugado a partculas de ouro coloidal, que
aparecem como bolinhas negras.

CEDERJ 81

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa

MARCADORES FLUORESCENTES
Tambm chamados fluorocromos, so corantes especficos para
microscopia de fluorescncia, pois tm a capacidade de absorver um
comprimento de onda da luz e emitir em outro, mais longo. Se for
utilizado um filtro que permita a passagem apenas do comprimento de
onda emitido, esse ser visto brilhando contra um fundo escuro, permitindo
que quantidades muito pequenas dessas molculas sejam detectadas. Na
microscopia de fluorescncia, esse princpio utilizado para detectar
componentes celulares especficos, como protenas ou acares. Nesses
casos, os marcadores fluorescentes so acoplados a molculas que se
ligam de modo especfico aos componentes celulares, como anticorpos
ou lectinas. Os marcadores mais utilizados so a rodamina, que emite em
vermelho, e a fluorescena, que emite em verde (Figura 6.9 e 6.10).

fluorescena

rodamina

Figura 6.9: A fluorescena (verde)


e a rodamina (vermelha) podem
ser conjugadas a anticorpos ou
outras molculas e funcionar
como marcadores moleculares.

Figura 6.10: Anticorpos marcados com


molculas que emitam cor permitem
ver em que regies da clula existem os
antgenos por eles reconhecidos.

QUE OUTRAS TCNICAS UTILIZAM ANTICORPOS?


Alm de serem associados s microscopias ptica e eletrnica, os
anticorpos tambm so marcadores indispensveis para aplicao em
mtodos bioqumicos, como os descritos na Aula 5. possvel associar
anticorpos s partculas de resina de uma coluna de cromatografia.
A tcnica recebeu o nome de cromatografia de afinidade.
82 CEDERJ

MDULO 1

6
AULA

Os anticorpos tambm podem ser utilizados para purificar uma


determinada molcula, como no mtodo de imunoprecipitao, que muito
parecido com a cromatografia de afinidade, s que, ao invs de montar uma
coluna, os anticorpos acoplados resina so misturados com a amostra.
A molcula que se deseja purificar pode ser, por exemplo, uma protena do
soro. Depois de algum tempo de incubao, a mistura centrifugada em
velocidade baixa, sufuciente apenas para colocar no pellet a resina acoplada
com anticorpo que pescou a protena do soro, separando-a das outras.
Num mtodo chamado Western blot, protenas separadas por
eletroforese podem ser transferidas para um papel de nitrocelulose
(eletrotransferncia, veja aula anterior) e a presena de uma determinada
protena revelada pela ligao de anticorpos conjugados a uma enzima
que depois ser revelada por incubao com seu substrato, formando um
produto corado onde est a banda protica especfica que se desejava
detectar (Figura 6.11).

Incubao
com anticorpos
acoplados a
enzimas
Nitrocelulose
com as protenas
separadas

Incubao
com substrato
da enzima

Figura 6.11: Western blot.

Produto de
reao colorido

Hoje em dia, a tcnica de Western blotting bastante usada no s


em pesquisa cientfica mas tambm em anlises clnicas. Seria muito difcil
marcar os anticorpos presentes no soro de cada paciente com uma enzima
ou mesmo com um fluorocromo; por isso usamos anticorpos secundrios,
que reconhecem outros anticorpos, estes ditos primrios. Podemos injetar
imunoglobulinas humanas, por exemplo, numa cabra, e ela reconhecer
essas imunoglobulinas como estranhas, isto , como antgenos. Produzir
ento anticorpos contra imunoglobulinas humanas, que reconhecero
as imunoglobulinas de qualquer pessoa. Esses anticorpos que a cabra
fez, os anticorpos secundrios, sero depois acoplados a fluorocromos,
ou a enzimas, ou a ouro coloidal, e usados como ferramentas para
reconhecer onde esto os anticorpos primrios, que por sua vez ligaro
onde estiverem os antgenos que eles reconhecem especificamente.
CEDERJ 83

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa

fcil saber se uma pessoa teve contato com algum agente causador
de doena incubando uma nitrocelulose contendo as protenas do provvel
parasito, separadas por eletroforese, com o soro da pessoa. Se houver
anticorpos no soro, eles se ligaro s bandas do parasito. Em seguida,
incubamos a nitrocelulose com anticorpos secundrios acoplados enzima
e revelamos em que banda ela se ligou usando seu substrato. Assim feita
obrigatoriamente a segunda testagem para HIV, o vrus que causa AIDS. A
primeira testagem (chamada ELISA, de enzyme linked immunoadsorbent
assay) feita com extratos do vrus no separados por eletroforese; todas
as protenas juntas so incubadas com o soro do paciente e depois com
anticorpos secundrios acoplados enzima. A resposta do ELISA sim ou
no, isto , tem ou no tem anticorpos. Os pacientes com resposta positiva
sero chamados a fornecer outra amostra de sangue para confirmar o teste.
Nesse segundo teste, usa-se o Western blot, para saber quais so as protenas
do vrus reconhecidas pelo soro do paciente. Assim possvel identificar qual
variante do vrus infectou aquela pessoa, dado importante para encaminhar
o tratamento daquele paciente e tambm para estudos epidemiolgicos.

NEM S ANTICORPOS SO USADOS COMO MARCADORES


CELULARES
Alm dos anticorpos, outras molculas podem ser utilizadas como
marcadores celulares, seja em experimentos de aglutinao, seja complexadas a
fluorocromos e partculas de ouro coloidal. Nas prximas aulas, algumas vezes
faremos referncia a lectinas, protenas e glicoprotenas isoladas de plantas
e animais que se ligam a seqncias especficas de acares presentes na
superfcie das clulas. As lectinas, na grande maioria das vezes, so responsveis
pela toxicidade de uma determinada planta ou animal para outras espcies.
Por se ligarem a componentes da superfcie celular, podem inibir processos de
adeso e reconhecimento entre a clula e o meio ambiente. A tabela a seguir
lista algumas espcies animais e vegetais de onde j foram isoladas lectinas.

84 CEDERJ

Espcie

Nome vulgar

Canavalia ensiformis

Feijo-cavalo

Triticum vulgaris

Trigo

Helix pomatia

Caracol

Limulus polyphemus

Lmulo ou caranguejo-ferradura

Arachis hypogaea

Amendoim

Ricinus comunis

Mamona

MDULO 1

6
AULA

O Lmulo, ou caranguejo ferradura, um artrpode que j


foi classificado entre os crustceos, depois entre os aracndeos
e hoje constitui a classe merostomata. Atualmente existem
apenas quatro espcies desse animal, nenhuma na Amrica do
Sul. Os esquemas a seguir representam o lmulo em vista dorsal
e ventral.

Figura 6.12: Esquema de um caranguejo-ferradura


retirado do site http://www.horseshoecrab.org.

RESUMO
Anticorpos so protenas secretadas pelos linfcitos em resposta a uma molcula
ou um organismo estranho.
Um organismo produz vrios anticorpos diferentes, capazes de reconhecer
diferentes pores de uma mesma molcula estranha. O soro contendo essa
mistura de anticorpos chamado policlonal.
Quando se produz um clone a partir da fuso de um linfcito e de uma clula
tumoral, essa linhagem pode ser mantida indefinidamente em cultura e secretar
anticorpos monoclonais.
Os anticorpos servem para identificar a presena de molculas na superfcie de
clulas por provocarem aglutinao quando presentes.
Os anticorpos tambm podem ser associados a molculas visveis ao microscpio
ptico de fluorescncia (fluorocromos) ou a partculas de ouro coloidal, permitindo
localizar molculas especficas em microscopia eletrnica.
Os anticorpos tambm podem ser utilizados para reter molculas numa coluna de
cromatografia e permitir sua purificao e para demonstrar a presena de uma
protena entre as bandas de um gel.
As lectinas so protenas extradas de plantas e animais que se ligam de forma
especfica a determinadas seqncias de acares presentes na superfcie celular,
permitindo sua identificao.
CEDERJ 85

Biologia Celular I | O uso de anticorpos na pesquisa

EXERCCIOS
1. O que so anticorpos?
2. Por que os anticorpos podem causar aglutinao de clulas?
3. Defina:
anticorpos policlonais
anticorpo monoclonal
soro imune
hibridoma
4. A que tipo de molcula os anticorpos so associados para observao em:
Microscopia ptica
Microscopia eletrnica
5. O que so lectinas?

86 CEDERJ

objetivos

AULA

Estrutura da membrana
plasmtica

Ao final desta aula, o aluno dever ser capaz de:


Entender por que a membrana uma bicamada lipdica;
Enumerar os tipos de lipdios que compem a bicamada;
Entender o que a assimetria da bicamada;
Exemplificar as conseqncias da assimetria na fisiologia celular;
Conceituar o que a fluidez da bicamada e os fatores que a
influenciam;
Conceituar domnios lipdicos.

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

INTRODUO

Coloque-se no lugar dos pesquisadores que, atravs da microscopia ptica,


descreveram uma enorme variedade de tipos celulares e elaboraram a teoria
celular. Que estruturas ou caractersticas voc acha que eles descreveram como
comuns a todos os tipos celulares?
claro que voc sabe: a membrana, o ncleo, a mitocndria, o citoplasma...
Voc sabe que para quase todas as estruturas celulares existem excees.
Assim, as hemcias no possuem ncleo, as amebas no possuem mitocndrias,
nenhuma clula animal possui cloroplastos etc. Nem por isso deixam de ser
clulas. Porm, todos os tipos celulares possuem um limite, ou seja, possvel
definir um espao intracelular (dentro da clula) e um espao extracelular (fora
da clula) (Figura 7.1).

Limite

Meio
intracelular

Meio
extracelular

Figura 7.1: A membrana estabelece um limite entre o meio


intracelular e o meio extracelular.

Nessa linha de raciocnio, podemos concluir que, se as clulas so


as unidades formadoras dos seres vivos, lgico supormos que essas
unidades possuem um limite.
Nessa altura, voc j deve ter concludo que esse limite a
membrana celular ou membrana plasmtica ou plasmalema, tema
desta aula.

D uma paradinha
Responda a este questionrio de pr-avaliao de seus
conhecimentos anteriores sobre membrana. Vale a pena
respond-lo antes de continuar. Veja o gabarito no final
desta aula.
1. A membrana celular uma estrutura que limita as clulas
e _____________________________________________.
2. A composio qumica da membrana de ___________
____________, _________________ e __________________ .

88

CEDERJ

MDULO 1

7
AULA

3. Os lipdeos so principalmente do tipo _______________


e se organizam na membrana formando uma ___________
_____________________.
4. Os lipdeos da membrana se caracterizam por possuir uma
extremidade da molcula __________ e a outra _________.
Molculas com essa natureza so chamadas _____________
_____________________.
5. Na bicamada lipdica, essas molculas se organizam
com as cabeas hidroflicas para ______________ e a regio
hidrofbica para ______________________ .
6. Enquanto isso, as protenas se inserem mais ou menos
profundamente __________________, e os carboidratos
(acares)_______________________________ .

Estamos certos de que o conceito de membrana, sua


estrutura e composio qumica so seus velhos conhecidos,
no apenas pelo contedo de Biologia Celular apresentado
no Ensino Mdio como tambm pela Bioqumica, que voc
j cursou. O que acabamos de revisar so os rudimentos do

!
Nos cadernos didticos de Bioqumica I esto
minuciosamente descritos os conceitos aqui
rapidamente revistos e os experimentos que
levaram a eles. Vale a pena dar uma conferida
antes de prosseguir no texto.

modelo estrutural da membrana plasmtica, proposto em


1972 pelos pesquisadores americanos Singer e Nicolson.
Esse modelo conhecido como modelo do mosaico fluido (Figura 7.2),
e resultou de anos de pesquisas em que foram utilizados vrios mtodos
de estudos fsicos, qumicos e biolgicos.

Meio intracelular

Fernanda de Abreu / cederj

Meio extracelular

Figura 7.2: De acordo com o modelo do mosaico fluido da membrana, as


diferentes protenas se inserem entre os lipdeos da bicamada.
CEDERJ

89

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

Resumindo:
Foto: Mrcia Attias e Marco Antnio
Vasconcelos Santos

1. Todos os seres vivos so


clulas ou conjuntos de clulas.
2. Todas as clulas so limitadas por uma membrana que
define e separa o meio intracelular
do meio extracelular, a membrana
celular. Delimite na Figura 7.3 o meio
intracelular e o meio extracelular.
Figura 7.3: Hemcito de molusco.

BSICO

Todas as clulas so limitadas por uma membrana que define


e separa o meio intracelular do extracelular. Dentro da clula, outros
compartimentos tambm so definidos por membranas. Um exemplo
disso o ncleo, onde fica confinado o material gentico. Outros
exemplos que nos so familiares so as membranas que limitam o
retculo endoplasmtico e as mitocndrias (Figura 7.4).

Figura 7.4: As membranas celulares delimitam os


contornos mais externos da clula, assim como
compartimento internos: o ncleo, o retculo
endoplasmtico e mesmo subcompartimentos,
como nas mitocndrias, onde duas membranas
delimitam dois compartimentos.

DADOS HISTRICOS
A estrutura e a composio qumica das membranas celulares
comearam a ser esclarecidas no sculo XIX.
O primeiro a propor uma natureza lipdica para as membranas
celulares foi Overton, ao observar que as clulas podiam inchar ou murchar,
de acordo com a composio do meio em que se encontravam.
Mais adiante, em 1917, Langmuir demonstrou que no apenas as
membranas eram formadas por lipdeos como estes eram de natureza anfiptica,
isto , uma regio da molcula era hidroflica e a outra era hidrofbica.
90

CEDERJ

MDULO 1

Como explicar a organizao desses lipdeos numa membrana em

AULA

que tanto o meio interno quanto o externo so hidroflicos? A resposta foi


dada em 1925 por Gorder e Grendel, estudando as membranas extradas de
hemcias (os glbulos vermelhos do sangue). Eles concluram que os lipdeos
se organizam na membrana como uma camada dupla (bicamada).
Chamamos de folheto cada uma das camadas da bicamada lipdica.
Assim, a membrana plasmtica tem um folheto externo, voltado para o
meio extracelular, e um folheto interno, voltado para o citoplasma.

Figura 7.5: Bicamada lipdica.


As cabeas polares (hidroflicas)
ficam em contato com o meio
aquoso, enquanto as caudas
apolares (hidrofbicas) se voltam
para o interior da bicamada.

Fernanda de Abreu / cederj

A Figura 7.5 representa uma bicamada de molculas anfipticas.

Bicamada lipdica

Na dcada de 1930, R. Chambers, comparando medidas de


tenso superficial de bicapas lipdicas artificiais e de membranas
naturais, concluiu que as membranas biolgicas no eram compostas
apenas por lipdeos. Foi a primeira indicao da presena das protenas
na composio da membrana.
Os lipdeos so os componentes universais das membranas
biolgicas; entretanto, as atividades especficas de cada tipo celular
dependem principalmente das protenas. Alm dessas duas classes de
molculas, os glicdios associados s protenas ou aos lipdeos tambm
fazem parte da composio das membranas biolgicas.

