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CURSO TCNICO EM QUMICA

MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Edio:
Colaborao:

CLAUDIO RAFAEL KUHN1


HELOSA C. DA SILVA ANTUNEZ2
RICARDO PERAA TORALLES3
o

1 Professor,Dr. em Cincia dos Alimentos, Eng de Alimentos.


2 Professora, MsC em Cincia dos Alimentos, Farmacutica Bioqumica.
o
3 Professor, Dr. em Cincia dos Alimentos, Eng Qumico.

IF SUL-RIOGRANDENSE
Curso Tcnico em Qumica - CAMPUS PELOTAS
Praa Vinte de Setembro, 455
CEP 96015-360
PELOTAS RS BRASIL

TEL: (053) 2123 1000


FAX: (053) 2123 1006
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LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS


MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

NDICE
NDICE .................................................................................................................... 2
PREFCIO .............................................................................................................. 4
1.

BOAS PRTICAS DE LABORATRIO ........................................................ 5

2.

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA ... 6

3.

RISCO BIOLGICO ..................................................................................... 8

4.

LAUDO MICROBIOLGICO ...................................................................... 10

4.1.
4.2.

Conceitos .................................................................................................... 10
Interpretao de resultados e concluses .................................................. 10

5.

PREPARO DO MATERIAL PARA ANLISE MICROBIOLGICA ............. 12

5.1.
5.2.
5.3.

Esterilizao do material ............................................................................. 12


Meios de cultura ......................................................................................... 13
Outros reagentes ........................................................................................ 14

6.

LIMPEZA DO MATERIAL CONTAMINADO ............................................... 15

6.1.
6.2.

Lavagem do material .................................................................................. 15


Testes para verificao da eficincia da lavagem e enxgue na remoo de
resduos ...................................................................................................... 16

7.

ANLISES MICROBIOLGICAS ............................................................... 17

7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.

Avaliao microbiolgica de superfcies Swab teste ............................. 17


Enumerao de coliformes totais e fecais .................................................. 20
Pesquisa de Salmonella spp. ..................................................................... 26
Enumerao de clostrdios sulfito-redutores............................................... 31
Enumerao de Staphylococcus aureus .................................................... 38
Enumerao de bactrias aerbias mesfilas ............................................ 45
Enumerao de fungos............................................................................... 48
Microscopia e visualizao de micro-organismos ....................................... 51
Pesquisa de Listeria monocytogenes ......................................................... 54
Anlise de gua.......................................................................................... 58

8.

MTODOS DE COLORAO .................................................................... 60

8.1.
8.2.
8.3.

Colorao de Gram .................................................................................... 60


Colorao de Esporos - Mtodo de Wirtz ................................................... 60
Colorao a fresco...................................................................................... 60

9.

TCNICAS DE ISOLAMENTO ................................................................... 61

9.1.
9.2.

Isolamento em cultivo slido ....................................................................... 61


Tcnica de semeadura por estrias ............................................................. 61

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9.3.
9.4.
9.5.
9.6.
9.7.

Tcnica de semeadura por espalhamento ................................................. 62


Tcnica de semeadura por derramamento ................................................. 63
Tcnica de semeadura em profundidade ................................................... 64
Isolamento em cultivo lquido ..................................................................... 65
Isolamento em cultivo contnuo .................................................................. 66

10.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................... 67

APENDICE 1 PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E


DESCARTE DE AMOSTRAS ................................................................................ 70
APENDICE 2 CRITRIOS DE CONTAGEM PARA MICRO-ORGANISMOS EM
PLACAS ................................................................................................................ 78
APNDICE 3 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES PARA
ANLISES MICROBIOLGICAS .......................................................................... 80
APNDICE 4 TABELAS DE NMERO MAIS PROVVEL ................................ 88
APNDICE 5 MODELOS DE RELATRIO ....................................................... 91
APNDICE 6 MODELO DE LAUDO MICROBIOLGICO ................................. 95
APNDICE 7 LINKS E ENDEREOS ELETRONICOS ..................................... 96
APNDICE 8 TELEFONES PARA CONTATOS .............................................. 100

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PREFCIO

A partir do descobrimento dos micro -organismos e de sua


participao como causa de vrias enfermidades no final do sculo
XIX, se estabeleceu a base para a gerao de princpios cientficos que
permitiram prevenir ou minimizar a contaminao, impedir a proliferao e
inativar de maneira segura os agentes patognicos e desenvolver tcnicas de
isolamento e deteco adequadas.
Os processos industriais de alimentos tm como base para a preservao
dos alimentos e da sade do consumidor, o conhecimento sobre o risco biolgico
e o controle da contaminao microbiolgica. O propsito dessa obra foi o de
reunir informaes bsicas de conduta e segurana exigidos para o
procedimento microbiolgico, alm de algumas tcnicas de anlise dos principais
micro-organismos, preparao de meios e reagentes especficos. Obviamente,
muitas tcnicas poderiam ser citadas, mas no atenderiam necessidade do
curso para o qual esta disciplina de microbiologia foi estruturada e tornariam a
obra extensa.
Portanto, este manual um compilado de diversas publicaes, protocolos
de anlise e apostilas utilizadas por profissionais na rea de alimentos, elaborado
no intuito de ofertar aos estudantes do Curso Tcnico em Qumica um suporte
para a rpida aprendizagem sobre os principais procedimentos analticos
microbiolgicos utilizados em instituies de ensino, laboratrios de controle de
qualidade e rgos fiscalizadores, com a aplicao de conceitos que constituem
a parte terica da disciplina de Microbiologia e que serviro como referncia para
estudos posteriores.
Desejo a todos os estudantes que porventura vierem a consultar esta obra,
boa leitura e sucesso.
Cludio Rafael Kuhn, Prof. Dr.

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1.

BOAS PRTICAS DE LABORATRIO

1. Ao entrar e sair do laboratrio: realizar a assepsia nas mos com lcool 70%
antes e aps os procedimentos de anlise;
2. Limpar as bancadas e a capela de fluxo laminar com lcool 70%, antes e aps
a utilizao;
3. O laboratrio no dever ficar aberto sem um responsvel, portanto, a ltima
pessoa que sair dever sempre deix-lo fechado. Existe uma chave reserva do
laboratrio, para eventuais necessidades de trabalho em dias ou horrios fora
do expediente da instituio. Esta a nica chave disponvel para emprstimo,
portanto, dever sempre ser devolvida ao laboratrio, para que possa servir a
todos os usurios (consulte o professor responsvel pelo laboratrio);
4. Nunca alterar a temperatura das estufas quando estas estiverem ocupadas.
Mesmo vazia qualquer alterao dever ser avisada aos demais, para evitar
enganos que conduzam a erros e perdas de trabalho
5. As pipetas, aps sua utilizao devero ser imediatamente imersas em
provetas ou recipientes contendo solues desinfetantes (Lisoform, gua
sanitria, etc.);
6. Os resultados de anlises realizadas pelo laboratrio no podem ser
comentados fora do local de trabalho, ou seja, deve-se manter sigilo
profissional: os resultados s interessam a quem solicitou a anlise; alm
disso, as anlises so realizadas por alunos e com fins didticos; portanto, no
tem validade para fins de emisso de laudo e/ou emisso de pareceres;
7. Verificar diariamente as autoclaves e, semanalmente, trocar a gua de
aquecimento;
8. Deve ser estabelecido um programa de controle contra infestaes (insetos e
roedores);

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2.

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As atividades prticas de Microbiologia tm como objetivo ensinar ao


estudante os princpios gerais e mtodos utilizados no estudo de microbiologia.
Nestas aulas sero utilizadas amostras que podem conter uma variedade de
bactrias, sendo algumas patognicas para o homem, portanto essencial que as
normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminaes acidentais.
01- O uso do guarda-p obrigatrio, enquanto a pessoa estiver no laboratrio. O
avental no dever sair do recinto de trabalho; aps o trmino da aula, guardar
em sacola plstica e lav-lo;
02- Utilizar o laboratrio, suas instalaes e equipamentos exclusivamente em
trabalhos de interesse didtico;
03- Durante o trabalho, somente pessoas autorizadas devero ter acesso ao
laboratrio;
04- Manter o laboratrio limpo e organizado. Incluir no tempo de programao do
trabalho a limpeza do material utilizado;
05- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes
e equipamentos.
06- Lavar as mos com soluo de lcool 70% e calar luvas de procedimento ao
iniciar a anlise (caso necessrio). Se for portador de algum ferimento nas
mos, procurar no tocar no material e, obrigatoriamente, usar luvas de
procedimento.
07- Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula
prtica, com soluo de lcool 70%..
08- Aps o trmino do procedimento, lavar as mos antes de sair do laboratrio e
fazer assepsia com soluo de lcool 70%
09- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a
anlise.
10- Utilizar exclusivamente material estril para a anlise.
11- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente
desinfeco e esterilizao. O mesmo procedimento dever ser repetido se
ocorrer ferimentos ou cortes.
12- No deixar seus pertences sobre os balces onde os experimentos sero
realizados
13- No comer, beber ou fumar no laboratrio.
14- Manter canetas, dedos e outros utenslios longe da boca.
15- No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

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16- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando


sobre a bancada.
17- Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.
18- Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na
estufa nem mesmo despejar na pia.
19- Antes de acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou
substncias inflamveis por perto.
20- Trabalhe sempre prximo ao fogo (ver quadro 01, abaixo).
21- Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscpio deve ser manuseado
cuidadosamente e aps o seu uso, deslig-lo, limp-lo e colocar a capa.
22- Siga exatamente as instrues do protocolo de anlise e as explicaes do
professor. No execute qualquer procedimento em caso de dvida.
Lembre-se: pergunte, esclarea e trabalhe com segurana.
23- Avisar ao professor em caso de contaminao acidental.
QUADRO 1 UTILIZACAO DO BICO DE BUNSEN
A utilizao do Bico de Bunsen essencial, pois visa diminuio de microorganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma
regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No
caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior
temperatura e no forma fuligem.
importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato
importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, j
que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: Zona
Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para Flambagem), Zona
Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j
podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 01: Zonas de combusto na chama em bico de Bunsen

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3.

RISCO BIOLGICO

O conceito de Biossegurana e sua respectiva aplicao tm como objetivo


principal dotar os profissionais e as instituies de ferramentas que visem
desenvolver as atividades com um grau de segurana adequado seja para o
profissional da rea qumica, de sade, de alimentos seja para o meio ambiente
ou para a comunidade.
Nesse sentido, podemos definir Biossegurana como sendo a condio
de segurana alcanada por um conjunto de aes destinadas a prevenir,
controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s atividades que possam
comprometer a sade humana, animal, vegetal e o ambiente.
A avaliao de risco incorpora aes que objetivam o reconhecimento ou a
identificao dos agentes biolgicos e a probabilidade do dano proveniente
destes. Tal anlise ser orientada por vrios critrios que dizem respeito no s ao
agente biolgico manipulado, mas tambm ao tipo de ensaio realizado, ao prprio
trabalhador e, quando pertinente, espcie animal utilizada no ensaio. Deve
contemplar as vrias dimenses que envolvem a questo, sejam elas relativas a
procedimentos (boas prticas: padres e especiais), a infraestrutura (desenho,
instalaes fsicas e equipamentos de proteo) ou informacionais (qualificao
das equipes). Tambm a organizao do trabalho e as prticas gerenciais
passaram a ser reconhecidas como importante foco de anlise, seja como
causadoras de acidentes, doenas e sofrimento, ou como integrantes
fundamentais de um programa de Biossegurana nas instituies.
Os agentes biolgicos que afetam o homem, os animais e as plantas so
distribudos em classes de risco assim definidas:
Classe de risco 1 (baixo risco individual e para a coletividade): inclui os
agentes biolgicos conhecidos por no causarem doenas em pessoas ou animais
adultos sadios. Exemplo: Lactobacillus sp.
Classe de risco 2 (moderado risco individual e limitado risco para a
comunidade): inclui os agentes biolgicos que provocam infeces no homem ou
nos animais, cujo potencial de propagao na comunidade e de disseminao no
meio ambiente limitado, e para os quais existem medidas teraputicas e
profilticas eficazes. Exemplo: Schistosoma mansoni.
Classe de risco 3 (alto risco individual e moderado risco para a
comunidade): inclui os agentes biolgicos que possuem capacidade de
transmisso por via respiratria e que causam patologias humanas ou animais,

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potencialmente letais, para as quais existem usualmente medidas de tratamento


e/ou de preveno. Representam risco se disseminados na comunidade e no meio
ambiente, podendo se propagar de pessoa a pessoa. Exemplo: Bacillus anthracis.
Classe de risco 4 (alto risco individual e para a comunidade): inclui os
agentes biolgicos com grande poder de transmissibilidade por via respiratria ou
de transmisso desconhecida. At o momento no h nenhuma medida profiltica
ou teraputica eficaz contra infeces ocasionadas por estes. Causam doenas
humanas e animais de alta gravidade, com alta capacidade de disseminao na
comunidade e no meio ambiente. Esta classe inclui principalmente os vrus.
Exemplo: Vrus Ebola.
Classe de risco especial (alto risco de causar doena animal grave e de
disseminao no meio ambiente): inclui agentes biolgicos de doena animal
no existente no Pas e que, embora no sejam obrigatoriamente patgenos de
importncia para o homem, podem gerar graves perdas econmicas e/ou na
produo de alimentos.

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4.

LAUDO MICROBIOLGICO

Nesta seo, so apresentadas consideraes que devem constar em um


laudo de anlises microbiolgicas. O modelo de documento deve ser consultado
no apndice 5.
4.1.

Conceitos

Com a finalidade de avaliar a qualidade microbiolgica, entende-se por:


I.

Produtos com condies higinicas insatisfatrias

Aqueles que apresentam micro-organismos indicadores higinicos


(mesfilos, fungos, coliformes totais, etc.) previstos na legislao vigente e acima
dos valores legais permitidos ou, caso no constem na legislao, acima do limite
geral de segurana microbiolgica (106 UFC.g-1) ou de limites estabelecidos por
rgos internacionais (APHA, FDA, etc.)
II.

Produtos em condies higinico-sanitrias insatisfatrias e/ou


potencialmente capazes de causar intoxicao/infeco alimentar

Aqueles que apresentam micro-organismos indicadores sanitrios (S.


aureus, B. cereus, C. perfringens, E. coli, etc.) previstos na legislao vigente e
acima dos valores legais ou, caso no constem na legislao, acima do limite geral
de segurana microbiolgica (106 UFC.g-1) ou de limites estabelecidos por rgos
internacionais (APHA, FDA, etc.)
III.

Produtos txicos

Aqueles que apresentam toxinas biolgicas pr-formadas.


IV.

Produtos deteriorados

So os que apresentam alteraes fsicas, qumicas ou sensoriais


pertinentes a cada classe de produto, resultante da ao microbiana.
4.2.
I.

Interpretao de resultados e concluses


Produto de acordo com os padres legais vigentes

Quando os resultados esto em acordo com os limites previstos na


legislao.

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II. Produto em desacordo com os padres legais vigentes


Quando os resultados ultrapassarem os limites previstos na legislao, no
laudo devero constar os itens fora dos respectivos limites.
4.2.1.

Consideraes

Quando o produto estiver configurado nos conceitos I e II (item 4.1) a


concluso do laudo deve conter explicitamente: condies higinicas
insatisfatrias ou condies sanitrias insatisfatrias, respectivamente.
Nestes casos, o destino final ser definido pela autoridade sanitria.
Quando o produto apresentar contagens padro em placas, coliformes
totais ou de fungos acima de dez vezes e at cem vezes os limites estabelecidos
em padres especficos, na concluso do laudo dever constar explicitamente
produto inaceitvel para consumo direto.
Nestes casos, o destino final ser definido pela autoridade sanitria.
Quando o produto estiver configurado nos conceitos III e IV (item 4.1), ou
apresentar contagens padro em placas, coliformes totais, coliformes
termotolerantes ou de fungos acima de cem vezes os limites estabelecidos em
padres especficos, na concluso do laudo dever constar explicitamente
produto imprprio para consumo.
Nestes casos, o destino final ser definido pela autoridade sanitria.

