Aplicaes Farmacuticas 2010

Docente: Iris Couto

Protocolo laboratorial
Transfeco de plasmdeo em linha celular animal (HEK 293T) para
expresso proteica:
HEK 293: Esta linha celular foi originada a partir de clulas embrionrias do rim
(HEK: human embryonic kidney). Foram geradas no anos 70 por transformao
do DNA de adenovrus no seu interior. O nmero 293 refere-se apenas ao facto de
ter sido a 293 experincia do investigador Alex Van der Eb. Pensa-se serem
fibroblastos ou clulas epiteliais do rim, no entanto existe alguma controvrsia.
Alguns investigadores (Graham e tal., 1977) mostraram que clulas embrionrias
do rim quando transformadas com adenovrus adquiriam propriedades de
neurnios imaturos.
A variante HEK 293 T contm o antignio T (oncogene que actua perturbando a
aco das protenas pRB e p53) do SV40 (Simian Vacuolating Virus). A presena
deste antignio T permite a replicao epissomal do plasmdeo transfectado.

Plasmdeo utilizado: pcDNA 3.1 Zeo+-APOBEC3G.

Este plasmdeo expressa human apolipoprotein B mRNA-editing enzymecatalytic polypeptide-like 3G (APOBEC3G) que uma protena humana responsvel
por restringir a replicao de HIV-1.
Este factor de restrio celular encontra-se presente maioritariamente no
bao, gnadas, moncitos e linfcitos perifricos.
Vai actuar durante a entrada do HIV-1 nas clulas alvo, no momento da
transcrio reversa, desaminando a cadeia simples, negativa do cDNA viral. Este
processo resulta na inactivao do processo replicativo por hipermutao do
genoma ou mesmo pela degradao do cDNA viral por um mecanismo dependente
da enzima DNA uracil glicosilase.

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Docente: Iris Couto

Dia 1 (tera, 18) : 1) Contar clulas (HEK 293T):

Ressuspender

as

clulas

em

10

ml

de

DMEM

(suplementado com: 10%FBS, 1mM L-Glutamina, 1mM

piruvato de sdio, 1mM a.a no essenciais).

Retirar 10 ul de clulas e ressuspender em 90 ul de Trypan

Blue,

Colocar as clulas na cmara de Neubauer e contar.

2) Plaquear 500.000 clulas/poo, em placas de 6 poos na

presena de DMEM.

Dia 3 (quinta, 20): Transfectar, atravs de precipitao por fosfato de clcio, as

293T com plasmdeo adequado.
Protocolo de transfeco por fosfato de clcio:
Tubo A: colocar 100ul de HBS (HEPES Buffer Solution).
Tubo B: colocar 100 ul de 1/10 de tampo TE (Tris-EDTA),
adicionar 25 ul de cloreto de clcio 1.25 M (cacl2),
adicionar 100 ng de DNA.
- Adicionar gota-a-gota a soluo do tubo B ao tubo A. Ir agitando o tubo A
medida que se vai adicionando o complexo DNA/cacl2.
- Esperar 15 minutos temperatura ambiente.
- Adicionar a mistura final (HBS+DNA/cacl2+TE) s clulas: gota-a-gota no sentido
dos ponteiros do relgio.

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Docente: Iris Couto

HEPES: um tampo orgnico muito usado em cultura de clulas devido ao seu

papel no aumento da permeabilidade celular e consequente internalizao do DNA.
tambm importante na manuteno do PH da cultura celular.

Dia 4 (sexta, 21):

Retirar o meio s 293T e colocar meio novo (DMEM):

Dia 5 (sbado, 22): 1) Lisar as clulas transfectadas:

Remover o meio s clulas,
Lavar com PBS 1x,
Retirar o PBS 1x e adicionar ao pellet de clulas o
tampo de lise: 20mM Tris, 100mM Nacl, 1mM EDTA,
0,5% Triton.
Manter em gelo 5 minutos.
Centrifugar a velocidade mxima durante 2 minutos, a
4C.
Retirar apenas o sobrenadante (o lisado solvel).
2)Preparar amostras para SDS-PAGE:
adicionar -mercaptoetanol (1:1) amostra e ferver a
95C, 5 minutos para desnaturao das protenas.
1 Parte
Enquanto se prepara o gel, preparar as amostras: 10ul de amostra + 10ul de
loading buffer.