OS LIPDEOS DA MEMBRANA
Os lipdeos correspondem a cerca de 50% da massa
Foto cedida pela Dra. Ana Maria B. Martinez

na maioria das membranas, sendo os outros 50% referentes


principalmente a protenas. Essa proporo varivel, havendo
membranas praticamente desprovidas de protenas, como o
caso da bainha de mielina, que envolve os neurnios. Portanto,
os lipdeos formam a base das membranas celulares, sendo
tambm responsveis por suas caractersticas fundamentais
de fluidez e permeabilidade. As membranas celulares so
formadas por trs tipos principais de lipdeos:
fosfolipdeos,
esteris,
glicolipdeos.
CEDERJ

91

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

Todos so do tipo anfiptico ou anfiflico (do grego amphy = dois;


philos = amigo), isto , uma parte de sua molcula hidroflica ou polar,
e a outra extremidade hidrofbica ou apolar (Figura 7.6).
Cabea polar

Cabea polar

Anis
esterides
rgidos
Cabea apolar

Cabea
apolar

Figura 7.6: Representao esquemtica de um fosfolipdeo (a) e do colesterol (b),


dois tipos de lipdeo que compem as membranas biolgicas. As cabeas hidroflicas esto assinaladas em cinza mais claro e as caudas hidrofbicas em tons mais
escuros. O esquema no est em escala, o colesterol uma molcula muito menor
que o fosfolipdeo.

Em meio aquoso, os lipdeos anfipticos podem formar micelas, em


que as cabeas polares ficam voltadas para o exterior e as caudas apolares
para o interior, ou ento formam bicamadas, em que as cabeas polares ficam
em contato com o meio aquoso e as caudas apolares se voltam para o interior
(Figura 7.7). Essas bicamadas tendem a selar-se em vesculas de 0,25 a 1,0mm
de dimetro, chamadas lipossomas.

Fernanda de Abreu / cederj

Figura 7.7: Os lipdeos anfipticos


podem se organizar em pequenas
micelas (a) ou em lipossomas (b).
Os segundos so maiores e fazem
contato com a gua tanto pelo lado
interno quanto pelo externo.

a Micela

92

CEDERJ

Lipossoma

MDULO 1
AULA

Dessa maneira, os grupos apolares das extremidades tambm no


ficam em contato com a gua. Guardadas as devidas propores, as
micelas so semelhantes a bolhas de sabo, s que enquanto as bolhas
de sabo ficam em contato com o ar (tanto por dentro quanto por fora),
as micelas ficam em meio aquoso, alm de serem muitssimo menores.

OS FOSFOLIPDEOS
Os fosfolipdeos so formados por um grupo hidroflico, composto
por um esqueleto de glicerol com um radical fosfatado e uma cauda
hidrofbica, composta por duas cadeias de cidos graxos de comprimento
varivel (14 a 24 carbonos). Uma dessas cadeias geralmente saturada,
isto , no h duplas ligaes entre os tomos de carbono, e a outra pode
ser saturada ou insaturada (Figura 7.8).

Figura 7.8: Os fosfolipdeos so formados por uma cabea polar onde a um esqueleto
de glicerol ligam-se um fosfato e um radical orgnico. A cauda apolar formada
por duas cadeias longas de cidos graxos. Uma dessas pode ser insaturada.

Os fosfolipdeos podem variar quanto ao radical fosfatado da


molcula (Figura 7.9), quanto ao comprimento das cadeias de cidos
graxos e quanto ao grau de insaturao dessas cadeias. Em geral, uma das
cadeias de cido graxo dos fosfolipdeos saturada, e a outra no .

CEDERJ

93

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

OS FOSFOLIPDEOS
Quatro tipos de fosfolipdeos predominam nas membranas
celulares dos mamferos: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, esfingomielina
e fosfatidiletanolamina.
Sobre as particularidades de cada um, podemos dizer que:
Apenas a fosfatidilserina carregada negativamente em pH
fisiolgico.
O fosfatidilinositol um lipdeo minoritrio, mas o nico que
serve de ncora a protenas, num arranjo descrito mais recentemente e de
grande importncia em vrios processos celulares (veja aula de protenas
de membrana).
Os fosfolipdeos no se distribuem simetricamente nas duas
metades da membrana. Em eritrcitos humanos, por exemplo, a
fosfatidilcolina e a esfingomielina se distribuem apenas na camada voltada
para o meio externo, enquanto a fosfatidilserina e a fosfatidiletanolamina
se localizam apenas na camada interna. Isso causa diferena de cargas entre
a face interna e a face externa da membrana. Essa distribuio diferenciada
dos fosfolipdeos uma das causas da assimetria da membrana (Figura
7.10), uma caracterstica que discutiremos mais adiante.

Figura 7.9: Principais tipos de fosfolipdeos encontrados nas membranas biolgicas.

94

CEDERJ

MDULO 1
Fernanda de Abreu / cedrj

AULA

Meio extracelular

Figura 7.10: Assimetria dos fosfolipdeos da


membrana. Os fosfolipdeos voltados para
o meio extracelular no so idnticos aos
voltados para o citoplasma.

Citoplasma

A FLUIDEZ DA BICAMADA LIPDICA


Nas membranas naturais, os lipdeos podem se mover livremente
no plano lateral da membrana (translocao), assim como rodar em
torno de seu prprio eixo (rotao) (Figura 7.11). Essa propriedade a
essncia da fluidez da membrana. Esses movimentos ocorrem o tempo
todo e com uma rapidez incrvel! Alm disso, as cadeias carbnicas dos
cidos graxos tambm podem flexionar-se.
Difuso lateral (translocao)

Figura 7.11: Os lipdios da membrana realizam movimentos de translocao e de rotao constantemente. O flip-flop, entretanto,
s ocorre em situaes especficas.

Flip-flop
Rotao

Por outro lado, muito raro que um lipdeo mude de plano na


bicamada, movimento denominado flip-flop. O flip-flop comum no
retculo liso e requer enzimas especficas e gasto de energia (voc vai ver
mais sobre isso na aula de retculo endoplasmtico).
Cada fosfolipdeo passa do estado lquido (fluido) para o estado
cristalizado (gel) a uma determinada temperatura, a chamada fase de
transio, que j foi determinada experimentalmente em membranas
artificiais compostas por apenas um tipo de fosfolipdeo.

Num cristal, as molculas se dispem de forma


peridica e repetitiva, estabelecendo um padro
que pode ser cbico, hexagonal etc.

CEDERJ

95

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

Como as membranas naturais so formadas de vrios


fosfolipdeos diferentes misturados, elas no se cristalizam,
mesmo quando em temperaturas prximas da fase de transio de
alguns deles. Essa mistura essencial, principalmente para clulas
diretamente expostas a ambientes de temperatura muito varivel.
A fluidez dos lipdeos da membrana varia com o comprimento
e com o nmero de duplas ligaes da cadeia de cidos graxos.

A forma da cadeia insaturada implica um aumento da distncia

Fernanda de Abreu / cederj

mnima entre esse fosfolipdeo e os que o rodeiam. Portanto, quanto


maior a quantidade de fosfolipdeos com cadeias insaturadas, maior
ser a fluidez da membrana (Figura 7.12). Entretanto, quanto mais
longas as cadeias carbnicas, menos fluida a membrana, porque
duas cadeias longas colocadas lado a lado interagem mais, limitando

b
Figura 7.12: (a) Cadeias insa-turadas,
membranas mais fluida; (b) cadeias
saturadas, membrana menos fluida.

a liberdade de movimento de cada uma.


Organismos simples, como bactrias e leveduras, so capazes
de modular a sntese de fosfolipdeos com mais duplas ligaes
quando a temperatura cai. Assim, a fluidez de sua membrana
mantida relativamente inalterada.

ESTERIS
O colesterol o esterol mais importante nas membranas
biolgicas. Na maioria das membranas dos eucariontes, h
praticamente uma molcula de colesterol para cada molcula
de fosfolipdeo. As molculas de colesterol so pequenas, e sua
estrutura, contendo anis, bastante rgida (Figura 7.13).

Figura 7.13: A estrutura do colesterol, com anis aromticos, torna a molcula bastante rgida. (a) frmula plana,
(b) frmula esquemtica, apontando em cinza mdio a parte hidroflica da molcula, em cinza claro os anis
carbnicos e em preto a cauda de hidrocarbonetos, (c) frmula tridimensional onde o oxignio da hidroxila
aparece em cinza, os carbonos em preto e os hidrognios em branco.

96

CEDERJ

MDULO 1
AULA

Elas se dispem por entre as molculas dos fosfolipdeos, conferindo


maior rigidez membrana e aumentando sua resistncia deformao.
Assim, quanto mais ricas em colesterol, menos fluidas so as membranas,
porque os anis aromticos do colesterol atrapalham o movimento das caudas
dos fosfolipdeos, que so muito flexveis. Se, por um lado, isso soa como
uma desvantagem, por outro, a presena de colesterol entre as molculas de
fosfolipdeos dificulta sua cristalizao em baixas temperaturas. Para haver a
formao de um cristal, preciso que os fosfolipdeos se aproximem muito,
o que dificultado pelo colesterol (Figura 7.14).

Figura 7.14: A molcula de colesterol, pequena e pouco flexvel, se


insere entre os fosfolipdeos, maiores e mais maleveis. A cabea
polar do colesterol muito pequena, apenas uma hidroxila, mas ela
que determina o posicionamento do colesterol na bicamada.

Isso representa uma grande proteo para organismos


sujeitos a grandes variaes de temperatura. Alguns
microorganismos tambm variam a composio lipdica de suas
membranas de acordo com a temperatura do ambiente.
Alm do colesterol, as membranas de fungos, plantas
e alguns protozorios podem conter outros esteris, como
o ergosterol.

OS GLICOLIPDEOS
Os glicolipdeos, como o prprio nome
indica, resultam da associao (por meio de
uma molcula de glicerol) entre um glicdio, que

Figura 7.15: Nos glicolipdeos, a poro hidroflica da


molcula formada por uma (a) ou mais (b) molculas de acares, incluindo muitas vezes o cido silico
(NANA), que confere carga negativa molcula.

Cauda de cido graxo

cadeias de cidos graxos (Figura 7.15).

Cauda de cido graxo

compa a poro hidroflica da molcula, e duas

CEDERJ

97

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

H glicolipdeos apenas no lado da membrana voltado para o


meio extracelular. Esses lipdeos apresentam uma forte tendncia a se
associar, em parte devido a pontes de hidrognio que se formam entre
as molculas de acares, mas tambm graas s foras de van der
Waals entre as cadeias carbnicas de suas longas caudas lipdicas. Por
essas caractersticas localizao e tendncia agregao, esses lipdeos
aumentam ainda mais a assimetria entre os dois folhetos da bicamada.
Os glicolipdeos mais complexos so os gangliosdeos (Figura
7.15b) que, por possurem resduos de cido silico, so negativamente
carregados. Os gangliosdeos so especialmente abundantes na membrana
plasmtica das clulas nervosas, mas tambm esto presentes em outros
tipos celulares.
Uma clula que exponha muitos glicolipdeos na superfcie de
sua membrana ficar mais protegida do ataque de cidos ou enzimas
que possam atingir sua superfcie. Isto especialmente importante em
compartimentos como o lisossoma (Aula 20), cujas membranas no
podem ser destrudas pelas enzimas ali contidas. Em contrapartida, a
grande diversidade de combinaes possveis para os acares expostos
fundamental em processos de reconhecimento entre clulas.
A bactria causadora do clera reconhece e s penetra em clulas
que exponham um determinado tipo de glicolipdeo em sua superfcie.
Sua entrada em clulas do epitlio intestinal desencadeia uma reao que
leva a clula a perder grande quantidade de sdio e gua, resultando na
diarria caracterstica da doena.

DOMNIOS LIPDICOS
Que em vrios tipos celulares cada regio da membrana poderia ter
composio, forma e funo diferentes, j era sabido h muito tempo. Esse ,
em essncia, o conceito de domnio de membrana, uma regio da membrana
diferente das demais, com caractersticas prprias. Por exemplo, por que
a regio apical das clulas do epitlio intestinal possui microvilosidades
e a superfcie basal e lateral destas clulas lisa (Figura 7.4)? Por que os
neurnios recebem estmulos pela regio do corpo celular e os transmitem
apenas na extremidade do axnio?
Inicialmente, verificou-se que cada domnio poderia conter
protenas de membrana diferentes, mas no se sabia o que mantinha
essas protenas restritas a essas regies. A resposta foi obtida h alguns
98

CEDERJ

MDULO 1
AULA

anos, quando foi descoberto que algumas regies da bicamada lipdica


tm fluidez menor que o resto da bicamada que as cerca. Esta menor
fluidez resultante da aglomerao de fosfolipdeos de cadeias longas
especialmente esfingomielina e colesterol nessas regies. As caudas
de cidos graxos desses lipdeos se emaranham, formando assim um
conjunto que no se mistura com o resto e se move em conjunto, como se
fosse uma jangada flutuando no mar. Nessa comparao, a jangada seria
o conjunto de lipdeos de menor fluidez (ou seja, com menor liberdade de
se misturar aos outros), e o mar em volta seria todo o resto da membrana.
Por esta razo, as plataformas lipdicas foram denominadas lipid rafts,
pois raft significa jangada, em ingls. O maior comprimento das cadeias
de cidos graxos desses lipdeos aumenta a espessura da bicamada nessas
regies, formando verdadeiras plataformas lipdicas (Figura 7.16),
denominao que adotaremos neste texto.
Glicolipdeo
Colesterol
Glicoprotena

Figura 7.16: As plataformas lipdicas so regies da membrana onde


se concentram lipdeos de cadeias
longas, especialmente do tipo esfingolipdeos e colesterol. Conseqentemente, a bicamada nessas regies
mais espessa, menos fluida, e s protenas com determinada extenso
podem se inserir ali.

Plataforma lipdica

Sabemos hoje que as plataformas lipdicas ocorrem em praticamente


todos os tipos celulares, mantendo prximos elementos da membrana,
como protenas, por exemplo, que participam de um mesmo conjunto de
reaes (veja a Aula 13) ou funo. Como a espessura da bicamada nas
plataformas maior, apenas alguns tipos de protenas conseguem se encaixar
nessas regies. Sabe-se tambm que, ao contrrio do que se acreditava
inicialmente, essas plataformas lipdicas no ficam necessariamente
navegando deriva pela membrana. A superfcie apical das clulas do
epitlio intestinal, por exemplo, basicamente uma regio de plataformas
lipdicas. Um outro tipo de plataforma lipdica, que no se desloca e forma
uma pequena invaginao permanente na membrana plasmtica, recebeu
o nome de cavola (Figura 7.17). Nas cavolas concentram-se receptores
de um tipo pouco comum, os ancorados (veja na Aula 8).

CEDERJ

99

Biologia Celular I | Estrutura da membrana plasmtica

Tornaremos a falar dos domnios de membrana, incluindo a


participao das protenas, nas aulas seguintes.

Foto: Mrcia Attias

Figura 7.17: As setas apontam as


cavolas na membrana de uma
clula de tiride humana.

