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MANUAL DE PRTICAS LABORATORIAS


DE MICROBIOLOGIA.

Autor : Leonildo dos Anjos Viagem (Contactos: Cell:+258824048436/+258861778915; email: lviagem@hotmail.com/lviagem@yahoo.com.br)


Licenciado em Biologia Marinha na Escola Superior de Cincias Marinhas e Costeira da
Universidade Eduardo Mondlane. Actualmente docente da Universidade Pedaggica de
Moambique, afecto na Delegao de Montepuez, Departamento de Ciencias Naturais e
Matemtica no curso de Biologia. director do curso de Agropecuaria

Montepuez
2013

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ii

ndice.
Viso geral

Bem-vindo ao Manual de Praticas Laboratoriais de Microbiologia ................................. 1


Objectivos do Manual. ...................................................................................................... 2
A Quem se destina este Manual? ...................................................................................... 2
Organizao do Manual. ................................................................................................... 3
cones de actividade .......................................................................................................... 4
Habilidades de estudo ....................................................................................................... 4
Precisa de apoio? .............................................................................................................. 4
Equipamentos e Materiais Bsicos Usados em Laboratrio de Microbiologia. ............... 5
Introduo ................................................................................................................ 5
Material e Equipamentos Bsicos usados nas aulas Laboratoriais de Microbiologia. ..... 5
Como se comportar num Laboratrio de microbiologia? ............................................... 10
Como proceder em casos de acidente em um laboratrio? ................................... 12
ROTEIRO DAS AULAS PRTICAS LABORATORIAIS

20

Observao ao microscpio ptico composto ................................................................ 20


Introduo .............................................................................................................. 20
Estudo das Bactrias ....................................................................................................... 26
Introduo .............................................................................................................. 26
Controlo de microrganismos. .......................................................................................... 28
Introduo. ............................................................................................................. 28
Aco de Anti-spticos. .................................................................................................. 36
Observao de bactrias lcticas no iogurte usando a colorao simples. ..................... 38
Observao de bactrias usando a colorao diferencial (Mtodo de Gram) ................. 40
Introduo .............................................................................................................. 40
Isolamento de Bactrias do Iogurte ................................................................................ 44
Identificao de Bactrias do Trtaro. ............................................................................ 46
PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA

47

Introduo. ...................................................................................................................... 47
Normas de Preparao dos Meios de Cultura ....................................................... 47
Identificao de Bactrias em Meios de Cultura Preparados com Gelatina ................... 49
Observao de bactrias do ar e do ambiente de trabalho. ............................................. 51
Introduo .............................................................................................................. 51
Observao e Isolamento de bactrias halofitas no peixe seco salgado. ........................ 54
Estudo dos Fungos

59

Introduo .............................................................................................................. 59
Observao de gemulao em leveduras ........................................................................ 61
Crescimento de leveduras no sumo de uva. .................................................................... 64
Multiplicao de leveduras em condies aerbias e anaerbias ................................... 65
Introduo .............................................................................................................. 65

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iii

Observao de ascsporos de Saccharomyces cerevisiae .............................................. 70


Isolamento de leveduras de caldo de cana-de-acar ..................................................... 72
Observao de bolor negro do po (Rhizopus sp) .......................................................... 74
Referencias Bibliogrficas....76

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Viso geral
Bem-vindo ao Manual de Praticas Laboratoriais de
Microbiologia
Caro estudante do curso de biologia! Pensando em si, elaborou-se este manual
intitulado Manual de Prticas Laboratoriais de Microbiologia, que contm
diversos protocolos de prticas laboratoriais, na qual servir de base para a fixao
dos contedos tericos, preparando lhe assim para a construo do saber, do
conhecer e do seu desenvolver, principalmente nos aspectos seguintes:
Controlo dos microrganismos no cultivo dos microrganismos;
A importncia dos microrganismos no mbito alimentar e ecolgico;
Metabolismo dos fungos e bactrias;
Necessidades de crescimento dos fungos e bactrias;
Cultivo e observao microscpica dos fungos e bactrias.
Espera-se que este manual lhe seja util para o desenvolvimento das sua habilidades
pratico-laboratoriais.

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Objectivos do Manual.
O estudante que participar as aulas prticas
pr
laboratoriais que constam neste manual
deve ser capaz de :
Identificar macro e microscopicamente as caractersticas de
diferentes grupos de microrganismos;
Fazer o cultivo de microrganismos em laboratrio;
Desenvolver aulas prticas de microbiologia, mesmo em
locais sem acesso ao equipamento de laboratrio.
Compreender a importncia dos microrganismos e sua fcil
Objectivos

manipulao laboratorial;
Conhecer as condies de cultura dos microrganismos
Discutir a importncia do cultivo de microrganismos em
laboratrio.

A Quem se destina este Manual?


Este manual foi concebido para todos os estudantes que tenham
concluido o ensino secundrio geral do SNE ou equivalente e que
estejam a frequentar o 2 ano do curso de biologia na Universidade
Pedagig
Pedagigica.
Para facilitar a compreenso das prticas
pr
propostas
nest manual, recomenda-se que o estudante tenha noes de
neste
Biologia Celular e Molecular e da Bioqumica.

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Organizao do Manual.
Tendo em conta que este manual foi produzido com base em um Tamplate
usado para a produo de mdulos na Universidade Pedaggica, este
encontra-se estruturado da seguinte maneira:
Pginas introdutrias
Um ndice completo.
Uma viso geral detalhada do manual, resumindo os aspectos-chave que voc precisa
conhecer para completar e realizar as prticas aqui sugeridas. Recomenda-se vivamente que
leia esta seco com ateno antes de comear a realizar as suas actividades praticoexperimental.
Contedo do manual.
O manual contm um total de 18 protocolos correspondentes ao mesmo nmero de aulas.
Cada uma das aulas inclui uma pequena nota introdutria, objectivos da aula, material a ser
usado, os procedimentos a serem seguidos e em alguns casos tarefas de auto-avaliao. Esta
ltima visa consolidar as prticas que acabou de desenvolver. Recomenda-se que resolva-os
para melhor medir os seus conhecimentos sobre a aula.
Comentrios e sugestes.
Esta a sua oportunidade para dar sugestes e fazer comentrios sobre os diferentes
protocolos que so sugeridos neste manual. Os seus comentrios sero teis para ajudar a
avaliar e melhorar este material didtico de extrema importncia para quem quer desenvolver
habilidades pratico-laboratoriais em microbiologia

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cones de actividade
Ao longo deste manual encontram-se uma srie de cones nas margens das
folhas. Estes icones servem para identificar diferentes partes do processo de
aprendizagem. Podem indicar uma parcela especfica de texto, uma nova
actividade ou tarefa, uma mudana de actividade, etc.
Acerca dos cones
Os cones usados neste manual so smbolos africanos, conhecidos por
adrinka. Estes smbolos tm origem do povo Ashante de Africa Ocidental,
datam do seculo 17 e ainda se usam hoje em dia.

Habilidades de estudo
Ao realizar uma aula prtica laboratorial necessrio ter muita ateno no
que observas, sendo necessrio fazer os respectivos desenhos. Para isso, tenha
consigo um bloco de anotaes e uma esferogrfica e tenha a certeza que o
que est a desenhar corresponde a aquilo que pretendes observar.

