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PROPRIEDADES FUNCIONAIS DE HIDROLISADOS OBTIDOS A PARTIR DE

CONCENTRADOS PROTICOS DE SORO DE LEITE


1

2 ,*

Maria Teresa Bertoldo PACHECO ; Ndia F. G. DIAS ; Vera Lcia S. BALDINI ;


3

C. TANIKAWA ; Valdemiro C. SGARBIERI

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade funcional de hidrolisados obtidos por diferentes sistemas enzimticos. Foram selecionadas proteses de origem animal (pancreatina) e bacteriana (protamex e alcalase). A atividade funcional foi monitorada pela
dosagem de glutationa no fgado e testes de atividade imunolgica no bao para reao imunolgica primria (IgM) atravs da contagem de clulas formadoras de placa (CFP). Nos ensaios biolgicos foram utilizados camundongos isognicos da linhagem A/J,
em dieta AIN com 20% de protenas na forma dos hidrolisados ou de concentrado de soro de leite. O nmero de CFP no diferiu estatisticamente para os hidrolisados de pancreatina e protamex, sendo inferior (P< 0,05) para o de alcalase. Os valores da dosagem
de glutationa no fgado (r=0,992) correlacionaram positivamente com os resultados de CFP do bao.
Palavras-chave: propriedades funcionais; soro de leite; hidrolisados; glutationa.

SUMMARY
FUNCTIONAL PROPERTIES OF WHEY PROTEIN HYDROLYSATES FROM MILK WHEY PROTEINS CONCENTRATE. The object of
this work was to compare the functional activity of whey protein concentrate (WPC) and its hydrolysates produced by different
enzyme systems. Pancreatin and microbial (protamex and alcalase) were utilized. Functional activity was monitored by liver
concentration of glutathione and primary immunological response (IgM) in spleen (PFC). In the biological assays isognic mice
A/J, fed on an AIN modified diet (20% WPC or its hydrolysates) were used. ThePFC number did not differ for pancreatin and
protemix hydrolysates but was inferior for alcalase hydrolysate (p<0.05). Liver glutathione concentration showed a high positive
correlation (r=0,992) with the PFC number in the spleen.
Keywords: functional properties; whey proteins; hydrolysates; glutathione.

1 - INTRODUO
Os hidrolisados proticos tm sido utilizados desde
1940 com finalidades mdicas na preparao de dietas
especiais para alimentao enteral de bebs e para manuteno do estado nutricional de pacientes impossibilitados de digerir protenas. Na dcada de 70 assistiu-se um
expressivo crescimento nos mtodos de preparao e uso
de hidrolisados proticos, tanto com finalidades clinica e
nutricional como para a melhoria de propriedades funcionais de protenas e alimentos de base protica [12].
A hidrlise enzimtica de polmeros em alimentos, como por exemplo de protenas, um processo de considervel importncia que tem sido utilizado para melhorar
propriedades fsicas, qumicas e funcionais dos alimentos, sem prejudicar seu valor nutritivo, melhorando, particularmente, as caractersticas de absoro das prote-

Recebido para publicao em 12/03/2004. Aceito para publicao


em 17/05/2005 (001308).
Departamento de Engenharia de Alimentos. FZEA/USP. CP: 23.
CEP: 19365-900, Pirassununga-SP.E-mail: mtb@usp.br
Departamento de Alimentos e Nutrio. FEA/UNICAMP.CP: 6121.
CEP: 13083-970, Campinas-SP.
Centro de Qumica. Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL).
Centro de Qumica e Nutrio Aplicada. CEP: 13073-001, CampinasSP.
A quem a correspondncia deve ser enviada.

nas. Segundo estes investigadores[18], os hidrolisados


para fins nutricionais devem reunir as seguintes propriedades: ser osmoticamente equilibrados; hipoalergnicos;
apresentar sabor aceitvel sendo que o valor nutritivo do
hidrolisado deve permanecer to prximo da protena original quanto possvel.
Exemplos de doenas ou condies clnicas que exigem o uso de frmulas especiais contendo hidrolisados
proticos incluem: doena de Crohn, colite ulcerativa,
sndrome de intestino curto, fstulas, pancreatite, traumas severos, sndromes de imunodeficincia e alergias
alimentares. Na preparao de alimentos especiais desejvel utilizar hidrolisados que possuam entre 2 a 6 aminocidos (peso molecular abaixo de 2kDa) para facilitar
ao mximo sua absoro intestinal, evitar o aparecimento de peptdeos amargos e a possibilidade de causarem
efeitos alergnicos [12, 22].
Protenas de soro e casenas so preferidas para formulaes infantis em virtude de seu elevado valor nutritivo. As protenas de leite so utilizadas na forma de hidrolisados, onde normalmente so reduzidas a aminocidos e peptdeos de muito baixo peso molecular.
Teoricamente a hidrlise extensiva deve destruir os eptonos alergnicos (regies de ligao da IgE), resultando
em produtos hipoalergnicos seguros [19].
Trabalhos recentes tm demonstrado que as protenas do soro apresentam algumas vantagens em relao
s casenas [6,8]. Diferenas fundamentais no metabo-