CONCLUSO: A IMPORTNCIA DA ASSIMETRIA DA


BICAMADA LIPDICA
Embora a bicamada lipdica seja representada em muitos esquemas
didticos de maneira simtrica e uniforme (com os dois folhetos idnticos),
voc viu, nesta aula, que seus componentes podem constituir domnios de
membrana. Alm disso, os dois folhetos so bastante distintos, a comear
pela presena de glicolipdeos (e tambm glicoprotenas) apenas no folheto
voltado para o meio extracitoplasmtico, enquanto a fosfatidilserina,
um fosfolipdeo negativamente carregado, insere-se apenas no folheto
voltado para o meio intracelular. E o que acontece quando esta disposio
perturbada? No caso da fosfatidilserina, observa-se que em clulas
que possuem um tempo de vida limitado, como o caso das hemcias e
dos leuccitos, o aparecimento desse fosfolipdeo no folheto externo da
membrana sinaliza que a clula est morrendo e um dos fatores pelos
quais elas so reconhecidas pelos fagcitos responsveis por remov-las.
Esse processo de morte celular programada, ou apoptose, ser estudado
na disciplina Biologia Celular 2.
RESUMO
A estrutura das membranas constituda por lipdeos das classes dos
fosfolipdeos, glicolipdeos e esteris.
Os lipdeos que formam a membrana so anfipticos. Distribuem-se em
bicamada, com a parte hidroflica de sua molcula voltada para o meio aquoso,
extracelular ou citoplasmtico, e a parte hidrofbica voltada para o interior
da membrana.
Cada camada da bicamada chamada de folheto.
As membranas so assimtricas porque os fosfolipdeos que compem os
seus folhetos so diferentes.

100

CEDERJ

MDULO 1

7
AULA

As membranas so fluidas porque os lipdeos que as compem movem-se o


tempo todo, fazendo flexo das cadeias de cidos graxos, rotao, translocao
e, raramente, flip-flop.
Existem regies menos fluidas na bicamada lipdica, as plataformas lipdicas,
ricas em cidos graxos de cadeia longa e colesterol.
Regies diferenciadas em termos de composio lipdica, funo e fluidez das
membranas constituem domnios de membrana.

EXERCCIOS
1. Descreva de modo sucinto o modelo do mosaico fluido da membrana.
2. Defina e diferencie meio intracelular e meio extracelular.
3. O que voc entende por compartimento celular?
4. Como se organizam os lipdeos nas membranas?
5. O que voc entende por fluidez dos lipdeos da membrana?
6. Que tipos de movimento realizam os lipdeos na membrana?
7. O que flip-flop? Quando ocorre?
8. Como atuam os seguintes fatores sobre a fluidez da membrana:
a) comprimento das cadeias de cidos graxos dos fosfolipdeos?
b) duplas ligaes nas cadeias de cidos graxos dos fosfolipdeos?
9. Por que o colesterol diminui a fluidez da membrana?
10. Descreva a assimetria da bicamada lipdica.
11. Como podem os lipdeos formar domnios na membrana?
12. O que so as plataformas lipdicas?

CEDERJ

101

objetivos

AULA

Protenas de membrana

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:


Reconhecer as diferentes protenas e carboidratos de
membrana de acordo com:
sua funo (transporte, reconhecimento e adeso etc.);
sua insero na bicamada lipdica (unipasso, multipasso,
ancorada, perifrica etc.);
sua organizao em domnios de membrana.

Pr-requisitos
Aulas de 11 a 16 de Protenas (Bioqumica I).

Biologia Celular I | Protenas de membrana

INTRODUO

A estrutura bsica de todas as membranas biolgicas formada por uma bicapa


lipdica; entretanto, so as protenas que conferem individualidade e especificidade
s membranas celulares.
As funes desempenhadas por cada membrana (transporte, reconhecimento, adeso,
veja Figura 8.1) dependem primariamente de suas protenas constituintes.
As protenas correspondem, em mdia, a cerca de 50% da massa de uma membrana,
podendo chegar a 75%, no caso da membrana mitocondrial interna.
A tcnica da criofratura (veja Aula 3) permitiu, pela primeira vez, observar que as
protenas de membrana se distribuem na bicamada lipdica ora atravessando-a de um
lado ao outro, ora inserindo-se apenas no folheto externo ou interno da bicapa.
Assim, na descrio clssica do modelo do mosaico fluido, as protenas da membrana
so classificadas em dois grupos: transmembrana, quando atravessam a matriz
lipdica; perifricas, quando se encontram associadas a outras protenas integrais
ou lipdeos da membrana.

b
Figura 8.1: Principais funes das protenas de membrana.
A transporte; B adeso; C reconhecimento.

MODOS DE INSERO DE UMA


PROTENA NA MEMBRANA
Decorridos quase 30 anos da proposio do
modelo do mosaico fluido das membranas, sabe-se
hoje que uma protena pode inserir-se na bicapa
a

lipdica de vrias formas:


1. As protenas transmembrana atravessam

Figura 8.2: As protenas esquematizadas em A e


B atravessam a bicamada lipdica. Em A, a cadeia
polipeptdica passa apenas uma vez atravs
da bicamada, enquanto B atravessa 3 vezes a
bicamada.

104 CEDERJ

a bicapa lipdica de um lado a outro, expondo parte


de si de cada lado da membrana (Figura 8.2).

MDULO 2

8
A protena que
transporta glicose
para dentro das
clulas do tipo
multipasso, assim
como a bomba de
sdio/potssio.

chamadas unipasso (Figura 8.2A), enquanto as que passam muitas vezes


pela bicamada so chamadas multipasso (Figura 8.2B). Muitas vezes, as
protenas multipasso criam em seu interior um ambiente hidroflico que
pode atuar como um poro transmembrana.
2. H protenas que se associam membrana de modo indireto,
ou seja, formam ligaes no covalentes com protenas transmembrana
(Figura 8.3). Estas correspondem s protenas perifricas inicialmente
descritas no modelo do mosaico fluido.

Meio
Extracelular

Figura 8.3: As protenas perifricas


ligam-se a protenas inseridas na
bicamada, seja pelo lado intracelular
(a) ou pelo lado extracelular (b).

Bicamada
lipdica

b
a
Meio
Intracelular

3. Outras protenas de membrana se prendem bicamada apenas


por uma ligao covalente a um dos lipdeos da membrana. Estas so
chamadas de protenas ancoradas (Figura 8.4 A e B).

a
Figura 8.4: As ncoras que prendem
as protenas pelo lado citoplasmtico
(b) so diferentes daquelas do lado
extracelular (a).

CEDERJ 105

AULA

Algumas protenas atravessam apenas uma vez a bicamada e so

Biologia Celular I | Protenas de membrana

!
As ncoras de membrana podem ser de vrios tipos, especficos para o lado
citoplasmtico ou para o lado extracelular da membrana. Protenas ligadas
covalentemente a lipdeos podem ser encontradas no folheto citoplasmtico.
Protenas ancoradas via glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), s existem na face
da membrana voltada para o meio extracelular. A protena ancorada por
GPI se prende sempre ao fosfolipdeo fosfatidilinositol, tendo como ponte
entre a protena e o fosfolipdeo uma seqncia de acares, que sempre
a mesma, uma etanolamina. interessante como uma mesma estrutura est
presente na ligao de protenas to diferentes membrana.

As protenas podem ser separadas dos folhetos lipdicos da


membrana por meios mais ou menos drsticos, de acordo com seu
modo de insero nesta. As protenas do tipo 1 (transmembrana) podem
ser isoladas da membrana com o uso de detergentes que solubilizam a
bicamada lipdica (Figura 8.5).

Figura 8.5: As protenas que atravessam


integral-mente a bicamada lipdica
podem ser isoladas pelo tratamento
com detergentes que se ligam aos
lipdeos, separando-os das protenas.

J as protenas do tipo 2 se soltam facilmente. Tratamentos brandos,


como o uso de solues que alteram o pH e/ou a fora inica so suficientes
para romper as foras que as mantm presas membrana (Figura 8.6).

106 CEDERJ

MDULO 2

8
AULA

Figura 8.6: Protenas que se ligam por carga a outros componentes da membrana
podem se soltar da mesma, se a fora inica da soluo onde se encontram for
drasticamente alterada.

Finalmente, as do tipo 3 s podem ser removidas pelo uso de


enzimas especficas da famlia das fosfolipases, que cortam as ncoras,
deixando as protenas livres.
Assim, as protenas tambm podem ser classificadas pela
dificuldade de sua extrao da membrana plasmtica. As do tipo 1,
transmembrana, e as do tipo 3, ancoradas, so consideradas protenas
integrais da membrana plasmtica, enquanto as do tipo 2, fceis de
extrair, so consideradas perifricas.

!
Protozorios parasitas como o Trypanosoma brucei (agente
da doena do sono) e o Plasmodium (causador da malria)
periodicamente secretam a enzima fosfolipase-c especfica
para fosfatidil inositol. Dessa forma, todas as protenas ancoradas
por GPI na superfcie deles so rapidamente eliminadas e
os protozorios se tornam invisveis para os anticorpos j
produzidos pelo hospedeiro.

CEDERJ 107

Biologia Celular I | Protenas de membrana

COMO AS PROTENAS ATRAVESSAM


A BICAMADA LIPDICA?
As pores de uma protena de membrana que se voltam para o
citoplasma ou para o meio extracelular so naturalmente hidroflicas.
Entretanto, o segmento da cadeia polipeptdica que atravessa a bicamada
lipdica precisa passar por um ambiente hidrofbico que, a princpio, seria
hostil. Esse segmento composto principalmente por aminocidos cujas
cadeias laterais so hidrofbicas, podendo, portanto, ficar voltadas para
as molculas apolares ( = hidrofbicas) adjacentes. Em contrapartida, os
laos peptdicos da cadeia so normalmente hidroflicos, ficando voltados
para o centro, onde formam pontes de hidrognio uns com os outros. Isso
leva a cadeia polipeptdica a enrolar-se em torno de um eixo imaginrio,
formando uma alfa-hlice (Figura 8.7).

Figura 8.7: Duas maneiras de representar a alfa-hlice do segmento


transmembrana das protenas.

O que so as protenas unipasso?


Se voc estiver se perguntando que tipos de protena tm essa
configurao, a resposta : principalmente protenas que atuam como
receptores. (Por qu? Veja aula de receptores.) J as protenas multipasso
criam um microambiente hidroflico na membrana atravs da qual
podem passar ( = ser transportadas) molculas especficas (veja as aulas
de Transporte, 9 a 12).
108 CEDERJ

MDULO 2

8
AULA

NEM TODAS AS PROTENAS ATRAVESSAM A BICAMADA


FORMANDO UMA HLICE
Mais raramente, as cadeias polipeptdicas no se enrolam em
alfa-hlice, mas adquirem uma conformao em fita beta-pregueada,
curvando-se em idas e vindas atravs da bicamada e originando uma
estrutura em canal relativamente rgida chamada beta-barril. As porinas
so protenas que possuem essa conformao e so encontradas na
membrana externa das mitocndrias e de algumas bactrias, sendo
responsveis pela passagem de pequenas molculas nutrientes e ons
(Figura 8.8). Alm de serem relativamente pouco seletivos, esses poros
so muito menos versteis do que as composies possveis com as
protenas em alfa-hlice.
a

Figura 8.8: (a) conformao em beta-barril. As cadeias de aminocidos formam fitas


relativamente rgidas; (b) porinas, formando canais na membrana de bactrias.

AS PROTENAS SE ASSOCIAM EM COMPLEXOS PROTICOS


Alm de criarem um ambiente hidroflico atravs das protenas

multipasso, muitas protenas ainda formam complexos na membrana.


Algumas vezes, todas as protenas componentes do complexo so iguais
(Figura 8.9A). Outros complexos so formados por protenas diferentes
(Figura 8.9B). Esses complexos proticos tambm formam uma rea

hidroflica pela qual podem passar molculas como ons ou acares,


que normalmente so barrados pela bicamada lipdica.
Figura 8.9: (a) Protenas se associam formando um complexo em que todas as
subunidades so iguais. (b) O receptor de acetilcolina um complexo protico em
que as subunidades no so iguais.
CEDERJ 109

Biologia Celular I | Protenas de membrana

AS PROTENAS TAMBM SE MOVEM


Assim como os lipdeos, as protenas de membrana tambm so
capazes de girar em torno de seu prprio eixo (rotao) e de deslocar-se
no plano da membrana (difuso lateral). O flip-flop de protenas no
ocorre nunca. A comprovao dos movimentos laterais foi obtida em
1970 por Frye e Edidin em experimentos com heterocrions (uma clula
hbrida com dois ncleos diferentes). Eles fabricaram anticorpos que
reconheciam as protenas da superfcie de clulas de camundongo e
marcaram esses anticorpos com fluorocromo verde. Tambm fabricaram
anticorpos que s reconheciam as protenas da superfcie de clulas
humanas e os marcaram com fluorocromo vermelho. Depois fizeram
um experimento em que fundiam uma clula de camundongo com uma
clula humana. Isso no acontece espontaneamente e difcil conseguir.
Hoje j se conhecem substncias que induzem a fuso de clulas diferentes
e isso usado na produo de anticorpos monoclonais (veja Aula 4). No
tempo de Frye e Edidin, s se podia fazer
fuso entre clulas diferentes com a ajuda
de vrus, e foi o que eles fizeram, obtendo
um heterocrion. Depois incubaram o
heterocrion com os anticorpos, a baixa
temperatura, e olharam no microscpio
de fluorescncia. Ele tinha metade da
membrana fluorescendo em verde e metade
em vermelho, correspondendo s protenas
de membrana que vieram das clulas de
camundongo e humana, respectivamente.
Resolveram colocar o heterocrion j
marcado com os anticorpos na temperatura
fisiolgica por alguns minutos e olharam
de novo: as fluorescncias tinham se
misturado completamente, no sendo mais
possvel distinguir verde e vermelho.
Assim, ficou demonstrado que as
protenas podem se mover no plano da
membrana plasmtica e que a membrana
Figura 8.10: Esquema do experimento que comprovou
a fluidez da membrana.

110 CEDERJ

fluida (Figura 8.10).

MDULO 2

8
AULA

MECANISMOS DE RESTRIO MOBILIDADE DAS


PROTENAS: BARREIRAS E DOMNIOS
Tem sido observado que muitas protenas no se difundem
livremente no plano da membrana. A membrana plasmtica se divide em
vrias reas, chamadas domnios, entre as quais podem existir barreiras.
Essa restrio interessante por vrios motivos: algumas clulas, como
as do epitlio intestinal, possuem, na superfcie voltada para a luz do
rgo, protenas que garantem a absoro dos nutrientes num s sentido;
outras, como os espermatozides, possuem protenas especficas na regio
da cabea (que far contato com o vulo) que no esto presentes na
cauda e vice-versa. Os mecanismos bsicos que restringem a mobilidade
das protenas no plano da membrana so:
1. Formao de complexos: vrias protenas se associam formando
complexos. Esses complexos proticos s podem se deslocar como um todo.
Alguns complexos so formados por diferentes protenas, enquanto outros
resultam do agrupamento de protenas semelhantes (Figura 8.11A).
2. Associao ao citoesqueleto ou matriz extracelular: algumas
protenas tm sua mobilidade lateral limitada por estarem associadas a
macromolculas do meio extra ou intracelular como elementos da matriz
extracelular e do citoesqueleto, respectivamente (Figura 8.11B,C).
3. Ligao entre protenas: as protenas de duas clulas adjacentes
podem ligar-se, limitando assim a mobilidade de ambas. A adeso entre
clulas ou entre uma clula e o substrato, por exemplo, formada pela
unio dos complexos proticos das duas clulas vizinhas ou de uma clula
e uma molcula do meio extracelular (veja aula de Junes Celulares)
(Figura 8.11D).
(A)

(A)

(A)b

(B)
(C)

(C)

(A)

(B)

(C)

(D)

(C)

(D)

Figura 8.11: Mecanismos de restrio mobilidade lateral das protenas de membrana:


(a) formao de agregados,
(b) associao a elementos do meio extracelular,
(c) associao a elementos do citoesqueleto e
(B)
(B) entre(D)
(D) clulas.
(d) formao de complexos
de interao
as protenas de duas

CEDERJ 111

Biologia Celular I | Protenas de membrana

FORMAO DE BARREIRAS
Alguns domnios so conseqncia da existncia de barreiras.
As barreiras so formadas por arranjos de protenas que impedem a
livre difuso de outras protenas ou lipdeos entre elas. As protenas se
difundem livremente dentro de um determinado domnio; entretanto,
no passam aos domnios vizinhos por no serem capazes de cruzar as
barreiras. As junes entre clulas que formam epitlios (Figura 8.12)
constituem barreiras. As protenas existentes no corpo celular do
espermatozide tambm no so encontradas no flagelo deste pela
existncia de uma barreira que restringe sua mobilidade e divide esses
dois domnios (Figura 8.13).