4.2.2. Exemplos de situaes analticas.


Determinaes
Salmonella
S. aureus
B. cereus
C. Sulfito redutores
Coliformes
termotolerantes

Parecer

Situao A
Ausncia
At 1.000
At 1.000
At 500
At 100

Produto aceitvel
para consumo.

Situaes/interpretaes
Situao B
Ausncia
1.000 10.000
1.000 10.000
500 10.000

Situao C
Presena
100.000 ou toxina
10.000
10.000

100 a 500

500

Condies higinicas
insatisfatrias

Produto imprprio
para consumo,
acompanhado do
termo deteriorado
ou potencialmente
capaz de causar
intoxicao/infeco
alimentar

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5.

PREPARO DO MATERIAL PARA ANLISE MICROBIOLGICA


5.1.

Esterilizao do material

Todo material que entrar em contato com o alimento/amostra analisado


deve estar esterilizado. No permitido, sob hiptese alguma, o uso de material
no estril ou sem uma adequada assepsia. A esterilizao deve ser feita em
estufa ou autoclave. Frascos e/ou tubos com rosca devem ser esterilizados em
autoclave, enquanto pipetas e placas, quando nos cilindros de inox ou enrolados
em papel Kraft, devem ser esterilizadas em estufa.
A esterilizao de vidraria em estufas preferida porque, ao final da
esterilizao, o material encontra-se completamente seco, pronto para uso,
dispensando a permanncia em estufa de secagem.
5.1.1. Uso da estufa
O material a ser esterilizado em estufa deve permanecer a 170C durante
duas horas.
Esterilizar Placas de Petri e pipetas em cilindros de inox fechados. Dever ser
colocado um chumao de algodo hidrofbico na extremidade superior das
pipetas.
Decorrido o tempo de esterilizao, deixar esfriar por si: a abertura ainda
quente poder danificar o material devido brusca variao de temperatura.
5.1.2. Uso da autoclave
Deve-se autoclavar o material a 121C e 1atm de presso por 15 minutos, ou
conforme recomendao especfica.
Frascos de vidro (erlenmeyers, provetas, etc.) devem ter sua boca protegida
por uma bucha de algodo hidrofbico, recoberta por papel Kraft amarrado
com cordo ou atilho de borracha.
Frascos e/ou tubos com tampa devem ser auto clavados com as tampas
afrouxadas; estas devem ser apertadas na hora de retirar o material da
autoclave.
Quando houver meios de cultura contendo Tubos de Durhan deve-se abrir a
autoclave apenas quando esta estiver fria, para evitar a formao de bolhas de
ar dentro do tubo.
Usar sempre fita de verificao da eficincia da autoclave no material a
autoclavar (tanto no material limpo quanto no contaminado).
Nunca encher demais a autoclave, para melhorar a eficincia trmica do
equipamento.

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Na esterilizao de vidraria em autoclave, recomendvel liberar o vapor


imediatamente aps o trmino do tempo de esterilizao, atravs da vlvula
de descarga de vapor. Esse cuidado diminui o acmulo de condensado e
facilita a secagem do material, porm, ateno: essa prtica recomendada
para frascos vazios. No caso de meios de cultura, diluentes e reagentes,
necessrio aguardar que a presso baixe at zero, antes de descarregar o
vapor, pois, em caso contrrio, poder ocorrer perda de lquido por
evaporao.
5.1.2.1.Funcionamento da autoclave
Colocar gua no fundo da autoclave at a altura do apoio do cesto.
Introduzir o cesto contendo o material a ser auto clavado, adaptar a tampa e
fechar os parafusos, deixando a vlvula de escape de vapor aberta.
Ligar a autoclave no mximo de intensidade. A princpio, haver expulso do
ar contido na caldeira. Quando a gua comear a ferver haver sada de um
jato intermitente de ar misturado com vapor d'gua. Quando todo o ar for
expulso, comear a sair apenas um jato contnuo de vapor d'gua.
Neste momento, fechar a vlvula de escape de vapor e observar o aumento de
presso acusado pelo manmetro.
Ao atingir a temperatura desejada, passar o boto para intensidade mdia
mantendo-se neste nvel pelo tempo desejado.
Decorrido este tempo, desligar a autoclave e esperar que a presso desa
zero; ento, abrir a vlvula de escape de vapor. Quando no houver mais
sada de vapor, abrir a tampa e retirar o material.
5.2.

Meios de cultura

Todos os meios de cultura empregados numa anlise microbiolgica devem


ser esterilizados.
Preparar os meios de cultura conforme instrues do fabricante se forem
meios comerciais. Se forem meios formulados, prestar ateno especial
pesagem dos componentes. Em meios nos quais necessria a correo do pH,
esta dever ser realizada antes da adio do gar.
Colocar uma bucha de algodo hidrofbico na boca de cada frasco e cobrir
com papel Kraft amarrado com cordo.
No caso de meios preparados em tubos de ensaio, colocar os tubos com as
tampas frouxas em bquer de plstico, ou outro recipiente adequado, e cobri-lo
com papel, onde dever ser feita a identificao.
Todo material deve ser identificado, devendo ser colocada a data de preparo
dos meios de cultura, assim como quantidades e outros dados necessrios
identificao.

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Alguns meios de cultura especiais no podem ser auto clavados, devendo


ser esterilizados por simples fervura ou em vapor fluente (autoclave aberta), ou,
ainda, filtrados. Seguir, ento, as recomendaes do fabricante.
Aps a esterilizao, os meios devem ser conservados sob refrigerao. As
placas de Petri contendo meios slidos devero ser secas antes do uso, em
estufas bacteriolgicas. Procede-se a desinfeco, com lcool 70%, das
superfcies que entraro em contato com as placas e estas permanecero abertas
por um tempo ao redor de 10 a 15 minutos, para secagem da superfcie do gar.
5.3.

Outros reagentes

Outros reagentes, como solues tampes de diluio, gua, soluo de


cidos ou lcalis, etc., precisam estar esterilizados se forem entrar em contato
com o alimento, podendo ser esterilizados na autoclave, junto com os demais
meios de cultura, ou ento, filtrados em filtros de esterilizao.

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6.

LIMPEZA DO MATERIAL CONTAMINADO


Todo o material utilizado nas anlises microbiolgicas deve ser
descontaminado antes do descarte e/ou lavagem. Autoclavar por 30 minutos a
121C e 1 atm de presso.
Placas e/ou tubos de ensaio devem ser auto clavados dentro de um bquer
plstico (ou outro recipiente adequado), para evitar que seus contedos derramem
dentro da autoclave. Os tubos devem ter suas tampas afrouxadas e devem ser
retirados parafilmes ou etiquetas antes de colocar o material para autoclavar.
Ponteiras e pipetas devem ser colocadas em solues desinfetantes
imediatamente aps o uso, para posteriormente serem auto clavadas.
Saindo da autoclave, somente os meios lquidos devem ser desprezados na
pia.
Meios slidos, se ainda quentes (fundidos) devem ser colocados em um
recipiente (ex.: bquer), devendo ir para o lixo apenas quando solidificarem. Nunca
colocar na pia. Se j estiverem solidificados, na hora da limpeza, retirar da placa
com uma esptula ou, se for tubo, com uma escovinha fina.
No caso de material que apresente mau cheiro, no colocar na lixeira do
laboratrio. Acondicionar em um saco ou sacola plstica e levar para a lixeira no
exterior do prdio.
6.1.

Lavagem do material

Para o bom desenvolvimento de um trabalho, fundamental que toda a


vidraria e material utilizado nas anlises seja muito bem lavado, pois resduos
orgnicos ou de sabo podem comprometer toda a anlise.
Sempre que possvel, deve-se deixar a vidraria imersa em soluo
detergente (Extran) por algumas horas, para facilitar a lavagem e remoo de
resduos.
Devem ser retirados os chumaos de algodo das pipetas antes de coloclas de molho.
Devem-se usar escovas, esponja, gua e detergente na lavagem do
material. Materiais difceis de lavar, como ponteiras e tubos de Durhan, devem ser
fervidos em gua e detergente por alguns minutos, para facilitar a limpeza.
No conseguindo uma boa limpeza da vidraria, deixar de molho em soluo
sulfocrmica ou soluo alcolica 1N de hidrxido de sdio por alguns minutos a
algumas horas, dependendo da aderncia do material a ser removido. Proteger as
mos com luvas de borracha, ao manusear estas solues.
Todo material deve ser "muito bem" enxaguado em gua corrente e com
gua destilada antes de ser colocado para secar na estufa.

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Bales e pipetas volumtricas devem secar temperatura ambiente (para


no descalibrar).
6.1.1. Lavagem de ependorfs e tips grandes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Autoclavar a 121C por 15 minutos.


Colocar em uma soluo de gua com detergente.
Lavar individualmente com escova (internamente).
Enxaguar com gua destilada.
Ferver por 15 minutos em microondas numa soluo de EDTA 5mM,
mexendo com basto de vidro a cada 5 minutos.
Conservar a soluo de EDTA e ferver por 10 minutos em gua destilada.
Repetir 1 vez os passos 5 e 6.
Remover a gua (individualmente, se necessrio).
Secar em estufa a 65C (mximo).
6.1.2. Lavagem de tips pequenos

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Autoclavar a 121C por 15 minutos.


Transferir para o rack especial em soluo sulfocrmica.
Lavar bem com gua destilada.
Ferver por 10 minutos em microondas em recipiente com gua destilada.
Lavar com gua destilada.
Remover a gua.
Secar em estufa a 65C (mximo).
6.2. Testes para verificao da eficincia da lavagem e enxgue na
remoo de resduos
6.2.1. Verificao do pH

Tomar alguns frascos de uma batelada de material lavado, principalmente


aquele submetido a tratamento com soluo sulfocrmica ou soluo de NaOH e
adicionar algumas gotas de soluo 0,04% de azul de bromotimol, observando a
cor. Em pH neutro, a soluo permanece verde, em condies cidas (pH 6,5 ou
menor) ocorre viragem para amarelo e em condies alcalinas (pH 7,3 ou maior)
ocorre viragem para azul. Alternativamente, pode-se utilizar tiras de papel
indicador de pH.

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7.

ANLISES MICROBIOLGICAS

Nesta seo, so elencadas algumas das principais anlises


microbiolgicas utilizadas industrialmente, em processos/programas de controle de
qualidade, voltadas para a deteco tanto de micro-organismos deterioradores
como patognicos.
7.1.

Avaliao microbiolgica de superfcies Swab teste

Boas condies de higiene so fundamentais na indstria moderna,


particularmente em processos envolvendo manipulao. A contaminao
microbiolgica de superfcies e equipamentos nas reas de produo ou
laboratrios deve ser monitorada e controlada diariamente.
A coleta de amostras efetuadas em equipamentos, no ambiente e em
utenslios para avaliao microbiolgica tem sido ferramenta indispensvel na
aplicao de boas prticas de fabricao. Os locais para retirada de amostras em
equipamentos devem ser selecionados de modo que incluam todos os pontos
sujeitos a abrigarem micro-organismos, que podem direta ou indiretamente
contaminar o produto e assim comprometer o processo industrial de manufatura.
A amostragem pelo mtodo de superfcie de contato tem o propsito de
avaliar os procedimentos de sanitizao e a interpretao dos resultados deve ser
baseada no conhecimento do produto, do processo e dos equipamentos para se
determinar a significncia dos dados.
Testes em forma de Swabs so teis na determinao da eficincia do
processo de higienizao de superfcies, equipamentos, manipuladores e reas de
processamento nas indstrias de bebidas, alimentos, cozinhas e hospitais. Nessa
metodologia, podem ser pesquisadas diferentes categorias de microrganismos,
variando-se apenas condies de cultivo (temperatura, por ex.) ou de inoculao.
O swab nada mais do que um cotonete de cabo comprido que deve ser
esterilizado num invlucro de papel, sendo um meio extremamente barato e de
uso banal em laboratrios de anlises clnicas e microbiolgicas. Cada tubo com
swab absorve a quantidade correta de caldo seletivo para a aplicao desejada.

7.1.1. Material requerido para anlise

Swabs
Diluente: gua peptonada 0,1% ou soluo salina 0,85%
Tubos de ensaio com tampa rosquevel
Pipetas de 1,0ml ou ponteiras para micropipeta de 1000L (estreis)
Placas de Petri
Meio de cultura: gar padro para contagem (gar PCA)
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Estufa incubadora regulada a 35-37C.


A sequncia de operaes para execuo do procedimento analtico
demonstrada na figura 02.
7.1.2. Preparo do material
a) Preparar os swabs, utilizando palitos para espetinho e algodo, no formato
de um cotonete, com algodo em apenas uma das pontas;
b) Enrolar os swabs individualmente em papel Kraft ou alumnio;
c) Preparar as placas vazias e devidamente embaladas, para esterilizao;
d) Preparar os tubos de ensaio contendo 10,0ml de gua peptonada 0,1%;
e) Preparar o meio em erlenmeyer, segundo a quantidade desejada, de acordo
com as instrues no rtulo e fechar com uma bucha de algodo, protegida
com papel;
f) ESTERILIZAR O MATERIAL (121c, 15min);
g) Obs: Utilize corretamente a autoclave, verificando o nvel de gua antes da
sua utilizao.

7.1.3. Inoculao
a) Abrir o swab para coleta somente no momento de pass-lo sobre a
superfcie desejada, em uma rea de aproximadamente 25cm2.
b) Imediatamente aps a coleta, colocar no tubo de ensaio contendo a gua
peptonada 0,1%, (a ponta com algodo ficar imersa) quebrando a
extremidade excedente e fechando o tubo;
c) No laboratrio, desinfetar a bancada com etanol 70%, para remover os
contaminantes presentes, trabalhando com o bico de Bunsen aceso;
d) Verter nas placas, cerca de 20 ml de gar Padro para Contagem,
previamente resfriado a 45C.
e) Obs: Aguardar completa solidificao do meio de cultura, distribuindo as
placas numa superfcie plana;
f) Do tubo contendo o swab, realizar as inoculaes spread plate (0,1ml) na
superfcie das placas contendo gar, abrindo apenas o suficiente para
inserir a pipeta, prximo ao bico de Bunsen.
OBS: podem ser realizadas ainda, inoculaes do tipo pour plate, conforme
os objetivos da anlise.
g) Incubar as placas invertidas a 35-37C, por 48h ou 5C, 5d;

7.1.4. Contagem das colnias e clculo dos resultados


Selecionar as placas com 25 a 250 colnias e contar com o auxlio de uma
lupa, em um contador de colnias.
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Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) por grama ou


mL da amostra, de acordo com os critrios de contagem de micro-organismos
(apndice 2).

Figura 02 Diagrama esquemtico para a avaliao higinica de superfcies.

7.1.1. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, no item resultados e discusso:
a) Informaes sobre quais os possveis microrganismos que podem estar
presentes, caracterizando-os quanto morfologia, habitat, patogenicidade,
condies de crescimento.
b) Comparao dos resultados obtidos com resultados de pesquisas similares
realizada na prtica.

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7.2.