Precisa de apoio?
Caso tenha alguma dvida durante a realizao das suas experiencias,
consulte ao seu professor antes que cometa erros que posteriormente sero
fatais para si.

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Equipamentos e Materiais Bsicos Usados em Laboratrio de


Microbiologia1.

Introduo
A realizao das prticas laboratoriais depende em grande parte de equipamentos
e materiais existentes no laboratrio. Mas isso no pode constituir um grande
problema que impea a realizao das prticas laboratorial em microbiologia,
podendo-se
se para isso produzir materiais alternativos que visem implementa-las.
implementa
No final desta aula voc deve ser capaz de:

Identificar os diferentes materiais que podem usados nas


aulas laboratoriais de microbiologia
Manusear com preciso o microscpio ptico e outros
Objectivos

equipamentos existentes no laboratorial especificamente para


compreenso dos microrganismos

Material e Equipamentos Bsicos usados nas


as aulas Laboratoriais de
Microbiologia.

Os materiais assim como os equipamentos


equipamentos a seguir referenciados so os bsicos
que podem ser usados para a concretizao das prticas que constam neste
manual.
Estufa bacteriolgica (Fig. 1 e 2):
2): permite o crescimento de microrganismos pela
incubao na temperatura adequada. A estufa apresentada na fig.2 foi produzida
localmente, esta que pode atingir uma temperatura mxima de cerca de 450C. Esta
foi produzida como forma de suprir as necessidades
necessidades existentes no laboratrio da

Uma viso da UP-Montepuez

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UP-Montepuez, visto que um material de grande importncia no estudo dos


microrganismos.

Figura 1: Estufa bacteriolgica convencional.

Figura 2. Estufa bacteriolgica produzida com material local. A: Vista externa e


B: estrutura interna.
Tubo de cultura: um tubo de vidro, sem borda ou com tampa de plstico
rosquevel. Utiliza-se no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio
e na conservao de culturas puras de microrganismos, permite economizar o
meio e o espao fisco.

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Figura 4. Tubo de ensaio


Estante para tubo de ensaio (fig.5): usada para suporte de tubos de ensaio.
Pina de madeira (fig.6): usada para prender o tubo de ensaio durante o
aquecimento

Figura 5: Estante de tubos de ensaio.

Figura 6: Pina de madeira

Placa de Petri (fig.7): facilita o isolamento de microrganismos devido grande


superfcie de crescimento que apresenta, possibilitando o aparecimento de
colnias separadas.

Figura 7. Placa de Petri

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Pipeta: serve para diluir preparaes diversas e inocular culturas lquidas. Estas
podem ser plsticas ou de vidro.
Pipeta Pasteur (fig.8) um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada para
transportar pequenos volumes de lquido.
Inculo (ou semente): concentrao de clulas suficientes para cultivar uma de
meio com bom rendimento

Figura 8. Pipetada Pasteur plstica


Lmina (fig.9): serve para examinar microrganismos ao microscpio. Estas
podem ser rasas ou escavadas.
Lmina Escavada: possui uma ou duas depresses possibilitando observar a
mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de lquido (Ensaio em gota
pendente)
Lamela (fig.10): utilizada para recobrir preparaes microscpicas in vivo

Figura 9. Lminas rasas

Figura 10. Lamelas ou lamnulas

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Termmetros: so utilizados em estufas microbiolgicas, de secagem e


esterilizao, banhos de gua (banhos-maria), etc. Deve-se dar preferncia a
termmetros de lcool (bulbo vermelho).

Figura 11. Termmetros


Pisseta ou frasco lavador (fig.12: Usada para lavagens de materiais ou recipientes
atravs de jatos de gua, lcool ou outros solventes.

Figura 12: Frasco lavador


Microscpio ptico: um aparelho que serve para ampliar a imagem das
microestruturas, utilizando para isso, como fonte de energia a luz (veja os detalhes mais
adiante).

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10

Figura 13. Microscpio optico

Como se comportar num Laboratrio de microbiologia?


As aulas prticas Laboratoriais tm como objetivo ensinar ao estudante os princpios
gerais e mtodos utilizados no laboratrio de microbiologia. Nas aulas prticas
laboratoriais de microbiologia so usados uma variedade de microrganismos, sendo
alguns patognicos para o homem, razo pela qual essencial que as normas sejam
seguidas, a fim de se evitar contaminaes acidentais. As normas que a seguir so
mencionadas no devem ser consideradas as nicas:
1. Evitar qualquer tipo de brincadeira, pois o trabalho de laboratrio de extrema
seriedade;
2. Nunca trabalhe sozinho no laboratrio;
3. Seguir os roteiros de prticas e instrues do professor ou do tcnico de laboratrio;
4. Qualquer acidente dever ser imediatamente comunicado ao professor ou ao tcnico;
5. Em caso de qualquer dvida na execuo da prtica, por mais simples que possa
parecer, pergunte ao professor;
6. O uso de bata branca (de preferncia de algodo) e guarda-p obrigatrio.
7. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes e
equipamentos.
8. Limpar e desinfetar o local de trabalho (mesa) antes e depois de cada aula prtica.
9. Lavar e desinfetar as mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que
for necessrio. Se for portador de algum ferimento nas mos, procurar no tocar no
material.

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11

10. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a
anlise. No use amostra ou substncia que no esteja rotulado.
11. Antes de usar qualquer produto deve ler com ateno o conjunto de informaes
impressas no rtulo dos reagentes, prestando ateno para os riscos que eles
comportam.
12. Devem retirar-se pequenas quantidades de reagentes de cada vez para evitar
desperdcios. Os excessos no devem ser devolvidos nos frascos a fim de evitar
contaminaes.
13. No se deve deixar os frascos dos reagentes abertos
14. Utilizar exclusivamente material estril para a anlise.
15. No comer, beber ou fumar no laboratrio.
16. Manter canetas, dedos e outros longe da boca.
17. No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.
18. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, e no sobre o local de
trabalho.
NUNCA TENTE SER HERI!

Para alm das normas acima citadas, existem outras que podem ser consideradas para a
manuteno do laboratrio por parte do responsvel tcnico, a destacar:
1.

O laboratrio deve ter duas portas de sada, sendo que nenhuma delas deve estar

bloqueada por materiais;


2.

Os materiais e os equipamentos devem ser armazenados em locais apropriados e

catalogados;
3.

Os reagentes devem estar arrumados em armrios ou estantes apropriados,

separados dos vidros e plsticos. Sempre que possvel os reagentes devem ser
arrumados em locais com ventilao.

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Como proceder em casos de acidente em um laboratrio?