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Propriedades funcionais de hidrolisados, Pacheco et al.

lismo e na ao fisiolgica das casenas e das protenas


de soro de leite, baseiam-se na propriedade das protenas do soro no sofrerem alteraes conformacionais pelos cidos estomacais. Ao atingirem o intestino delgado
so rapidamente digeridas e seus aminocidos absorvidos, elevando rapidamente a concentrao aminoacdica
do plasma e estimulando a sntese de protenas nos tecidos [6,14].
As protenas e peptdeos do soro produzem vrios
efeitos biolgicos quando ingeridas como estmulo sntese de glutationa, estmulo sntese de IGF-1 (Insulin
Growth Factor I), reforo imunolgico, ao hipocolesterlemica, ao antitumoral e aumento da longevidade
em animais de experimentao [11]. Contudo, para que
as protenas do soro de leite estimulem a sntese de glutationa e atuem como imunomoduladoras, elas devem
permanecer com suas estruturas nativas intactas, preservando a atividade biolgica original, que devem ser
transferidas aos peptdeos resultantes da hidrlise [10].
As protenas de soro de leite parecem ser as nicas
com propriedade de aumentar a resposta imune atravs
de uma maior produo de glutationa celular. Para vrios investigadores [9,10,11] o estmulo sntese de glutationa e ao estmulo imunolgico depende das propriedades das protenas de soro liberarem pela hidrlise enzimtica peptdeos de glutamilcistena, contidos nesta seqncia nas fraes de albumina srica (BSA), lactoglobulina e de imunoglobulina G. Contudo, para
que os peptdeos sejam preservados at a fase de digesto para absoro, as protenas devem estar na forma estrutural nativa [10]. A glutationa um tri-peptdeo composto de glutamato, glicina e cistena, distribuda em todas as clulas do organismo humano e animal.
Desempenha funo metablica como antioxidante celular, protegendo contra efeitos deletrios de radicais livres, xenobiticos e como substrato para a enzima glutationa peroxidade (selnio dependente), com ao desintoxicante sobre o perxido de hidrognio e outros hidroperxidos [11].
Durante a preparao de concentrados proticos de
soro de leite e seus hidrolisados, alguns cuidados so necessrios para diminuir a desnaturao das protenas
durante as diversas etapas do processamento como praquecimento, evaporao e secagem. Como cita a literatura, os peptdeos glutamilcistena contidos nas protenas devem permanecer intactos e nesta seqncia [9,
10]. Sabe-se que as enzimas possuem especificidade
quanto posio de clivagem das ligaes peptdicas, resultando em fragmentos proticos com diferentes seqncias aminoacdicas. Como os estudos sobre a ao
imunomoduladora de hidrolisados proticos de protenas de soro de leite so escassos, pretendeu-se neste trabalho investigar se a utilizao de diferentes enzimas,
com diferentes especificidades em hidrlise extensiva,
mantm as propriedades bioativas, no que se refere ao estmulo da produo de glutationa e aumento na produo de anticorpos.

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2 - MATERIAL E MTODOS
2.1 - Obteno do concentrado protico de soro
de leite (CSL)
O concentrado protico de soro de leite foi obtido a
partir de leite desnatado pasteurizado, separado da frao casena por coagulao, utilizando coalho lquido comercial (H-La 2154/CHR HANSEN), nas propores indicadas pelo fabricante. O soro foi ultrafiltrado e diafiltrado em membranas de fluxo tangencial (corte 10KDa
WGM-Kock membrane system) para concentrao da
protena e remoo de outros componentes do soro, e posteriormente desidratado em liofilizador, conforme descrito em BORGES et al. [7].