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Docente: Iris Couto

SDS-PAGE
Preparar gel de poliacrilamida a 12,5%:
Tampo de Corrida 1x:
Acrilamida/bisacrilamida: 6,25 ml
Resolving buffer (Tampo de separao): 5 ml
gua bidestilada: 3,5 ml
TEMED 10%: 0,25 ml
Persulfato de amnio (APS): 0,1 ml

2 Parte
1- Montar os vidros e colocar no suporte com os parafusos para dentro.
2- Colocar o Resolving Gel e adicionar um pouco de gua (para o gel no secar).
Deixar polimerizar.

3- Tirar a gua (despejar, mas com cuidado) e colocar o Stacking.

Stacking buffer:
Acrilamida/bisacrilamida: 0,5 ml
Tampo stacking: 1 ml
gua bidestilada: 3,4 ml
TEMED 10%: 0,1ml
APS: 0,03 ml
Agitar bem.

4- Colocar o pente com o gel j no suporte.

(Opo: embrulhar em pelcula aderente caso queira fazer o gel no prximo dia.
Pr nos poos tampo de corrida).

5- Aps polimerizao do gel retirar o pente do suporte.

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6- Montar o esquema de corrida.

7- Retirar do suporte o gel e colocar no suporte de corrida, poos voltados para
dentro.
Encher o centro com tampo de corrida at cima (ver se fica tudo bem apertado e
se no h fugas).
8- Colocar tampo de corrida de lado at cobrir a mancha cinzenta. Aplicar as
amostras.
Tapar com a tampa (preto com preto e vermelho com vermelho). Ligar a fonte:
120V at passar o Stacking e depois a 180V ( 1h).

9- Corar o gel com comassie blue e visualizar as bandas das protenas.

Transferncia de protenas:
Tampo de Transferncia 1x (5L): - 15.14g Tris
- 72.07g Glicina
- 1L metanol
- gua at 5L

9- Preparar a transferncia: a) Preparar tampo de transferncia

b) Esponjas: passar por gua destilada e equilibrar em tampo de transferncia 10
c) Retirar o gel- equilibrar em tampo de transferncia 10.
Cortar o papel Wotron 3mm: o tamanho do gel.
d) Cortar a membrana Hyband do tamanho do gel.
e) Sandwich (tudo imerso em tampo de transferncia (no
esquecer de tirar os poos com uma lmina, o gel no pode
ter bolhas, com a esponja humedecida tirar as bolhas).
f) Encher com soluo de transferncia.

g) Pr a correr a transferncia: 90V ou 250mA ( 1h)

10- Desmanchar a Sandwich, verificar para que lado est a protena. Marcar os
cantos do gel na membrana, marcar os traos do marcador.

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Docente: Iris Couto

11- Bloquear 1h a membrana com PBS-Tween 20 0.2% + leite 4% (pode-se pr o.n.

a 4C _ mas neste caso no dia seguinte pr a incubar 30 Temp ambiente).
12- Lavar 1h, de 15 em 15, com PBS-Tween 20 0.1%.
13- Incubar 1h30 com anticorpo adequado em PBS-Tween 20 0.1%
14- Lavar com PBS+Tween20 0.1%, de 15 em 15.
15- Preparar a deteco (durante as lavagens): esticar bem a pelcula aderente na
bancada; ir buscar as cassetes de revelao e tirar os ECL (substrato) do frigorfico
para equilibrar temperatura ambiente.
16- Deteco: aps terminar as lavagens passar por gua destilada. Colocar a
membrana com a protena para cima, em cima da pelcula aderente. Colocar ECL
por cima da membrana e incubar 5 (2ml do frasco grande e 50_l do frasco
pequeno _ por membrana para duas membranas fazer: 6ml do frasco grande e
150_l do frasco pequeno). Eliminar o excesso de reagente de deteco (escorrer
para papel absorvente). Cobrir com pelcula aderente e eliminar bolhas de ar.
Colocar a membrana na cassete, prender com fita-cola.
17- Cmara escura: retirar a pelcula fotogrfica da caixa e colocar na cassete
(dobrar o canto). Expor 15 ou 30.
18- Revelar: revelador (pr e tirar at ver sinal); gua (lavar bem); fixador (at
ficar transparente e deixar de estar escorregadio); lavar com gua corrente.
19- Secar.

Referncias:
Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (July 1977). "Characteristics of a human cell line transformed by DNA from
human adenovirus type 5". J. Gen. Virol. 36 (1): 5974. doi:10.1099/0022-1317-36-1-59. PMID 886304.
http://vir.sgmjournals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=886304.