O laboratrio, sendo um local onde se est exposto a diversos riscos, e como tantos
outros ambientes de trabalho deve se ter noes de primeiros socorros em casos de
acidente.
No caso de ocorrer um acidente no laboratrio, deve comunicar de imediato ao
professor ou ao responsvel do laboratrio.
Torna-se necessrio durante o trabalho em um laboratrio de microbiologia, ter
conhecimento de alguns procedimentos de primeiros socorros, no s, mas tambm,
saber identificar o tipo de acidente para facilitar o trabalho dos tcnicos de sade. Na
tabela 1, so indicadas alguns procedimentos de primeiros socorros, que no podem ser
entendidos como um tratamento completo, aconselhando-se ao estudante depois de o
acidente dirigir-se a um posto mdico mais prximo, caso o acidente seja grave.
Tabela 1: Alguns procedimentos de primeiros socorros.
Acidente
Salpicos e/ou queimaduras com
substncias qumicas superficiais
Salpicos de substncias qumicas
nos olhos

Pequenos golpes

Inalao de substncias toxicas

Queimaduras ligeiras

Procedimentos
Lavar com gua abundante e corrente a rea afetada, uso de sabo
facilita a remoo. Recomenda-se depois ir a um posto mdico
Lavar os olhos com soro fisiolgico ou com gua. Com ajuda de dois
dedos deve-se manter as plpebras afastadas, de modo que o lquido
utilizado na lavagem seja tangencialmente ao globo ocular. Depois deve
consultar a um mdico
Se o corte for pequeno deve deixar sangrar por alguns segundos e lavar a
ferida com gua corrente. De seguida deve desinfeta-la e proteg-la com
um penso.
A vtima deve ser afastada do local, aliviando-lhe o vestirio no pescoo
e no peito. No caso da vtima estiver inconsciente, deve deita-lo com a
cabea na posio lateral e inclinada para trs, mantendo-o aquecido.
Levar de imediato a um posto de sade.
No caso de queimadura trmica deve ser aplicada uma pomada
especfica e posteriormente aplicar uma gaze esterilizada

(Fonte: Marques et al, s/d)


Obs: O laboratrio deve estar apetrechado de armrio de primeiros socorros, este deve,
pelo menos, conter agua oxigenada, gaze esterilizada, adesivos, tesoura, pensos
adesivos e uma pomada antissptica.

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Tabela 2: Smbolos de preveno usados nos rtulos das embalagens

Substncia

Smbolo

Precaues
Evitar choques, variao de presso,
frico, calor e fogo

Explosiva

Comburente

Evitar qualquer contacto com


substncias combustveis. Perigo de
inflamao
Manter afastada de chamas nuas e

Inflamvel

fontes de calor

Caractersticas da Substncia

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Toxico

Evitar qualquer contacto com o corpo,


podendo em casos extremos ter
consequncias mortais

A inalao, ingesto ou absoro pela pele e mucosas


de pequenas quantidades da substncia provocam a
morte ou danos agudos ou crnicos para a sade;
Provocam a destruio dos tecidos vivos em contacto
com a substncia ou seus vapores;

Corrosivo

Evitar qualquer contacto com a pele,


com os olhos e com a roupa. Evitar
inalar os vapores

Evitar qualquer contacto com o corpo.


Evitar inalar os vapores

Pode induzir alteraes genticas (mutaes)


hereditrias ou aumentar a sua incidncia;

Perigosa para o

Evitar derrame e descartar em

ambiente

recipientes prprios

Provocam ou podem provocar um perigo imediato ou


retardado no meio ambiente.

Mutagnica

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Provocam inflamao por contacto direto breve,


prolongado ou repetido com a pele e mucosas;

Irritante
Sensibilizante

15

Evitar qualquer contacto com a pele,


com os olhos e com a roupa. Evitar
inalar os vapores

Aps contacto direto breve, prolongado ou repetido


com a pele e mucosas, induzem uma reao de
hipersensibilizao, tal que futuras exposies mesma
substncia originam respostas alrgicas;
Podem provocar a morte ou danos agudos ou crnicos
quando ingeridos ou absorvidos pela pele ou mucosas;

Nocivo
(Fonte: Adaptado de Bandeira e Nota, 2008)

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17

Elaborao de um relatrio de aula prtica laboratorial.


Ao terminar cada uma das aulas prticas laboratoriais propostas neste manual,
dependendo das circunstncias ou pela proposta do docente, deve-se elaborar um
relatrio.
O relatrio que ser elaborado servir como um instrumento de registo das diferentes
fases da aula laboratorial e, para alm disso, servir como um informe de todo o
trabalho que estudante desenvolveu na aula.
Existem aspetos relevantes que se deve ter em conta durante a elaborao do relatrio
de uma aula prtica, sendo que o tipo de linguagem utilizada de extrema importncia,
visto que, reflete o modo de pensar e de trabalhar do estudante. Assim, a linguagem
deve apresentar:
1.

Objetividade e clareza: aqui nada deve ser subentendido ou por conta de

imaginao do estudante ou praticante, isto quer dizer, o texto de um relatrio no pode


expressar ambiguidade. O outro factor que contribui para a clareza de uma informao
as ilustraes que complementam um texto, visto que, para alm de atrarem a
ateno, ajudam a dar informaes de uma forma mais rpida, clara e precisa.
2.

Simplicidade: o texto deve ser escrito com mais simplicidade possvel, o

que evidencia clareza de pensamento. O relatrio deve ser de fcil entendimento,


isto , as palavras simples no podem parecer complexas.
Estrutura de um relatrio de aula prtica laboratorial
O relatrio de uma aula prtica laboratorial deve ser, geralmente estruturado da
seguinte forma:
1.

Elementos pr textuais
1.1.

Capa (ou primeira pagina): esta deve incluir:

O titulo completo da experiencia, que deve ser curto e dar uma indicao
clara da inteno do trabalho;
Nome (s) do (s) autor (es);
O nome da Escola/Faculdade/Delegao onde o trabalho foi realizado;
Data em que o relatrio foi concludo;

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18

Resumo: esta seco deve ser um relato breve de todo o relatrio,


nomeadamente a finalidade do trabalho, os procedimentos gerais utilizados, os
resultados mais relevantes e as concluses a que se chegou.
ndice
2.

Elementos textuais
2.1. Introduo: aqui deve ser apresentado de uma forma clara o problema em
estudo (se existir um problema), indicando o objetivo do trabalho, dizendo de
que trata o relatrio e os motivos que conduziram a sua elaborao, bem como o
objetivo que se pretende alcanar.
2.2.

Protocolo experimental: aqui inclui o material utilizado e a descrio

dos vrios passo da experiencia. Deve conter elementos suficientes para


assegurar que a repetio do trabalho, por algum seja ou no experiente na
rea, leve a obteno de resultados semelhantes.
2.3.

Resultados ou observaes: aqui deve conter uma exposio factual do

foi observado, expressa com apoio de desenhos, tabelas ou grficos elaborados


no decorrer da experiencia/trabalho. Deve-se descrever de uma forma
pormenorizada e sem comentrios interpretativos os ensaios bem sucedidos.
Pode se fazer uma breve referncia aos ensaios mal sucedidos ou tentativas
infrutferas, que podem ocorrer em qualquer experiencia laboratorial.
2.4.

Discusso: aqui feita a anlise e interpretao dos resultados obtidos,

tendo em conta os objetivos.


2.5.

Concluso: aqui faz-se a sntese da discusso dos resultados obtidos em

relao ao problema ou objetivo inicial. Deve ser o mais sucinto possvel, sem
omitir, no entanto, as principais concluses, que devem ser mencionadas de
acordo com a ordem pelo qual aparecem no trabalho.
3.

Elementos ps - textuais
3.1.

Bibliografia2: aqui faz-se a enumerao da lista de todo o material ou, de

preferncia, apenas o material referido no texto (trabalhos ou artigos) de acordo


com normas previamente determinadas.

As normas que sero usadas para a formulao da bibliografia no acto de


elaborao do relatrio so as que constam nas normas de produo e publicao
de trabalhos cientficos na UP.