Enumerao de coliformes totais e fecais

O habitat de bactrias que pertencem ao grupo coliforme o trato


gastrintestinal do homem e animais de sangue quente, existindo ainda outros
gneros como Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, que podem persistir longos
perodos e se multiplicar em ambientes no fecais.
Na contagem de coliformes, distinguem-se dois grupos: coliformes totais e
fecais. O ndice de coliformes totais utilizado para avaliar condies higinicas,
sendo que altas contagens significam contaminao ps-processamento, limpeza
e sanitizao ineficientes, tratamento trmico inadequado ou multiplicao durante
o processo de estocagem.
O ndice de coliformes fecais/termotolerantes empregado como indicador
de contaminao fecal, ou seja, de condies higinico-sanitrias, visto que
presumir-se que a populao deste grupo constituda de uma alta proporo de
E. coli, que habita o trato intestinal de homens e animais. Assim, sua presena
indica a possibilidade de ocorrerem outros micro-organismos entricos, bem como
de sorotipos de E. coli responsveis por gastroenterites, hemorragias, diarrias.
7.2.1. Material necessrio
Meios de cultura
Caldo lauril sulfato triptose (LST)
Caldo lactosado bile verde brilhante (VBBL)
Caldo EC
Vidraria esterilizada
Banho-maria a 44,5C
Estufa a 35C
7.2.2. Procedimento
Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL
de gua peptonada 0,1%.
-1

Proceder diluio seriada decimal (1mL da diluio 10


adicionados a 9mL de diluente, e assim por diante at diluio
requerida).
De cada diluio do alimento, transferir 1mL para 3 tubos contendo o
meio LST, homogeneizando atravs de agitao cuidadosa;
Incubar a 35C durante 48 horas;
Decorrido o tempo de incubao separar os tubos positivos, ou seja,
que apresentarem gs no interior do tubo de Durhan (Fig. 03), e
dispensar os demais.

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Figura 03 tubos com caldo LST sem crescimento (e) e com produo de gs (d)

Prosseguir como em 6.1.2.1. para pesquisa de coliformes totais e


como em 6.1.2.2. para pesquisa de coliformes fecais.
7.2.2.1.Pesquisa de coliformes totais
a) Transferir, com o auxlio de ala de nquel-cromo, uma alada de cada tubo
positivo de LST para outro tubo contendo caldo lactosado bile verde
brilhante (VBBL);
b) Incubar a 35C durante 48 horas;
c) Selecionar os tubos positivos (com gs no interior dos tubos de Durhan);
d) Calcular o "Nmero Mais Provvel" (NMP) de coliformes totais por grama
(mL) de alimento utilizando a sequncia numrica de tubos positivos na
Tabela NMP (apndice 4).
7.2.2.2.Pesquisa de coliformes termotolerantes
a) Transferir uma alada de cada tubo positivo de caldo LST para outro tubo
contendo caldo EC;
b) Incluir, para controle da temperatura do banho-maria, um tubo de caldo EC
inoculado com uma cultura de E. coli (controle positivo) e outro inoculado
com uma cultura de Enterobacter aerogenes (controle negativo);
c) Incubar a 44,5C durante 24 horas;
d) Selecionar os tubos positivos (com gs no interior dos tubos de Durhan)
(Fig. 04);

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Figura 04 tubos com caldo EC sem crescimento (e) e com produo de gs (d)

e) Calcular o "Nmero Mais Provvel" (NMP) de coliformes fecais por grama


(mL) de alimento utilizando a sequncia numrica de tubos positivos na
Tabela NMP (apndice 4).

7.2.2.3.Contagem e confirmao de E. coli


A partir dos tubos EC positivos, prosseguir da seguinte forma:
a) Para cada tubo EC positivo estriar uma alada da cultura em placas de gar
eosina azul de metileno (EMB).
b) Incubar as placas a 35C por 24hs e observar o desenvolvimento de
colnias tpicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem centro
brilho metlico).
c) Transferir duas colnias bem isoladas para tubos com gar nutriente
(AN)/gar PCA (gar inclinado) e incubar os tubos a 35C por 24hs.
d) A partir das culturas puras em AN/PCA fazer colorao de Gram e inocular
nos meios teste abaixo, para as provas bioqumicas de indol VM, VP e teste
citrato.
I.

Teste de citrato
Caldo Citrato de Koser
Inocular uma alada, incubar a 35C, durante 72 a 96hs.
Crescimento positivo: turbidez
Crescimento negativo: lmpido
Cepas de E. coli so citrato negativas

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gar Citrato de Simmons


Transferir uma alada de cultura para a rampa dos tubos com gar citrato
inclinado
Incubar a 35C, durante 48hs.
O crescimento altera a cor do meio de verde para azul e indica teste
positivo.
O no crescimento e no alterao da cor do meio indica teste negativo.
II.

Teste de indol (caldo triptona 1%)


Inocular uma alada, incubar a 35C, durante 24hs..
Adicionar 5 gotas do Reagente de Kovacs para cada 4,0mL de cultura e
agitar levemente
O desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfcie do meio de
cultura indica teste positivo.
A permanncia do anel na cor amarela do reagente indica teste negativo.
Cepas de E. coli podem ser indol positivas ou negativas.
III.

Teste de Vermelho de metila e Voges-Proskauer (caldo VM-VP)


Inocular uma alada, incubar a 35C, durante 48hs.
Para o teste VP
Transferir 1,0mL de cultura para um tubo de ensaio
Adicionar 0,6mL de soluo de alfa Naftol 5% e agitar
Adicionar 0,2mL de soluo de KOH 40% e agitar
Adicionar cristais de creatina (pitada) para acelerar a reao
Descansar por uma hora e observar periodicamente.
O desenvolvimento de cor vermelha ou rsea no meio indica teste positivo
A permanncia do meio na cor do reagente (amarelada ou esverdeada)
indica teste negativo
Cepas de E. coli so VP negativas
Para o teste VM
Reincubar a cultura remanescente no caldo VM-VP por 48hs adicionais e
realizar o teste de VM
Adicionar a cada 2,5mL de cultura, 5 gotas de soluo de vermelho de
metila
Observar imediatamente se o meio adquire cor vermelha (teste positivo) ou
amarela (teste negativo)
As cepas de E. coli so VM positivas

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Considerar como E. coli a seguinte combinao de resultados:


Colorao de Gram: Bastonetes, Gram negativas.
Indol + ou
VM +
VP
Citrato
Anotar o nmero de tubos EC positivos estriados para as placas com
gar EMB que foram confirmados como E. coli e determinar o NMP em tabela
apropriada s diluies utilizadas.

7.2.3. Resultados
Expressar os resultados das contagens de coliformes totais e fecais
em "Nmero Mais Provvel por grama (mL) de alimento".
Obs.: Em anlise de leite, suprime-se a etapa de inoculao da amostra em
LST, inoculando-se sries de 3 tubos, com as diluies adequadas,
diretamente em caldo VBBL, para pesquisa de coliformes totais. Dos tubos
positivos, pega-se uma alada e inocula-se em caldo EC, para confirmao
de coliformes fecais.

7.2.4. Atividades

a)
b)
c)
d)

Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).


Insira no relatrio, as seguintes informaes:
Informaes sobre pesquisas similares realizada na prtica, para efeito de
comparao com os resultados obtidos;
Coloque a classificao de risco biolgico para o micro-organismo;
Cite outras cepas de E. coli que representam risco.
Pesquise sobre o grupo de enterobactrias, destacando os principais
gneros de microrganismos que representam risco, patogenicidade, origem
de contaminao (habitat natural, como chegam a alimentos) e medidas de
controle.

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Figura 05 Diagrama esquemtico para a contagem de coliformes segundo a tcnica dos


tubos mltiplos e provas bioqumicas.

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7.3.

Pesquisa de Salmonella spp.

As salmonelas so muito difundidas, podendo estar presentes na gua, no


solo, no ar, nas guas residuais, nos animais, nos seres humanos, nas fezes e
nos equipamentos. Entretanto, seu habitat natural o trato intestinal de seres
humanos e animais. Presume-se que todas as espcies e cepas de salmonelas
so patognicas para o homem.
Entre as enfermidades graves esto a febre tifide e a paratifoide, que
podem ocasionar febre, diarria, cefalia e septicemia. As salmoneloses so
infeces entricas produzidas por outras cepas e desenvolvem um quadro de
infeco gastrointestinal com dores abdominais, diarreia, febre, vmito, prostrao,
sendo raramente fatais.
Existem vrios alimentos relacionados com a transmisso de salmonelas,
sendo a maioria deles de origem animal ou contaminados por alimentos de origem
animal.
A tcnica de anlise um mtodo cultural clssico, desenvolvido com a
finalidade de garantir a deteco do micro-organismo, mesmo em condies
desfavorveis, nas quais a microbiota competidora muito maior que a populao
de Salmonella ou nos casos onde as clulas da bactria estejam injuriadas pelo
processo de preservao.
7.3.1. Material necessrio
Meios de cultura:
gua peptonada tamponada
Caldo Rappaport-Vassiliadis
Caldo tetrationato
Soluo de iodo
Soluo de verde brilhante 1:1000
gar Hektoen-enteric
gar XLD
gar Bismuto Sulfito (BS)
gar lisina ferro (LIA)
gar trplice acar ferro (TSI)
gar urease (UA)
Soros polivalentes somtico e flagelar
Vidraria esterilizada
Estufa a 35C e 42C
Contador de colnias
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7.3.2. Procedimento
7.3.2.1.Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25g ou 25mL do alimento com 225mL de gua
peptonada tamponada. Incubar a 37C, por 24 horas.
7.3.2.2.Enriquecimento
Transferir 1mL de caldo de pr-enriquecimento para um tubo
contendo 10mL de caldo tetrationato (acrescentar ao tetrationato 0,2mL de
iodo e 0,1mL de verde brilhante no momento do uso) e 0,1mL para um tubo
contendo 10mL de caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar o primeiro a 35C e
o segundo a 42C (em banho-maria) por 24 horas.
7.3.2.3.Semeadura em gar seletivo
Semear uma alada de cada cultura do enriquecimento em placas de
gar XLD, gar BS e gar Hektoen-enteric (HE), de modo a obter colnias
isoladas. Incubar a 35C por 24 horas.
7.3.2.4.Identificao de colnias suspeitas
gar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem
centro negro. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir
colnias com centro negro grande e brilhante, ou mesmo inteiramente
negras. Cepas de Salmonella, fermentadoras de lactose produzem
colnias amarelas com ou sem centro negro.
gar HE: colnias verde-azuladas a azuis com ou sem centro negro
(algumas podero ser totalmente negras). Cepas de Salmonella,
fermentadoras de lactose produzem colnias amarelas com ou sem
centro negro.
gar BS: colnias marrons, cinzas ou pretas, com ou sem brilho metlico.
7.3.2.5.Identificao bioqumica
Tocar com a agulha no centro da colnia suspeita e semear em tubo
contendo gar trplice acar ferro (TSI), inclinado, gar lisina ferro (LIA) e
gar urease (UA), nesta ordem e utilizando a mesma picada. Incubar os
tubos de TSI com as tampas ligeiramente afrouxadas e os tubos de LIA
com as tampas bem fechadas. Incubar a 37C/24h.
Reao tpica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo
cido (amarelo), com ou sem produo de H2S (escurecimento do gar)
(Fig. 06). Reao atpica em TSI, que no deve ser descartada se as
demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cido
(amarelos), com ou sem produo de H2S.
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Reao tpica de Salmonella em LIA: fundo e rampa alcalinos (prpura,


sem alterao da cor do meio), com ou sem produo de H 2S (Fig. 07).
Reao atpica em LIA, que no deve ser descartada se as demais
reaes em TSI se apresentarem tpicas: fundo amarelado com rampa
alcalina, com ou sem produo de H2S.
Teste de urease: viragem alcalina do indicador, com alterao da cor do
meio de pssego para cor de rosa escuro (teste positivo), ou
permanncia do meio na cor original (teste negativo). A maioria das
cepas de Salmonella so ureases negativas.

(a)
(b)
(c)
Figura 06 gar TSI sem crescimento (a), com crescimento caracterstico (b) e com
crescimento no caracterstico (c).

Figura 07 gar LIA sem crescimento (e) e com crescimento positivo (d)

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7.3.2.6.Identificao sorolgica
Dever ser feita aps a identificao bioqumica, utilizando-se
inicialmente o soro polivalente somtico (contm anticorpos contra os
antgenos somticos das salmonelas dos grupos A, B, C1, C2, D, E1, E2,
E3, E4 e contra o antgeno Vi) e posteriormente o soro polivalente antiSalmonella flagelar (contm anticorpos contra os antgenos flagelares a, b,
c, d, i, 1, 2, 5) (Probac do Brasil Produtos Bacteriolgicos Ltda.). A
metodologia para a identificao sorolgica a de aglutinao em lmina.
7.3.3. Resultados
Expressar os resultados como "ausncia" ou "presena" de
Salmonella sp em 25g ou 25mL de alimento.

7.3.4. Atividades
Pesquise sobre a importncia do micro-organismo em alimentos (incidncia,
contaminaes, riscos, habitats, etc.), os principais gneros e sua classificao em
relao ao risco biolgico.
Faa uma pesquisa de artigos relacionados presena da bactria em
alimentos e/ou processos industriais e compare com os resultados da prtica.
Elabore o relatrio de aula prtica conforme modelo (apndice 5) e inclua
as informaes pesquisadas.

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Figura 08 Esquema da tcnica de anlise de Salmonella.

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7.4.

Enumerao de clostrdios sulfito-redutores

A bactria Gram-positiva, tem a forma de bastonete e formadora de


esporos, produz toxina, anerbio-aerotolerante, pH timo entre 5,5 8,0,
fermentadora de lactose, produzindo cido. Habita naturalmente o solo, guas
residuais, poeira, fezes humanas e animais.
Os esporos esto amplamente distribudos na natureza, sendo tambm
encontrados em vrios alimentos. Desenvolvem-se em carnes aps o cozimento,
ou em alimentos aquecidos e resfriados lentamente, com consumo tardio.
Tambm se encontram originando intoxicao alimentar em pasta de pescado e
frango refrigerado.
A presena de clostrdios mesfilos em alimentos com baixa acidez indica
que possivelmente o tratamento trmico foi insuficiente para destruir os esporos
existentes nos alimentos perecveis; se detectados em baixo nmero podem
indicar higiene deficiente, enquanto que contagens elevadas podem ser
decorrentes de permanncia do produto em temperaturas de multiplicao.
A toxina termolbil, inativada a 60C, durante 4 minutos. Esta enterotoxina
est ligada a produo de esporos, constituindo sua estrutura e liberada aps a
lise das clulas esporulantes.
H vrios meios de cultura disponveis para a enumerao de C.
perfringens em alimentos, como o gar Sangue Neomicina, gar Sangue
Cicloserina, gar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS), gar Triptona Sulfito
Neomicina (TSN), gar Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), gar Tripticase de
Soja Sangue de Carneiro (TSB) e o gar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC), que
pode ser utilizado com ou sem gema de ovo.
A seletividade destes meios resultante da incorporao de um ou mais
antibiticos, para inibir diversos anaerbios e anaerbios facultativos e, salvo no
caso dos meios com sangue, a caracterstica diferencial comum a todos os demais
a presena de ferro e sulfito. Os clostridios reduzem sulfito a sulfeto, que reage
com o ferro e precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo colnias pretas.
Dentre esses meios, o SPS e o TSN so considerados excessivamente
seletivos e pouco satisfatrios, pois podem inibir diversas cepas de C.
perfringens. O SFP e o gar Sangue Neomicina ao contrrio, so considerados
pouco seletivos e, portanto, mais adequados para situaes em que o microorganismo constitui-se na microbiota predominante no alimento. O gar Sangue
Cicloserina parece adequado para a enumerao de C. perfringens, porm, os
dados disponveis para uma melhor avaliao do seu desempenho so limitados,
uma vez que no tm sido utilizados rotineiramente na anlise de alimentos.
Por esses motivos, o gar TSC tem sido o meio mais utilizado para
enumerao de C. perfringens por plaqueamento direto, constituindo-se tambm
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numa excelente alternativa pra a enumerao de clostridios sulfito-redutores em


geral, conseguindo suprimir o crescimento de praticamente todos os anaerbios
facultativos que acompanham os clostridios em alimentos. importante ressaltar,
entretanto, que o gar TSC (bem como os meios utilizados nas etapas
subseqentes da analise) permite o crescimento e produo de toxina de C.
botulinum, devendo ser observados cuidados durante a execuo dos testes, para
garantir a segurana do analista e do laboratrio.
Na enumerao de C. perfringens o TSC pode ser suplementado com gema
de ovo, para verificar a produo de lecitinase, caracterstica dessa espcie de
Clostridium. A incorporao da gema de ovo ao TSC na etapa inicial da anlise,
entretanto, no apresenta muita vantagem em relao ao TSC sem gema de ovo,
porque nem todas as cepas de C. perfringens produzem halo de reao da
lecitinase, no sendo possvel descartar as colnias sem halo, na confirmao dos
isolados. Adicionalmente, o halo produzido por uma colnia pode ser obscurecido
pelos halos de outras colnias, sendo a reao com a gema de ovo melhor
observada no teste de inibio da atividade de lecitinase pela -toxina da C.
perfringens (Reao de Nagler).
As colnias presuntivas de C. perfringens em gar TSC devem ser
confirmadas por testes bioqumicos, sendo mais recomentdadas as caractersticas
de ausncia de motilidade, habilidade de fermentar a lactose e reduzir nitrato a
nitrito e incapacidade de hidrolisar a gelatina.
A tcnica (Fig. 09) baseia-se na inoculao da amostra (matrias-primas e
alimentos) ou de uma diluio da mesma em meios de cultura seletivos. Aps
incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido
reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferro III,
formando um precipitado negro.

