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Edio:
Colaborao:
IF SUL-RIOGRANDENSE
Curso Tcnico em Qumica - CAMPUS PELOTAS
Praa Vinte de Setembro, 455
CEP 96015-360
PELOTAS RS BRASIL
NDICE
NDICE .................................................................................................................... 2
PREFCIO .............................................................................................................. 4
1.
2.
3.
4.
4.1.
4.2.
Conceitos .................................................................................................... 10
Interpretao de resultados e concluses .................................................. 10
5.
5.1.
5.2.
5.3.
6.
6.1.
6.2.
7.
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
8.
8.1.
8.2.
8.3.
9.
9.1.
9.2.
9.3.
9.4.
9.5.
9.6.
9.7.
10.
PREFCIO
1.
1. Ao entrar e sair do laboratrio: realizar a assepsia nas mos com lcool 70%
antes e aps os procedimentos de anlise;
2. Limpar as bancadas e a capela de fluxo laminar com lcool 70%, antes e aps
a utilizao;
3. O laboratrio no dever ficar aberto sem um responsvel, portanto, a ltima
pessoa que sair dever sempre deix-lo fechado. Existe uma chave reserva do
laboratrio, para eventuais necessidades de trabalho em dias ou horrios fora
do expediente da instituio. Esta a nica chave disponvel para emprstimo,
portanto, dever sempre ser devolvida ao laboratrio, para que possa servir a
todos os usurios (consulte o professor responsvel pelo laboratrio);
4. Nunca alterar a temperatura das estufas quando estas estiverem ocupadas.
Mesmo vazia qualquer alterao dever ser avisada aos demais, para evitar
enganos que conduzam a erros e perdas de trabalho
5. As pipetas, aps sua utilizao devero ser imediatamente imersas em
provetas ou recipientes contendo solues desinfetantes (Lisoform, gua
sanitria, etc.);
6. Os resultados de anlises realizadas pelo laboratrio no podem ser
comentados fora do local de trabalho, ou seja, deve-se manter sigilo
profissional: os resultados s interessam a quem solicitou a anlise; alm
disso, as anlises so realizadas por alunos e com fins didticos; portanto, no
tem validade para fins de emisso de laudo e/ou emisso de pareceres;
7. Verificar diariamente as autoclaves e, semanalmente, trocar a gua de
aquecimento;
8. Deve ser estabelecido um programa de controle contra infestaes (insetos e
roedores);
2.
3.
RISCO BIOLGICO
4.
LAUDO MICROBIOLGICO
Conceitos
Produtos txicos
Produtos deteriorados
10
Consideraes
Parecer
Situao A
Ausncia
At 1.000
At 1.000
At 500
At 100
Produto aceitvel
para consumo.
Situaes/interpretaes
Situao B
Ausncia
1.000 10.000
1.000 10.000
500 10.000
Situao C
Presena
100.000 ou toxina
10.000
10.000
100 a 500
500
Condies higinicas
insatisfatrias
Produto imprprio
para consumo,
acompanhado do
termo deteriorado
ou potencialmente
capaz de causar
intoxicao/infeco
alimentar
11
5.
Esterilizao do material
12
Meios de cultura
13
Outros reagentes
14
6.
Lavagem do material
15
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
16
7.
ANLISES MICROBIOLGICAS
Swabs
Diluente: gua peptonada 0,1% ou soluo salina 0,85%
Tubos de ensaio com tampa rosquevel
Pipetas de 1,0ml ou ponteiras para micropipeta de 1000L (estreis)
Placas de Petri
Meio de cultura: gar padro para contagem (gar PCA)
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7.1.3. Inoculao
a) Abrir o swab para coleta somente no momento de pass-lo sobre a
superfcie desejada, em uma rea de aproximadamente 25cm2.