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19

Como planificar uma aula prtica Laboratorial de microbiologia?


O primeiro passo para que se possa se desenvolver uma aula prtica experimental com
os estudantes a planificao da aula, assim como tradicionalmente tem-se feito com as
aulas tericas que obedecem um plano previamente estabelecido, pelo professor.
Planificando possvel determinar com exatido quantas e quais as aulas a serem dadas
e o tempo que poder durar cada uma das aulas.
Como j foi referenciado anteriormente, uma aula prtica deve ter um roteiro, com
objectivos, a lista de materiais ser usado, os procedimentos a seguir na APL.
Papel do Professor em uma APL
Um dos desafios do professor das cincias naturais pr em prtica a parte terica
estudada. Dadas as condies oferecidas pelas escolas no que se refere aos laboratrios
escolares, fundamental que o professor seja criativo utilizando recursos, mesmo
precrios, o que ir despertar aos estudantes a motivao e aprofundamento da cincia.
Muitas vezes o professor ter que transpor obstculos como ausncia de laboratrios,
ou ainda, quando a escola possui laboratrios, mas este desprovido de matrias,
recursos humanos (tcnicos de laboratrio) e tambm, quando no adaptado para o
desenvolvimento de prticas laboratoriais. Faz-se necessrio que o professor realize
algumas aulas prticas na sala, utilizando materiais de baixo custo.
Para executar as actividades experimentais, o professor deve estar atento ao facto que o
estudante um sujeito pensante possuidor de capacidade, inteligente e criativo.
de salientar que para a concretizao das APLs fundamental que se proporcione um
espao onde as aulas prticas devem ser realizadas e condies concretas para que
ocorram as APLs. Mas isso no pode constituir limitao para a no realizao das
APLs, visto que, estas podem ser realizadas em qualquer sala de aula, sem a
necessidade de instrumentos e aparelhos sofisticados, bastando apenas que se tenha boa
vontade e alguns objectos de uso comuns. Entretanto preciso criar-se, o que poder
contribuir para a melhoria do processo de ensino e aprendizagem nas cincias naturais.

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ROTEIRO DAS AULAS PRTICAS


PRTICAS LABORATORIAIS
Observao ao microscpio ptico composto
Introduo
Pelo facto de a microbiologia estudar seres vivos bastante pequenos que no so
visveis a olho nu, surge a necessidade de desvendar as suas estruturas, composio
qumica, etc. Para isso, desenvolveram-se
desenvolveram se certos instrumentos que permitissem o seu
estudo. De entre vrios, o microscpio (do grego: micros = pequeno, scopein =
observar) constitui um instrumento de extrema importncia para desvendar os grandes
mistrios do mundo vivo invisvel a olho nu. O microscpio ptico composto um
aparelho que serve para
para ampliar a imagem das microestruturas, utilizando para isso,
como fonte de energia a luz.
Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:
Identificar a constituio do microscpio ptico;
Indicar as funes de cada um dos constituintes do microscpio
ptico composto;
Objectivos

Manusear com preciso o microscpio ptico composto.

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21

CONSTITUIO DO
MICROSCPIO PTICO

Parte ptica

Parte Mecnica
Base ou p: Suporte do
microscpio
Coluna ou Brao: Pea fixa a
base, na qual esto aplicadas
todas as outras partes
constituintes do microscpio
Parafuso Macromtrico
Possibilita movimentos
verticais de grande amplitude,
permite uma focagem rpida.

Parafuso Micromtrico:
Possibilita movimentos verticais
de pequena amplitude, permite
otimizar a focagem.

Tubo ou canho:
Suporta a ocular
Revolver: Suporta e
permite a seleo da
objetiva

Platina: local onde


se coloca a
preparao a
observar. Possui um
orifcio no centro por
onde passam os raios
de luz

Sistema de
iluminao
Condensador: tem
como finalidade
concentrar os raios
emitidos pela fonte
luminosa, fazendoos incidir na
preparao

Sistema de
ampliao

Fonte de Luz: os MOC


modernos possuem uma
lmpada de tungstnio.

Diafragma: encontra-se
associado ao
condensador. Regula a
intensidade da luz

Objetivas: sistema
de lentes que
ampliam a imagem
do objeto.
Oculares: sistema
de lentes que
ampliam a imagem
fornecida pela
objetiva

Figura 15. Representao esquemtica da constituio do microscpio ptico composto (Fonte: Adaptado de Marques et al, s/d

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23

Procedimento para manipulao do microscpio ptico.


Retire o microscpio da caixa pelo brao e coloque na mesa de trabalho;
A seguir ligue a fonte luminosa e disponha a objetiva no revlver. Se estiver a
usar o microscpio ptico solar, use a face plana do espelho, caso contrrio, a face
cncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir completamente a superfcie do espelho
e este deve estar centrado de maneira que o cone luminoso refletido atravesse
completamente o condensador (que deve estar completamente levantado, com o
diafragma aberto) bem como a abertura da platina, de tal forma que o campo do
microscpio (isto , o espao da platina visualizado com a ocular) fique totalmente
iluminado.
Colocar a lmina contendo a preparao sobre a platina, manualmente (para o
caso que o microscpio no apresenta charriot) desloque a preparao de tal forma
que a lmina fique sobre a abertura da platina, perfeitamente iluminada pelo cone
luminoso.
Escolhe a objetiva. Para isso deve ter em conta o tipo de preparao que
pretende observar:
1. Preparaes a fresco (In vivo): trabalhar apenas com objetivas a seco,
comeando sempre pela objetiva de menor aumento;
2. Preparaes coradas (In vitro):
Focalize inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento;
Gire o revlver de maneira que nenhuma das objetivas fique em uso;
Coloque sobre a preparao uma pequena gota de leo de imerso;
Colocar no eixo ptico a objetiva de maior aumento (imerso)
NB1: Para as preparaes coradas que do imagens por absoro, use o mximo de
iluminao com o condensador completamente elevado e o diafragma totalmente
aberto. Para as preparaes a fresco, que do imagens por refrao, ilumine menos a
fim de que o material a observar seja mais percetvel. Comece descendo o

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24

condensador, a uns dois teros da sua abertura, depois olhando pela ocular, regule o
cone luminoso, fechando aos poucos o diafragma.
Focalize o objeto. Esta operao consiste em trazer o objeto para o foco da
objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, ser vista pelo observador.
Para efetivar a focalizao proceda o seguinte:
Gire o revlver colocando a objetiva de menor ampliao no eixo ptico;
Ajuste a iluminao de campo;
Centralize a preparao;
Aproxime ao mximo a preparao, da objetiva de menor ampliao, por meio
do mecanismo de movimento. Durante este trabalho dever ser observado a
aproximao diretamente com a vista, no devendo ser utilizado a ocular;
Imprima (observando pela ocular) movimento moderado de afastamento entre a
preparao e a objetiva, at que seja distinguida a imagem do objeto;
Movimente o parafuso micromtrico para focalizao final;
Regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nitidez;
Para trocar de objetiva basta girar o revlver e em seguida ajustar o foco
imprimindo movimentos lentos no parafuso micromtrico;
Quando terminar a observao, gire o revlver at a menor objetiva e apagar a
luz.
Tape com a capa e coloque-o na caixa.
N.B2: Quando o microscpio binocular deve-se ajustar a distncia interocular de tal
forma que o observador visualize um s campo de luz. Para o caso de microscpio
monocular, procurar manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.
Regras bsicas na conservao do microscpio.
O microscpio constitui um aparelho bastante caro, aps cada uso necessrio tomar
diversos cuidados para manter a funcionamento do aparelho. De entre os vrios
cuidados que se devem tomar para a conservao do microscpio, a seguir so
mencionados alguns:

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O microscpio deve estar sempre protegido com uma capa plstica ou com caixa
prpria e guardado em ambiente provido de luz artificial para evitar o crescimento de
fungos. A cada utilizao o p do microscpio dever ser removido com um pano
limpo.
As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e internamente,
por um tcnico, s quando necessrio.
A objetiva de imerso limpa com papel de filtro ou papel vegetal humedecido
com uma mistura de xilol e ter na proporo de 1:1 ou ainda por lcool.
As objetivas a seco so limpas com um linho macio e ocasionalmente, com
papel humedecido com gua destilada.
A parte interior das objetivas no deve ser limpa usualmente e quando feito
dever ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se remover a objetiva e passar
suavemente um pincel macio. No se deve assoprar para evitar a humidade. Esta
operao dever ser feita com muito cuidado para no descentralizar as objetivas.
Para uma boa conservao do microscpio o operador dever seguir uma rotina
diria que vai desde uma simples remoo do p at uma lubrificao mensal de todas
as partes mveis com um leo fluido.

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26

Estudo das Bactrias


Introduo
As bactrias so seres unicelulares e procariontes, so constitudas por clulas
procariticas, ou seja, no possuem uma membrana que individualize o material nuclear do
material citoplasmtico. O citoplasma no se encontra dividido em compartimentos,
devido a ausncia de um sistema de endomembranas. As bactrias apresentam parede
celular quimicamente complexa e podem apresentar flagelos.
Segundo o que se pode notar na fig.15, as bactrias podem ser encontradas nos formatos de
bastonetes (bacilos), vrgulas (vibries), esferas (cocos, diplococos, estreptococos ou
estafilococos) e em espirais espirilos.
Para a observao de clulas bacterianas utilizam-se esfregaos secos, fixados e corados.
Esfregao: a tcnica muito simples e bastante usada em bacteriologia. Consiste em fazer
deslocar uma lmina sobre outra que contenha uma gota de material a observar na
extremidade. Esta tcnica permite a obteno de uma camada muito fina e homognea de
clulas sobre a lmina. Aps a secagem, o material pode ser fixado e corado.
Fixao: tem como objetivo matar a clula e impedir a destruio do material biolgico
por autlise, de modo a preservar a estrutura inicial, esta tcnica pode ser feita pelo calor
ou lcool e formol.
Colorao: esta pode ser de dois tipos fundamentais:
Simples, em que o esfregao coberto com um nico tipo de corante durante um tempo
especfico. Na colorao simples as clulas so coradas de um modo uniforme.
Diferencial, usa-se mais de um corante e substancia. Uma das tcnicas de colorao
diferencial mais importantes e muito utilizada em bacteriologia mtodo de Gram (veja
adiante sobre este mtodo)

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Figura 15. Diferentes formas que as bactrias.

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28

Controlo de microrganismos.
Introduo.
A preveno e o controlo dos microrganismos podem ser eficientemente
realizados mediante aplicao de agentes qumicos ou fsicos sobre eles antes que
estes entrem em contacto com os hospedeiros, ou antes que atravessem a barreira
cutnea. Tais procedimentos podem ser utilizados sobre os alimentos, gua,
objectos em geral ou sobre a pele/mucosa. A natureza do agente a ser utilizado
(fsico ou qumico), seu tipo especfico (grupo a que pertence) e sua intensidade
de aplicao tm de ser apropriados para a natureza do material que se vai
submeter ao tratamento, bem como devem ser condizentes com o grau de
eliminao dos microrganismos que se pretende alcanar. Portanto, pode-se
planear desde uma inactivao selectiva, at uma destruio completa de todos os
micrbios presentes no local. Sendo assim faz-se necessrio definir alguns
conceitos essenciais e fazer consideraes bsicas sobre os mesmos.
Conceitos de Definies.

a) Esterilizao: a destruio dos microrganismos nas formas vegetativas e


esporuladas. A esterilizao pode ser por meio fsico (calor) ou qumico (solues
esterilizantes).
b) Desinfeco: o emprego de mtodos qumicos ou fsicos com vistas a
destruir ou inibir microrganismos patognicos em objectos (superfcies) ou em
ambiente.
c) Antissepsia: a eliminao das formas vegetativas de bactrias patognica e
grande parte da flora residente da pele ou mucosa, atravs da aco de substncias
qumicas chamadas de anti-spticos, substncia ou produto capaz de deter ou
inibir a proliferao de microrganismos patognicos, temperatura ambiente, em
tecidos vivos.

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29

A antissepsia difere da desinfeco pelo facto de se referir (antissepsia) apenas


aos tecidos vivos, por isso deve se evitar o uso de expresses tais como
desinfeco da pele ou ferida, ou mesmo, antissepsia de um material
inanimado; o correcto dizer antissepsia da pele ou da ferida e desinfeco
do material ou ambiente de trabalho.
d) Assepsia: o conjunto de procedimentos que se empregam para impedir que
um determinado meio seja contaminado. Quando este meio for isento de bactrias
ou outro tipo de microrganismo se chama de meio assptico.
Desinfetantes: substncia ou produto capaz de deter ou inibir a proliferao de
microrganismos patognicos em ambientes e superfcies do consultrio,
temperatura ambiente.
Detergente: substncia ou preparao qumica que produz limpeza; possui uma
ou mais propriedades: tensoatividade, solubilizao, disperso, emulsificao e
umectao.
Equipamento de proteo individual (EPIS): so equipamentos de proteo
utilizados pelo profissional, pessoal auxiliar, paciente e equipamentos, a fim de
evitar contaminao e acidentes (gorro, mscara, avental, luvas, culos de
proteo, etc)
Mtodos de controlo e eliminao microbiana.
Os mtodos de controlo e eliminao de microrganismos em objectos (incluindo
alimentos), ambientes e superfcie corporal diferem conforme a natureza do
micrbio, bem como do item a ser higienizado. Existe uma variao muito grande
entre os microrganismos quanto sensibilidade aos mtodos empregues para o
controlo e eliminao dos mesmos. Deve-se observar o facto de que, a princpio, o
termo controlo se refere aos mtodos que visam reduzir a populao microbiana
a quantidades tolerveis ou, ento, estratgias que impedem a referida populao