Protena A

Figura 8.12: Em clulas epiteliais, as junes ocludentes (tight junctions)


formam barreiras transmembrana que limitam o movimento da protena A,
que fica restrita ao domnio apical, e da protena B, que fica restrita ao
domnio basolateral.

Figura 8.13: A membrana do


espermatozide possui trs
domnios: dois na cabea e
um na cauda.

112 CEDERJ

Domnios da cabea

MDULO 2

8
AULA

OS CARBOIDRATOS DE MEMBRANA
Correspondem aos acares. Grande parte dos lipdeos e das
protenas de membrana voltados para o meio extracelular apresenta-se
ligado a carboidratos, formando glicoprotenas ou glicolipdeos. H ainda
um terceiro tipo de carboidratos: so as proteoglicanas, que geralmente
so encontradas na matriz extracelular (sero abordadas em maior detalhe
em Biologia Celular 2), mas algumas se inserem na bicamada lipdica por
parte de sua poro protica ou por meio de uma ncora do tipo GPI.
O conjunto de carboidratos da membrana forma o chamado
glicoclix ou cell-coat. Quanto mais carboidratos contiver uma
membrana, mais espesso ser o glicoclix (Figura 8.14).
Alm de estarem sempre ligados a uma protena ou a um lipdio
na membrana plasmtica, os acares esto sempre voltados para o meio
extracelular (Figura 8.15).

Figura 8.14: Fotomicrografia


da periferia de uma clula cujo
glicoclix foi evidenciado por
uma tcnica especfica.

DE: ALBERTS, Bruce et al. Molecular Biology of the Cell. 4.ed. Nova York: Garland Science Publishing, 2002.

Figura 8.15: Esquema dos componentes do glicoclix e sua relao com a


bicamada lipdica.

CEDERJ 113

Biologia Celular I | Protenas de membrana

Isso uma conseqncia do seu processo de sntese no retculo


endoplasmtico e no complexo de Golgi (veja aulas correspondentes).
As enzimas que acrescentam os acares a uma protena ou a um lipdio
durante sua sntese se localizam no interior dessas organelas e vo anexando
os carboidratos a protenas ou lipdios que esto inseridos no folheto da
membrana voltado para o lmen, evidentemente. Ao chegar superfcie,
esse folheto estar voltado para o meio extracelular (Figura 8.16).
Membrana do retculo

Citossol

Membrana plasmtica

Figura 8.16: Correspondncia espacial entre o meio extracelular


e o interior (lmen) das organelas.

QUAL A FUNO DOS ACARES NA MEMBRANA?


Na superfcie celular, os acares exercem muitas funes, dentre
as quais podemos destacar a de proteger a bicamada lipdica, conferir
carga negativa superfcie celular como um todo e atuar em processos
de reconhecimento e adeso celular, o que voc vai conhecer com mais
detalhes em outras aulas.
Alm disso, os espaos entre as clulas so freqentemente
preenchidos por acares de tipos especiais como, por exemplo, a
celulose, que forma a parede celular dos vegetais. A celulose, como voc
provavelmente sabe, formada pela polimerizao de molculas de glicose.
O tecido conjuntivo e a cartilagem tambm possuem grandes quantidades
de carboidratos, as proteoglicanas. As proteoglicanas so molculas muito
longas e ramificadas que atuam como verdadeiras esponjas, ajudando
na reteno de gua por esses tecidos.

114 CEDERJ

MDULO 2

8
Proteoglicana

RESUMO
As membranas celulares formam barreiras que confinam molculas e atividades

especficas a esses compartimentos.


As funes de uma membrana dependem principalmente das protenas que a compem.
Nas membranas podem estar presentes protenas cuja funo seja de

reconhecimento, transporte, adeso, enzimas etc.


As protenas transmembrana atravessam toda a extenso da bicamada lipdica,

geralmente como uma ou mais alfa-hlices ou como uma fita beta-pregueada


em forma de barril.
Outras protenas no atravessam a bicamada, mas formam ligaes covalentes

com lipdeos da membrana. Outras ainda formam ligaes fracas (no covalentes)
com outras protenas da membrana.
A maior parte das protenas e alguns dos lipdeos voltados para o lado externo

da membrana apresentam cadeias de acar ligadas. Esses acares ajudam a


proteger e a lubrificar a superfcie da clula e esto relacionados a processos de
reconhecimento clula-clula.
Embora muitas protenas possam difundir-se livremente no plano da mesma,

as clulas tm meios de confinar certas protenas a determinados domnios da


membrana, imobilizando-as atravs de ligaes a macromolculas localizadas
dentro ou fora da clula.

CEDERJ 115

AULA

Proteoglicanas diferem de glicoprotenas em algumas caractersticas: as glicoprotenas tm


uma cadeia ramificada de monossacardeos diferentes ligados a uma protena. J as proteoglicanas
tm longas cadeias lineares de dissacardeos repetidos ligados a uma protena. A relao em massa
entre a cadeia de acares e a cadeia protica tambm diferente: enquanto na glicoprotena
a parte protica muito maior, na proteoglicana, a parte glicdica predomina.

Biologia Celular I | Protenas de membrana

EXERCCIOS
1. Por que a criofratura foi fundamental para se saber como as protenas se inserem
na bicamada lipdica.
2. Defina os seguintes conceitos:
protena transmembrana
protena perifrica
protena ancorada
-hlice proteica e fita -pregueada
protena unipasso
protena multipasso
porinas
complexo proteico
3. Quais os tipos de movimento que as protenas podem fazer na membrana?
4. O que um heterocrion?
5. O que so domnios de membrana?
6. O que so barreiras de membrana?
7. Como os acares se ligam s membranas?
8. O que glicoclix?
9. Diferencie glicoprotenas de proteoglicanas.
10. Por que todos os carboidratos de membrana se localizam na face extracelular
da mesma?

116 CEDERJ

objetivos

AULA

Permeabilidade da membrana

Ao final desta aula, voc dever reconhecer:


A importncia do transporte atravs das membranas.
A permeabilidade de uma bicamada lipdica.
Osmose.

Pr-requisito
Estrutura de protenas (Bioqumica I)

Biologia Celular I | Permeabilidade da membrana

INTRODUO

Sabemos que a membrana plasmtica funciona como uma barreira,


separando o ambiente intracelular do meio externo. Entretanto, as
clulas interagem durante toda sua vida com o meio externo, seja na
absoro do oxignio de que necessitam para a respirao celular e
conseqente liberao do gs carbnico, seja na obteno de ons e
molculas maiores, como a glicose e outros acares.
Estamos acostumados a nos referir membrana como dotada de
permeabilidade seletiva, mas o que ser isso? Ser que cada clula
capaz de escolher as molculas que passam pela membrana?
Bom, voc j deve ter percebido que a passagem de molculas atravs
da membrana obedece a certos critrios. Esses critrios so universais e
independem do tipo de clula ou da atividade que ela esteja exercendo,
estando vinculados natureza lipdica da membrana.

Recordando:
As membranas celulares so compostas por uma bicamada
de lipdeos, onde esto inseridas protenas. Enquanto
as protenas variam muito de acordo com as atividades
especficas dos diferentes tipos celulares, os lipdeos so,
alm de majoritrios, praticamente os mesmos nas
membranas plasmticas das diferentes clulas. Os lipdeos
podem ser definidos como molculas hidrofbicas no
carregadas, embora os fosfolipdeos e mesmo o colesterol
nas membranas possuam uma extremidade hidroflica em
suas molculas.

118 CEDERJ

Se o texto acima lhe parece confuso, volte Aula 7.

MDULO 2

9
AULA

A PERMEABILIDADE SELETIVA DA MEMBRANA


PLASMTICA
A chave para compreendermos
a natureza da permeabilidade seletiva
das membranas est justamente na
natureza da bicamada lipdica.
A seleo das molculas que
atravessam a bicamada feita em

Molcula A
(atravessa
a bicamada
lipdica)

Molcula B
(no atravessa
a bicamada
lipdica)

Clula

funo de seu tamanho, polaridade


e carga (Figura 9.1).
Tamanho: quanto menor a molcula, mais facilmente ela
atravessar a bicamada lipdica.
Polaridade: como a natureza da bicamada lipdica apolar, as
molculas apolares tm muito mais facilidade para atravessar a bicamada
do que molculas polares.
Carga: molculas dotadas de carga, como os ons, embora
geralmente pequenas, no atravessam a bicamada lipdica.
Esses trs fatores atuam em conjunto, de modo que as molculas
que passam atravs da bicamada lipdica com mais facilidade so aquelas
bem pequenas, apolares e sem carga. Os melhores exemplos de molculas
desse tipo so o CO2 e o O2. Entretanto, vrios solventes orgnicos, como
o metanol, tambm se enquadram nessa categoria e so extremamente
prejudiciais s clulas.

Figura 9.1: Esquema da permeabilidade da bicamada lipdica frente


a diferentes molculas.

Bicamada lipdica sinttica

A uria, o glicerol e a gua so molculas polares, mas ainda


pequenas e sem carga, e tambm atravessam a bicamada lipdica.
J a glicose e a sacarose, embora sem carga, so polares e grandes
demais para passar pela bicamada lipdica.
CEDERJ 119

Biologia Celular I | Permeabilidade da membrana

Por ltimo, os ons, como o Na+, K+ e Cl-, embora sejam molculas


muito pequenas, so hidroflicos, prendendo em volta de si uma grande
quantidade de molculas de gua (a chamada camada de solvatao),
o que aumenta muito o seu tamanho e os torna incompatveis com a
natureza da bicamada lipdica.

D uma paradinha. V at a cozinha, prepare uma limonada, pegue umas batatinhas fritas
e, na volta, reveja estes conceitos de Bioqumica I:
Molcula polar X molcula apolar
Molcula hidroflica X molcula hidrofbica
on
Camada de solvatao
Ah, no tem nada a ver!
Como no? J imaginou tomar limonada se o acar no dissolver na gua? E a batata?
Fica horrvel, encharcada de leo de fritura!
Repare que esses conceitos fazem parte do nosso dia-a-dia.

A concentrao o quarto fator que influencia a passagem de uma


molcula atravs da membrana. Assim, as molculas de oxignio atravessaro
a membrana para o meio intracelular apenas enquanto a concentrao de
oxignio no meio intracelular for menor que no meio extracelular. Isso
explica por que as plantas, que produzem oxignio dentro de suas clulas,
liberam-no para a atmosfera, enquanto as clulas animais, que consomem
oxignio, o absorvem do meio (Figura 9.2). Todo o processo ocorre sem que
a clula gaste energia (ATP). No box voc observa como se d a troca desses
gases entre os alvolos pulmonares e as hemcias.

Hemcia nos capilares do pulmo:


a concentrao de CO2 dentro
da clula maior que no alvolo,
portanto o CO2 SAI.
J a concentrao do O2 no meio externo
maior que dentro da hemcia,
portanto ele ENTRA.
Capilar

Figura 9.2: A troca de gases entre os seres vivos e o meio ambiente feita sempre
por difuso simples, obedecendo diferena de concentrao. Como a planta
est produzindo O2, ele lanado ao meio ambiente. J o animal consome
continuamente O2 e expira CO2, que lanado ao meio ambiente e absorvido pela
planta, em cujas clulas a concentrao mais baixa.

120 CEDERJ

MDULO 2

9
AULA

Vimos, assim, que a permeabilidade seletiva da bicamada lipdica


nada tem a ver com a utilidade das molculas para a clula, dependendo
apenas das caractersticas fsico-qumicas das mesmas.

DIFUSO SIMPLES
o processo que acabamos de descrever: a passagem de substncias
atravs da bicamada lipdica chamada difuso simples. Observe o
esquema no boxe para entender melhor como funciona.
No caso de a molcula transportada ser a gua, recebe o nome
de osmose.

OSMOSE
Na osmose, a gua, que o solvente universal tanto do meio
intracelular quanto do meio extracelular, se comporta como soluto.
A osmose pode ser observada em dois experimentos muito simples, que
voc pode executar no plo.

Experimento 1:
Material:
Luvas de ltex descartveis
Hemcias (sangue de camundongo ou outra cobaia)
Soro fisiolgico
Sal de cozinha (NaCl)
Tubo de ensaio
Pipetas e bulbos
Lminas e lamnulas
Microscpio ptico

Procedimento:
1. Sempre usando as luvas, recolha uma amostra (1 ml) do
sangue do animal num tubo contendo soro fisiolgico (1 ml). Este
ser o tubo 1. Misture, colha com a pipeta uma gota da mistura,
monte entre lmina e lamnula e observe ao microscpio ptico. Qual
o formato das hemcias?

CEDERJ 121

Biologia Celular I | Permeabilidade da membrana

2. Retire 1 ml do contedo do tubo 1 e misture num outro


tubo contendo apenas gua destilada. Esse ser o tubo 2. Misture
e colha uma gota com a pipeta. Monte entre lmina e lamnula e
observe ao microscpio ptico. Qual o formato das hemcias?
3. Retire 1 ml do contedo do tubo 1 e misture num outro
tubo (tubo 3) contendo 1 ml de soro fisiolgico ao qual se adicionou
uma pitada de sal de cozinha. Misture e colha uma gota com a
pipeta. Monte entre lmina e lamnula e observe ao microscpio
ptico. Qual o formato das hemcias?

Discusso dos resultados:


A soluo do tubo 1 chamada isotnica em relao ao citoplasma
das hemcias. A concentrao de NaCl igual existente no citoplasma
das hemcias. Por isso, seu volume no sofreu alterao (Figura 9.3 B).
A do tubo 2 hipotnica em relao ao citoplasma das hemcias.
A concentrao de NaCl menor que no citoplasma. Nessa situao a
gua atravessou a membrana plasmtica (Figura 9.3C) e as membranas
terminaram por se romper (Figura 9.3D).
No tubo 3, a soluo hipertnica em relao ao citoplasma das
hemcias. A concentrao de NaCl muito alta, as hemcias perderam
gua e por isso murcharam (Figura 9.3A).
Nas trs situaes, o que atravessou a membrana das hemcias
no foram os ons Na+ e Cl-, j que a bicamada lipdica impermevel
a eles. A gua, que apesar de ser uma molcula polar no possui carga
e bem pequena, atravessa a bicamada, sempre no sentido em que a
concentrao da gua estiver menor, isto , para o compartimento
onde o NaCl estiver mais concentrado.