b) Imediatamente aps a coleta, colocar no tubo de ensaio contendo a gua
peptonada 0,1%, (a ponta com algodo ficar imersa) quebrando a
extremidade excedente e fechando o tubo;
c) No laboratrio, desinfetar a bancada com etanol 70%, para remover os
contaminantes presentes, trabalhando com o bico de Bunsen aceso;
d) Verter nas placas, cerca de 20 ml de gar Padro para Contagem,
previamente resfriado a 45C.
e) Obs: Aguardar completa solidificao do meio de cultura, distribuindo as
placas numa superfcie plana;
f) Do tubo contendo o swab, realizar as inoculaes spread plate (0,1ml) na
superfcie das placas contendo gar, abrindo apenas o suficiente para
inserir a pipeta, prximo ao bico de Bunsen.
OBS: podem ser realizadas ainda, inoculaes do tipo pour plate, conforme
os objetivos da anlise.
g) Incubar as placas invertidas a 35-37C, por 48h ou 5C, 5d;
18
7.1.1. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, no item resultados e discusso:
a) Informaes sobre quais os possveis microrganismos que podem estar
presentes, caracterizando-os quanto morfologia, habitat, patogenicidade,
condies de crescimento.
b) Comparao dos resultados obtidos com resultados de pesquisas similares
realizada na prtica.
19
7.2.
20
Figura 03 tubos com caldo LST sem crescimento (e) e com produo de gs (d)
21
Figura 04 tubos com caldo EC sem crescimento (e) e com produo de gs (d)
Teste de citrato
Caldo Citrato de Koser
Inocular uma alada, incubar a 35C, durante 72 a 96hs.
Crescimento positivo: turbidez
Crescimento negativo: lmpido
Cepas de E. coli so citrato negativas
22
23
7.2.3. Resultados
Expressar os resultados das contagens de coliformes totais e fecais
em "Nmero Mais Provvel por grama (mL) de alimento".
Obs.: Em anlise de leite, suprime-se a etapa de inoculao da amostra em
LST, inoculando-se sries de 3 tubos, com as diluies adequadas,
diretamente em caldo VBBL, para pesquisa de coliformes totais. Dos tubos
positivos, pega-se uma alada e inocula-se em caldo EC, para confirmao
de coliformes fecais.
7.2.4. Atividades
a)
b)
c)
d)
24
25
7.3.
26
7.3.2. Procedimento
7.3.2.1.Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25g ou 25mL do alimento com 225mL de gua
peptonada tamponada. Incubar a 37C, por 24 horas.
7.3.2.2.Enriquecimento
Transferir 1mL de caldo de pr-enriquecimento para um tubo
contendo 10mL de caldo tetrationato (acrescentar ao tetrationato 0,2mL de
iodo e 0,1mL de verde brilhante no momento do uso) e 0,1mL para um tubo
contendo 10mL de caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar o primeiro a 35C e
o segundo a 42C (em banho-maria) por 24 horas.
7.3.2.3.Semeadura em gar seletivo
Semear uma alada de cada cultura do enriquecimento em placas de
gar XLD, gar BS e gar Hektoen-enteric (HE), de modo a obter colnias
isoladas. Incubar a 35C por 24 horas.
7.3.2.4.Identificao de colnias suspeitas
gar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem
centro negro. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir
colnias com centro negro grande e brilhante, ou mesmo inteiramente
negras. Cepas de Salmonella, fermentadoras de lactose produzem
colnias amarelas com ou sem centro negro.
gar HE: colnias verde-azuladas a azuis com ou sem centro negro
(algumas podero ser totalmente negras). Cepas de Salmonella,
fermentadoras de lactose produzem colnias amarelas com ou sem
centro negro.
gar BS: colnias marrons, cinzas ou pretas, com ou sem brilho metlico.
7.3.2.5.Identificao bioqumica
Tocar com a agulha no centro da colnia suspeita e semear em tubo
contendo gar trplice acar ferro (TSI), inclinado, gar lisina ferro (LIA) e
gar urease (UA), nesta ordem e utilizando a mesma picada. Incubar os
tubos de TSI com as tampas ligeiramente afrouxadas e os tubos de LIA
com as tampas bem fechadas. Incubar a 37C/24h.