7.4.1. Testes confirmativos


A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas
confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade,
reduo de nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose, fermentao da
rafinose e liquefao da gelatina.

7.4.2. Material necessrio


Meio de cultura:
gar triptose-sulfito-cicloserina TSC ou gar Sahid Ferguson
Perfringens (SFP) base
Sol. D-Cicloserina 4%
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Jarras para anaerobiose


Envelopes geradores de anaerobiose
Vidraria esterilizada
Estufa a 46C
Contador de colnias
Soluo salina peptonada 0,1%;
gar estoque;
gar motilidade - nitrato tamponado;
Meio leite com ferro;
Meio lactose-gelatina;
Caldo vermelho de fenol-base;
Soluo de rafinose 10% ;
Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi);
Meio tioglicolato;
Alfa naftilamina 0,5%;
cido sulfanlico 0,8%;
Polimixina B;
Kanamicina;
Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida;
Gerador de anaerobiose;
Reagentes para colorao de Gram.

7.4.3. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de
gua peptonada 0,1%;
-1

b) Proceder diluio seriada decimal (1mL da diluio 10 adicionados a


9mL de diluente, e assim por diante at diluio requerida);
c) De cada diluio, transferir 1mL para placas de Petri esterilizadas (usar
placas pequenas ou descartveis, que caibam no interior da jarra de
anaerobiose);
d) A cada placa, adicionar cerca de 15mL de gar TSC (acrescentar ao gar
base 1% de D-Cicloserina a 4% no momento do uso), resfriado a 50C,
homogeneizando suavemente;
e) Aps solidificao do gar, colocar nova camada de gar TSC, cobrindo
toda a superfcie do gar ("over-gar");
f) Aps a solidificao da sobre camada, incubar, sem inverter as placas, em
anaerobiose, durante 24 horas a 46C;
g) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as colnias negras e cont-las.

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7.4.3.1.Uso da jarra de anaerobiose


a) Colocar as placas de Petri inoculadas no interior da jarra de anaerobiose,
deixando um espao de pelo menos 5cm entre a ltima placa e a tampa
da jarra.
b) Destacar o papel alumnio que cobre a fita indicadora colocada na lateral
do anaerobac (envelope gerador de anaerobiose - Probac) a qual dever
apresentar cor azul.
c) Usando uma pipeta, distribuir lentamente 20mL de gua destilada sobre
toda a superfcie absorvente do anaerobac, cuidando para no molhar a
fita indicadora.
d) Colocar o anaerobac sobre a ltima placa da jarra de anaerobiose com a
superfcie mida para cima.
e) Para fechar a jarra, colocar a tampa e ala de tal maneira que o parafuso
fique exatamente sobre a depresso circular existente no centro da tampa.
f) Atarraxar o parafuso completamente, para que a jarra fique
hermeticamente fechada.
g) Colocar na estufa. Ao final da incubao, a fita indicadora dever estar
branca e virar para azul quando a jarra for aberta.
Ateno: Para manter a perfeita vedao da jarra, passar mensalmente
vaselina slida no aro de borracha.

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Figura 09 Diagrama esquemtico para anlise de C. perfringens.

7.4.4. Identificao bioqumica


Transferir colnias tpicas e transferir para o meio tioglicolato.
Incubar a 35-37 C.
Inocular a cultura obtida nos meios a seguir, para a confirmao bioqumica.
7.4.4.1. Prova de reduo de nitrato
Esta prova bioqumica tem a finalidade de testar a habilidade do microorganismo em reduzir o nitrato a nitrito.
Dissolver o gar nitrato-motilidade em gua destilada e autoclavar a 121C,
15min.

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Selecionar colnias tpicas por placas, transferindo-as para tubos de ensaio


contendo os meios gar nitrato-motilidade e meio de leite e ferro.
Incubar a 35-37C, 24hs.
Na leitura, adicionar gotas do reativo para nitrato:
Soluo A: cido sulfanlico
cido sulfanlico
1,0g
cido actico
125mL
Soluo B: alfa-naftol
Alfa-naftol
0,5g
cido actico
100mL
Resultado Positivo: aparecimento de cor rosa a vermelho, indicando a presena de
nitrito. A motilidade (Fig. 10) verificada pela migrao da linha de perfurao,
difundindo-se por todo o meio, com turvao.
Resultado Negativo: sem alterao da cor original aps adio do reativo.

Figura 10 Caldo nitrato com crescimento positivo (e) e gar nitrato com reduo do nitrato
a nitrito positivo e motilidade negativa (d)

7.4.4.2.Prova da coagulao do leite


A prova verifica a atuao do micro-organismo sobre o leite, com a
coagulao, peptonizao e produo de gs, principalmente.
Meio de leite e ferro
Leite desnatado
10,0g
gua destilada
100mL
Dissolver o leite desnatado em gua

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Distribuir volumes de 3,0mL em tubos de ensaio contendo malha de ferro


ao fundo
Autoclavar a 121C, 15min
Procedimento:
Inocular uma alada da cultura do meio tioglicolato e incubar a 35C, 1824hs.
Observar a ocorrncia de coagulao do meio e escurecimento (Fig. 11).

Figura 11 Meio de leite e ferro com crescimento positivo (e) e crescimento negativo (d)

7.4.5. Resultado
Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnia por
grama (UFC.g-1).

7.4.6. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, dentro do item resultados e discusso:
a) Informaes sobre pesquisas similares realizada na prtica, para efeito de
comparao com os resultados obtidos;
b) Coloque a classificao de risco biolgico do micro-organismo;
c) Cite outras cepas de clostrdios que representam risco.

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7.5.

Enumerao de Staphylococcus aureus

A bactria faz parte da famlia Micrococcaceae, tendo como habitat natural


as cavidades nasais, garganta e trato intestinal. Apresenta como principais
caractersticas ser gram-positiva, esporulada, imvel e produtora de toxina,
patognica, aerbia e com temperatura de crescimento entre 6,5 e 45C.
A toxina produzida formada por protenas simples, solveis em gua e
solues salinas, resistente ao enzimtica e tambm termo resistente. Em
alimentos, no so totalmente inativadas pela coco normal, pasteurizao e
outros tratamentos trmicos concorrentes. A dose infectante da toxina
estafiloccica est entre 0,015 e 0,357ug de enterotoxina por Kg de peso corporal.
Produtos de origem animal industrializados, carnes, ovos, leite, pescado,
massas alimentcias, cremes, maionese, doces de confeitaria com ou sem recheio
so os alimentos mais propcios presena do micro-organismo.
A contagem de S. aureus constitui um indicador de qualidade higinicosanitria e pode ser feita com dois objetivos: o primeiro relacionado sade
publica, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicao alimentar e o
segundo relacionado com o controle da qualidade dos processos de produo
industrial de alimentos, condio em que o micro-organismo serve como indicador
de contaminao ps-processo ou das condies de sanificao das superfcies
destinadas ao contato com alimentos.
7.5.1. Material necessrio
Meios de cultura:
Agar Baird Parker
Caldo BHI
gar DNA - azul de toluidina
Plasma de coelho / plasma de cavalo
Vidraria esterilizada
Estufa a 35C
Contador de colnias

7.5.2. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de gua
peptonada 0,1%;
-1

b) Proceder diluio seriada decimal (1,0mL da diluio 10 adicionados a 9mL


de diluente, e assim por diante at diluio requerida);
c) Preparar o gar Baird-Parker conforme instrues do rtulo e esterilizar em
autoclave.
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OBS: antes de verter o gar BP nas placas, adicionar a cada 95,0 mL de meio,
as seguintes solues:
1,0 mL de telurito de potssio a 1%
5,0 mL de emulso de gema de ovo
Preparo da emulso de gema de ovo:
Extrair assepticamente as gemas, colocando-as em uma proveta
esterilizada.
Medir seu volume e adicionar igual volume de soluo salina (0,85%),
esterilizada.
Homogeneizar bem, sem fazer espuma.
Misturar ao gar BP (quente), na proporo indicada.
Preparo da soluo de telurito de potssio
Telurito de potssio
1,0g
gua destilada estril qsp 100mL
Utilizar vidraria esterilizada
d) Aps a mistura da emulso de gema de ovo e da soluo de telurito ao gar BP,
verter o meio nas placas e aguardar a solidificao para inoculao em superfcie
(spread plate).
e) Transferir 0,1mL de cada diluio do alimento para as placas de petri (duas por
diluio) com o meio de cultura gar Baird-Parker, espalhando com a ala de
Drigalsky.
f) Aps completa secagem da superfcie do gar, inverter as placas e incub-las a
35C durante 48 horas (Fig. 12);
g) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as colnias suspeitas (negras,
convexas, lustrosas, rodeadas por um halo claro) e efetuar os testes bioqumicos
de confirmao.

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Figura 12 gar BP com crescimento caracterstico de S. aureus.

7.5.2.1.Identificao bioqumica

7.5.2.1.1.Colorao de Gram
Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram (Cap. 7).
A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para S. aureus. A
presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes
complementares.
7.5.2.1.2.Produo de coagulase
a) Inocular as colnias suspeitas em caldo BHI e incubar a 35C durante 24
horas;
b) Misturar 0,1mL desta cultura com 0,3mL de plasma de coelho;
c) Incubar a 35C, observando a formao de cogulo. Observar, de hora em
hora, durante 6 horas. A ausncia de cogulo indica teste negativo. Utilizar
controles negativo e positivo.
7.5.2.1.3.Prova da catalase
Aps o crescimento em caldo BHI, colocar uma gotcula do inculo numa
lmina de microscpio e gotejar gua oxigenada.
Observar o desprendimento de bolhas, indicativo de S. aureus.

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7.5.2.1.4.Produo de termonuclease
Pipetar, de modo a espalhar, 10mL de gar DNA-azul de toluidina sobre
uma placa de Petri. Aps solidificar, cortar o gar usando um tubo capilar
esterilizado, de modo a obter orifcios de 2mm de dimetro. Remover o gar dos
orifcios por aspirao.
Utilizando pipetas Pasteur, tubos capilares ou micropipetas, adicionar a
cada orifcio, aproximadamente, 10l da cultura em caldo usada para o teste da
coagulase, previamente aquecida durante 15 minutos em banho-maria em
ebulio. Incubar a placa em cmara mida por 4 horas a 35-37oC. Leitura final
com 24h.
Reao positiva: aparecimento de um halo cor de rosa brilhante,
estendendo-se por, pelo menos, 1mm alm das bordas do orifcio.
7.5.3. Resultados
Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias
selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em
considerao a diluio utilizada.
Quando o nmero de colnias confirmadas
for diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a
proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para
contagem de colnias, deste Manual.
O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas
confirmadas.
Expressar o resultado como:
Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC.g-1 ou mL-1 ou
Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x 10y UFC.g-1 ou mL-1.
Quando todas as colnias repicadas so confirmadas pelos testes
confirmativos, o resultado final da contagem ser igual ao nmero obtido na
contagem inicial multiplicado pela diluio (de acordo com o determinado pela
regra de contagem aplicada).
Quando o nmero de colnias confirmadas diferente do nmero de
colnias repicadas, calcular o resultado final utilizando a seguinte frmula:
Cxcxd
R =
R
R = Resultado
C = nmero de colnias contadas
c = nmero de colnias confirmadas

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r = nmero de colnias repicadas


d = diluio utilizada
Exemplo:
Diluio 10-2 = 30 colnias contadas (20 eram tpicas e 10 atpicas).
Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo.
Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes
confirmativos.
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas:
20 x 4 x 100
RT =
= 1.600
5
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:
R
10 x 2 x 100
=
= 400
5
a
O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:
Resultado final:
RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL.

Quando for necessrio contar colnias tpicas e atpicas em placas de


diferentes diluies
Nunca somar colnias tpicas ou atpicas de diferentes diluies, pois
colnias atpicas em uma determinada diluio podero se apresentar tpicas em
diluies subseqentes. Submeter aos testes confirmativos, segundo a
metodologia especfica para cada caso, 3 a 5 colnias tpicas e 3 a 5 colnias
atpicas da diluio escolhida.
Calcular o nmero de UFC/g ou mL somente aps a confirmao de cada
tipo (T e A) em uma mesma diluio.
Exemplo:
-2
Diluio 10 = 240 colnias contadas, das quais 50 eram tpicas e 190
atpicas.
Diluio 10-3 = 20 colnias tpicas e 5 atpicas.
Como na diluio 10-3 o nmero de colnias se encontra fora do intervalo
-2
de preciso e repetitividade, a diluio escolhida para confirmao foi 10 . Destas,
foram repicadas 5 colnias tpicas e 5 colnias atpicas. Todas as colnias tpicas
e 4 atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.

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10-2 RT

50x5x100
5

= 5000

Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:


190x4x100
10-2 RA
=
= 15.200
5
Colnias confirmadas na diluio 10-2 = 20.200 colnias
Resultado final ser a soma do nmero de colnias confirmadas na diluio
escolhida:
5.000
+
2,0 x104UFC/g ou
Res final =
=
15.200
mL.

7.5.4. Atividades
Pesquise em fontes bibliogrficas adequadas (artigos):
a) A presena do micro-organismo em amostras similares e compare com os
resultados obtidos na prtica, apontando, em caso positivo (presena) as
possveis fontes de contaminao e risco devido sua presena, medidas
preventivas, etc.
b) A classificao de risco biolgico para o micro-organismo
Elabore o relatrio de aula prtica e insira essas informaes no item Resultados
e discusso

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Figura 13 Representao esquemtica da tcnica de enumerao de S. aureus.

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7.6.