2.2 - Obteno dos hidrolisados a partir dos concentrados proticos de soro de leite
Utilizou-se no preparo dos hidrolisados para os ensaios biolgicos, um reator com capacidade de 2,5L, com
agitao constante, durante 360 minutos. O grau de hidrlise obtido para todos os hidrolisados foi de aproximadamente 20%. No final do processo a temperatura foi elevada a 85 C por 15 minutos, para inativao das enzimas. Posteriormente os hidrolisados foram congelados e
liofilizados.
0

Trs sistemas enzimticos foram utilizados: a)


Pancreatina (Sigma)- complexo enzimtico obtido de pncreas suno, contendo as enzimas proteolticas tripsina,
quimotripsina e carboxipeptidases; b) Alcalase 0,6L (Novo Nordisk)- enzima proteoltica de grau alimentcio, preparada por fermentao controlada de uma linhagem selecionada de Bacillus licheniformis; c)Protamex (Novo
Nordisk)- protese de Bacillus, desenvolvida para hidrlise de protenas alimentares.
A proporo enzima substrato foi de 1:250, sendo
que a concentrao de substrato para todos os sistemas
foi de 10% (p/v), nas condies timas de pH e temperatura de cada enzima, de acordo com as especificaes do
fabricante. O grau de hidrlise foi monitorado pelo mtodo do pH-stat [3].

2.3. Composio centesimal


Slidos totais, protena bruta (Nx6,38) e cinzas foram determinados segundo AOAC [1]. Lipdios totais e
lactose pelo mtodo de BLIGH & DYER [5] e de ACTON
[2], respectivamente.

2.4 - Composio de aminocidos


Foi determinada aps hidrlise cida (HCl 6N,
110 C, 22h) em um analisador de aminocidos (Dionex
DX - 300), por separao em coluna de troca catinica, seguida de reao colorimtrica ps-coluna com ninidrina.
A quantificao foi realizada com base numa mistura de
padres de aminocidos (Pierce kit 22).
o

Para determinao dos aminocidos livres as amos-

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tras foram tratadas com cido tricloro actico a 10%


(TCA) e centrifigadas. Os aminocidos livres foram extrados do sobrenadante com ter etlico. O solvente foi
posteriormente evaporado e a amostra seca redissolvida
no tampo de anlise.

ERCAL et al. [15]. Amostras de aproximadamente 300mg


de tecido foram inicialmente homogeneizadas em 1,2mL
de gua ultra-pura. A seguir, adicionou-se o mesmo volume de acetonitrila para precipitao dos compostos proticos atravs de centrifugao (10.000g, 10 min, 4C).

2.5 - Solubilidade

A corrida na HPCE foi realizada em tampo fosfato


10mM, pH 7,0. A coluna capilar de slica fundida com
85cm de comprimento foi mantida temperatura de
22C. As amostras foram injetadas sob presso de
50mbar pelo tempo de 5seg e a diferena de potencial aplicada foi de 20kV. A deteco dos componentes sulfurados (glutationa oxidada e reduzida) foi feita em 214nm.
Segundo ERCAL et al. [15], os resultados obtidos por esse mtodo foram similares aos obtidos por cromatografia
lquida de alta resoluo (HPLC).

A desnaturao protica do CSL foi avaliada atravs


da solubilidade em pH 4,6. Aps 1 hora de agitao em
pH 4,6 (temperatura 25 C) as amostras foram centrifugadas (10.000g/15 min/25 C). A protena foi determinada no sobrenadante (%Nx6,38).
0

2.6 - Ensaio biolgico


Utilizaram-se camundongos isognicos da linhagem
A/J com sete semanas de idade, livres de patgenos especficos (SPF), fornecidos pelo Centro de Bioterismo
(CEMIB) da UNICAMP. O protocolo experimental foi certificado pela Comisso de tica em Experimentao
Animal (CEEA-IB-UNICAMP) por estar de acordo com os
princpios do Colgio Brasileiro de Experimentao
Animal (COBEA). Durante a durao dos testes, os animais foram alojados em grupos de 5 por gaiola e mantidos em isoladores.
Dietas: As dietas foram preparadas de acordo com o
"American Institute of Nutrition" (AIN-93G), como descrita por REEVES et al. [21], contendo 20g de protena/100g de dieta. Utilizou-se como fonte de protena o
CSL e seus hidrolisados.

2.7 - Avaliao da atividade imunomoduladora


das dietas
2.7.1 - Estmulo produo de anticorpos pelas
clulas de bao
A atividade imunognica das vrias dietas foi avaliada pelo teste CFP (clulas formadoras de placas) no bao.
O teste indica a capacidade de formao transitria de anticorpos (IgM), contra imungenos das hemcias lavadas
de carneiro e foi descrita por CUNNINGHAM &
SZENBERG [13].
Inicialmente, os animais foram mantidos por 15 dias
nas diferentes dietas, quando receberam a injeo de hemcias (10 clulas) e depois de 7 dias foram sacrificados
para a contagem de clulas que produziram a reao antgeno - anticorpo (CFP), a partir de uma suspenso de clulas de bao dos camundongos. Os resultados foram expressos em nmero de clulas de bao formadoras de placa (CFP).