Reao tpica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo
cido (amarelo), com ou sem produo de H2S (escurecimento do gar)
(Fig. 06). Reao atpica em TSI, que no deve ser descartada se as
demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cido
(amarelos), com ou sem produo de H2S.
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(a)
(b)
(c)
Figura 06 gar TSI sem crescimento (a), com crescimento caracterstico (b) e com
crescimento no caracterstico (c).
Figura 07 gar LIA sem crescimento (e) e com crescimento positivo (d)
28
7.3.2.6.Identificao sorolgica
Dever ser feita aps a identificao bioqumica, utilizando-se
inicialmente o soro polivalente somtico (contm anticorpos contra os
antgenos somticos das salmonelas dos grupos A, B, C1, C2, D, E1, E2,
E3, E4 e contra o antgeno Vi) e posteriormente o soro polivalente antiSalmonella flagelar (contm anticorpos contra os antgenos flagelares a, b,
c, d, i, 1, 2, 5) (Probac do Brasil Produtos Bacteriolgicos Ltda.). A
metodologia para a identificao sorolgica a de aglutinao em lmina.
7.3.3. Resultados
Expressar os resultados como "ausncia" ou "presena" de
Salmonella sp em 25g ou 25mL de alimento.
7.3.4. Atividades
Pesquise sobre a importncia do micro-organismo em alimentos (incidncia,
contaminaes, riscos, habitats, etc.), os principais gneros e sua classificao em
relao ao risco biolgico.
Faa uma pesquisa de artigos relacionados presena da bactria em
alimentos e/ou processos industriais e compare com os resultados da prtica.
Elabore o relatrio de aula prtica conforme modelo (apndice 5) e inclua
as informaes pesquisadas.
29
30
7.4.
31
32
7.4.3. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de
gua peptonada 0,1%;
-1
33
34
35
Figura 10 Caldo nitrato com crescimento positivo (e) e gar nitrato com reduo do nitrato
a nitrito positivo e motilidade negativa (d)
36
Figura 11 Meio de leite e ferro com crescimento positivo (e) e crescimento negativo (d)
7.4.5. Resultado
Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnia por
grama (UFC.g-1).
7.4.6. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, dentro do item resultados e discusso:
a) Informaes sobre pesquisas similares realizada na prtica, para efeito de
comparao com os resultados obtidos;
b) Coloque a classificao de risco biolgico do micro-organismo;
c) Cite outras cepas de clostrdios que representam risco.
37
7.5.
7.5.2. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de gua
peptonada 0,1%;
-1
38
OBS: antes de verter o gar BP nas placas, adicionar a cada 95,0 mL de meio,
as seguintes solues:
1,0 mL de telurito de potssio a 1%
5,0 mL de emulso de gema de ovo
Preparo da emulso de gema de ovo:
Extrair assepticamente as gemas, colocando-as em uma proveta
esterilizada.
Medir seu volume e adicionar igual volume de soluo salina (0,85%),
esterilizada.
Homogeneizar bem, sem fazer espuma.
Misturar ao gar BP (quente), na proporo indicada.
Preparo da soluo de telurito de potssio
Telurito de potssio
1,0g
gua destilada estril qsp 100mL
Utilizar vidraria esterilizada
d) Aps a mistura da emulso de gema de ovo e da soluo de telurito ao gar BP,
verter o meio nas placas e aguardar a solidificao para inoculao em superfcie
(spread plate).
e) Transferir 0,1mL de cada diluio do alimento para as placas de petri (duas por
diluio) com o meio de cultura gar Baird-Parker, espalhando com a ala de
Drigalsky.
f) Aps completa secagem da superfcie do gar, inverter as placas e incub-las a
35C durante 48 horas (Fig. 12);
g) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as colnias suspeitas (negras,
convexas, lustrosas, rodeadas por um halo claro) e efetuar os testes bioqumicos
de confirmao.