Enumerao de bactrias aerbias mesfilas

O mtodo de contagem de micro-organismos em placas um mtodo geral,


que pode ser utilizado tanto para a contagem de grandes grupos microbianos,
como os aerbios mesfilos, os aerbios psicrfilos e os bolores e leveduras,
como tambm para a contagem de gneros e espcies em particular, como
Staphylococcus aureus.
O mtodo baseia-se na premissa de que cada clula microbiana presente
em uma amostra ir formar, quando fixada em um meio de cultura slido
adequado, uma colnia visvel e isolada.
Variando o tipo de meio e as condies de incubao possvel selecionar
o grupo, gnero ou espcie que se deseja contar.
Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos
(pares, ttrades, cachos, cadeia) as contagens sero inferiores do que o nmero
de clulas individuais, pois cada um dos arranjos formar uma colnia, neste caso,
a contagem expressa como unidades formadoras de colnias (UFC.g-1 ou mL1
).
Nos alimentos esta contagem detecta o nmero de bactrias aerbias ou
facultativas e mesfilas presentes. A contagem padro em placas (PCA) tem sido
usada como indicador da qualidade higinica dos alimentos, fornecendo tambm
idia sobre seu tempo til de conservao. Sua presena em alimentos indica: (a)
matrias-primas excessivamente contaminadas; (b) limpeza e desinfeco de
superfcies inadequada; (c) higiene inadequada na produo.
7.6.1. Material necessrio
Meio de cultura:
gar Plate Count (PCA)
Vidraria Esterilizada
Estufa a 35C
Contador de colnias
7.6.2. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL
de gua peptonada 0,1%;
-1

b) Proceder diluio seriada decimal (1mL da diluio 10 adicionados a


9mL de diluente, e assim por diante at diluio requerida);
c) De cada diluio do alimento transferir 1mL para placas de Petri
esterilizadas. Se possvel, empregar 2 placas, para cada diluio;

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d) Adicionar cerca de 15mL de PCA esfriado a 45 C, em cada placa


semeada e homogeneizar girando suavemente as placas no sentido
horrio e anti-horrio alternadamente;
e) Uma vez solidificado o gar, inverter as placas e incub-las a 35C
durante 48 horas;
f) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as placas contendo 25 a
250 colnias e cont-las com o auxlio de contador;
g) Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias de bactrias
aerbias mesfilas por grama de amostra (UFC.g-1).
7.6.3. Resultados
Realizar a contagem das colnias, utilizando o contador de colnias e
expressar os resultados em "Unidades Formadoras de Colnias" por grama de
alimento (UFC.g-1), obedecendo o seguinte critrio:
a) Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;
b) Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.
Caso no seja possvel selecionar placas nas situaes acima, consulte os
critrios para contagem em placas (apndice 1).
7.6.4. Atividades
Pesquise em fontes bibliogrficas adequadas, quais os possveis microorganismos presentes na amostra analisada, fontes de contaminao e risco
devido sua presena.
Elabore o relatrio de aula prtica e insira essas informaes no item
Resultados e discusso

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Figura 14 Diagrama esquemtico para a avaliao higinica de superfcies.

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7.7.

Enumerao de fungos

A presena de bolores e leveduras viveis e em ndice elevado nos


alimentos, pode fornecer vrias informaes, tais como, condies higinicas
deficientes de equipamentos; multiplicao no produto em decorrncia de falhas
no processamento e/ou estocagem; matria-prima com contaminao excessiva.
Em produtos de tomates, frutas e outros, a contagem de bolores e
leveduras de grande importncia no sentido de se determinar a qualidade da
matria-prima utilizada no processamento, bem como o rigor da seleo.
A contagem de bolores e leveduras aplicvel principalmente na anlise de
alimentos cidos, com pH< 4,5, alimentos parcialmente desidratados, farinhas,
etc., nos quais a presena elevada indicativa de falhas ao longo do
processamento, comprometendo a vida til do produto. Embora existam muitas
espcies toxignicas, os resultados desta contagem no visam obteno de
informaes relacionadas sade pblica, mas sim uma avaliao geral da
qualidade do produto.
O meio de cultura gar Batata Dextrose utilizado para contagem de
bolores e leveduras em alimentos. O meio deve ser acidificado com cido tartrico
10% esterilizado para inibio do crescimento das bactrias.
Os bolores possuem aspecto cotonoso em funo da presena do
agrupamento de hifas que forma um miclio. Os bolores a as leveduras podem
apresentar colnias com diversas coloraes.
Na contagem de bolores e leveduras em alimentos, o resultado deve ser
expresso em unidades formadoras de colnias (UFC)/ g (ou mL) de amostra de
bolores e leveduras e no contando-se separadamente os bolores e as leveduras,
pois, sua confirmao s possvel, quando se procede a microscopia. As placas
devem ser incubadas a 25C por 3 a 5 dias.
O mtodo de plaqueamento em superfcie recomendado para a contagem
de aerbios psicrfilos e para a contagem de bolores e leveduras, pois assim
evita-se a exposio das clulas ao calor do gar fundido, no caso dos microorganismos psicrfilos, e permite uma mxima exposio ao ar, o que beneficia os
bolores (aerbios em sua maioria).
7.7.1. Material necessrio
Meio de cultura:
gar Batata Dextrose (BDA)
Reagente:
cido tartrico a 10%
Vidraria esterilizada
Papel indicador de pH
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Contador de colnias
7.7.2. Procedimento
a) Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225mL de
gua peptonada 0,1%;
-1

b) Proceder diluio seriada decimal (1mL da diluio 10 adicionados a


9mL de diluente, e assim por diante at diluio requerida);
c) De cada diluio do alimento, transferir 0,1mL para a superfcie das
placas de gar batata dextrose (acidificado com cido tartrico a 10% at
pH 3,5. Se possvel, empregar 2 placas para cada diluio);
Obs.: Uma vez acidificado, plaquear imediatamente o BDA, pois este
no pode ser reaquecido.
d) Espalhar com a ala de Drigalski;
e) Incub-las a 25C, sem inverter, durante 3-5 dias. Na falta de
incubadoras, mant-las temperatura ambiente, protegidas da luz;
f) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as placas mais adequadas e
contar as colnias;
7.7.3. Resultados
Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.
Expressar os resultados em "Nmero de Unidades Formadoras de colnia
por grama de alimento" (UFC/g).
OBS: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de
fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus
esporos.

7.7.4. Atividades
Baseado na morfologia observada nas colnias obtidas pesquise em
bibliografia adequada:
a) A identificao das colnias fngicas comparada com a de fungos
conhecidos
b) A origem da contaminao (fontes, habitat natural, como chegam a
alimentos);
c) Se o fungo identificado por comparao, produz ou no micotoxinas.
d) De posse dessas informaes, elabore o relatrio da prtica, conforme o
modelo (apndice 5).

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Figura 15: Esquema para contagem de fungos filamentosos.

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7.8.

Microscopia e visualizao de micro-organismos

Caractersticas morfolgicas dos fungos


Os fungos podem se apresentar na forma filamentosa (bolores) ou
unicelular (leveduras). Alguns fungos patgenos humanos so dimrficos,
dependendo das condies de cultivo (especialmente a temperatura), podendo se
apresentar tanto na forma micelial quanto leveduriforme.
Os fungos filamentosos, tambm conhecidos por bolores, so constitudos
por hifas, que se ramificam e se entrelaam formando o miclio. A parte do miclio
que penetra no substrato digerindo-o e absorvendo-o o miclio vegetativo. O
miclio reprodutivo o responsvel pela produo de esporos e varia
grandemente nas diferentes espcies de fungos, servindo para classific-los e
identific-los.
A colorao uma tcnica para visualizar micro-organismos, uma vez que
estes se apresentam quase incolores nas observaes em microscpios.
Para a observao, necessrio que os micro-organismos sejam fixados
(aderidos) lmina. A fixao mata os micro-organismos e preserva estruturas.
Contudo, existem corantes prprios para observao de clulas, sem destruir os
micro-organismos, constituindo a tcnica de exame a fresco. A amostra deve ser
fina e espalhada sobre e lmina de vidro, constituindo um filme denominado
esfregao..
A prtica tem por objetivos:
Demonstrar a tcnica de preparo de amostras microbianas em
lminas de vidro (esfregao);
Visualizar aspectos da morfologia de fungos atravs da observao
macroscpica e microscpica de vrias culturas.
Identificar as diferentes partes do microscpio tico comum e
manusear o equipamento adequadamente;
Diferenciar os diferentes tipos de visualizao.

7.8.1. MATERIAL NECESSRIO

culturas fornecidas (amostras de alimentos com mofos)


lminas e lamnulas
Ala de platina
Microscpio tico comum

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7.8.2. Procedimento
Examinar macroscopicamente e microscopicamente as culturas fornecidas
em placas de Petri. Para o exame microscpico fresco, colocar uma gota de
gua em uma lmina e com uma ala, emulsionar uma pequena quantidade da
cultura do fungo a ser observado. Cobrir com lamnula e observar ao microscpio
(Fig. 17) em diferentes ampliaes.
Obs: na utilizao de corante, repetir a preparao do esfregao,
substituindo a gua pelo corante azul de metileno.

7.8.3. Resultados
a) Comparar a morfologia das culturas fornecidas com culturas conhecidas
(Fig. 16) a partir do exame macroscpico e microscpico,

Figura 16 Visualizaes de colnias fngicas

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Figura 17 Representao esquemtica de um microscpio tico comum.

7.8.4. Atividades
Forme grupos e pesquise sobre os diferentes tipos de microscopia tica
(campo claro, campo escuro, contraste de fase, contraste de fase com
interferencia diferencial CID, de fluorescncia, confocal) e eletrnica (varredura
e transmisso), destacando as suas caracteristicas e finalidades/aplicaes.
Entregar o trabalho escrito e tambem realizar uma apresentao em
powerpoint.

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7.9.

Pesquisa de Listeria monocytogenes

Os membros do gnero Listeria so micro-organismos amplamente


distribudos no ambiente, definidos como bastonetes regulares Gram-positivos,
no-esporulados, catalase positivos e no-produtores de H2S. Crescem numa
ampla faixa de temperatura (3-45C), com timo a 30-37C, sendo considerados
psicrotolerantes, pela sua capacidade de multiplicao em temperaturas de
refrigerao. So anaerbios facultativos, fermentando a glucose com produo
de cido lctico, sem produo de gs.
Atualmente, o gnero Listeria encontra-se atualmente constitudo por cinco
espcies (L. monocytogenes, L. seeligeri, L. ivannovii, L. innocua e L. welshimeri),
dentre as quais L. monocytogenes inquestionavelmente patognica para o
homem e, ao contrrio da maioria dos patgenos de origem alimentar que
provocam sintomas gastrointestinais, as principais manifestaes clnicas de
listeriose so inicialmente semelhantes a um resfriado, com possibilidade de
progresso para quadros de meningite, meningoencefalite, septicemia, aborto ou
parto prematuro. A taxa de mortalidade encontra-se na faixa de 20-30% dos casos
diagnosticados.
Um grande nmero de mtodos de deteco de L. monocytogenes em
alimentos tem sido desenvolvido, sendo mais amplamente difundidos e utilizados
o mtodo da United States Food and Drug Administration (FDA) e o mtodo do
United States Department of Agriculture (USDA). Os mtodos so semelhantes na
sequncia de etapas de subcultura e condies de incubao, com diferenas
relacionadas escolha dos meios utilizados em cada etapa e aplicao ou no
de uma segunda etapa de enriquecimento seletivo, antes do plaqueamento
diferencial.
7.9.1. Material necessrio
Meios de cultura:
Caldo de enriquecimento para listeria (LEB)
Caldo Fraser
gar Palcam
gar Oxford
gar tripticase soja com extrato de levedura (0,6%)
gar sangue de cavalo
gar sangue de ovelha
Meio para teste de motilidade
gar prpura de bromocresol
Vidraria esterilizada
Estufas a 25oC, 30oC e 35oC.
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Filtros esterilizantes
7.9.2. Metodologia
7.9.2.1.Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25g ou 25mL do alimento com 225 mL de caldo de
enriquecimento para listeria (LEB). Incubar a 30oC por 24 horas.
7.9.2.2.Enriquecimento
Transferir 0,1mL do LEB para um tubo contendo 10mL de caldo
Fraser. Incubar a 35oC por 24 a 48 horas (at escurecimento do meio). Ter
sempre um tubo contendo caldo Fraser inoculado com cultura pura de L.
monocytogenes.
7.9.2.3.Semeadura em gar seletivo
Semear uma alada do tubo escurecido em placas de gar PALCAM
e gar Oxford, de modo a obter colnias isoladas.
Incubar as placas de gar Palcam e Oxford a 35oC por 24-48 horas.
7.9.2.4.Identificao das colnias suspeitas
gar Palcam: colnias cinza-esverdeadas com centro cncavo,
negro; halo negro sobre fundo vermelho.
gar Oxford: colnias negras com centro cncavo e halo negro.
7.9.2.5.Purificao das colnias
Tocar o centro das colnias suspeitas com a agulha de nquel cromo
e semear em tubos de gar soja tripticase com extrato de levedura (TSA-YE).
Incubar a 35oC por 24 horas. A partir destas culturas, realizar testes
fenotpicos e bioqumicos, a fim de confirmar a presena de Listeria sp.:
a) Catalase na superfcie de uma lmina de microscopia, previamente
desengordurada com etanol comercial, preparar uma suspenso
bacteriana, a partir do cultivo recente em TSA-YE a ser testado, e uma
alada de soluo salina a 0,85% esterilizada. esta suspenso, adicionar
uma gota de gua oxigenada a 3%, verificando-se o surgimento ou no de
bolhas de oxignio, por at 2 minutos, como conseqncia da presena ou
no da enzima.
b) Motilidade inocular as cepas a serem testadas em um tubo de ensaio
contendo 4mL de Motility Test Medium (DIFCO). A inoculao deve ser
feita com o auxlio de uma agulha de inoculao, picando-se o gar at o

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tero inferior da sua profundidade. A incubao processa-se a 25C,


temperatura onde a motilidade caracterstica de Listeria sp manifestada,
por um perodo de at 7 dias. Efetuar observaes diariamente, a fim de se
constatar a presena da motilidade caracterstica do gnero, ou seja,
motilidade com aspecto de guarda-chuva no tero superior do gar,
indicando, tambm, a caracterstica de microaerofilia apresentada por estes
micro-organismos.
c) -hemlise demarcar cada placa de gar Sangue de Cavalo (TSASangue) em sua poro inferior de modo a identificar 20 espaos, onde
cada um deve receber uma picada da respectiva cepa a ser testada. Aps
a inoculao, inverter as placas e incubar a 35C por 24 a 48 horas.
Decorrido esse intervalo, examinar as placas sob luz clara, de forma a
identificar possveis zonas de clareamento ao redor do crescimento
(hemlise), provocadas pela produo de -hemolisina. Registrar o
resultado para cada cepa como no hemoltico (sem alterao no meio ao
redor do crescimento bacteriano) ou -hemoltico (com uma zona de
clareamento total ao redor do inoculo).
d) Fermentao de carboidratos cada placa de gar Prpura de
Bromocresol, acrescida do respectivo acar (dextrose, rhamnose, xilose
ou manitol) a ser testado, deve ser demarcada, em sua poro inferior,
identificando 12 espaos. Em cada espao inocular, por picada, uma das
culturas. Aps a inoculao, incubar as placas invertidas por 24 horas a
35C. O surgimento de um halo amarelo ao redor da picada indicativo de
resultado positivo, ou seja, o micro-organismo foi capaz de produzir cido a
partir do substrato (acar) fornecido. Registrar os resultados como
positivos ou negativos para cada carboidrato.

7.9.3. Resultados
Expressar os resultados como "ausncia" ou "presena" de Listeria
monocytogenes em 25g ou 25 mL de alimento.

Nota: sempre que as anlises laboratoriais demonstrarem a presena de outras


espcies de Listeria, da rea reservada a observaes, do Certificado Oficial de
Anlise, dever constar: Presena de Listeria, seguida do nome da espcie
encontrada. Por exemplo: Presena de Listeria innocua, Presena de Listeria
welshimeri ou outra.
A Tabela 1 abaixo ilustra a forma como cada um destes testes pode ser
utilizado na confirmao e diferenciao das espcies dentro do gnero.