2.8 - Anlise estatstica


Os resultados experimentais submetidos a anlise
de variana e as mdias foram comparadas pelo teste de
Tuckey ao nvel de significncia de 5%. Utilizou-se o pacote estatstico Statistic (Basic Statistics and tables
Program - Statsoft, 1995).

3 - RESULTADOS E DISCUSSO
Solubilidade da ordem de 87% foi encontrada para
as protenas de CSL. O valor encontrado para a solubilidade foi superior ao citado por MORR & FOEGEDING
[20], obtidos para concentrados proticos de soro de leite
obtidos pelo processo de ultrafiltrao. Os autores encontraram 78% de solubilidade a pH 4,0. O acrscimo de
solubilidade no CSL pode ser devido a menor desnaturao das protenas, que reflete os cuidados durante o processamento, principalmente em relao temperatura.
BOUNOUS & GOLD [10] encontraram solubilidade acima de 95% para protenas de soro ultrafiltradas.
TABELA 1 - Composio centesimal do concentrado protico do
soro de leite (CSL), dos hidrolisados de pancreatina (H ), de
protamex (H ) e da alcalase 0,6 L (H ), todos ao nvel de 20%
de grau de hidrlise
P a

P r

A l

2.7.2 - Determinao dos nveis de glutationa


Para anlise dos nveis de glutationa no fgado, os rgos foram coletados imediatamente aps sacrifcio dos
animais, congelados, triturados e armazenados em nitrognio lquido, at o momento da anlise. A determinao da glutationa foi realizada por eletroforese capilar de
alta resoluo (HPCE), de acordo com a metodologia por

A Tabela 1 mostra a composio centesimal de CSL,


comparativamente aos hidrolisados gerados pela pancreatina (H ), pela protamex (H ) e pela alcalase (H ), ao
nvel de 20% de grau de hidrlise.
P a

P r

A l

Ao se comparar a composio dos hidrolisados com o


CSL que lhes originou, pela ao de diferentes sistemas
enzimticos, conclui-se que as concentraes de gua
(umidade) e de cinzas so mais elevadas nos hidrolisa-

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dos, explicado pela maior higroscopicidade dos hidrolisados em relao ao concentrado original. O teor de cinzas mais elevado resulta da metodologia utilizada, onde
h necessidade de se acrescentar mineral (NaOH) para o
controle do pH durante a reao enzimtica que, ao gerar
grupos carboxlicos tende a baixar o pH do meio de reao. Alguns autores utilizam o hidrxido de amnio para
essa finalidade, evitando, desta forma, o inconveniente
de adicionar sal ao produto [17].

TABELA 2 - Perfis de aminocidos no concentrado protico de


soro de leite (CSL) e hidrolisados com diferentes enzimas

O teor mais elevado de umidade e de cinzas nos hidrolisados faz com que a concentrao de protenas fique
diminuda em relao ao concentrado original. Nota-se
que o hidrolisado mais higroscpico foi o da enzima protamex.
Os perfis de aminocidos do concentrado de soro de
leite e seus hidrolisados so mostrados na Tabela 2.
Pode-se verificar que as protenas do soro de leite apresentam elevado contedo de aminocidos de cadeia ramificada, particularmente leucina (Leu) e isoleucina (Ile), os
quais esto relacionados com a construo de tecido
muscular e regenerao de traumas mltiplos [4]. Outra
caracterstica importante das protenas do CSL o elevado contedo de aminocidos sulfurados, os quais apresentam um balano entre metionina e cistena de aproximadamente 1:1 [8].
Comparando-se os valores de aminocidos dos produtos de soro de leite, observa-se que nos hidrolisados
ocorre uma grande perda de histidina (His). De modo geral, ocorreu uma ligeira reduo dos nveis de aminocidos nos hidrolisados em relao ao CSL. Contudo, a perda de sulfurados (metionina + cistena) foi maior para o
sistema enzimtico Alcalase, que poderia estar relacionado s condies mais severas de pH e temperatura
(50C/pH 8,0) utilizados durante o processo de hidrlise
da protena.
Os dados da Tabela 2 sugerem que o sistema enzimtico pancreatina gera no hidrolisado uma concentrao mais elevada de aminocidos livres que as demais enzimas utilizadas. Isso, provavelmente, deve-se ao fato da
pancreatina conter, alm de endoproteses (tripsina, quimotripsina), as carboxipeptidases, que so exoproteases, responsveis pela maior liberao de aminocidos livres. Conseqentemente, o hidrolisado de pancreatina
apresenta maior contedo de grupos sulfidrilas livres,
provavelmente devido maior liberao de cistena e peptdeos de baixo peso molecular contendo cistena.
Na Figura 1 pode-se observar que todos os teores de
aminocidos essenciais presentes no soro de leite e nos
hidrolisados esto acima dos teores estabelecidos pela
FAO/WHO para crianas at 5 anos de idade, exceto a
histidina que para os hidrolisados se mostra ligeiramente limitante devido perda ocorrida durante o processo
de hidrlise.