39
7.5.2.1.Identificao bioqumica
7.5.2.1.1.Colorao de Gram
Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram (Cap. 7).
A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para S. aureus. A
presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes
complementares.
7.5.2.1.2.Produo de coagulase
a) Inocular as colnias suspeitas em caldo BHI e incubar a 35C durante 24
horas;
b) Misturar 0,1mL desta cultura com 0,3mL de plasma de coelho;
c) Incubar a 35C, observando a formao de cogulo. Observar, de hora em
hora, durante 6 horas. A ausncia de cogulo indica teste negativo. Utilizar
controles negativo e positivo.
7.5.2.1.3.Prova da catalase
Aps o crescimento em caldo BHI, colocar uma gotcula do inculo numa
lmina de microscpio e gotejar gua oxigenada.
Observar o desprendimento de bolhas, indicativo de S. aureus.
40
7.5.2.1.4.Produo de termonuclease
Pipetar, de modo a espalhar, 10mL de gar DNA-azul de toluidina sobre
uma placa de Petri. Aps solidificar, cortar o gar usando um tubo capilar
esterilizado, de modo a obter orifcios de 2mm de dimetro. Remover o gar dos
orifcios por aspirao.
Utilizando pipetas Pasteur, tubos capilares ou micropipetas, adicionar a
cada orifcio, aproximadamente, 10l da cultura em caldo usada para o teste da
coagulase, previamente aquecida durante 15 minutos em banho-maria em
ebulio. Incubar a placa em cmara mida por 4 horas a 35-37oC. Leitura final
com 24h.
Reao positiva: aparecimento de um halo cor de rosa brilhante,
estendendo-se por, pelo menos, 1mm alm das bordas do orifcio.
7.5.3. Resultados
Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias
selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em
considerao a diluio utilizada.
Quando o nmero de colnias confirmadas
for diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a
proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para
contagem de colnias, deste Manual.
O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas
confirmadas.
Expressar o resultado como:
Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC.g-1 ou mL-1 ou
Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x 10y UFC.g-1 ou mL-1.
Quando todas as colnias repicadas so confirmadas pelos testes
confirmativos, o resultado final da contagem ser igual ao nmero obtido na
contagem inicial multiplicado pela diluio (de acordo com o determinado pela
regra de contagem aplicada).
Quando o nmero de colnias confirmadas diferente do nmero de
colnias repicadas, calcular o resultado final utilizando a seguinte frmula:
Cxcxd
R =
R
R = Resultado
C = nmero de colnias contadas
c = nmero de colnias confirmadas
41
42
10-2 RT
50x5x100
5
= 5000
7.5.4. Atividades
Pesquise em fontes bibliogrficas adequadas (artigos):
a) A presena do micro-organismo em amostras similares e compare com os
resultados obtidos na prtica, apontando, em caso positivo (presena) as
possveis fontes de contaminao e risco devido sua presena, medidas
preventivas, etc.
b) A classificao de risco biolgico para o micro-organismo
Elabore o relatrio de aula prtica e insira essas informaes no item Resultados
e discusso
43
44
7.6.
45
46
47
7.7.
Enumerao de fungos
48
Contador de colnias
7.7.2. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de
gua peptonada 0,1%;
-1
7.7.4. Atividades
Baseado na morfologia observada nas colnias obtidas pesquise em
bibliografia adequada:
a) A identificao das colnias fngicas comparada com a de fungos
conhecidos
b) A origem da contaminao (fontes, habitat natural, como chegam a
alimentos);
c) Se o fungo identificado por comparao, produz ou no micotoxinas.
d) De posse dessas informaes, elabore o relatrio da prtica, conforme o
modelo (apndice 5).
49
50
7.8.