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de crescer alm dos limites aceitveis. J a palavra eliminao significa acabar


na sua totalidade com os microrganismos em determinado local.
Em uma viso global, os principais mtodos fsicos e qumicos, no
quimioterpicos, para o controlo e eliminao microbiana so:
1. Mtodos fsicos.
a) Temperatura: um dos mtodos eficientes para o controlo do crescimento e
eliminao de microrganismos, pelo facto de ser relativamente seguro para quem
o executa, ter custo baixo e por no formar produtos txicos.
O calor aparentemente mata os microrganismos pela desnaturao de suas
enzimas, que resulta na mudana tridimensional dessas protenas, inativando-as.
A resistncia ao calor varia entre os diferentes microrganismos, e essas diferenas
podem ser expressas pelo conceito de ponto de morte trmica (PMT). O PMT
a menor temperatura em que todos os microrganismos em uma suspenso lquida
especfica sero mortos em 10 minutos. Outro fator a ser considerado no processo
de esterilizao o tempo requerido para o material se tornar estril. Esse perodo
expresso como tempo de morte trmica (TMT), que designa o tempo mnimo
em que todas as bactrias em uma determinada cultura lquida especfica sero
mortas, em uma determinada temperatura.
Esterilizao pelo calor: distinguem-se o calor hmido e o calor seco. O calor
hmido a gua ou o vapor de gua a alta temperatura, possui maior poder de
penetrao comparativamente ao calor seco que mata os microrganismos por
efeitos de oxidao.
Baixas temperaturas: actuam principalmente mediante a reduo da actividade
enzimtica microbiana, o que diminui sua taxa metablica e velocidade de
crescimento. No geral as baixas temperaturas so utilizadas apenas como mtodo
de preservao dos microrganismos, embora, dependendo da intensidade de

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31

aplicao, poder levar a morte de alguns microrganismos. Os mtodos mais


empregados so: refrigerao e congelamento.
b) Filtrao: mtodo empregado para remover microrganismos de lquidos, ar e
gases. Os filtros de partculas de ar de alta eficincia (high-efficiency particulate
air - HEPA) removem quase todos os microrganismos maiores que cerca de 0,3
m de dimetro.
c) Dessecao: a remoo da humidade de determinada matria, e pelo
impedimento da mesma em absorver a humidade do ar. Os microrganismos no
podem crescer e se reproduzir nesse ambiente seco, mas podem permanecer
viveis por longos perodos. No momento que a gua reintroduzida, podem ser
reactivados, retomando seu crescimento e diviso. Esse o princpio da
liofilizao (congelamento-dessecao), um processo utilizado em laboratrios
para a preservao de microrganismos.
d) Remoo do oxignio: na ausncia de oxignio as bactrias aerbicas morrem,
ou ento, formam esporos, caso sejam dotadas dessa capacidade. Essa tcnica
possui importncia prtica na indstria alimentcia, a qual utiliza-se de
embalagens (ou envasamento) a vcuo como meio de melhorar a conservao de
alimentos (carne, legumes, etc).
e) Presso osmtica: tcnica que utiliza altas concentraes de sais e aucares
para conservar prteses biolgicas e alimentos, baseada nos efeitos da presso
osmtica. Altas concentraes de determinadas substncias criam um ambiente
hipertnico que ocasiona a sada de gua da clula microbiana. Esse processo
pode ser comparado ao mtodo de conservao por dessecao, pois ambos os
mtodos retiram da clula a humidade que ela necessita para o crescimento.
Lembre-se de que, como regra geral, os fungos e os bolores so muito mais
capazes que as bactrias de crescer em materiais com baixa humidade ou com alta
presso osmtica.
2. Mtodos qumicos.

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Os mtodos qumicos so baseados em substncias naturais ou sintticas para


eliminar ou inibir o crescimento dos microrganismos em tecidos vivos ou em
objectos inanimados. Infelizmente, poucos agentes qumicos proporcionam a
esterilidade, a maioria apenas reduz as populaes microbianas em nveis seguros
ou removem as formas vegetativas de patgenos nos objectos.
Existem duas categorias principais de efeitos dos mtodos qumicos:
Efeito esttico (bacteriosttico ou fungiosttico): ocasiona a inibio no
crescimento microbiano.
Efeito microbicida/germicida (bactericida, fungicida, viruscida, protozoocida
ou esporocida): promove a destruio dos microrganismos.
A capacidade de eliminar microrganismos, a rapidez assim como o espectro de
aco, define o nvel de desinfeco que pode ser alcanado por determinado
produto. Tendo em vista isso, podem se classificar da seguinte forma:
Nvel baixo: eliminao da maioria das bactrias, de alguns vrus e alguns fungos,
sem inativao de microrganismos mais resistentes como micobactrias e formas
esporuladas.
Nvel intermedirio: inativao das formas vegetativas de bactrias, da maioria
dos vrus e maioria dos fungos.
Nvel alto: destruio de todos os microrganismos, com excepo de formas
esporuladas.
Tipos de agentes qumicos utilizados no controle microbiano:
1. Agentes alquilantes: so compostos cancergenos e, por isso, no devem ser
utilizados em tecidos vivos. Por definio, um alquila ou alcoila um radical
monovalente (CnH2n+1) formado pela remoo de um tomo de hidrognio de

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33

um hidrocarboneto saturado. Os principais alquilantes utilizados para o controlo


dos microrganismos so:
a) Glutaraldedo: seu mecanismo de aco ocorre atravs da alterao do DNA e
de enzimas. Serve para a desinfeco (de alto nvel) e para a esterilizao,
dependendo da concentrao e do tempo de exposio. Tem como desvantagens o
vapor irritante, odor desagradvel, ser carcinognico e ter a sua eficcia diminuda
na presena de matria orgnica. Um possvel substituto do glutaraldedo o ortofitalaldedo (OFA) que alm de mais efetivo contra a maioria dos
miroorganismos, mostra-se pouco irritante.
b) Formaldedo: actua como desinfetante ou esterilizante, possuindo ptimo
efeito sobre bactrias gram-positivas e gram-negativas, alm de vrus, fungos,
micobactrias e endsporos. Obtm-se a esterilizao atravs da soluo alcolica
de formaldedo a 8% ou aquosa a 10%, com exposio mnima de 18 horas.
Apresenta alto poder carcinognico, e deve ser manuseado usando-se
equipamentos de proteo individual (EPIs).
c) xido de etileno (ETO): um esterilizador gasoso incolor muito eficiente,
utilizado principalmente para materiais termossensveis como as sondas para
laparoscopia e artroscopia. Possu alto poder de penetrao, carcinognico,
exigindo treinamento de pessoal, uso de EPIs e exames bioqumicos de sade
peridicos.
2. Fenis: atuam na desnaturao de protenas, servindo como antimicrobianos.
Actualmente, os compostos fenlicos so pouco utilizados, pois irritam a pele e
apresentam odor desagradvel. Possuem efeitos carcinognicos, com acentuada
toxicidade em felinos e crianas. Um dos compostos fenlicos mais utilizados
deriva do alcatro e so denominadas cresis, estes so ptimos desinfetantes de
superfcie.
3. Bifenis: so derivados do fenol que possuem dois grupos fenlicos ligados
por uma ponte. Um bifenol, o hexaclorofeno muito utilizado em procedimentos

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de controlo microbiano, principalmente estafilococos e estreptococos grampositivos.