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TABELA 1 Caractersticas empregadas para a confirmao e identificao das


espcies de Listeria (adaptado de Holt el al., 1994)

Catalase
Motilidade guardachuva
-hemlise
Fermentao de:
Dextrose
Manitol
Xilose
Rhamnose
V = Varivel
+ = Positivo
- = Negativo

L.
monocytogenes
+
+

L.
seeligeri
+
+

L.
ivanovii
+
+

L.
innocua
+
+

L.
welshimeri
+

+
+

+
+
-

+
+
-

+
V

+
+
V

7.9.4. Atividades
Elabore o relatrio de aula prtica de acordo com o modelo (apndice 5).
Insira no relatrio, dentro do item resultados e discusso:
a) Informaes sobre pesquisas similares realizada na prtica, para efeito de
comparao com os resultados obtidos;
b) Coloque a classificao de risco biolgico do micro-organismo;

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7.10. Anlise de gua


Coletar as amostras de gua em frascos esterilizados. No caso de gua
clorada, adicionar ao frasco, antes da esterilizao, 0,1mL de tiossulfato de sdio
a 1%. Esta quantidade suficiente para neutralizar o cloro residual em 100mL de
gua.
Ao coletar amostras de torneiras e tubulaes, deve-se limpar a rea
externa da sada com etanol 70%, flambar, se o material for resistente ao fogo, e
deixar a gua fluir por 2 a 3 minutos, antes da coleta. Se a amostra for coletada e
enviada ao laboratrio pelo prprio interessado, sem a prvia neutralizao do
cloro, adicionar a soluo de tiossulfato de sdio (esterilizada), imediatamente
aps a chegada da amostra, sob condies asspticas.
7.10.1.Material necessrio
Meio de cultura:
Caldo lauril sulfato triptose (LST) - concentrao dupla
Caldo lactosado bile verde brilhante (VBBL)
Caldo EC
Vidraria esterilizada
Estufa a 35C
Banho-maria a 44,5C
7.10.2.Procedimento
7.10.2.1. Teste presuntivo para coliformes
a) Para anlise de gua, utilizar 10 tubos (alternativamente pode ser utilizado
uma srie de 5 tubos) com 10 mL de LST dupla concentrao, contendo um
tubo de Durhan invertido.
b) Colocar 10mL de amostra em cada tubo.
c) Incubar a 35C por 48 horas.
d) Observar os tubos positivos (formao de gs).
7.10.2.2.Teste confirmativo para coliformes totais e fecais
Passar, com o auxlio de uma ala de nquel-cromo, uma alada de cada
tubo positivo, para tubos de caldo VBBL e tubos de Caldo EC.
Incubar os tubos de caldo VBBL a 35C por 48 horas, e os tubos de caldo
EC a 44,5C por 24-48h.
Anotar o nmero de tubos positivos de VBBL e de EC.

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7.10.3.Resultados
Expressar os resultados das contagens de coliformes totais e fecais
em "Nmero Mais Provvel em 100mL de gua".

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8.

MTODOS DE COLORAO
8.1.

Colorao de Gram
1 - Preparar a extenso na lmina
2 - Fixar pelo calor
3 - Corar um minuto com a soluo de cristal violeta fenicada (ou com a
soluo de oxalato de amnio segundo Hucker)
4 - Escorrer o corante e cobrir durante 1 min com lugol
5 - Lavar com gua corrente
6 - Diferenciar com lcool 95o
7 - Lavar com gua corrente
8 - Corar o fundo rapidamente com fucsina
9 - Lavar e secar
10 Observar no microscpio, em diferentes ampliaes.

8.2.

Colorao de Esporos - Mtodo de Wirtz


1 - Preparar a extenso na lmina
2 - Fixar pelo calor
3 - Cobrir com verde malaquita e aquecer at o desprendimento de
vapores durante 1-2 minutos, sem deixar ferver
4 - Lavar com gua corrente
5 - Corar rapidamente com a safranina
6 - Lavar e secar
7 Observar no microscpio, em diferentes ampliaes.

8.3.

Colorao a fresco
1 - Preparar a extenso na lmina
2 - Corar com azul de metileno
4 - Escorrer o corante
5 Observar no microscpio, em diferentes ampliaes.

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9.

TCNICAS DE ISOLAMENTO
9.1.

Isolamento em cultivo slido

Esse mtodo usado para o isolamento de certos produtores de enzimas,


usando meios seletivos contendo o substrato que podem ser degradados pelas
enzimas produzidas pelos microrganismos desejados.
Os estudos iniciais feitos pelo bacteriologista alemo Robert Koch foram
muito importantes para a obteno de culturas puras. Antigamente, as tentativas
de isolamento eram feitas somente atravs de meios lquidos, sendo assim muito
difcil isolar microrganismos como bactrias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de
cultivo slido em superfcie de batata. Por volta do mesmo tempo, um associado
de Koch, Frederick Loeffler, desenvolveu o extrato de carne peptonado para o
cultivo de bactrias patognicas e Koch tentou solidificar esse meio. Ele conseguiu
atravs da mistura do meio com gelatina em um suporte slido que permitia a sua
solidificao, mas tinha a desvantagem de se liquefazer a temperatura superior a
28C e ser degradada por vrias espcies microbianas que possuem gelatinase.
Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar gar como agente
solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japons dono de uma
hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado aps uma noite
fria. Outro agente solidificante o cido silcico, o qual quimicamente definido.
Ele importante na preparao de meios que devem ser rigorosamente definidos.

9.2.

Tcnica de semeadura por estrias

Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma


ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma
pequena parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri com
gar fazendo movimentos em ziguezague, formando um caminho na forma de
estrias. Existem vrias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela
descontnua ou contnua. Na forma descontnua (Fig. 18), so feitas estrias na
poro 1 da placa e em seguida flamba-se a ala; aps, faz-se uma retirada de
bactrias da regio 1 e espalha-se sobre a regio 2; flamba-se mais uma vez e

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espalha-se bactrias da regio 2 na 3. As colnias presentes na regio 3 estaro


mais isoladas (TORTORA et al., 2006).
Fazendo de forma contnua, haveria primeiramente a coleta de uma
pequena quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das
bordas da placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias
at a outra borda da placa. Uma outra descrio a da semeadura por estrias
feita em duplicata em uma mesma placa, percorrendo a ala ou fio de platina
somente at o centro da placa, e do lado oposto fazendo o mesmo procedimento.
As colnias isoladas estaro mais ao centro e, atravs da repetio, poder-se-ia
obter microrganismos que estavam presentes na segunda amostra do inculo,
porm no presente na primeira.

Figura 18 Semeadura por estrias com ala de platina

9.3.

Tcnica de semeadura por espalhamento

Nessa tcnica (Fig. 19), um pequeno volume da soluo de microrganismos


contendo de 30-300 clulas transferido para o cento de uma placa de gar j
solidificado com o auxlio de uma pipeta estril. Em seguida, mergulha-se uma
ala de Drigalski em lcool e a flamba de modo a manter todo o material estril.
Com o auxlio dessa ala, espalha-se aquele volume depositado por toda a
superfcie do gar. As colnias cresceram espalhadas por toda a superfcie do
gar.

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Figura 19 Semeadura por espalhamento

9.4.

Tcnica de semeadura por derramamento

O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado de


pour plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra original diluda de
forma que quando feita a placa consegue-se colnias bem separadas. Um
pequeno volume da melhor diluio ento derramado em uma placa de Petri
sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e
mistura-se os dois com uma agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar
(Fig. 20).
Esse mtodo permite o crescimento de colnias na superfcie e dentro do
gar, pois algumas clulas foram misturadas no gar durante a sua solidificao,
como pode ser verificado na Figura 9, onde h a comparao do crescimento aps
a semeadura por pour plate e por espalhamento.
A maioria dos fungos e bactrias no morta pela breve exposio ao gar
quente, mas microrganismos sensveis ao calor certamente podem ser danificados
pelo gar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colnias. Alm disso,
quando se deseja identificar microrganismos atravs da morfologia da colnia,
esse mtodo no muito indicado, pois as colnias presentes dentro do gar no
fornecero dados corretos (TORTORA et al., 2006).

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Figura 20 Comparao entre o mtodo de pour plate e de espalhamento

9.5.

Tcnica de semeadura em profundidade

Faz-se a utilizao da agulha de platina e semeia-se o material contido nela


picando um gar slido contido num tubo (Fig. 21). Com isso haver o crescimento
de microrganismos em anaerobiose no fundo e aerobiose perto da superfcie do
gar.

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Figura 21 Semeadura em profundidade.

9.6.

Isolamento em cultivo lquido

Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de


determinada populao microbiana so geralmente lquidos. Aps o crescimento
avantajado ento ocorre o isolamento de determinadas clulas. Isso pode ser feito
como mostrado nas tcnicas em estado slido ou atravs de uma srie de
diluies em meio lquido.
Fazendo uma diluio em novo meio estril (Fig. 22), espera-se que em
certo momento se obter culturas provenientes de somente uma nica clula.
dessa forma que feita o isolamento e a contagem de clulas de Escherichia coli
em guas ou alimentos, por exemplo.

Figura 23 Srie de diluies para isolamento de um microrganismo.

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9.7.

Isolamento em cultivo contnuo

Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de


um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever produzir
um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros.
Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers. No
entanto, o crescimento de um determinado organismo oriundo de uma amostra
variada na forma de batelada pode resultar numa mudana das condies do
meio, e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas. Isso pode ser
reajustado inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo
meio idntico ao inicial. Aps um bom desenvolvimento do microrganismo
desejado, semeia-se uma alquota em meio slido.
A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros
depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros
organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de
crescer mais rapidamente com os substratos disponveis poder ter um nmero
maior de clulas.
No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento o
desejvel, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato
limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contnuo, onde novo meio de cultivo
adicionado de tempos em tempos e as presses seletivas so restauradas.

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10.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 53-62.
TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R.
Yeasts, molds and mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online.
2001. Disponvel em: http:// www.cfsan.fda.gov
VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens - An illustrated text.
London: Wolf Publishing Ltd, 1991.p. 235-265.

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APENDICE 1 PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E


DESCARTE DE AMOSTRAS
1. CONSIDERAES GERAIS AMOSTRAS DE ALIMENTOS
Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com etanol 70%,
para remover os contaminantes presentes.
Trabalhar na regio prxima chama de um bico de Bunsem, com a chama
azulada, com as portas e janelas do laboratrio fechadas, para evitar correntes de
ar. Todos os instrumentos e utenslios utilizados para a abertura das embalagens
e retirada de amostra (tesouras, pinas, facas, esptulas, etc.) devem ser
mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.
Para a amostragem de peas de alimentos slidos, como cortes de carnes,
salsichas, queijos, etc., deve-se cortar pedaos pequenos, de diversos pontos da
pea, de modo que a unidade analtica seja o mais representativa possvel, at
obter-se a quantidade requerida para a anlise. No caso de alimentos lquidos,
homogeneizar por agitao e pipetar assepticamente a unidade analtica (25mL).
Alimentos congelados devem, de preferncia, ser preparados para a anlise
sem descongelamento prvio, pois o processo de descongelamento pode provocar
injrias a um nmero significativo de clulas dos micro-organismos. Quando no
for possvel retirar a unidade analtica sem descongelar a amostra, o
descongelamento deve ser feito em geladeira, na embalagem original.
Pesar 25g da amostra e diluir em 225mL de gua peptonada 0,1%. Para
anlise de Salmonella, pesar 25g adicionais, que devero ser diludas em 225mL
de gua peptonada tamponada. Homogeneizar em Stomacher por 2 minutos.
Na transferncia de volumes entre as diluies, usar sempre uma pipeta
diferente para cada diluio. Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar
vigorosamente o tubo com o auxlio de um agitador tipo "Vortex".
A definio do nmero de diluies seriadas decimais a serem realizadas
ser feita em funo da contagem microbiana esperada em cada alimento. Assim,
em alimentos crus, o nmero de diluies que sero necessrias, ser maior do
que em um alimento processado, por exemplo.
Alm da quantidade requerida para realizao da anlise, pesar mais 100g
do alimento, identificar, congelar e guardar por 30 dias, como contra prova.

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INSTRUCOES GERAIS
1.1 A pesagem e o preparo de amostras so pontos crticos de controle do processo
analtico.
1.2 O local deve estar higienizado antes do incio da pesagem, conforme norma
especfica do laboratrio.
1.3 Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma especfica do
laboratrio.
1.4 O responsvel pelo procedimento deve, antes do incio dos trabalhos, realizar
assepsia das mos e antebraos.
1.5 Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a rea analtica e Equipamento
de Proteo Individual (EPI), conforme estabelecido em normas especficas do
laboratrio.
1.6 Devem ser aplicados os procedimentos de verificao de balanas, conforme
procedimento especfico do laboratrio.
1.7 O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de Bunsen, no caso de
uso de bancada, ou em fluxo laminar especfico para tal atividade.
1.8 A superfcie de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em
soluo desinfetante no inflamvel, previamente testada.
1.9 Todo o material deve estar organizado e em condies adequadas de uso antes
do incio dos trabalhos.
1.10 No deve ser permitida a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no
local, principalmente durante a pesagem das amostras.
2. INSTRUES PARA MANUTENO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO
LABORATRIO
2.1. No laboratrio, aps o recebimento, as amostras devem ser estocadas at o
momento da anlise, conforme abaixo:
2.1.1 Refrigeradas perecveis
As refrigeradas perecveis devem ser mantidas sob refrigerao e analisadas o mais
rapidamente possvel. Aguardar no mximo at o dia seguinte.
2.1.2 Congeladas
As amostras congeladas devem ser mantidas no mximo a -18 C e analisadas em
um prazo mximo de 7 dias da colheita.
2.1.3 No perecveis
Amostras no perecveis devem ser estocadas em lugar fresco, protegidas da
umidade e da luz, de forma que suas caractersticas originais sejam mantidas, e
analisadas o mais rapidamente possvel.

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2.2 Registros
Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas, conforme
estabelecido em procedimento especfico do laboratrio.
2.3 Manuteno das amostras aps a anlise
Aps a retirada das alquotas para anlise, as amostras devem ser embaladas
em sacos plsticos de primeiro uso, perfeitamente identificadas e mantidas
congeladas, conforme item 2.1.2.
As amostras estveis em temperatura ambiente devem ser mantidas identificadas,
protegidas por saco plstico de primeiro uso ou adequadamente fechadas na
embalagem original, em temperatura ambiente e em local apropriado previamente
estabelecido, conforme item 2.1.3.
Todas as amostras, exceto gua, leite e outros produtos lquidos, os quais devem
ser descartados logo aps a realizao do procedimento analtico, devem ser
mantidas nas condies acima especificadas por 10 dias. Aps esse prazo, as
amostras devem ser descartadas conforme item 2.4.
2.4 Descarte de amostras analisadas
Todas as amostras que derem entrada no laboratrio de microbiologia devem ser
descartadas conforme procedimento especfico estabelecido pelo laboratrio.
3. PREPARO DA AMOSTRA
Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo para provas
de: Contagem de Micro-organismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listeria
monocytogenes, Pesquisa de Vibrio cholerae, etc., fazer tantas pesagens por
amostra quantas forem necessrias.
3.1 Enlatados
No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das
embalagens, observando se esto amassadas, levemente tufadas ou com
microfugas aparentes.
Quando forem observadas quaisquer dessas alteraes, proceder conforme
estabelecido no Captulo 20 Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de
baixa acidez.