51
7.8.2. Procedimento
Examinar macroscopicamente e microscopicamente as culturas fornecidas
em placas de Petri. Para o exame microscpico fresco, colocar uma gota de
gua em uma lmina e com uma ala, emulsionar uma pequena quantidade da
cultura do fungo a ser observado. Cobrir com lamnula e observar ao microscpio
(Fig. 17) em diferentes ampliaes.
Obs: na utilizao de corante, repetir a preparao do esfregao,
substituindo a gua pelo corante azul de metileno.
7.8.3. Resultados
a) Comparar a morfologia das culturas fornecidas com culturas conhecidas
(Fig. 16) a partir do exame macroscpico e microscpico,
52
7.8.4. Atividades
Forme grupos e pesquise sobre os diferentes tipos de microscopia tica
(campo claro, campo escuro, contraste de fase, contraste de fase com
interferencia diferencial CID, de fluorescncia, confocal) e eletrnica (varredura
e transmisso), destacando as suas caracteristicas e finalidades/aplicaes.
Entregar o trabalho escrito e tambem realizar uma apresentao em
powerpoint.
53
7.9.
54
Filtros esterilizantes
7.9.2. Metodologia
7.9.2.1.Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25g ou 25mL do alimento com 225 mL de caldo de
enriquecimento para listeria (LEB). Incubar a 30oC por 24 horas.
7.9.2.2.Enriquecimento
Transferir 0,1mL do LEB para um tubo contendo 10mL de caldo
Fraser. Incubar a 35oC por 24 a 48 horas (at escurecimento do meio). Ter
sempre um tubo contendo caldo Fraser inoculado com cultura pura de L.
monocytogenes.
7.9.2.3.Semeadura em gar seletivo
Semear uma alada do tubo escurecido em placas de gar PALCAM
e gar Oxford, de modo a obter colnias isoladas.
Incubar as placas de gar Palcam e Oxford a 35oC por 24-48 horas.
7.9.2.4.Identificao das colnias suspeitas
gar Palcam: colnias cinza-esverdeadas com centro cncavo,
negro; halo negro sobre fundo vermelho.
gar Oxford: colnias negras com centro cncavo e halo negro.
7.9.2.5.Purificao das colnias
Tocar o centro das colnias suspeitas com a agulha de nquel cromo
e semear em tubos de gar soja tripticase com extrato de levedura (TSA-YE).
Incubar a 35oC por 24 horas. A partir destas culturas, realizar testes
fenotpicos e bioqumicos, a fim de confirmar a presena de Listeria sp.:
a) Catalase na superfcie de uma lmina de microscopia, previamente
desengordurada com etanol comercial, preparar uma suspenso
bacteriana, a partir do cultivo recente em TSA-YE a ser testado, e uma
alada de soluo salina a 0,85% esterilizada. esta suspenso, adicionar
uma gota de gua oxigenada a 3%, verificando-se o surgimento ou no de
bolhas de oxignio, por at 2 minutos, como conseqncia da presena ou
no da enzima.
b) Motilidade inocular as cepas a serem testadas em um tubo de ensaio
contendo 4mL de Motility Test Medium (DIFCO). A inoculao deve ser
feita com o auxlio de uma agulha de inoculao, picando-se o gar at o
55
7.9.3. Resultados
Expressar os resultados como "ausncia" ou "presena" de Listeria
monocytogenes em 25g ou 25 mL de alimento.
56
Catalase
Motilidade guardachuva
-hemlise
Fermentao de:
Dextrose
Manitol
Xilose
Rhamnose
V = Varivel
+ = Positivo
- = Negativo
L.
monocytogenes
+
+
L.
seeligeri
+
+
L.
ivanovii
+
+
L.
innocua
+
+
L.
welshimeri
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
V
+
+
V
7.9.4. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, dentro do item resultados e discusso:
a) Informaes sobre pesquisas similares realizada na prtica, para efeito de
comparao com os resultados obtidos;
b) Coloque a classificao de risco biolgico do micro-organismo;
57
58
7.10.3.Resultados
Expressar os resultados das contagens de coliformes totais e fecais
em "Nmero Mais Provvel em 100mL de gua".