O outro bifenol amplamente utilizado o triclosano, um dos componentes
presentes em sabonetes antibacterianos e pastas de dentes. especialmente
efetivo contra bactrias gram-positivas, mas tambm funciona bem contra fungos
e bactrias gram-negativas. Existem algumas expcees, como a Pseudomonas
aeruginosa, uma bactria gram-negativa que muito resistente ao triclosano,
bem como a muitos outros antibiticos e desinfetantes.
4. Halognios: os halognios (ou halgenos), particularmente o iodo e o cloro,
so agentes antimicrobianos eficazes, tanto isoladamente, como constituintes de
compostos inorgnicos ou orgnicos.
Cloro ou compostos clorados: so amplamente empregados na desinfeco de
nvel mdio. So efetivos contra os vrus, bactrias gram-positivas e gramnegativas, fungos, e efectividade mdia como esporocidas. Uma grande
vantagem a permanncia de actividade residual, e como desvantagens
destacam-se a inactivao pela matria orgnica, actividade corrosiva em metais
e o efeito descolorante. Os principais compostos clorados com aco desinfetante
so: hipoclorito de sdio (gua sanitria, lquido de Dakin), hipoclorito de clcio
(alvejantes em p) e as cloraminas (amnia com cloro).
Iodo: agem contra todos os tipos de bactrias, muitos endsporos, vrios fungos
e alguns vrus. O iodo pode ser empregado para a desinfeco de equipamentos e
superfcies, no sendo seu uso recomendado em metais facilmente oxidveis ou
que mancham facilmente.
5.

Peroxignios perxido de hidrognio, cido peractico e oznio: so

agentes qumicos oxidantes que exercem aco na membrana citoplasmtica, no


DNA e em outros componentes celulares.
6.

lcoois: o mecanismo de aco do lcool a desnaturao de protenas, mas

tambm pode romper membranas e dissolver lipdeos, inclusive o componente

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lipdico dos vrus envelopados. Agem efetivamente contra as bactrias, fungos,


mas no contra endsporos e vrus no envelopados. Os dois alcois mais
comumente utilizados so o etanol e o isopropanol. Tm a vantagem de agir e
ento evaporar rapidamente, sem deixar resduos. Contudo, os lcoois no so
antisspticos satisfatrios quando aplicados em feridas, pois causam a
coagulao de uma camada de protenas, sob a qual as bactrias continuam a
proliferar. Como antissptico das mos, o lcool em gel apresenta determinadas
vantagens sobre o lquido, as quais destacam-se:
O gel retm certo grau de molculas de lcool, com a volatilidade
reduzida, possibilita maior tempo de ao.
Adeso do gel nas mos, prolongando a aco do lcool;
O gel protege a pele do ressecamento promovido pelo lcool lquido;
O gel menos inflamvel, evitando acidentes com queimaduras;
Mais fcil no acondicionamento, na medida que o gel no vaza
facilmente.
7. Corantes: o azul metileno e o cristal violeta (violeta genciana) constituem-se
nos principais corantes antimicrobianos, atuando por inibio da sntese da parede
celular.
8. Agentes de superfcie (tensoativos ou surfactante): os agentes de superfcie
podem reduzir a tenso superficial entre molculas de um lquido. Esses agentes
incluem os sabes e os detergentes.

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36

Aco de Anti-spticos
spticos.
Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:

Objectivo

Verificar a aco de anti-spticos


spticos sobre a microbiota das
mos.

Placa de petri com gelatina


Marcador
Estufa a 400C
Materiais

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37

1. Divida a placa de Petri contendo gelatina em 4 partes iguais.


Utilize para isso, um marcador, fazendo a diviso na parte de baixo da
placa.
2. Identifique cada quadrante com os respectivos ttulos: Controle
(C), Mo Suja (MS), Detergente (Det),
), lcool 70% (A),
(
e lcool
Iodado (AI ). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema
abaixo.

Procedimentos

3. No quadrante identificado como Mo Suja encoste o dedo


(sem lavar) na gelatina por 1 minuto.
4. A seguir lave as mos com detergente e seque-as
seque levemente e
encoste o mesmo dedo no quadrante da gelatina identificado como
Detergente por 1 minuto.
seque-as e encoste o mesmo dedo no
5. Lave as mos com lcool, seque
quadrante da gelatina identificado como lcool
lc
por 1 minuto.
6. Incube a placa na estufa a 300C por um perodo de 48 horas.
Obs: Nada deve encostar-se
se ao quadrante identificado como
Controle.

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38

1. Faa uma representao esquemtica dos resultados obtidos


na avaliao da microbiota das mos.

Crescimento Bacteriano
Controlo
Placa
Auto-avaliao

Mo suja
Detergente
lcool 70%

2. Como voc interpreta os resultados obtidos? Qual a


importncia da antissepsia das mos?

Observao de bactrias lcticas no iogurte usando a colorao


c
simples.
Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:
Mostrar a existncia de bactrias lcticas no iogurte
Descrever as caractersticas das bactrias existentes no
Objectivos

iogurte

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39

Microscpico ptico
Laminas e lamelas
Agua destilada
Conta gota
Papel vegetal
Azul metileno
lcool

Materiais

Lamparina de lcool
leo de imerso
Iogurte natural

1. Coloque uma gota de gua na lmina


2. Agite o iogurte, e com conta gota retire uma pequena poro
e coloque-aa sobre a gota de gua que colocaste anteriormente na
lmina. Aplique a tcnica de esfregao e espalhe sobre a
lmina.
3. Seque suavemente chama de lamparina o esfregao
efetuado.
4. Coloque sobre o esfregao duas a quatro gotas de lcool para
Procedimentos

retirar o excesso de gordura;


5. Deixe secar o esfregao por alguns minutos
6. Adicione o azul metileno e deixe por 1 a 2 minutos
7. Por imerso em gua retire o corante do esfregao;
8. Deixe secar o esfregao ao ar por alguns minutos;
9. Observe ao microscpio ptico a preparao usando primeiro
a objetiva de menor ampliao e recorre ao uso de objetiva de
imerso, para isso, coloque uma gota de leo de imerso sobre
o esfregao e seguidamente observe com a objetivas de maior
ampliao (60x).

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Observao de bactrias usando a colorao diferencial (Mtodo


de Gram)
Introduo
A colorao Gram foi proposta pelo fsico dinamarqus Hans Cristian Gram em
1884. Esta tcnica permite distinguir clulas bacterianas quanto composio das
suas paredes celulares, facilitando a observao morfolgica das prprias clulas.
Em termos fsico-qumicos, o processo baseia-se na reao de um corante alcalino
com os cidos da clula. Este tipo de colorao consiste em tratar as bactrias
sucessivamente com cristal violeta, lugol, lcool-acetona e fuscina (ou safranina).
O cristal violeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o
qual confere colorao roxa tanto pelas bactrias Gram positivas, quanto as
Gram negativas. Com a adio de lcool acetona, as bactrias Gram
negativas libertam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano de
pequena espessura, enquanto que as Gram positivas retm o complexo,
permanecendo roxas. A adio de fuscina (ou safranina) no altera a cor das Gram
positivas, mas confere a cor avermelhada as bactrias Gram negativas, que
foram descoloridas pelo lcool acetona. As etapas do mtodo de Gram e os
resultados esto resumidos na tabela 3.

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41

Tabela 3. Resumo do processo da colorao Gram e os respetivos resultados.


Solues em ordem de Reaco e aspecto das bactrias
aplicao
Gram positivas
Violeta de Genciana (VG) ou Clulas coradas em violeta
Cristal Violeta
Soluo de iodo (I) ou lugol
Formao do complexo VG-II no
interior das clulas, que permanecem
em violeta

Gram negativas
Clulas coradas em
violeta
Formao do complexo
VG-I no interior das
clulas,
que
permanecem em violeta
O complexo no removido pelo O etanol remove o
etanol. As clulas permanecem violetas complexo VG-I. As
clulas
ficam
descoradas
As clulas no so afetadas, As clulas tomam o
permanecem violetas
corante,
tornando-se
vermelhas

Etanol

Safranina

(Fonte: Marques et al,, s/d)


Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:
Executar a tcnica de colorao de Gram;
Classificar as bactrias segundo o tipo de Gram;
Objectivos

Relacionar a composio qumica da parede celular das bactrias com


os corantes de Gram.