122 CEDERJ

MDULO 2

9
AULA

Figura 9.3: Variaes na forma e no volume de clulas submetidas a solues de diferentes tonicidades.

EXPERIMENTO 2:
Material:
Uma cebola sem casca
gua destilada
Acar (sacarose)
Tubo de ensaio
Pipetas e bulbos
Lminas e lamnulas
Microscpio ptico
Procedimento:
1. Puxe cuidadosamente uma pelcula da superfcie da
cebola. Estenda essa pelcula sobre uma gota dgua colocada numa
lmina e monte com uma lamnula. Observe e descreva o formato
das clulas ao microscpio.
2. Puxe uma outra pelcula semelhante primeira mas
monte sobre uma gota de uma soluo saturada de acar em
gua. Observe ao microscpio e descreva as alteraes.

CEDERJ 123

Biologia Celular I | Permeabilidade da membrana

Discusso dos resultados:


Embora no tenham carga, as molculas de acar (sacarose) so
muito grandes para atravessar a bicamada lipdica. Assim, para que a
concentrao de sacarose dentro e fora da clula fique igual, a clula perde
gua e sua membrana se descola da parede celular, murchando, embora
a parede no altere sua forma. A osmose o mecanismo primordial pelo
qual as plantas absorvem do ambiente a gua de que necessitam.

parede
celular

ncleo

membrana
plasmtica

hipertnico

isotnico

hipotnico

Figura 9.4: Variaes na forma de uma clula vegetal submetida a solues de


diferentes tonicidades. Repare que a parede celular impede mudanas drsticas na
forma e no tamanho das clulas.

BSICO

A DIFUSO SIMPLES NO ATENDE


A TODAS AS NECESSIDADES DA CLULA
Embora todo o O2 e CO2 utilizados e produzidos por uma clula
passem atravs da membrana por difuso simples, esse no , nem poderia
ser, o nico processo de troca de substncias entre a clula e o meio
extracelular. No possvel imaginar que alteraes da concentrao
externa de ons levem as clulas a absorver gua at romper ou, ao
contrrio, provoquem seu murchamento. Tambm a produo de ATP
dependente da absoro de molculas como a glicose, incapaz de
atravessar a bicamada lipdica.
Qual ser, ento, o mecanismo que atende s diferentes necessidades
das diferentes clulas? o que veremos na aula seguinte. Ao final da Aula
12, voc encontrar o resumo e os exerccios referentes a esta aula.
124 CEDERJ

objetivos

Ao final desta aula, voc dever compreender o que so:


Protenas transportadoras: carreadores e canais.
Aquaporinas.

10
AULA

As protenas transportadoras

Biologia Celular | As protenas transportadoras

PROTENAS TRANSPORTADORAS
Dentre as protenas presentes na membrana celular de todas
as clulas, destacam-se aquelas cuja principal funo permitir a
passagem das molculas que no so capazes de atravessar a bicamada
lipdica. Todas as protenas transportadoras possuem as seguintes
caractersticas:
1. Atravessam a bicamada lipdica de um lado ao outro, isto ,
so protenas transmembrana.
2. So do tipo multipasso, isto , sua seqncia de aminocidos
atravessa muitas vezes a bicamada. Muitas protenas transportadoras
so, na verdade, complexos de duas ou mais protenas que terminam
por formar uma regio hidroflica na membrana, permitindo assim a
passagem de molculas hidroflicas.

D uma paradinha:
Se voc acha que protena multipasso isso,
d uma espreguiada, endireite as costas
e volte aula de protenas de membrana (nmero 8)
para refrescar sua memria.

Protena multipasso aquela cuja cadeia polipeptdica atravessa


muitas vezes a bicamada lipdica.
3. So especficas para um tipo de molcula, isto , um transportador
de glicose no transportar frutose, assim como a protena que permite a
passagem de Na+ no pode ser usada para transportar K+ ou outro ction.

COMO ATUA UMA PROTENA TRANSPORTADORA


As protenas transportadoras se dividem em duas
grandes categorias, de acordo com seu modo de atuao:
carreadoras e canais.
As carreadoras (tambm chamadas carregadoras)
se ligam molcula a ser transportada em um dos lados
da membrana e a liberam do outro lado (Figura 10. 1).

Figura 10.1: Princpio do funcionamento de um


carreador por mudana de conformao

126 CEDERJ

MDULO 2

10
AULA

Podem ser comparadas s enzimas, pois, como elas, ligam-se a um soluto


especfico e sofrem alteraes na sua forma at liberar esse soluto do outro
lado da membrana e reiniciar o processo com uma nova molcula; porm,
diferentemente das enzimas, no alteram o soluto que transportado
por elas. Outro ponto importante que cada unidade de uma protena
carreadora transporta poucas molculas do soluto por vez. Um bom
exemplo de carreador a protena que continuamente transporta a
glicose do sangue para dentro das clulas. Nos momentos em que um
determinado tipo celular necessita de maior aporte de glicose, isso
feito aumentando o nmero de transportadores na membrana
das clulas, pois a velocidade com que um
carreador capaz de atuar no se modifica.
Situaes de esforo muscular, como uma
corrida, levam a esse tipo de situao;
entretanto, o tecido mais vulnervel
falta de glicose o nervoso.

As protenas carreadoras podem


ser constitudas por complexos de
duas ou mais subunidades, como
dois carregadores que trabalham em
conjunto para transportar o mvel.

J as protenas do tipo canal atuam como comportas: ao se


abrirem, formam um poro ou canal pelo qual passa rapidamente um
enorme nmero de molculas (Figura 10.2). Como a imensa maioria
dos canais transporta apenas ons, so tambm chamados canais inicos.
importante ressaltar que cada tipo de canal inico altamente
especfico para um dado on, o que os diferencia de um simples
poro aquoso.

Figura 10.2: Esquema de uma protena do tipo canal no estado aberto.


CEDERJ 127

Biologia Celular | As protenas transportadoras

Podemos fazer um paralelo entre o funcionamento de uma protena carreadora e uma


protena canal, comparando-as ao procedimento de descarga de um caminho de areia:
se a areia vier em sacos, ser necessrio que os operrios descarreguem saco por saco.
Se o caminho for do tipo basculante e a areia no estiver ensacada, basta levantar a
caamba e toda a areia ser despejada de uma s vez. A primeira situao corresponde
ao transporte via carreadores poucas unidades por vez num ritmo constante, enquanto
houver molculas para serem transportadas. O caminho basculante funciona como uma
protena canal, abre-se por um pequeno intervalo de tempo e uma grande quantidade
de pequenas molculas (os ons podem ser comparados aos gros de areia) passa em
pouco tempo.

AS AQUAPORINAS
A passagem de gua atravs da membrana das hemcias muito
rpida (podendo mesmo levar ao seu rompimento), enquanto outros tipos
celulares, como os ovcitos de peixes e anfbios, permanecem na gua dos
rios e lagos sem absorver ou perder quantidades significativas de gua.
A constatao e a pesquisa em torno desses fatos levou descoberta de
um novo tipo de protena transportadora: as aquaporinas.
Naturalmente, as protenas dessa famlia esto ausentes da
membrana dos ovcitos desses animais, para evitar que eles arrebentem
quando lanados em gua doce ou desidratem quando os ovos so postos
em gua salgada.
As aquaporinas formam uma famlia de protenas de membrana
especficas para a passagem de molculas de gua e j foram identificadas
na membrana de muitos tipos celulares, alm das hemcias. Na membrana
dos tbulos coletores dos glomrulos renais (Figura 10.3), por exemplo,
ajudam a captar a maior parte da gua perdida durante o processo de
filtragem do sangue, o que diminui o volume final de urina produzido.
Ao contrrio dos canais inicos, as aquaporinas permanecem abertas
o tempo todo, permitindo a passagem da gua do meio mais diludo
(geralmente o extracelular) para o mais concentrado (o citoplasma).

128 CEDERJ

MDULO 2

10
AULA

O controle de sua atividade feito de outra forma: quando a clula recebe


determinado tipo de estmulo (geralmente por parte de um hormnio),
molculas de aquaporina que estavam armazenadas dentro da clula
so direcionadas a se inserir na membrana, acelerando a passagem de
gua atravs dela.

Figura 10.3: No processo de filtrao


do sangue, grande quantidade de
gua absorvida pelos tbulos renais,
ajudando a diluir as toxinas. Parte
dessa gua recuperada, voltando
para o sangue, atravs de aquaporinas
presentes na membrana do tbulo
distal. Com isso, o volume de urina
produzido diminui.

Tbulo renal

Sangue

Cincia vida!
Os portadores do diabetes do tipo 2 produzem grande quantidade de
urina, sempre muito diluda. Nesses indivduos, a reabsoro de gua
nos tbulos renais deficiente justamente pela falta de aquaporinas
na sua membrana. Diversas outras doenas tambm esto associadas
ao mau funcionamento dessas protenas.

!
Tudo relativo Talvez voc esteja se perguntando: sero as
aquaporinas carreadores ou canais? Pense no assunto; voltaremos
a ele na seo de exerccios.

Na prxima aula, vamos colocar as protenas transportadoras para


funcionar. Voc ver que, em sua aparente complexidade, os processos
de transporte obedecem a um nmero pequeno de regras, capazes de se
adequar a todas as situaes da vida celular.
Na Aula 12 voc encontra o resumo sobre transporte
atravs de membranas.

CEDERJ 129

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de compreender o


significado e o funcionamento dos mecanismos de:
Transporte passivo atravs de canais inicos.
Transporte passivo atravs de carreadores.

11

AULA

Transporte passivo

Biologia Celular I | Transporte passivo

OS CANAIS INICOS E O TRANSPORTE PASSIVO


Ao contrrio dos carreadores, cuja atividade de transporte
relativamente lenta e constante, os canais inicos permanecem em geral
abertos apenas por algumas fraes de segundo (lembre do exemplo
do caminho basculante da aula anterior). Durante esse perodo, uma
verdadeira enxurrada de ons passa atravs deles, sempre a favor do
gradiente eletroqumico e de concentrao. Isso quer dizer que os ons se
movem atravs dos canais inicos sempre saindo do compartimento onde
sua concentrao esteja maior para o compartimento onde ela seja menor.
Uma vez aberto o canal, no h dispndio de energia para que os ons
passem. Por isso mesmo, esse tipo de transporte chamado de passivo.
Se nesse ponto voc lembrou que na difuso simples tambm no
h gasto de energia, voc est absolutamente certo: a difuso simples
tambm considerada um tipo de transporte passivo, embora no haja
protenas envolvidas neste caso.

!
Assim como nos canais inicos, as
pessoas espremidas numa saleta
tambm tendem a se espalhar,
quando uma porta para um
compartimento mais espaoso
aberto.

132 CEDERJ

11 MDULO 2

O QUE LEVA UM CANAL INICO A ABRIR-SE?

AULA

Cada canal inico responde (= se abre) a um tipo de estmulo (Figuras


11.1, 11.2 e 11.3). Esse estmulo pode ser um ligante, uma sensibilidade
do canal a alteraes de voltagem ou a um estmulo mecnico.
Nos canais ativados por ligante, uma molcula se liga ao canal e
induz uma mudana no formato da molcula que abre a comporta (Figura
11.1A e 11.1B). Um bom exemplo de ligante a adrenalina (vide box).
Quando ficamos nervosos ou com medo, essa substncia liberada na
corrente sangnea e, ao encontrar canais inicos que so ativados por
ela na superfcie de vrios tipos de clula, dispara processos qumicos
que resultam na acelerao dos batimentos cardacos, no suor frio e
outros sintomas relacionados a essas situaes. Repare no esquema: h
canais que so abertos por ligantes extracelulares (como a adrenalina)
e outros por ligantes produzidos na prpria clula, ou seja, so abertos
por dentro (Figura 11.1B).

MEIO EXTRACELULAR

MEIO INTRACELULAR

Figura 11.1: Para alguns canais, o


ligante que o abre uma substncia
que vem de fora da clula (a). Em
outros casos, o canal aberto por
uma substncia presente no interior
da prpria clula (b).

Ter um ataque de nervos no trnsito


abre vrios canais inicos dependentes
de adrenalina.

CEDERJ 133

Biologia Celular I | Transporte passivo


Uma alterao no potencial eltrico da
membrana leva abertura dos canais ativados
por voltagem (Figura 11.2). Estes existem em
grande nmero nas clulas musculares (vide
boxe), e por conta disso que a musculatura
se contrai quando levamos um choque.

Figura 11.2: A inverso na distribuio de


cargas entre os dois lados interno e externo da
membrana provoca a abertura dos canais ativados
por voltagem.

A atividade muscular depende


tanto de canais que se abrem por
ligante como de canais ativados
por voltagem.

!
J na atividade cerebral
participam muitos canais
dependentes de voltagem.

134 CEDERJ

11 MDULO 2

Algumas plantas insetvoras possuem plos que, ao serem


pressionados por uma presa em potencial, disparam a abertura de canais

AULA

inicos sensveis a estmulos mecnicos, levando a folha a fechar-se,


aprisionando o inseto (Figura 11.3).

Figura 11.3: Algumas plantas, como a Dionaea, possuem


canais inicos sensveis a estmulos mecnicos que,
quando abertos, causam o fechamento das folhas.
(Foto: Mrcia Attias)

Voc j deve ter notado que grande parte dos exemplos que temos
utilizado nesta aula se refere aos tecidos chamados excitveis, isto , msculos
e nervos. Os tipos celulares desses tecidos necessitam responder rapidamente a
estmulos. Isso conseguido quando, em reposta a um estmulo, abrem-se canais e
por eles passam grandes quantidades de ons em pequeno intervalo de tempo.
No estado de repouso, a membrana dessas clulas se encontra polarizada.
Isto , h um acmulo de ctions (especialmente Na+ e K+) no meio extracelular.
Em conseqncia, o meio intracelular negativo em relao ao extracelular.
Essa diferena de cargas (chamada potencial de membrana) mantida pelo
transporte ativo desses ctions, a ser estudado na Aula 12.

Meio extracelular

Meio intracelular
Membrana em repouso

Meio extracelular

Meio intracelular
Membrana despolarizada

CEDERJ 135

Biologia Celular I | Transporte passivo

O QUE LEVA UM CANAL INICO A SE FECHAR?


Em condies normais, os canais inicos permanecem abertos por
intervalos de tempo da ordem de milissegundos (milsimos de segundo).
No caso dos canais ativados por ligantes, essa ligao rapidamente se
desfaz, e o canal passa a um estado inativo chamado perodo refratrio,
durante o qual ele no se abrir, mesmo na presena do estmulo especfico.
Esse perodo refratrio observado em todos os canais inicos, mesmo
nos ativados por voltagem (Figura 11.4).

++
inativo

++
aberto

Figura11.4: Os canais inicos permanecem fechados no estado de repouso. Uma vez


abertos, rapidamente passam para um estado inativo, ou refratrio. Nesse estgio, mesmo
que sejam estimulados, no se abriro.

A propagao de um estmulo pela abertura de sucessivos canais


inicos atravs da membrana das clulas nervosas muito rpida e
eficiente (Figura 11.5). A existncia do perodo refratrio impede que o
estmulo "volte", reativando antes do tempo, e sem necessidade, trechos
da membrana j percorridos.