59
8.
MTODOS DE COLORAO
8.1.
Colorao de Gram
1 - Preparar a extenso na lmina
2 - Fixar pelo calor
3 - Corar um minuto com a soluo de cristal violeta fenicada (ou com a
soluo de oxalato de amnio segundo Hucker)
4 - Escorrer o corante e cobrir durante 1 min com lugol
5 - Lavar com gua corrente
6 - Diferenciar com lcool 95o
7 - Lavar com gua corrente
8 - Corar o fundo rapidamente com fucsina
9 - Lavar e secar
10 Observar no microscpio, em diferentes ampliaes.
8.2.
8.3.
Colorao a fresco
1 - Preparar a extenso na lmina
2 - Corar com azul de metileno
4 - Escorrer o corante
5 Observar no microscpio, em diferentes ampliaes.
60
9.
TCNICAS DE ISOLAMENTO
9.1.
9.2.
61
9.3.
62
9.4.
63
9.5.
64
9.6.
65
9.7.
66
10.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
67
68
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public
Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.
PAHO. Organizacin Panamericana de la Salud. Contaminacin microbiana de
los alimentos vendidos en la va pblica en ciudades de Amrica Latina y
caractersticas socio-economicas de sus vendedores y consumidores.
Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al. (Eds.). 1996, 176p.
RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In:
Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://
www.cfsan.fda.gov
RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito
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SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne
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Washington: ASM, 1994, p. 130-140.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de Mtodos de
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SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de alimentos. Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuria (EMBRAPA). Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia
Agroindustrial de alimentos (CTAA). Servio de produo de informao SPI.
Braslia, DF, 117p, 1995.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for
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Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public
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TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R.
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VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens - An illustrated text.
London: Wolf Publishing Ltd, 1991.p. 235-265.
69
70
INSTRUCOES GERAIS
1.1 A pesagem e o preparo de amostras so pontos crticos de controle do processo
analtico.
1.2 O local deve estar higienizado antes do incio da pesagem, conforme norma
especfica do laboratrio.
1.3 Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma especfica do
laboratrio.
1.4 O responsvel pelo procedimento deve, antes do incio dos trabalhos, realizar
assepsia das mos e antebraos.
1.5 Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a rea analtica e Equipamento
de Proteo Individual (EPI), conforme estabelecido em normas especficas do
laboratrio.
1.6 Devem ser aplicados os procedimentos de verificao de balanas, conforme
procedimento especfico do laboratrio.
1.7 O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de Bunsen, no caso de
uso de bancada, ou em fluxo laminar especfico para tal atividade.
1.8 A superfcie de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em
soluo desinfetante no inflamvel, previamente testada.
1.9 Todo o material deve estar organizado e em condies adequadas de uso antes
do incio dos trabalhos.
1.10 No deve ser permitida a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no
local, principalmente durante a pesagem das amostras.
2. INSTRUES PARA MANUTENO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO
LABORATRIO
2.1. No laboratrio, aps o recebimento, as amostras devem ser estocadas at o
momento da anlise, conforme abaixo:
2.1.1 Refrigeradas perecveis
As refrigeradas perecveis devem ser mantidas sob refrigerao e analisadas o mais
rapidamente possvel. Aguardar no mximo at o dia seguinte.
2.1.2 Congeladas
As amostras congeladas devem ser mantidas no mximo a -18 C e analisadas em
um prazo mximo de 7 dias da colheita.
2.1.3 No perecveis
Amostras no perecveis devem ser estocadas em lugar fresco, protegidas da
umidade e da luz, de forma que suas caractersticas originais sejam mantidas, e
analisadas o mais rapidamente possvel.
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2.2 Registros
Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas, conforme
estabelecido em procedimento especfico do laboratrio.