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3.1.1 Pr-incubao de amostras visualmente normais


As amostras de conservas visualmente normais devem ser incubadas a 36 1C
por 10 dias a 55 1C por um perodo de 5 a 7 dias, conforme instrues abaixo:
- Retirar cuidadosamente a cinta de identificao;
- Lavar a lata com gua e detergente, usando esponja;
- Secar com flanela limpa e seca;
- Identificar a amostra com o nmero de protocolo do laboratrio;
- Recolocar a cinta de identificao usando fita adesiva para prend-la na
amostra;
- Forrar a prateleira das estufas com papel filtro e incubar as amostras de forma
que a recravao fique em contato com o papel filtro.
Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os
recipientes no sofreram estufamento. Verificar se o papel filtro apresenta
manchas que possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos.
Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos
recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever
a alterao, quando ocorrer.
3.1.2 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao
Ao final da pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as
latas estiver manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a
respectiva amostra anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de
acordo com a temperatura da pr-incubao.
3.1.3 Preparo das amostras aps a pr-incubao
Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo
desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para
o lado oposto ao analista.
Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno
orifcio.
Abrir a lata e transferir pores do contedo para os meios de cultivo indicados.
3.2 Produtos UHT
No recebimento das amostras, verificar a integridade e alteraes nas embalagens
logo aps o recebimento.
As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Fazer
constar do COA amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao
detectada.
3.2.1 Pr-incubao das amostras visualmente normais

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Aps sofrerem limpeza e desinfeo, as amostras devem ser incubadas sobre


folhas de papel filtro, em estufa a 36 1C, por um perodo de 7dias.
As amostras cujas embalagens mostrarem qualquer alterao aps o perodo de
incubao no devem ser analisadas. Emitir o resultado como amostra alterada,
incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.
3.2.2 Preparo das amostras aps a pr-incubao
Produtos UHT lquidos:
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol 70 GL.
Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a
embalagem e iniciar a anlise conforme indicado no Captulo 3 Contagem de
micro-organismos mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao em
produtos lcteos lquidos UHT.
Produtos UHT pastosos e viscosos :
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando
algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol
70 GL.
Com auxlio de tesoura, previamente esterilizada, abrir a embalagem, e, usando
esptulas ou colheres estreis, pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e
transferi-la para sacos de stomacher ou para frascos estreis apropriados.
3.3 Produtos slidos
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando
algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de pinas, tesouras ou bisturis, previamente esterilizados, cortar e
pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos (superfcie e
profundidade) em sacos para stomacher.
No caso de anlise de mexilhes, antes de abrir as conchas, escov-las com gua e
sabo, enxaguar bem em gua corrente e aps em gua estril. Sec-las com gaze
esterilizada e abri-las assepticamente com o auxlio de faca ou bisturi. Preparar uma
amostra composta, em recipiente estril, misturando de 10 a 12 exemplares e
incluindo o lquido das conchas. Pesar 50 g dessa amostra composta e
homogeneizar com 450 mL do diluente especfico. Dividir em duas alquotas de 250
mL e transferir para recipientes estreis.
Frango inteiro resfriado - Pesar, assepticamente, alquotas dos seguintes locais
para o preparo da amostra: peito, coxas ou asas, proximidades da cloaca e dorso,
at completar as 25 0,2 g da amostra, em sacos para stomacher.

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Frango inteiro congelado - Antes da pesagem, as amostras devem ser


descongeladas em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar da mesma forma
que o frango inteiro resfriado
Outros produtos crneos congelados - Antes da pesagem, as amostras devem ser
descongeladas em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar, ento,
assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher.
3.4 Semi-conservas
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem, usando
algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de pinas, tesouras, abridores metlicos ou bisturis, previamente
esterilizados, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, colhida de vrios pontos,
em sacos para stomacher.
3.5 Produtos pastosos e viscosos
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem, usando
algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Amostras de produtos pastosos: com auxlio de esptulas ou colheres, previamente
esterilizadas, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos
(superfcie e profundidade), em frascos erlenmeyer estreis ou em sacos para
stomacher.
Amostra de produtos lquidos densos (ex: iogurte): Agitar o recipiente que
contm a amostra para homogeneizao. Realizar a assepsia da embalagem
usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70
GL.
Com auxlio de esptulas ou colheres, previamente esterilizadas, pesar
assepticamente 25 0,2 g em frasco erlenmeyer estril ou em sacos plsticos para
stomacher.
3.6 gua
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, ou ainda aspirar o
contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador, quando no
houver espao livre para a homogeneizao.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Para pesquisa de Salmonella em gua usada em aqicultura e em gua de chiller,
homogeneizar bem a amostra invertendo o recipiente por 25 vezes, e transferir 100

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mL da amostra para um frasco contendo 50 mL de gua peptonada 1% tamponada


em concentrao tripla.
3.7 Outros Produtos Lquidos
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. Antes da abertura da
embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo
desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quando no houver espao livre dentro do recipiente para homogeneizao da
amostra, aspirar o contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador.
Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e
retirar a alquota analtica.
3.8 Produtos gordurosos
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma, usando algodo
embebido em desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de esptula estril, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra,
retirando alquotas de vrios pontos da superfcie e profundidade, em frasco
erlenmeyer previamente esterilizado, ou em sacos stomacher.
Colocar em banho-maria a 46 1C, por um perodo mximo de 15 minutos.
Somente aps a liquefao da amostra, adicionar o diluente previamente aquecido a
46 1C.
Agitar, de forma a obter uma suspenso homognea.
Para amostras de produtos gordurosos, utilizar o diluente especificado na tcnica,
adicionado de 1% de Tween 80.
3.9 Produtos em p e granulados
Agitar ou inverter o produto por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem que contm a amostra, proceder assepsia
da mesma usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou
etanol 70 GL.
Pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e transferir, cuidadosamente, para
um frasco erlenmeyer ou saco para stomacher.
OBS: Quando as embalagens forem sacos de 25 kg ou mais, ou quando as
amostras forem colhidas em vidros onde no exista espao livre para
homogeneizao, transferir cerca de 500g do produto para um saco estril, e em
seguida agitar ou inverter o saco com a amostra por 25 vezes.

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Com o auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem


e em seguida pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para
stomacher, utilizando esptula ou colher estril.
3.10 Ovos
Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e secar bem. Coloclos de molho em soluo de cido peractico 0,02% por 15 minutos. Aps, secar
com algodo embebido em etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quebrar a casca assepticamente, transferindo a gema para recipiente estril.
Descartar as claras. Misturar as gemas com auxlio de basto de vidro estril.
Pesar 25 0,2 g da mistura de gemas em sacos para stomacher.
No caso de ovos de codorna, pesar 25 0,2 g de gema com a clara.
Ovo lquido integral e ovo em p: Pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra em
frasco erlenmeyer ou saco para stomacher.

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APENDICE 2 CRITRIOS DE CONTAGEM PARA MICRO-ORGANISMOS EM


PLACAS
Para cada diluio, selecionar placas que contenham:
25-300 colnias (para bactrias);
10-150 colnias (para fungos)
Multiplicar pelo inverso da diluio inoculada e pelo inverso da alquota coletada
para as placas;
Expressar o resultado em unidades formadoras de colnias por grama ou mililitro
ou centmetro quadrado (UFC.g-1 ou ml-1 ou cm-2) de produto;
No caso de mais de uma placa por diluio, considerar a mdia aritmtica da
contagem em cada uma das placas;
Usar a notao exponencial e at trs casas aps a vrgula. Na casa antes da
vrgula, o numero deve estar entre 1 e 9.
Casos especiais:
Somente so considerados para efeito de clculo e expresso de resultado
quando no houver placas com crescimento dentro da situao normal de
contagem.
Nessas situaes, expressar o resultado em UFC.g-1 ou ml-1 de produto seguido
da notao (est);
Usar a notao exponencial e apenas uma casa aps a vrgula. Na casa antes da
vrgula, o numero deve estar entre 1 e 9
No caso de mais de uma placa por diluio, considerar a mdia aritmtica da
contagem em cada uma das placas;
I. Todas as placas apresentam mais de 250 colnias:
Se for possvel contar as colnias da placa, contar e calcular o nmero de UFC.g-1
ou ml-1 a partir da contagem obtida;
Havendo uma distribuio homognea, dividir a placa em quatro quadrantes,
contar as colnias em um quadrante e multiplicar o resultado por quatro; aps
realizar o clculo normalmente;
Se no for possvel contar as colnias, selecionar a rea demarcada no contador
de colnias, representada por 6 quadrados consecutivos de 1cm 2 na horizontal e 6
na vertical; calcular a mdia por cm2:
Se o nmero de colnias/cm2 > 10, contar as colnias em quatro quadrados
representativos, multiplicar por 65 (rea da placa, em cm 2) x (valor inverso da
diluio) x (valor inverso da alquota);

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Se o nmero de colnias/cm2 < 10, a partir da mdia encontrada, multiplicar


por 65 (rea da placa, em cm2) x (valor inverso da diluio) x (valor inverso da
alquota);
Se o nmero de colnias for maior do que 100, expressar como: > 6.500 x
(valor inverso da diluio) x (valor inverso da alquota);
II. Nenhuma placa atingiu 25 colnias:
Selecionar as placas com colnias em numero mais prximo de 25 e calcular
normalmente;
III. Nenhuma placa com crescimento:
-1
-1
Representar o resultado como <10 UFC.g ou ml (est);
IV. Placas em duplicata, uma com 25-250 e outra com mais de 250 ou menos
de 25 colnias:
Considerar o nmero de ambas, calculando normalmente e utilizando a mdia;
V. Placas com espalhamento:
O espalhamento ocorre por desintegrao das clulas, por dois motivos:
durante a homogeneizao do inculo com o meio (ocorre o crescimento de
colnias individuais dentro da zona de espalhamento); ou da inadequada
mistura do inculo com o meio (crescimento de uma massa contnua).
Se cada espalhamento no cobrir mais de 25% da rea da placa,
considerar cada zona como uma colnia, sem contar as colnias dentro das
reas;
Se o espalhamento cobrir mais de 50% da placa, selecione uma regio livre
de espalhamento, conte as colnias em quadrados de 1cm 2, multiplicando pela
rea total da placa (65cm2).

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APNDICE 3 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES PARA


ANLISES MICROBIOLGICAS
gar Baird-Parker suplementado
Preparar o meio conforme instrues no frasco. Esterilizar em autoclave a
121C durante 15 minutos. Esfriar a 50C e adicionar a cada 940 mL de meio as
seguintes solues:
a) 10 mL de telurito de potssio a 1%
b) 50 mL de emulso de gema de ovo
Extrair assepticamente as gemas, colocando-as em uma proveta
esterilizada. Medir seu volume e adicionar igual volume de soluo salina
esterilizada. Homogeneizar bem, sem fazer espuma. Distribuir em placas de Petri
esterilizadas (15-20mL por placa). Secar a superfcie do meio antes de usar as
placas.
gar Conservao
Extrato de carne ................................... 3g
Peptona ................................................ 10g
Cloreto de sdio ................................... 8g
Fosfato de sdio dibsico anidro ......... 1,22g
gar ..................................................... 15g
gua destilada ..................................... 1000mL
Misturar todos os componentes e aquecer at total dissoluo. Autoclavar a
121C por 15 minutos. Distribuir 3mL em tubos pequenos (tipo frasquinho de
antibitico) esterilizados. Deixar solidificar.
Obs.: Somente colocar o gar aps corrigir o pH (7,4-7,6)
gar DNA Azul de Toluidina
Tris (hidroximetil) aminoetano................ 0,61g
DNAse gar .......................................... 0,63g
Sol.CaCl2 0,01M .................................... 0,1mL
NaCl ...................................................... 0,925g
gar ....................................................... 0,775g
Sol. de azul de toluidina 1% .................. 0,92mL
Dissolver o Tris (hidroximetil) aminometano em 100mL de gua destilada e
ajustar o pH em 9,0. Adicionar os demais ingredientes, exceto o azul de toluidina.
Fundir em microondas. Resfriar a 50C e adicionar o azul de toluidina a
essa soluo. O frasco de Erlenmeyer contendo o meio preparado deve ser
tampado com rolha de borracha e mantido em geladeira a 4 C. No preciso
esterilizar.

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gar Nitrato-Motilidade
extrato de carne .................................... 3,0 g
peptona ................................................. 5,0 g
nitrato de potssio ................................ 5,0 g
fosfato dissdico ................................... 2,5 g
galactose ............................................... 5,0 g
glicerol ................................................... 5,0 g
gar ....................................................... 3,0 g
gua ...................................................... 1000mL
Dissolver os ingredientes, aquecendo. Acertar o pH para 7,4 e dividir em
tubos (9 mL por tubo). Esterilizar em autoclave 121 oC durante 15 minutos. Esfriar
rapidamente em gua corrente.
gar Nutriente
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Oxford
Preparar conforme instrues no frasco. Autoclavar. Adicionar,
assepticamente, o suplemento conforme recomendado pelo fabricante. Distribuir
em placas estreis.
gar PALCAM
Preparar conforme instrues no frasco. Autoclavar. Adicionar,
assepticamente, o suplemento, conforme recomendado pelo fabricante. Distribuir
em placas estreis.
gar Plate Count
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Potato Dextrose
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Purpura de Bromocresol
Proteose peptona .................................... 10g
NaCl ........................................................ 5g
Prpura de bromocresol .......................... 0,02g (2mL de sol. 1%)
gar ......................................................... 15g
Agua ........................................................ 1000mL

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Dissolver todos os ingredientes, exceto o gar. Ajustar o pH para 6,8.


Adicionar o gar e aquecer at completa dissoluo. Autoclavar a 121C por 15
minutos.
Soluo 1% de Prpura de Bromocresol dissolver 0,1g de prpura de
bromocresol em 1,9mL de NaOH 0,1N e completar o volume para 10mL
com gua destilada.
Adio de carboidratos resfriar o gar base (fundido) a 5055C e
adicionar, assepticamente, 10% de uma soluo a 10% do carboidrato a ser
testado (esta soluo deve ser previamente esterilizada por filtrao, com
poro de 0,22micra). Plaquear imediatamente.
gar Sangue de Cavalo
Preparar gar tripticase soja, conforme instrues no frasco. Autoclavar.
Esfriar a 45oC e adicionar assepticamente, 7% de sangue desfibrinado de cavalo.
Distribuir em placas esterilizadas.
gar Sangue de Ovelha
Preparar como descrito para o gar sangue de cavalo.
Obs. Usar suspenso de hemcias de ovelha e no o sangue desfibrinado.
gar Sulfito de Bismuto
Preparar conforme instrues no frasco.
gar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC)
Preparar e esterilizar a base, de acordo com as instrues do fabricante. Na
hora de usar, fundir e resfriar o meio a 45C e adicionar 1% da soluo de DCicloserina a 4% (esterilizada por filtrao).
gar Tripticase Soja com Extrato de Levedura
Pesar o gar tripticase soja conforme instrues no frasco. Adicionar 0,6%
de extrato de levedura. Hidratar, homogeneizar e autoclavar. Distribuir em placas e
tubos estreis.
gar Trplice Acar Ferro
Preparar de acordo com as instrues do fabricante.
gua Peptonada a 0,1%
peptona .......................................... 1 g
gua destilada ............................... 1000mL

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Dissolver a peptona na gua destilada. Ajustar o pH a 7,0+0,2. Autoclavar a


121oC durante 15 minutos.
gua Peptonada Tamponada
NaCl ............................................ 5g
Na2HPO4.7H2O ......................... 6.6 g
KH2PO4 ...................................... 1.5g
Peptona ....................................... 10.0g
gua destilada ............................ 1000 mL
Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 7.5 0,1.
Autoclavar a 121oC por 15 min.
Caldo BHI
Preparar conforme instrues no frasco.Distribuir 2 mL por tubo.
Caldo Bile Lactose Verde Brilhante
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10mL por tubo,
introduzindo um tubinho de Durhan em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo de Enriquecimento para Listeria
Preparar conforme instrues no frasco.
Caldo EC
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10mL por tubo,
introduzindo um tubinho de Durhan em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo Fraser
Preparar conforme instrues no frasco. Autoclavar. Resfriar a 50C.
Dissolver o suplemento conforme instrues do fabricante, e adicion-lo
assepticamente ao caldo. Distribuir 10mL por tubo de ensaio, com tampa de rosca,
previamente esterilizados.
Caldo Indol
triptona ...................................... 10 g
NaCl ........................................... 5 g
gua destilada ........................... 1000mL
Dissolver os ingredientes e acertar o pH para 7,0. Dividir 5mL por tubo de
ensaio. Autoclavar a 121oC durante 15 minutos.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Caldo Lauril Sulfato Triptose


Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10mL por tubo,
introduzindo um tubinho de Durhan em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo MR-VP
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 5 mL por tubo antes de
autoclavar.
Caldo Rappaport-Vassiliadis
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo.
Caldo Tetrationato
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10mL por tubo de ensaio.
No autoclavar. No instante do uso, adicionar 0,1mL de uma soluo de verde
brilhante 1:1000 e 0,2mL da seguinte soluo de lugol:
Lugol
iodo ............................................. 6 g
iodeto de potssio ....................... 5 g
gua destilada ............................ 20 mL
Caldo Tioglicolato
Preparar o meio conforme instrues no frasco.
Corantes para Colorao de Esporos
a) Verde malaquita
verde malaquita ........................... 5 g
gua destilada ............................. 100 mL
b) Safranina
safranina ...................................... 1 g
gua destilada ............................. 100 mL
Corantes para Colorao de Gram
a) Cristal violeta fenicada
cristal violeta ............................... 1 g
lcool 95GL ................................ 10 mL
fenol fundido ............................... 2 g
gua destilada ............................ 100 mL
Dissolver o corante no lcool, juntar o fenol misturando sempre, e em
seguida juntar a gua, aos poucos. Filtrar aps 24 horas de repouso.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

b) Cristal violeta, segundo Hucker


A. cristal violeta ........................... 4 g
B. lcool 95GL .......................... 20 mL
B. oxalato de amnio ................. 0,8 g
gua destilada ........................... 80 mL
Misturar A e B.
c) Lugol
iodo ............................................ 1 g
iodeto de potssio ..................... 20 g
gua destilada ........................... 300 mL
Triturar o iodo com o iodeto de potssio em um graal adicionando gua aos
poucos.
d) Fucsina
Fucsina bsica ........................... 1 g
lcool 95GL .............................. 10 mL
fenol fundido ............................. 30 mL
gua destilada ........................... 100 mL
Fucsina Bsica para B. cereus
Dissolver 0,5g de fucsina bsica em 20mL de etanol 95%. Diluir para 100mL
com gua destilada.
Lisina Iron gar
Preparar conforme instrues do fabricante.
Caldo de Hugh-Leifson com glicose
Preparar conforme instrues do fabricante.
Meio de Carne cozida (CMM)
Carne picada
Peptona ...........................2g
Glicose ............................ 0,2g
Cloreto de sdio .............. 0,5g
gua ................................ 100mL
Colocar 3cm de carne picada em cada tubo. Adicionar 10mL do meio.
Autoclavar a 121C por 40 minutos. Adicionar a glicose e autoclavar mais 3
minutos (ou preparar conforme descrito abaixo).
Preparar uma Soluo de Glicose a 10%.
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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Esterilizar a 118C por 15 minutos ou esterilizar por filtrao.


Colocar 1mL no tubo e ferver 10 minutos.
Resfriar e inocular a amostra.
Meio para Teste de Motilidade
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 3mL por tubo de ensaio
pequeno. Autoclavar.
Plasma de coelho
Usar 0,2mL de citrato a 2% (filtrar em papel filtro) para 0,8mL de sangue.
Centrifugar a 1500RPM por 5 minutos.
Reagente de Kovacs
p. dimetil amino benzaldeido ................. 5 g
lcool amlico ......................................... 75 mL
HCl concentrado .................................... 25 mL
Dissolver o aldeido no lcool e adicionar o cido.
Reagente VM
vermelho de metila ................................. 0,1 g
lcool etlico ........................................... 300 mL
gua ....................................................... 200 mL
Dissolver o corante no lcool e adicionar a gua.
Reagente VP
a) alfa naftol ........................................... 5 g
lcool absoluto ....................................... 100 mL
b) soluo de KOH a 40%
Soluo alcolica 1N de hidrxido de sdio
Pesar 40g de hidrxido de sdio em um bquer, transferir para um banho
de gua fria, em uma capela, adicionar 100mL de gua e homogeneizar at
dissolver. Aguardar o resfriamento e transferir para um balo volumtrico,
completando o volume para 1 litro com etanol 96GL.
Soluo 0,04% de azul de bromotimol
Adicionar 16mL de uma soluo de NaOH 0,01N a 0,1g de azul de
bromotimol e, em balo volumtrico, completar o volume para 250mL com gua
destilada.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Soluo Sulfocrmica
Dissolver 60g de dicromato de potssio em 200mL de gua destilada
quente. Colocar o frasco em um banho de gelo ou gua fria, dentro da pia, e
aguardar resfriar. Com todo o cuidado, adicionar aos poucos, lentamente e com
constante agitao, 800mL de cido sulfrico soluo de dicromato de potssio.
Manter o frasco no banho frio durante todo o tempo de preparo, porque a reao
do cido com o dicromato libera uma quantidade significativa de calor.
Cuidado: O cido sulfrico e a soluo sulfocrmica obtida so extremamente
corrosivos. Proteger os olhos com culos apropriados e as mos com luvas de
borracha.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

APNDICE 4 TABELAS DE NMERO MAIS PROVVEL


TABELA 1. Diluies: 1,0 0,1 e 0,01g ou mL
Combinaes de tubos
positivos
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3

NMP/g
0,3
0,3
0,3
0,4
0,7
0,7
1,1
1,1
0,9
1,4
1,5
2,0
2,1
2,8
2,3
3,9
6,4
4,3
7,5
12
9,3
15
21
24
46
110
240

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TABELA 2. Diluies: 0,1 - 0,01 e 0,001g ou mL


Combinaes de tubos
positivos
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3

NMP/g
3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1.100
2.400

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TABELA 3. Nmero Mais Provvel (NMP) para diversas combinaes de tubos


positivos e negativos na inoculao de 10 pores de 10mL de amostra por tubo
(AMERICAN PUBLIC HEALTH OF WATER AND WASTEWATER)
Nmero de tubos
positivos

NMP/100mL

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
23

TABELA 4. Nmero Mais Provvel (NMP) para diversas combinaes de tubos


positivos e negativos na inoculao de 5 pores de 10mL de amostra por tubo
(AMERICAN PUBLIC HEALTH OF WATER AND WASTEWATER)
Nmero de tubos
positivos

NMP/100mL

0
1
2
3
4
5

2,2
2,2
5,1
9,2
16
16

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APNDICE 5 MODELOS DE RELATRIO


A) FORMA DE PSTER

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B) FORMA DE DOCUMENTO (Word)


Capa
Dados da instituio, curso, disciplina, professor responsvel
(cabealho)
Ttulo do trabalho (maisculas)
Componentes (nomes dos autores)
Local e data
Introduo
Neste item so colocadas informaes gerais do assunto/tema
abordado, como histrico, curiosidades, importncia do micro-organismo
(risco, patogneses, etc.)
..........................
O objetivo do trabalho foi .....
Obs: o(s) objetivo(s) devem compor a introduo, constituindo o
LTIMO PARGRAFO.
Material e mtodos
Materiais: descrio do que foi utilizado.
Procedimento: como foi executada anlise (metodologia empregada)
OBS: tanto o item material como o procedimento devem ser bastante
resumidos, porm claros e que permitam ao leitor a possibilidade de, alm
de compreender, executar o procedimento.
Pode ser apresentada a descrio do procedimento na forma de
fluxograma.
Resultados e discusso
Aqui deve ser apresentado, em primeiro momento, o resultado da
anlise (em formato de tabelas, grficos, figuras, etc.) para, aps, realizarse a argumentao e explicao do resultado.
NUNCA deve ser apresentado qualquer tabela, figura, grfico, etc.,
sem um texto anunciando o resultado.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Ex:
Os resultados da contagem de micro-organismos (tab ou fig. 01)
indicam um elevado nvel de contaminao nas amostras analisadas:
(inserir a tabela/figura 01)
A argumentao DEVE ser fundamentada em dados de bibliografia
especializada na rea (artigos, livros, apostilas) e a COMPARADOS OS
RESULTADOS com outros trabalhos similares.
Concluso
De forma clara e objetiva, preferencialmente na forma de tpicos, em
concordncia com o(s) objetivo(s).
Obs: um objetivo pode gerar mais de uma concluso, mas NUNCA DEVEM
ser colocadas concluses em quantidade inferior aos objetivos.
Referncias
A seguir so explicitados exemplos de apresentao das referncias
bibliogrficas utilizadas para a composio do trabalho, baseados no
modelo da ABNT, norma regulamentadora NBR 6023.
permitido utilizadar uma fonte de tamanho inferior ao utilizado no restante
do trabalho.
Exs:
Para Livros
CECCHI, H.M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de
alimentos. 2a Ed. Ed UNICAMP, Campinas, SP, 2003.
JOSLYN, M.A. Methods in food analysis (physical, chemical and
instrumental methods of analysis). Nova Iorque e Londres. Academic
Press, 1970.
Para Peridicos
TELLEFSON, J.R. Calibration in Kjeldahl protein analysis. Cereal Foods
World, 24(2), 1980, p.54

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

Para Legislao
BRASIL. Resoluo-RDC n 12, de 02 de Janeiro de 2001. Regulamento
tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos. Dirio Oficial da
Republica Federativa do Brasil, Brasil, n 7-E, p. 46-53, 10 Jan. 2001,
seo I.
Anexos
Nos anexos, podem ser includos clculos, planilhas, procedimentos
auxiliares, figuras, etc. que porventura sejam necessrios para
complementar as informaes.

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MANUAL DE PRTICAS EM MICROBIOLOGIA

APNDICE 6 MODELO DE LAUDO MICROBIOLGICO


Laudo microbiolgico (Modelo)
ANLISE MICROBIOLGICA
EMPRESA:
PRODUTO:
PRODUZIDO:
VALIDADE:
EMISSO:
QUANTIDADE:

N:

LOTE:

INTERESSADO:
.
.
..
COMPOSIO DO PRODUTO:
..
.
METODOLOGIA ANALTICA
.
.
.
RESULTADOS
.......................
ANLISE

RESULTADO

PADRO

CONCLUSO:
A amostra analisada enquadra-se/no se enquadra nos padres microbiolgicos vigentes, estando portanto,
apta/inapta para o consumo.
Responsabilizamo-nos pelo teor da declarao acima e colocamo-nos a sua disposio para qualquer
esclarecimento.
REFERNCIA BIBLIOGRFICA:

(ASSINATURA E CARIMBO DO RESPONSVEL TCNICO)


__________________________________________________
NOME DO RESPONSVEL TCNICO

...............(Dados do local de anlise)


Instituio.........
Endereo..........

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APNDICE 7 LINKS E ENDEREOS ELETRONICOS


RGOS GOVERNAMENTAIS
Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana CTNBio
www.ctnbio.gov.br
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA
www.anvisa.gov.br
Ministrio da Sade
www.saude.gov.br
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
www.agricultura.gov.br
Codex Alimentarius
www.codexalimentarius.net
International Commission on Microbiological Specifications for Foods - ICMSF
http://www.icmsf.iit.edu
Organizao das Naes Unidas para Agricultura e Alimentao FAO
www.fao.org
Portal FAO Brasil
www.fao.org.br
Bacteriological Analytical Manual Online.
www.cfsan.fda.gov

SOCIEDADES CIENTFICAS
Sociedade Brasileira de Virologia
www.sbv.org.br
Sociedade Brasileira de Microbiologia
www.sbmicrobiologia.org.br
Sociedade Brasileira de Protozoologia
www.icb.usp.br/~sbpz
American Society for Microbiology
www.asm.org

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Associao Argentina de Microbiologia


http://www.aam.org.ar/
Fitopatologia UFRGS
http://www6.ufrgs.br/agronomia/fitossan/fitopatologia/colaborador.php?id=3
Atlas eletrnico de parasitologia da UFRGS
www.ufrgs.br/para-site/siteantigo/alfabe.htm

BUSCA DE PERIDICOS / ARTIGOS


Peridicos CAPES
www.periodicos.capes.gov.br
Medline
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
BioMedNet
www.bmn.com
Free Medical Journals
www.freemedicaljournals.com
HealthGate
www.healthgate.com
Infotrieve
www4.infotrieve.com
Science
www.sciencemag.org
Nature
www.nature.com/nature
Highwire
http://highwire.stanford.edu/
PubMed Free Articles
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
Scielo Brasil
http://www.scielo.br/?lng=pt
Society of General Microbiology
http://www.sgm.ac.uk/

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LINKS DE INTERESSE PARA REA DA MICROBIOLOGIA:


http://www.ambientebrasil.com.br/
http://www.sbcs.org.br/solos/visao/index.php
http://www.abes-dn.org.br/portal/
http://www.ambi-agua.net/splash-seer/
http://cienciahoje.uol.com.br/
http://www.arvore.org.br/seer/index.php/rica
http://publicacoes.unigranrio.edu.br/index.php/sare
http://www.rbciamb.com.br/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/journals/83/
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_serial&pid=1517-8382&lng=en&nrm=iso
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_serial&pid=0103-8478&lng=pt&nrm=iso
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_serial&pid=1413-4152&lng=pt&nrm=iso
http://lunazul.ucaldas.edu.co/index.php?option=com_content&task=blogcategory&i
d=33&Itemid=31
http://www.prp.ueg.br/revista/index.php/biociencia/about/editorialPolicies
http://apps.unochapeco.edu.br/revistas/index.php/acta/index
http://revistas.unicentro.br/index.php/ambiencia
http://www.ambi-agua.net/splash-seer/
http://revistaseletronicas.pucrs.br/fabio/ojs/index.php/fabio/index
http://proxy.furb.br/ojs/index.php/rea/issue/view/180/showToc
http://www.scielo.br/scielo.php/script_sci_serial/pid_0001-3714/lng_en/nrm_iso
http://www.finep.gov.br/prosab/index.html
www.aguaonline.com.br
www.saneamentobasico.com.br
www.assemae.org.br
www.aesbe.org.br
http://www.diariodasaude.com.br/
Ecologia Microbiana
http://commtechlab.msu.edu/sites/dlc-me/zoo/
http://microbes.org/
http://www.cme.msu.edu/CME/index.html
http://commtechlab.msu.edu/sites/dlcme/resources/index.html
http://www.microbeworld.org/mlc/pages/wonders.asp
Ambientes extremos e astrobiologia:
http://www.astrobiology.com/extreme.html
http://www.archaea.unsw.edu.au/
http://www.lyon.edu/projects/marsbugs/astrobiology/

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Evoluo e filogenia
http://cmex-www.arc.nasa.gov/VikingCD/Puzzle/Evolife.htm
http://www.bact.wisc.edu/MicrotextBook/ClassAndPhylo/classify.html
Microbiologia do solo
http://www.inweh.unu.edu/biology447/modules/module8/soil/chapter3Soil446.htm
http://www.ucc.ie/impact/agrisf.html
Biodegradao e biocatlise
http://umbbd.ahc.umn.edu/
Biofilmes
http://www.erc.montana.edu/Res-Lib99-SW/Movies/default.htm
Vrus de plantas
http://www.virology.net/garryfavwebplant.html
Microbiologia do ar:
http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/airborne.htm#crest
Coluna de Winogradsky
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/microbiology/winogradsky.htm
l

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APNDICE 8 TELEFONES PARA CONTATOS

IF SUL RIO-GRANDENSE
CAMPUS PELOTAS
Geral
Fax
Coordenadoria do Curso de Qumica
Sala dos professores do Curso de Qumica
Almoxarifado do Curso de Qumica

2123 1000
2123 1006
2123 1040
2123 1041
2123 1158

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