136 CEDERJ

O TRANSPORTE PASSIVO NO OCORRE S NOS CANAIS INICOS


Duas condies definem o transporte passivo:
1. Sempre ocorre a favor do gradiente (do lado onde o soluto est
mais concentrado para o lado onde est menos concentrado).
2. No h dispndio de energia.
Embora todos os canais inicos faam transporte passivo,
importantssimo considerar que vrias protenas carreadoras tambm
transportam seus solutos a favor do gradiente de concentrao e sem gasto
energtico, isto , fazem transporte passivo (Figura 11.6). O transportador de
glicose da maioria das clulas um carreador do tipo passivo.

Figura 11.6: O transporte


passivo ocorre tanto
atravs de carreadores
como de canais. O essencial
que no h gasto de
energia e o caminho
sempre no sentido de
igualar a concentrao da
molcula nos dois lados da
membrana.

CEDERJ 137

11 MDULO 2

Figura11.5: A propagao
de um estmulo nervoso
percorre a membrana
do neurnio (a). As
figuras B e C mostram
o percuso do estmulo
ao longo de um trecho
da membrana, onde se
abrem sucessivamente
canais inicos ativados
por voltagem (b). Os
canais abertos criam
uma rea de inverso
da voltagem que induz
abertura dos canais
vizinhos. Enquanto os
canais recm-ativados
se encontram no estado
inativo (rea sombreada),
impedindo
que
o
estmulo d "marcha
r", os canais frente
abrem-se, permitindo a
propagao do estmulo
no sentido correto.

AULA

Biologia Celular I | Transporte passivo

A glicose o principal combustvel utilizado pelas clulas para produo de energia (a). Alm de sua quebra
constante no meio intracelular criar um gradiente de concentrao em que sua absoro pela clula favorecida,
a clula tambm capaz de transformar a glicose que no ser utilizada imediatamente em glicognio (no caso
de clulas animais) ou amido
(nas clulas vegetais) . Essas
estratgias favorecem a formao
de um gradiente de entrada
de glicose nas clulas. Se no
houver glicose disponvel para
entrar na clula, os

estoques

formados anteriormente, sero


disponibilizados (b).
a

CONCLUSO
Podemos comparar o transporte passivo a um caminho sendo
esvaziado. No caso dos canais inicos, seria um caminho basculante,
que descarrega toda a areia de uma vez. J no caso dos carreadores, os
trabalhadores precisam descarregar saco por saco. O que h de comum
nos dois processos que ele feito do compartimento onde h areia
(o caminho), para onde h menos (fora do caminho). J para encher
o caminho, a histria ser outra...

Pense s quantos "problemas" da clula j resolvemos at agora: o


transporte de gases (CO2 e O2), a aquisio de nutrientes como a glicose,
a propagao de estmulo nervoso por canais inicos...
Pois , mas isso no resolve tudo, veremos na prxima aula
situaes que o transporte passivo por si s no pode solucionar.

Na Aula 12 voc encontra o resumo sobre transporte


atravs de membranas.
138 CEDERJ

objetivos

Ao final desta aula, voc dever ser capaz de saber


o significado de:
Transporte ativo;
Bomba de sdio/potssio;
Uniporte, simporte e antiporte;
Protenas de multirresistncia a drogas.

12

AULA

Transporte ativo

Biologia Celular I | Transporte ativo

TRANSPORTE ATIVO. PARA QU?


Numa clula que, ao longo de um determinado perodo, realize
apenas transporte passivo, a distribuio de ons dos meios intracelular
e extracelular tender a ser idntica (Figura 12.1). Como a tonicidade
do meio intracelular resulta da concentrao de ons, protenas solveis
e acares do citosol, essa clula tender a tornar-se hipertnica em
relao ao meio externo, acarretando a absoro de gua por osmose e
um aumento de seu volume que poder levar ao rompimento.
Alm disso, com o equilbrio entre os meios intra e extracelular,
o transporte inico simplesmente no ocorrer. Como devolver ao
compartimento de origem os ons que passaram pelos canais inicos?
A resposta funcional a esse dilema o transporte ativo.

Figura 12.1: Se apenas os


canais inicos promovessem
o transporte de ons, em
pouco tempo haveria uma
distribuio uniforme de
cargas dentro e fora da
clula e a diferena de
cargas entre o lado interno
e o externo da membrana
celular seria zero.

!
A harmonia do desequilbrio:
Assim como uma bicicleta s se mantm equilibrada nas duas rodas se estiver
em movimento, a vida celular tambm requer atividade constante. Por
exemplo, no caso dos neurnios, o que indica se seu estado de repouso ou
atividade a diferena de cargas nos lados interno e externo na membrana
celular. Quando a clula est em repouso, o exterior positivo em relao ao
meio interno. Em atividade, essa polaridade se inverte momentaneamente e o
interior se torna positivo. Essa mudana de carga se faz pela passagem de ons
(principalmente Na+ e K+). Se a distribuio de ons fosse igual nos dois lados
da membrana, a clula no saberia em que estado se encontra.

Tal como um ciclista que precisa manter constantemente o equilbrio


pedalando, a clula est constantemente alterando a composio inica dos
meios intra e extracelular, mantendo-se num equilbrio dinmico.

140 CEDERJ

12 MDULO 2

O QUE TRANSPORTE ATIVO

AULA

O transporte ativo (Figura 12.2) contrape-se ao passivo em seus


dois postulados bsicos:
1. d-se sempre contra o gradiente de concentrao do soluto que
est sendo transportado;
2. requer gasto energtico (ATP) por parte da clula.

Figura 12.2: No transporte ativo, a substncia transportada por um carreador contra o seu gradiente
eletroqumico, ou seja, do compartimento onde
est em menor concentrao para onde j existe
em maior quantidade.

A esses postulados acrescenta-se mais uma norma: apenas


protenas do tipo carreador so capazes de realizar transporte ativo.
Este mantm um desequilbrio dinmico entre os meios intracelular
e extracelular, especialmente com relao aos ons. Enquanto a abertura
dos canais inicos tende a uniformizar a distribuio intra e extracelular
de nions e ctions, alm de aumentar a tonicidade do ambiente
intracelular, a expulso seletiva de ons por transporte ativo traz duas
conseqncias:
1. equilbrio da tonicidade do meio intracelular, impedindo a
absoro excessiva de gua por osmose (controle do volume
celular) (Figura 12.3);

Figura 12.3: Devido presena


de ons, protenas, acares e
outras molculas em soluo
no citoplasma, alm do espao
ocupado pelas organelas, sua
concentrao sempre maior
que a do meio extracelular.
Por isso mesmo, h uma
natural tendncia de que as
clulas absorvam gua por
osmose. A absoro excessiva
de gua evitada por vrios
mecanismos: (a) a presena de
uma parede celular semi-rgida
nos vegetais, (b) vacolos
contrteis em protozorios e
(c) a expulso ativa de ons nas
clulas eucariontes em geral.

CEDERJ 141

Biologia Celular I | Transporte ativo


2. estabelecimento de uma distribuio diferenciada de ons
(gradiente) entre os meios intra e extracelular.
Numa clula tpica em repouso, a quantidade de Na+ intracelular
10 a 30 vezes menor do que no meio extracelular, enquanto a quantidade
de K+ cerca de 30 vezes maior no meio intracelular que no meio
extracelular. Considerando, alm desses ctions majoritrios, outros
ons como Cl-, Mg++, Ca++ e PO4--,o ambiente intracelular negativo em
relao ao meio extracelular (Figura 12.4).

Figura 12.4: Numa membrana em repouso,


h mais ctions no lado extracelular que no
citoplasma. Portanto, o meio externo positivo
em relao ao meio interno.

Devido a essa distribuio diferenciada de cargas, dizemos


que a membrana plasmtica polarizada. Dizemos que a membrana
est em repouso enquanto for mantida essa polaridade (positiva fora,
negativa dentro) (Figura 12.5A). Quando os canais forem abertos e o
citoplasma for invadido por ons, estar ocorrendo uma despolarizao
da membrana (Figura 12.5B). A despolarizao sinaliza uma alterao
no estado funcional da clula. Por exemplo, se for uma clula muscular, a
conseqncia dessa mudana de sinal ser a contrao muscular. No caso
de uma glndula, pode ser esse o sinal para a secreo de um hormnio,
e assim por diante.
Meio extracelular
Figura 12.5: (a) A diferena na distribuio de ons
entre os lados intra extracelular da membrana
cria um potencial de membrana onde o interior
negativo em relao ao exterior.
(b) Quando se abrem os canais inicos, os ons movem-se
a favor de seu gradiente eletroqumico, invertendo
a distribuio de cargas entre os dois lados da
membrana.

142 CEDERJ

Meio intracelular

12 MDULO 2

Quando um determinado estmulo leva abertura de canais inicos


para Na+ e K+, a rpida entrada no citoplasma de uma grande quantidade

AULA

de ons Na+ e a evaso de uma quantidade tambm considervel de ons


K+ para fora da clula provocam a despolarizao. Como no balano
final a entrada de ctions maior que a sada, o meio interno se torna
positivo em relao ao meio externo.
At este ponto, descrevemos eventos que dependem apenas da
abertura de canais, isto , transporte passivo. O papel do transporte ativo
ser fazer com que a clula retorne ao estado de repouso, ou seja, refazer
a distribuio dos ons de modo que o meio intracelular seja negativo
em relao ao meio extracelular, mesmo que isso signifique deslocar ons
do compartimento onde eles esto em menor concentrao para outro
onde sua concentrao seja maior. A repolarizao (retorno ao estado
polarizado) da membrana feita por um sistema de transporte ativo
chamado de bomba de sdio/potssio.

D uma paradinha:
O transporte ativo, energeticamente falando, sempre
feito ladeira acima. Isto , enquanto para descarregar um
caminho de areia basta erguer a caamba e despejar o
contedo, para ench-lo sero necessrios vrios operrios
com ps.

Outra boa comparao seria um escorregador: descer


por ele no requer nenhum esforo; j a subida...

CEDERJ 143

Biologia Celular I | Transporte ativo

A BOMBA DE SDIO/POTSSIO
A bomba de Na+/K+ um dos sistemas de transporte ativo mais
estudados e mais bem conhecidos. A Figura 12.6 resume suas principais
caractersticas funcionais.

Meio Intracelular

Figura12.6: A bomba de Na+/K+ um complexo protico formado por duas


subunidades. Na maior delas esto o stio cataltico (intracelular)
onde ocorre a hidrlise do ATP e os locais por onde passam os
ons Na+ (para o meio externo) e K+ (para o meio intracelular).
Para cada 3Na+ que saem, entram 2K+ e uma molcula de ATP
hidrolisada a ADP e Pi.

A energia de cada molcula de ATP que hidrolisada a ADP


e Pi (fosfato inorgnico) utilizada para bombear trs ons Na+ para
fora da clula e dois ons K+ para dentro. Acredita-se que o processo
envolva inicialmente a ligao do Na+ pelo lado interno da subunidade
do complexo protico, seguida da hidrlise do ATP. A energia resultante
provoca uma mudana na forma dessa subunidade que resulta: (a) na
liberao do Na+ no lado externo da membrana, (b) na ligao do K+
tambm pelo lado extracelular. A ligao do K+ subunidade leva
liberao do Pi. Sem o Pi, a subunidade novamente muda de conformao,
levando liberao do K+ no citoplasma e ao reincio do processo.
A Figura 12.7 ilustra as principais etapas desse ciclo.

144 CEDERJ

12 MDULO 2
AULA

Figura12.7: O funcionamento da bomba de sdio/potssio decorre de mudanas na forma do complexo


protico que a constitui. (1) Inicialmente se ligam 3 ons Na+ pelo lado citoplasmtico da membrana
(apenas um est representado). (2) Nesse ponto, ocorre a hidrlise do ATP em ADP e Pi de alta energia.
(3) Essa energia ser utilizada em nova mudana de forma da molcula e conseqente expulso
do Na+ . (4) A seguir, ligam-se pelo lado externo dois on K+ (apenas um est representado). Essa (5) nova
ligao induz a liberao do Pi, cuja energia j foi gasta, e nova mudana de conformao da
molcula para o estado inicial, quando poder se ligar a novos ons Na+ e reiniciar o ciclo.

Repare que cada etapa leva a uma mudana conformacional da


protena transportadora que dispara a etapa seguinte. Se o ciclo for
interrompido em algum ponto, todo o mecanismo de bombeamento
ficar bloqueado. o que acontece com a ouabana, uma droga extrada
de uma planta africana. Seu efeito txico consiste justamente em ligar-se
ao local normalmente ocupado pelo K+ na molcula. Sob seu efeito,
a bomba de Na+/K+ paralisada.

As sinistras protenas MDR


Certos transportadores ativos so especializados em expulsar ativamente
substncias txicas para as clulas. Essas protenas continuam presentes
em clulas que se tornam cancerosas. Aps algum tempo, as clulas
malignas aprendem a reconhecer e expulsar os remdios que so usados
na quimioterapia, fazendo com que o tratamento no funcione, mesmo
se a dosagem das drogas for aumentada. Essas protenas so chamadas de
protenas de multirresistncia a drogas, ou MDR (do nome em ingls). Esse
tipo de transporte ativo (gasta ATP!) tambm se desenvolve em parasitas
como o Plasmdio, causador da malria, que j possui vrias cepas
resistentes aos remdios utilizados no tratamento da doena.

CEDERJ 145

Biologia Celular I | Transporte ativo

UNIPORTE, SIMPORTE, ANTIPORTE


A bomba de Na+/K+ uma protena carreadora atravs da qual
passam, em sentidos opostos, dois ons diferentes (o sdio e o potssio). J
o transportador de glicose, tambm uma protena carreadora, transporta
apenas um tipo molecular. Essas caractersticas levaram ao agrupamento
das protenas carreadoras em trs grupos: as que fazem uniporte, as que
fazem simporte e as do grupo antiporte (Figura 12.8).
As protenas uniporte transportam apenas um tipo de molcula.
o caso do transportador de glicose presente na membrana da maioria
das clulas.
Na superfcie voltada para a luz, as clulas do epitlio intestinal
possuem uma protena transportadora de glicose que carreia simultaneamente
ons sdio. Chama-se a isso simporte ou co-transporte. Veja no boxe da
pgina 145 as vantagens desse tipo de transporte para a clula. J na bomba
de Na+/K+ tambm ocorre a passagem de duas molculas distintas, mas em
sentidos opostos. A isso chamamos antiporte.
Figura12.8: Alguns carreadores levam
apenas um tipo de molcula (uniporte);
outros realizam o transporte de duas
espcies moleculares diferentes, que pode
ser no mesmo sentido (simporte) ou em
opostos (antiporte).