2.3 Manuteno das amostras aps a anlise
Aps a retirada das alquotas para anlise, as amostras devem ser embaladas
em sacos plsticos de primeiro uso, perfeitamente identificadas e mantidas
congeladas, conforme item 2.1.2.
As amostras estveis em temperatura ambiente devem ser mantidas identificadas,
protegidas por saco plstico de primeiro uso ou adequadamente fechadas na
embalagem original, em temperatura ambiente e em local apropriado previamente
estabelecido, conforme item 2.1.3.
Todas as amostras, exceto gua, leite e outros produtos lquidos, os quais devem
ser descartados logo aps a realizao do procedimento analtico, devem ser
mantidas nas condies acima especificadas por 10 dias. Aps esse prazo, as
amostras devem ser descartadas conforme item 2.4.
2.4 Descarte de amostras analisadas
Todas as amostras que derem entrada no laboratrio de microbiologia devem ser
descartadas conforme procedimento especfico estabelecido pelo laboratrio.
3. PREPARO DA AMOSTRA
Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo para provas
de: Contagem de Micro-organismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listeria
monocytogenes, Pesquisa de Vibrio cholerae, etc., fazer tantas pesagens por
amostra quantas forem necessrias.
3.1 Enlatados
No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das
embalagens, observando se esto amassadas, levemente tufadas ou com
microfugas aparentes.
Quando forem observadas quaisquer dessas alteraes, proceder conforme
estabelecido no Captulo 20 Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de
baixa acidez.
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77
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80
gar Nitrato-Motilidade
extrato de carne .................................... 3,0 g
peptona ................................................. 5,0 g
nitrato de potssio ................................ 5,0 g
fosfato dissdico ................................... 2,5 g
galactose ............................................... 5,0 g
glicerol ................................................... 5,0 g
gar ....................................................... 3,0 g
gua ...................................................... 1000mL
Dissolver os ingredientes, aquecendo. Acertar o pH para 7,4 e dividir em
tubos (9 mL por tubo). Esterilizar em autoclave 121 oC durante 15 minutos. Esfriar
rapidamente em gua corrente.
gar Nutriente
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Oxford
Preparar conforme instrues no frasco. Autoclavar. Adicionar,
assepticamente, o suplemento conforme recomendado pelo fabricante. Distribuir
em placas estreis.
gar PALCAM
Preparar conforme instrues no frasco. Autoclavar. Adicionar,
assepticamente, o suplemento, conforme recomendado pelo fabricante. Distribuir
em placas estreis.
gar Plate Count
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Potato Dextrose
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Purpura de Bromocresol
Proteose peptona .................................... 10g
NaCl ........................................................ 5g
Prpura de bromocresol .......................... 0,02g (2mL de sol. 1%)
gar ......................................................... 15g
Agua ........................................................ 1000mL
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Soluo Sulfocrmica
Dissolver 60g de dicromato de potssio em 200mL de gua destilada
quente. Colocar o frasco em um banho de gelo ou gua fria, dentro da pia, e
aguardar resfriar. Com todo o cuidado, adicionar aos poucos, lentamente e com
constante agitao, 800mL de cido sulfrico soluo de dicromato de potssio.
Manter o frasco no banho frio durante todo o tempo de preparo, porque a reao
do cido com o dicromato libera uma quantidade significativa de calor.
Cuidado: O cido sulfrico e a soluo sulfocrmica obtida so extremamente
corrosivos. Proteger os olhos com culos apropriados e as mos com luvas de
borracha.
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NMP/g
0,3
0,3
0,3
0,4
0,7
0,7
1,1
1,1
0,9
1,4
1,5
2,0
2,1
2,8
2,3
3,9
6,4
4,3
7,5
12
9,3
15
21
24
46
110
240
88
NMP/g
3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1.100
2.400
89
NMP/100mL
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
23
NMP/100mL
0
1
2
3
4
5
2,2
2,2
5,1
9,2
16
16
90
91
92
Ex:
Os resultados da contagem de micro-organismos (tab ou fig. 01)
indicam um elevado nvel de contaminao nas amostras analisadas:
(inserir a tabela/figura 01)
A argumentao DEVE ser fundamentada em dados de bibliografia
especializada na rea (artigos, livros, apostilas) e a COMPARADOS OS
RESULTADOS com outros trabalhos similares.
