21/06/2013

Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

FERRAMENTAS E TCNICAS
BSICAS DE ANLISE DE DNA
E CLONAGEM

No filme Parque dos Dinossauros ...

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Dolly

CLONAGEM GNICA OU MOLECULAR

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FERRAMENTAS E
TCNICAS DE ANLISE

PCR
(Polimerase
Chain
Reaction)

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Sequenciamento do DNA

Sequenciamento do DNA
ATCGCCAGCTTTACTTTACG
TAGCGGTCGAAA

TG A

FITA DNA

G
T

STOP

T
BIG DYE
A

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Sequenciamento do DNA

eletroferograma

A gama de enzimas para a

manipulao do DNA
(1) Nucleases
(2) Ligases
(3) Polimerases
(4) Enzimas modificadoras
(5) Topoisomerases

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Enzimas de Restrio
tb conhecidas como Endonucleases de Restrio

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Nomenclatura
EcoRI

E = gnero Escherichia
co = espcie coli
R = cepa RY13
I = primeira endonuclease identificada

- Reconhecem sequncias de 4 a 8 nucleotdeos

- Sequncias palindrmicas
- Escritas em 5 3
Ex.

GAATTC
CTTAAG

Mapas de restrio

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Eletroforese

Mtodos de colorao de gis

Brometo de Etdio

Nitrato de Prata

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CLONAGEM GNICA OU MOLECULAR

O vetor plasmidial

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A clula hospedeira

E.coli: organismo mais

utilizado em Biologia
Molecular;

Aceita DNA exgeno de

qualquer organismo;

Presente na flora bacteriana

normal humana;

Cresce 37graus e meio de

cultura similar ao TGI (LB).

Transformao

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Transformao
No laboratrio:
Cloreto de Clcio e choque trmico.
Ca++

42 graus

Eletroporao

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No Laboratrio...

Normas de biossegurana
O Conselho Tcnico Nacional de
Biossegurana (CTNBio) o rgo
responsvel
pela
normatizao
e
fiscalizao dos trabalhos que envolvem
transgnicos e engenharia gentica de
forma geral, inclusive os aspectos ticos.

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Trabalhando com E.coli

Uso de cepas no-patognicas.

Descarte com responsabilidade:

Flambe a ala ao manipular;
Mantenha seu rosto longe do tubo;
No incube as placas por muito tempo;
Autoclave todo o material usado antes de
descart-lo.

Prticas microbiolgicas-padro

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Prticas microbiolgicas-padro

Prticas microbiolgicas-padro

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Uso do brometo de etdio

Agente intercalante marcador de cidos nucleicos.
Se intercala no DNA: poderoso efeito mutagnico
e, possivelmente pode ser cancergeno ou
teratognico.

USAR !!! :

Medies e micropipetagem

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Anlise do DNA com enzimas

de restrio

Anlise do DNA com enzimas

de restrio

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Anlise do DNA com enzimas

de restrio

SISTEMAS-MODELO

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E. coli

E.coli e outras bactrias:

estudo do metabolismo catabolismo e
anabolismo

Levedura

Estudo de processos moleculares: diferenas

entre procariotos e eucariotos
So eucariotos unicelulares;
Haplides;
Crescem muito rpido (duplicam em 2h);
Poucos equipamentos, simples.
Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pomble.

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O verme nematide
Eucarioto multicelular;
pequeno e fcil de
manter;
3 dias de ovo a adulto;
Caenorhabditis elegans

Mosca-da-fruta
Estudo de mutantes;
Produzem centenas de descendentes em
poucos dias;
Ovo a adulto em 12 dias;
Drosophila melanosgaster

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Outros
Peixe-zebra (paulistinha)
Anfbios
Galinha
Camundongo
Clulas humanas
Plantas

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