DIFUSO FACILITADA OU TRANSPORTE ATIVO


SECUNDRIO
O alimento que ingerimos absorvido pelas clulas que revestem
o intestino delgado o epitlio intestinal (Figura 12.9). Durante a
digesto, essas clulas devem absorver grandes quantidades de glicose
da luz intestinal e distribu-la pelo resto do organismo. Essa absoro
feita por um mecanismo de simporte entre sdio e glicose. Esse tipo
de transporte existe apenas na superfcie apical das clulas e fora que a

146 CEDERJ

12 MDULO 2

glicose seja sempre transportada da luz para o citoplasma, pois devido


ao da bomba de Na+/K+ o gradiente de concentrao do sdio sempre

AULA

muito maior no meio externo, favorecendo sua entrada na clula juntamente


com a glicose. Esse tipo de transporte chamado de difuso facilitada ou
transporte ativo secundrio, pois embora no dependa diretamente de ATP
e obedea ao gradiente de concentrao do Na+, depende do funcionamento
da bomba de Na+/K+, um transportador ativo. Esse mecanismo impede que
as clulas intestinais percam glicose em direo luz intestinal nos perodos
de jejum. Essa situao j foi comentada quando estudamos os domnios de
membrana (Aula 8). A clula do epitlio intestinal possui ento dois domnios:
o apical, onde existem as microvilosidades e o co-transportador de sdio e glicose
e o domnio basolateral, onde o transportador de glicose do tipo uniporte.

Figura12.9: A existncia de dois transportadores diferentes para a glicose no


epitlio intestinal tanto impede a concentrao excessiva de glicose nessas
clulas durante a fase de absoro da luz intestinal quanto a perda de glicose
para a luz intestinal nos perodos de jejum. Nessa fase, a clula estar recebendo
glicose pelos transportadores uniporte do domnio basolateral. Assim,
a concentrao citoplasmtica de glicose nessas clulas ser sempre superior
do meio extracelular, como indica o sombreado da seta direita.

CEDERJ 147

Biologia Celular I | Transporte ativo

TRANSPORTE INTRACELULAR E TRANSPORTE TRANSCELULAR


A maior parte da glicose (e de todos os nutrientes) que as clulas
do epitlio intestinal absorvem apenas atravessa essas clulas a caminho
da circulao. Esse fenmeno chamado de transporte transcelular.
Alm desse, temos o transporte intracelular, quando molculas so
levadas de um compartimento celular para outro (do ncleo para o
citosol, por exemplo) e o transporte celular propriamente dito, em que
as molculas so transportadas para dentro ou para fora das clulas
atravs da bicamada ou das protenas de membrana.
Difuso simples

Cotransporte

!
A receita de soro caseiro
(1 colher de ch de sal e 1
colher de sopa de acar em
1 litro de gua), utilizada para
reidratao oral de pessoas
com diarria, se baseia no
simporte de Na+ e glicose
que ocorre no intestino. A
absoro do Na+ (do cloreto de
sdio) e da glicose derivada do
acar aumenta a tonicidade
do citoplasma das clulas
intestinais, fazendo com que
a gua seja absorvida por
osmose.

OUTROS TIPOS DE TRANSPORTE ATIVO


Embora o sistema da bomba de Na+/K+ seja o mais conhecido e
mais bem estudado, muitos outros sistemas de transporte ativo mantm
o saudvel desequilbrio entre os diferentes compartimentos intra
e extracelulares.
1. Nas membranas do retculo endoplasmtico liso, um
transportador ativo de Ca++ bombeia esse ction do citoplasma para o
interior do retculo. O Ca++ dispara vrios eventos celulares, como por
exemplo a contrao muscular. Para que o msculo volte ao estado de
relaxamento, necessrio que todo o Ca++ seja recolhido novamente ao
retculo, caso contrrio o msculo permanecer contrado, fenmeno
conhecido por tetania.
2. Em vrios microorganismos e bactrias existe uma bomba de
prtons, as H+ ATPases, ou prton-ATPases. Elas funcionam como a
bomba de Na+/K+, expulsando ons H+ (prtons) s custas de ATP.

148 CEDERJ

12 MDULO 2

Em compensao, quando os H+ acumulados em um dos lados da


membrana retornam, passando por uma protena especfica, ocorre a

AULA

sntese de ATP para a bactria.


3. As protenas de multirresistncia a drogas, j comentadas
anteriormente, fazem parte de uma grande famlia de transportadores
ativos, as protenas ABC (de ATP Binding Cassete, uma sequncia
de aminocidos presente nas protenas dessa famlia que se ligam ao
ATP, necessrio para que o transporte atravs delas seja realizado).
As protenas dessa famlia atuam tanto no transporte de ons como de
pequenas molculas, participando de processos de detoxificao por
vrias drogas de natureza lipdica.
A importncia dos transportadores ABC pode ser bem avaliada no
caso da fibrose cstica, uma anomalia gentica relativamente comum. Nos

portadores dessa doena o gene que codifica um transportador de Cl


defeituoso, ou inexistente, acarretando profundos desbalanceamentos no
equilbrio hdrico e eletroltico do indivduo. Esses sintomas se manifestam
como alta concentrao de sal no suor, alta viscosidade do muco que reveste
as vias respiratrias, ocasionando obstruo delas, e muitos outros que
diminuem a qualidade e a expectativa de vida dos afetados.

OUTROS TIPOS DE ANTIPORTE


Nem todo antiporte feito com gasto de energia. A manuteno
do pH timo nos diversos compartimentos celulares depende de alguns
mecanismos de antiporte que funcionam a favor do gradiente de
concentrao. Muitas clulas possuem em sua membrana plasmtica
uma protena antiporte que regula o pH citoplasmtico da seguinte
forma: o pH citoplasmtico deve permanecer em torno de 7,0; assim,
se o aumento da concentrao de H+ levar queda do pH, este ser
trocado por Na+, sempre muito abundante no meio extracelular por
conta da bomba de Na+/K+.
Um sistema antiporte tambm aumenta a eficincia do transporte
do CO2 retirado das clulas pelas hemcias. Ao difundir-se para dentro
das hemcias, o CO2 convertido em HCO3-- (on bicarbonato). Nessa

forma ele mais solvel no sangue que o CO2 e trocado por Cl pelo
antitransportador aninico presente na membrana das hemcias,
chamado de banda 3. Assim, uma quantidade muito maior de CO2
pode ser transportada livre no sangue (na forma de bicarbonato) e no
apenas no interior das hemcias (Figura 12.10).
CEDERJ 149

Biologia Celular I | Transporte ativo


Figura 12.10: O CO2 produzido pelos tecidos passa
por difuso simples para o
interior das hemcias (a).
Na hemcia (b) o CO2 se
transforma em HCO3- (on
bicarbonato) e trocado
por CL- atravs da protena
antiporte banda 3.
b

RESUMO
A bicamada lipdica das membranas celulares altamente impermevel
maioria das molculas hidrossolveis e a todos os ons. A transferncia de
nutrientes, metablitos e ons atravs da membrana plasmtica e membranas
intracelulares feita atravs de protenas transportadoras.
As membranas celulares contm vrias protenas transportadoras, cada uma das
quais responsvel pela transferncia de um soluto especfico atravs da membrana.
Existem duas classes de protenas transportadoras: carreadoras e canais.
O gradiente eletroqumico representa a fora direcional de um on resultante
de seu gradiente de concentrao e do campo eltrico.
No transporte passivo, um soluto no carregado move-se a favor do gradiente
de concentrao, do lado em que est mais concentrado para o lado em que
est menos concentrado, enquanto um soluto carregado move-se a favor de seu
gradiente eletroqumico.
No transporte ativo, um soluto no carregado move-se contra o gradiente de
concentrao; um soluto carregado move-se contra o gradiente eletroqumico;
esse processo requer energia.
As protenas carreadoras ligam-se a solutos especficos (ons inorgnicos,
pequenas molculas orgnicas ou ambos), fazendo com que atravessem a
membrana atravs de mudanas em sua conformao que expem o stio de
ligao do soluto a um lado da membrana e a seguir ao outro.
As protenas carreadoras podem agir como bombas para transportar o soluto
ladeira acima, contra o gradiente eletroqumico, utilizando energia derivada
da hidrlise de ATP, pelo fluxo de ons como Na+ e H+, ou pela luz.
A bomba de Na+/K+ da membrana de clulas animais uma ATPase que
transporta ativamente Na+ para fora da clula e K+ para dentro, mantendo
um gradiente de Na+ atravs da membrana que utilizado para promover o
transporte de outras molculas e para transmitir sinais eltricos.

150 CEDERJ

pode ser ativo ou passivo, o transporte atravs dos canais sempre passivo.
A maior parte das protenas do tipo canal de canais inicos seletivos que
permitem a passagem de ons inorgnicos especficos de acordo com seu tamanho
e carga. O transporte atravs desses canais pelo menos 1.000 vezes mais veloz
que o transporte atravs de qualquer carreador conhecido.
A maior parte dos canais inicos s se abre sob determinados estmulos, como
a alterao do potencial de membrana (ativados por voltagem) ou a ligao de
uma molcula especfica (ativados por ligante).

EXERCCIOS
1. Marque certo ou errado e justifique:
a) A membrana plasmtica impermevel a molculas carregadas. ( )
b) Protenas canal ligam-se aos solutos que vo transportar. ( )
c) Apenas o transporte passivo capaz de manter o equilbrio celular. ( )
d) O transporte atravs de carreadores mais rpido que atravs de canais ( )
e) Simporte e antiporte so a mesma coisa. ( )
2. Comente a frase a seguir: Podemos comparar o transporte atravs de um canal
ao de um carreador a encher uma garrafa com gros de feijo usando um funil
ou uma colher.
3. Por que alguns autores chamam o simporte de Na+ e glicose atravs da membrana
de transporte ativo secundrio se no h consumo de ATP no processo?
4. O que so aquaporinas? Qual sua importncia nos dutos coletores das clulas
renais?
5. Releia o texto. Enumere os tipos de transportadores de Na+ citados e o sentido de
sua atividade.
6. Comente a frase: Dizer que a membrana dotada de permeabilidade seletiva
dizer que atravs dela s passam as molculas de que a clula necessita.
CEDERJ 151

12 MDULO 2

onde os solutos podem se difundir. Enquanto o transporte pelas protenas carreadoras

AULA

As protenas do tipo canal formam poros aquosos atravs da bicamada lipdica, por

Gabarito

Biologia Celular I

Mdulo 1 - Aula 1
1.

ocular

objetiva

aumento final

5x

40x

200X

10x

20x

200X

20x

10x

200X

10x

100x

1000X

2. As clulas recebem este nome porque o que Hooke descreveu foram as paredes
celulares remanescentes onde antes haviam estado clulas que morreram, deixando
lacunas semelhantes s celas dos monges.
3. Comparao do microscpio de Hooke (Figura 1.1) com o modelo atual (Figura 1.4),
identificando as partes anlogas.
ocular
macromtrico
micromtrico
revlver
objetivas
amostra
platina
condensadora
fonte de luz

4. A importncia de cada um dos componentes para observao ao microscpio


ptico: fonte de luz: atravessar a amostra, formando uma imagem na retina do
observador; lente condensadora: concentrar a luz, aumentando a intensidade do
feixe; espessura e contrasteda amostra: quanto mais espessa a amostra, maior o
contrastel, mas menor a visibilidade de detalhes.
5. Podemos observar clulas vivas e sem adio corantes tanto no contraste de
fase quanto no contraste interferencial.
154 CEDERJ

6. No microscpio de fluorescncia a amostra tratada com um corante fluorescente


e iluminada com uma fonte de luz ultravioleta, capaz de fazer com que apenas as
reas onde o corante se fixou apaream na imagem.
7. Limite de resoluo a menor distncia em que dois pontos so distinguveis
como individuais. O limite da resoluo do microscpio ptico de 0,2 m.
8. Uma hemcia mede 8 m. Quando observada sob o aumento total de 1.000
vezes, medir 8.000 m=8x103 m = 8 mm = 0,8 cm
9. O ncleo a nica estrutura claramente visvel dentro de uma clula observada
ao microscpio ptico devido a seu tamanho, localizao e porque as outras
estruturas ou so muito pequenas ou aparecem apenas como tbulos ou vesculas
dentro da clula.
10.

5 m = 5.000.nm
0,5 mm= 500 m
100m = 100.000 nm
1.000m= 1 mm
60 nm= 0,06 m

11. Uma clula foi fotografada com 2.000x de aumento no microscpio ptico.
Uma estrutura que tenha na realidade 2 m aparecer na foto com 4.000 m =
4 mm = 0,4 cm.
12.

A. Campo claro, amostra corada de esfregao sanguneo.


B. Cromossomos em microscopia de fluorescncia.
C. Corte de pele, microscopia de campo claro.
D. Contraste interferencial de Nomarski, epitlio da mucosa bucal.
E. Fluorescncia: ncleo em azul, citoesqueleto em verde.
F. Clulas do epitlio vaginal coradas pelo mtodo de Papanicolau. Campo claro.

CEDERJ 155

Mdulo 1 - Aula 2
1. a menor distncia em que dois pontos podem ser definidos como distintos.
2. 104 x 102 x 109 m= 104+2-9m= 10-3 m = 1 mm
10.000 = 104

104 x 102 x 10 9 m= 104+2-9m= 10-3 m = 1 mm


100 nm = 102 x 10 m
9

Resposta: 1 milmetro
3- 30 m = 30 x 10 4 cm
9/30 x 10 4= 3 x 103= 3.000
Resposta: 3000 vezes. Obs.: em geral esse o aumento inicial para observao
ao microscpio de transmisso. Uma vez localizada a rea de interesse usamos
aumentos bem maiores.
4.
Microscpio ptico

Microscpio eletrnico

Poder de resoluo

2 m

2 nm

Lentes

De vidro

Eletromagnticas

Emisso do filamento

Luz visvel

Eltrons (radiao novisvel)

5. A formao da imagem no microscpio de transmisso se d sobre uma tela


fluorescente. Nos pontos em que os eltrons foram barrados pelos tomos da
amostra a imagem escura, enquanto os eltrons no barrados incidem sobre
a tela fornecem reas claras. tomos de elementos mais leves tendem a deixar
passar mais eltrons e elementos mais pesados tendem a barrar mais eltrons.
6. Para que os eltrons no sejam barrados ou desviados por molculas de
ar (O2, CO2, H2 O vapor) na coluna. O oxignio tambm causaria a combusto
do filamento.
7. Fixao: para estabilizar a forma e estrutura qumica
Desidratao: para remover a gua e substitu-la por um solvente orgnico (acetona
ou etanol)

156 CEDERJ

Incluso: substituio do solvente orgnico por resina


Ultramicrotomia: cortes ultrafinos na resina endurecida contendo fatias das
clulas.
Contrastao: impregnao com metais pesados (urnio, chumbo) para aumentar
o contraste das estruturas celulares, especialmente membranas.

8. No microscpio eletrnico de varredura as imagens so tridimensionais. O


feixe de eltrons varre a superfcie da amostra gerando um sinal para um
monitor de TV.
9. Unidade de membrana, ribossomas, organelas em geral, cromatina,
estruturas intracelulares.
10. Superfcie celular, pseudpodes, exoesqueleto de artrpodes, superfcie de
folhas, dentes, conchas e outras estruturas mineralizadas.

Mdulo 1 - Aula 3
1.
Fixao: manter a estrutura geral da clula
Infiltrao com glicerol: o glicerol impede a formao de cristais de gelo durante
o congelamento. Os cristais perfurariam e destruiriam a clula
Fratura: feita a baixa temperatura e sob vcuo, expe as superfcie das membranas
plasmtica e das organelas intracelulares.
Evaporao com platina: feita em ngulo de 45o visa criar reas sombreadas
segundo o relevo das protenas de membrana e estruturas celulares.
Evaporao com carbono: feita homogeneamente por toda a rplica, cria uma
base, sendo o carbono transparente ao feixe de eltrons.
Limpeza da rplica: feita com cidos ou bases fortes. Remove restos celulares
que estejam grudados na rplica.
Lavagem: feita com gua. Depois dela a rplica recolhida sobre uma grade e
levada ao microscpio eletrnico de transmisso.