Concluso
De forma clara e objetiva, preferencialmente na forma de tpicos, em
concordncia com o(s) objetivo(s).
Obs: um objetivo pode gerar mais de uma concluso, mas NUNCA DEVEM
ser colocadas concluses em quantidade inferior aos objetivos.
Referncias
A seguir so explicitados exemplos de apresentao das referncias
bibliogrficas utilizadas para a composio do trabalho, baseados no
modelo da ABNT, norma regulamentadora NBR 6023.
permitido utilizadar uma fonte de tamanho inferior ao utilizado no restante
do trabalho.
Exs:
Para Livros
CECCHI, H.M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de
alimentos. 2a Ed. Ed UNICAMP, Campinas, SP, 2003.
JOSLYN, M.A. Methods in food analysis (physical, chemical and
instrumental methods of analysis). Nova Iorque e Londres. Academic
Press, 1970.
Para Peridicos
TELLEFSON, J.R. Calibration in Kjeldahl protein analysis. Cereal Foods
World, 24(2), 1980, p.54
93
Para Legislao
BRASIL. Resoluo-RDC n 12, de 02 de Janeiro de 2001. Regulamento
tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos. Dirio Oficial da
Republica Federativa do Brasil, Brasil, n 7-E, p. 46-53, 10 Jan. 2001,
seo I.
Anexos
Nos anexos, podem ser includos clculos, planilhas, procedimentos
auxiliares, figuras, etc. que porventura sejam necessrios para
complementar as informaes.
94
N:
LOTE:
INTERESSADO:
.
.
..
COMPOSIO DO PRODUTO:
..
.
METODOLOGIA ANALTICA
.
.
.
RESULTADOS
.......................
ANLISE
RESULTADO
PADRO
CONCLUSO:
A amostra analisada enquadra-se/no se enquadra nos padres microbiolgicos vigentes, estando portanto,
apta/inapta para o consumo.
Responsabilizamo-nos pelo teor da declarao acima e colocamo-nos a sua disposio para qualquer
esclarecimento.
REFERNCIA BIBLIOGRFICA:
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SOCIEDADES CIENTFICAS
Sociedade Brasileira de Virologia
www.sbv.org.br
Sociedade Brasileira de Microbiologia
www.sbmicrobiologia.org.br
Sociedade Brasileira de Protozoologia
www.icb.usp.br/~sbpz
American Society for Microbiology
www.asm.org
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98
Evoluo e filogenia
http://cmex-www.arc.nasa.gov/VikingCD/Puzzle/Evolife.htm
http://www.bact.wisc.edu/MicrotextBook/ClassAndPhylo/classify.html
Microbiologia do solo
http://www.inweh.unu.edu/biology447/modules/module8/soil/chapter3Soil446.htm
http://www.ucc.ie/impact/agrisf.html
Biodegradao e biocatlise
http://umbbd.ahc.umn.edu/
Biofilmes
http://www.erc.montana.edu/Res-Lib99-SW/Movies/default.htm
Vrus de plantas
http://www.virology.net/garryfavwebplant.html
Microbiologia do ar:
http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/airborne.htm#crest
Coluna de Winogradsky
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/microbiology/winogradsky.htm
l
99
IF SUL RIO-GRANDENSE
CAMPUS PELOTAS
Geral
Fax
Coordenadoria do Curso de Qumica
Sala dos professores do Curso de Qumica
Almoxarifado do Curso de Qumica
2123 1000
2123 1006
2123 1040
2123 1041
2123 1158
100