Estmulo imunolgico dos concentrados e hidrolisados


enzimticos

FIGURA 1 - Aminocidos essenciais do concentrado de soro de


leite (CSL) e seus hidrolisados com diferentes enzimas, em relao ao padro da FAO/WHO [16]

tudado pelo estmulo sntese tecidual de glutationa (geralmente no fgado) e da formao de anticorpos (IgM) de
camundongos imunizados com hemcias de carneiro.
Na Tabela 3 so apresentados alguns dados de concentrao de glutationa no fgado e de contagem de clulas formadoras de placa (CFP) do bao em camundongos
isognicos A/J alimentados com o CSL e seus hidrolisados provenientes da ao hidroltica de vrios sistemas
enzimticos: pancreatina (H ), protamex (H ) e alcalase
0,6 L (H ), comparados com a casena.
P a

O estmulo imunolgico das vrias preparaes foi es-

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A l

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TABELA 3 - Valores de contagem de clulas formadoras de placa (CFP) em bao e concentraes de glutationa no fgado de
camundongos isognicos A/J, alimentados com concentrados e hidrolisados de protenas de soro de leite e com casena
para comparao

4 - CONCLUSES
A anlise dos dados permite algumas concluses:

o estmulo imunolgico (CFP) produzido pelo CSL e o

hidrolisado de pancreatina (H ) no apresentou diferena estatstica, seguidos pelo hidrolisado de protamex (H ) que no difere estatisticamente do H , porm difere do CSL;
p a

p r

p a

o hidrolisado de alcalase apresentou resposta imu-

nolgica inferior (p0,05) as demais preparaes testadas;

o tratamento com casena produz estmulo imunol-

gico inferior aos preparados de protena de soro


(CSL);

a concentrao de glutationa no fgado foi proporcioObserva-se que os valores para o CSL e o H no diferem estatisticamente, j o H no difere do H , mas sim
do CSL. O hidrolisado H (Alcalase 0,6L) e a casena, apresentaram os menores valores de CFP, diferindo estatisticamente dos trs produtos de protenas do soro. A concentrao de glutationa no fgado foi proporcional ao n
CFP e revela uma perfeita correlao positiva, como ilustra a Figura 2.

nal ao nmero de CFP e revela uma perfeita correlao (r=0,99218). Comparado casena, o concentrado de soro de leite (CSL) apresenta capacidade trs a
quatro vezes superior, quanto ao estimulo do sistema imunolgico de camundongos isognicos da linhagem A/J.

P a

P r

P a

A l

Quanto aos valores de CFP no bao, os animais que


receberam o hidrolisado de pancreatina como fonte de
protena (20%), no diferiu estatisticamente do hidrolisado de Protamex e do CSL. Diferiu apenas do tratamento casena e hidrolisado de alcalase. Alguns fatores podem ter influenciado a menor atividade imunomoduladora dos peptdeos derivados do tratamento com alcalase como, a temperatura utilizada durante a protelise
(50 C), o pH elevado (8,0) assim como a seqncia dos resduos de aminocidos presentes nos fragmentos resultantes da lise. Outro fator a especificidade da enzima,
que ao clivar as ligaes peptdicas em stios especficos
da protena forma peptdeos que podem ter composio
diferente dos demais e de bioatividade diferenciada.
0

FIGURA 2 - Anlise de correlao linear entre os resultados da


contagem de CFP e dos nveis de glutationa para os diferentes
tratamentos

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6 - AGRADECIMENTOS
Agradecemos Fundao de Amparo Pesquisa do
Estado de So Paulo (FAPESP) pela concesso de auxlio
financeiro e bolsa de ps doutorado.

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