CEDERJ 157

2. O plano mdio, isto , aquele para onde convergem as caudas hidrofbicas


dos fosfolipdeos.
3. s protenas integrais da membrana.
4. Mostrou que as protenas se inserem na bicamada lipdica, podendo ser de
diferentes tamanhos e estar distribudas aleatoriamente (ao acaso) ou formando
arranjos como linhas paralelas, crculos, aglomerados, etc. Da a comparao a
um mosaico.

Mdulo 1 - Aula 4
1. As clulas, para serem mantidas em cultura, devem estar em ambiente estril, a
temperatura, presso e pH dentro de uma faixa que permita sua sobrevivncia e
multiplicao. O meio de cultura deve conter ainda todos os nutrientes necessrios
(protenas, acares, lipdeos, sais minerais) e fatores de crescimento, como
vitaminas e hormnios.
2. Cultivar in vitro consiste em retirar clulas de um organismo e faz-las sobreviver
em um recipiente como uma placa de Petri, tubo de ensaio ou outros. Algumas
clulas se multiplicam in vitro, outras apenas sobrevivem e se diferenciam,
geralmente aderindo s paredes do vidro ou plstico do recipiente. In vivo
consiste em manter clulas dentro de um organismo, que ser seu hospedeiro.
Alguns protozorios parasitas, como o Toxoplasma gondii, so normalmente
mantidos em camundongos, j que morrem rapidamente se no penetrarem em
outras clulas. Alguns heterocrions formam tumores que secretam anticorpos
de interesse para os pesquisadores. Esses tumores tambm so mantidos por
passagem entre animais.
3. uma cultura inicial, obtida a partir de clulas extradas de um animal.
4. Tanto a clula tumoral quanto a transformada podem se multiplicar indefinidamente;
entretanto, a clula transformada guarda as caractersticas do tipo celular que lhe deu
origem (e.g., a cultura de clulas epiteliais transformadas forma uma camada com as
clulas unindo-se entre si, como num epitlio normal), enquanto a clula cancerosa
cresce desorganizadamente, formando grumos ou massas.
5. uma clula formada pela fuso de dois tipos celulares diferentes. Seu
ncleo rene o DNA das duas clulas originais e ela se comporta combinando
caractersticas das duas clulas originais.
158 CEDERJ

6. C, pois com a alta taxa de multiplicao ser mais rpida a obteno de grandes
quantidades da protena secretada.
7. So clulas pluripotentes, que ao se multiplicar podem dar origem a todos os
tipos celulares que constituem um organismo.

Mdulo 1 - Aula 5
1. Porque depois de rompidas as clulas impossvel saber de que tipo celular
vieram as organelas.
2. Choque osmtico, choque trmico, macerao, sonicao e tratamento com
detergente no inico.
3. Por centrifugao diferencial, que consiste em centrifugar o homogeneizado
usando velocidades e tempos de centrifugao progressivamente maiores para
colocar no pellet organelas cada vez menos densas.
4. a centrifugao de uma amostra sobre vrias camadas de solues de uma
substncia inerte (geralmente sacarose) que tenham concentraes e, portanto,
densidades cada vez maiores. Assim a amostra que est sendo centrifugada vai
encontrar cada vez mais resistncia at que a soluo numa certa regio do tubo
tem densidade igual da amostra, que pra de migrar para o fundo, formando
uma banda que pode ser recolhida.
5. Na cromatografia de partio pequenas molculas como fosfolipdeos, lipdeos
neutros ou aminocidos livres so separados conforme seu grau de polaridade
ou apolaridade.
6. Na cromatografia de filtrao em gel ou peneira molecular, protenas e
glicoprotenas podem separadas conforme sua massa molecular.
7. Na cromatografia de troca inica as molculas so separadas conforme sua carga.
8. Na cromatografia de afinidade uma molcula pode ser separada de uma mistura
por sua ligao especfica com outra molcula, geralmente um anticorpo, que foi
acoplado resina.

CEDERJ 159

9. A eletroforese usa um campo eltrico para separar cidos nuclicos ou protenas,


que foram previamente desnaturadas e tratadas com SDS, conforme sua massa
molecular. A massa molecular de uma certa protena da amostra pode ser feito por
comparao com padres colocados na mesma corrida eletrofortica. A eletroforese
serve tambm para acompanhar a purificao de uma protena, porque permite
observar quantas protenas diferentes esto presentes numa amostra.
10. Na tcnica de Western blot protenas j separadas por eletroforese podem ser
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, ficando acessveis incubao
com anticorpos ou outros ligantes especficos. Assim, possvel mostrar que uma
certa protena est presente numa amostra porque um anticorpo especfico a
reconheceu. Ou mostrar que o soro de um paciente reconhece antgenos de um
parasito, portanto ele j teve contato com o parasito.

Mdulo 1 - Aula 6
1. So protenas sintetizadas pelos linfcitos B que se ligam a molculas ou
organismos estranhos a um dado indivduo.
2. Como cada molcula de anticorpo possui dois stios de ligao para cada
antgeno, possvel a formao de ligaes cruzadas, ou seja, um dos braos da
molcula de anticorpo se liga a um antgeno e o outro a outro antgeno (veja
esquema).
3. Defina:
Anticorpos policlonais Reconhecem vrias pores diferentes de um antgeno e
resultam da produo de vrias linhagens de linfcitos B. Pode-se dizer que so
uma mistura de anticorpos diferentes que reconhecem molculas de um mesmo
organismo. (veja Figura 6.4).
Anticorpo monoclonal- Reconhece uma determinada seqncia antignica e deriva
de uma nica linhagem clonal de um linfcito B.
Soro imune o soro extrado um animal previamente inoculado com determinados
antgenos, por exemplo, o soro antiofdico e o soro anti-rbico.
Hibridoma o resultado da fuso de uma clula tumoral (da o sufixo oma) com
um linfcito B. O resultado uma clula que se multiplica indefinidamente, como
a clula tumoral, e que secreta continuamente anticorpos, como o linfcito B.

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4. Associaes de anticorpos e molculas.


Microscopia ptica - fluorocromos (fluorescena, rodamina) ou enzimas
(peroxidase, fosfatase alcalina).
Microscopia eletrnica partculas de ouro coloidal.
5. So protenas ou glicoprotenas derivadas de animais ou plantas que
reconhecem (se ligam) seqncias especficas de acares presentes na superfcie
de clulas.

Mdulo 2 - Aula 7
Exerccio inicial
1. [as estruturas intracelulares como ncleo, mitocndrias, retculo endoplasmtico,
complexo de Golgi e vacolos].
2. [protenas] [lipdeos] e [carboidratos ou glicdeos].
3. [fosfolipdeo] [bicamada].
4. [hidroflica] [hidrofbica] [anfipticas].
5. [fora] [dentro]. [entre as molculas de lipdeos] [se ligam a protenas ou lipdeos
da membrana apenas no lado extracelular dela]
Exerccio final
1. A membrana formada por uma bicamada lipdica onde se inserem mais ou
menos profundamente as protenas. Os lipdeos da bicamada so anfipticos e
as cabeas polares ficam voltadas para o exterior, enquanto as caudas apolares
ficam voltadas para o interior da bicamada.
2. Meio intracelular tudo que fica da membrana plasmtica para dentro da
clula. Meio extracelular o que fica da membrana plasmtica para fora. Os
compartimentos delimitados por retculo endoplasmtico, complexo de Golgi e
o interior de organelas e
vacolos tambm so considerados como meio extracelular, j que tambm ficam
separados do citoplasma por uma membrana.

CEDERJ 161

3. qualquer espao limitado por uma membrana contnua e separado do meio


externo ou do citosol. A mitocndria, por exemplo, possui duas membranas e
dois compartimentos, o intermembranas e a matriz mitocondrial, separados pela
membrana mitocondrial interna.
4. Numa bicamada onde as cabeas polares ficam voltadas para o exterior,
enquanto as caudas apolares ficam voltadas para o interior da bicamada.
5. Eles podem se deslocar livremente no plano da membrana.
6. As caudas hidrofbicas dos cidos graxos podem oscilar, os fosfolipdeos podem
realizar movimentos de rotao em torno de seu prprio eixo e de translao no
plano do folheto em que esto inseridos.
7) quando um fosfolipdeo muda de folheto na bicamada. Esse um evento raro
que necessita de enzimas especficas, as flipases, para ocorrer.
8. a- Quanto mais curtas as cadeias de cidos graxos, mais fluida a membrana.
b- Quanto mais fosfolipdeos com cadeias insaturadas, mais fluida a
membrana.
9. O colesterol uma molcula pequena e muito rgida por conta dos anis
aromticos. Pelo seu tamanho, ela se insere entre as molculas de fosfolipdeo,
diminuindo o espao disponvel para os movimentos deles.
10. A composio das membranas varia com relao quantidade de cada
tipo de fosfolipdeo. Alm disso, alguns fosfolipdeos nunca so flipados s
estando presentes em um dos folhetos da bicamada lipdica. Fosfatidilcolina e
a esfingomielina se distribuem apenas na camada voltada para o meio externo,
enquanto a fosfatidilserina e a fosfatidiletanolamina se localizam apenas na
camada interna.
11. Algumas regies so compostas por lipdeos de menor fluidez que permanecem
agregados, formando domnios com funes especficas. Quando esses domnios
ocorrem em invaginaes da membrana, so chamados cavolas.
12. So regies da membrana em que se acumulam cidos graxos de cadeias
mais longas e colesterol, formando regies menos fluidas, onde a espessura da
bicamada maior e em que apenas protenas com determinada expanso das
alfa hlices podem inserir-se.

162 CEDERJ

Mdulo 2 - Aula 8
1. Porque a tcnica separa os dois folhetos da bicamada lipdica, expondo
protuberncias que correspondem s protenas transmembrana.
2.
protena transmembrana: aquela que atravessa a bicamada lipdica.
protena perifrica: aquela que se liga de modo no covalente a lipdeos ou
a protenas transmembrana.
protena ancorada: um tipo de protena integral que se insere na bicamada
por uma poro lipdica qual se liga por uma seqncia de acares.
alfa-hlice protica e fita beta-pregueada. Os aminocidos da cadeia polipeptdica
podem atravessar a bicamada lipdica (hidrofbica), enrolando-se numa hlice
onde os aminocidos hidroflicos fiquem voltados para o interior da hlice e os
hidrofbicos para o exterior. Esse o caso da alfa-hlice. Na fita beta-pregueada, os
aminocidos formam arranjos mais lineares e rgidos, que atravessam a bicamada
lipdica, formando um barril.
protena unipasso: so aquelas cuja cadeia polipeptdica atravessa a bicamada
apenas uma vez.
protena multipasso: so aquelas cuja cadeia polipeptdica vai e vem atravs da
membrana vrias vezes.
Porinas - so protenas do tipo barril, que formam poros aquosos em algumas
membranas, como a membrana externa das mitocndrias.
complexo protico: quando dois ou mais polipeptdeos de membrana, iguais
ou diferentes, se associam para constituir um complexo funcional.
3. Podem se deslocar lateralmente na bicamada lipdica e rodar em torno de seu eixo.
4. uma clula formada pela fuso do citoplasma e dos ncleos de duas outras,
diferentes entre si.
5. So reas da membrana onde se concentram protenas e, conseqentemente,
funes especficas.

CEDERJ 163

6. So mecanismos que impedem o livre fluxo de protenas no plano da membrana.


Podem ser associaes de protenas em complexos de membrana ou associaes
com elementos do citoesqueleto ou do meio extracelular ou mesmo regies de
adeso entre duas clulas vizinhas que impedem a passagem de protenas da face
apical da membrana para a superfcie basolateral e vice-versa.
7. Sempre se ligam a protenas ou lipdeos da membrana formando, respectivamente
glicoprotenas e glicolipdeos.
8. a camada de resduos de cadeias de acares que reveste as clulas.
9. As proteoglicanas so molculas muito grandes nas quais um grande nmero
de cadeias de acar se liga a uma cadeia protica. So caractersticas do meio
extracelular, especialmente no tecido conjuntivo. As glicoprotenas so protenas
nas quais a parte protica a principal e possui acopladas a ela cadeias de
acares.
10. Por causa da sua via de biossntese, no retculo endoplasmtico e no complexo
de Golgi. Os acares so adicionados voltados para o interior dos elementos do
Golgi e, quando as vesculas que dali brotam se fundem membrana, os acares
ficam voltados para fora.

Mdulo 2 - Aula 12
1.
a) Correto, molculas com carga (ons) formam em volta de si uma camada de
solvatao de molculas de gua incompatvel com o carter hidrofbico da
bicamada lipdica da membrana.
b) Errado, apenas carreadores ligam-se temporariamente aos solutos que
transportam. Por isso mesmo, poucas molculas so transportadas por vez.
c) Errado, a clula depende de uma instabilidade dinmica que sinalize estados
de atividade e repouso.
d) Errado, os solutos passam em grande quantidade e velocidade atravs dos canais
numa velocidade 1.000 vezes superior ao transporte atravs de carreadores.
e) Errado, alm de o antiporte ser uma troca de molculas entre dois compartimentos,
o simporte o transporte necessariamente conjunto de um on e uma segunda
espcie molecular, por exemplo a glicose, sempre no mesmo sentido.
164 CEDERJ

2. A frase uma boa analogia. Enquanto um enorme nmero de gros passa


pelo funil em poucos segundos, levaramos muito mais tempo para colocar igual
quantidade de gros usando uma colher. Cada gro deve estar na colher, enquanto
nem todos os gros entraro em contato com as bordas do funil.
3. Porque, para que ele ocorra, necessrio que a bomba de Na+/K+ esteja mantendo
maior a concentrao de sdio no meio extracelular. Do contrrio, a clula poderia at
perder glicose para o meio externo.
4. Aquaporinas so protenas transportadoras de gua encontradas nas membranas
de vrias clulas animais. Nos dutos das clulas coletoras essas protenas aceleram a
reabsoro da gua perdida durante a filtrao do sangue, impedindo a excessiva
diluio da urina e a perda de gua do organismo.
5. O sdio pode ser transportado a favor do gradiente de concentrao (transporte
passivo) por canais inicos e tambm no co-transporte de sdio e glicose. O
transporte ativo de sdio (contra o gradiente e com gasto de energia) feito
pela bomba de sdio/potssio. No caso do sdio, a favor do gradiente quer dizer
para dentro da clula; e contra o gradiente, para fora da clula.
6. A frase est incorreta. A permeabilidade seletiva se refere aos diferentes
graus de afinidade que as molculas que formam a bicamada lipdica possuem
pelas molculas dos meios intra e extracelular. A bicamada permevel a vrias
substncias txicas que sejam solveis em lipdeos (metanol, benzeno), enquanto
substncias boas como a glicose s passam atravs de protenas especficas da
membrana, pois ela no permevel a molculas hidroflicas como a glicose.

CEDERJ 165

Servio grfico realizado em parceria com a Fundao Santa Cabrini por intermdio do gerenciamento
laborativo e educacional da mo-de-obra de apenados do sistema prisional do Estado do Rio de Janeiro.

Maiores informaes: www.santacabrini.rj.gov.br

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