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Iogurte comercial
Lminas
Lamelas
Pipeta
gua destilada
Luvas
Materiais

Soluo de violeta de cristal


Lugol (soluo de iodo)
lcool etlico (96%)
Soluo de safranina
Microscpio ptico
leo de imerso

42

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43

1. Coloca uma gota de gua na lmina


2. Torne homogneo o iogurte e retira uma gota. Espalhe-a
Espalhe na lmina, sob a
gota de gua, para formar o esfregao.
3. Seca o esfregao ao ar durante 1 min.
4. Efetue a colorao de Gram.. Para a sua efetivao siga os seguintes
procedimentos:
5. Cobre o esfregao com violeta de cristal durante 1 minuto.
6. Lava com gua corrente evitando fazer incidir o jacto diretament
diretamente sobre o
esfregao.
7. Cobre com lugol durante 1 minuto.
Procedimentos

8. Repete a lavagem.
9. Pingue uma gota de lcool a 95% durante 1 minuto.
10. Repete a lavagem.
11. Pingue uma gota de safranina deixe por 30 segundos.
12. Repete a lavagem.
13. Seca suavemente sobre papel absorvente.
14. Observa ao microscpico, sem usar lamela, com as objetivas de menor
ampliao. Regista as tuas observaes.
15. Coloca uma gota de leo de imerso sobre a preparao e observa com a
objectiva de 60x. Faz um esquema da tua observao e legenda
legenda-o.
Interpretao dos Resultados
As bactrias do esfregao aparecero coradas de violeta quando forem
Gram-posetivas,
posetivas, ou coradas de rosa (safranina) no caso de serem Gram
Gramnegativas.

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44

1. Qual a objetiva que permite uma melhor visualizao das bactrias?


Procure justificar tendo em conta a dimenso das clulas observadas.
2. Registe esquematicamente o que observaste
3. Caracterize quanto a forma as bactrias observadas
4. Indique a colorao das clulas das duas espcies.
Auto-avaliao

5. Que concluses podem tirar?


6. Procure identificar
ficar a funo do soluto de lugol e da safranina.
7. Em que consiste a colorao Gram?

Isolamento de Bactrias do Iogurte


Ao completar esta aula,, voc ser capaz de:

Identificar as bactrias existentes no iogurte;


iogurte
Isolar as bactrias do iogurte
Objectivos

Iogurte magro natural


Ansa de repicagem
Placas com meio slido
Materiais

Parafilme ou pelcula aderente


Lamparina de lcool
Estufa a 37C

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45

1. Esterilizar a ansa de repicagem na lamparina.


2. Deixe arrefecer e mergulhe no iogurte.
3. Faa um riscado numa placa contendo meio slido.
4. Sele a placa com tiras de parafilme ou pelcula aderente.
5. Colocar na estufa a 37C.
Terminologia

6. Alguns dias depois tentar observar os 2 tipos de colnias:


A. Colnias muito transparentes em forma de flor (Lactobacillus)
(
B. Colnias brancas, pequenas e redondas ((Streptococcus
Streptococcus)

1. Retire, junto chama, uma poro de clulas dum tipo de


colnia isolada, com uma ansa.
2. Deposite essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma
lmina e cobra com lamela.
3. Observe ao microscpio, tentando identificar os
microrganismos.
Sugestes da prtica

4. Retire, com uma ansa junto chama, uma poro de clulas


dum tipo de colnia isolada. Faa uma placa de
d isolamento.
5. Coloque na estufa a 37C, faa para os dois tipos de colnias,
com vista a obter-se
se um crescimento isolado dos dois gneros
de microrganismos.

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46

Identificao de Bactrias do Trtaro.


Ao completarr esta unidade / lio, voc ser capaz de:

Verificar a formao de bactrias na boca,


Indicar a importncia da higiene bucal.
Objectivos

Lmina
Lamela,
Microscpio ptico
Palito de dente
Papel filtro,
Materiais

Pipetas Pasteur
Azul metileno
lcool
Com o palito de dente retire entre os dentes o trtaro e
espalhe numa lmina;
Pingue uma gota de gua.
Cubra com uma lamela.

Procedimentos

Observe ao microscpio
Anote a observao
Adicione uma gota de azul metileno.

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47

PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA


Introduo.
Os meios de cultura sendo associaes de substncias que permitem o cultivo dos
microrganismos fora do seu meio natural, fundamental que os meios de cultivo
contenham substncias exigidas pelo microrganismo para o seu crescimento e
multiplicao.
Nas preparaes dos meios de cultura todos os nutrientes devem ser dissolvidos em gua
para que possam ser absorvidos pelas clulas microbianas.
Nos laboratrios geralmente utiliza-se gua destilada no preparo destes meios, no entanto
nas unidades industriais costuma-se utilizar gua de rios ou poos. A guadeve ter boa
origem e composio qumica constante; quando necessrio, deve ser devidamente tratada.
Como constituintes bsicos dos meios de cultura, alm da gua, pode-se especificar: as
fontes de carbono (protenas, aucares), as fontes de nitrognio (peptonas), fontes de
energia, so tambm necessrios sais inorgnicos, vitaminas e outras substncias que
estimulam o crescimento dos microrganismos. Em meios de cultura solidificados, alm
destes componentes deve-se introduzir agar, gelatina ou slica gel com a funo especfica
de solidificar esses meios.
Normas de Preparao dos Meios de Cultura
Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de cultura podem ser
pesados separadamente, ou consecutivamente num nico recipiente (Bquer). Para
quantidades inferiores a 1g utiliza-se uma balana analtica (semi-analtica). O agar-agar
geralmente pesado separadamente, sendo o valor da pesagem em funo da quantidade
do meio a ser distribudo nos recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante
em p para cada litro de soluo nutriente.

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48

Solubilizao dos componentes: adicionar os nutrientes previamente pesados a um


Bquer contendo gua destilada em quantidade suficiente para dissolv-los. Os extratos de
carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilizao.
Deve-se evitar o uso de lume directo e prolongado para no haver queima do material e
consequente escurecimento do meio. O agar no solvel a frio, devendo se necessrio ser
solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.
Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao mximo os meio lquidos, antes de
acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar na menor temperatura em que no
haja solidificao.
So empregadas para ajuste do pH solues de hidrxido de sdio ou cido clordrico a
0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH atravs do uso de um
papel de tornassol.
Em meios solidificados, o pH cido s dever ser ajustado depois da esterilizao para
evitar a hidrlise do agar quando em temperatura elevada. Neste caso o pH cido
ajustado com uma soluo estril de cido lctico.
Clarificao: em alguns casos h necessidade de clarificao dos meios que durante o
preparo tornam-se turvos. A clarifio pode ser feita simplesmente pelo calor ou pelo uso
de clara ou albumina de ovo, aquecendo em seguida at ebulio e filtrando-se em gs e
ou algodo hidrfilo.
Distribuio, esterilizao e conservao: os meios de cultura depois de preparados so
distribudos em recipientes adequados (tubos, bales, Erlenmeyeres), especificando o
respectivo nome ou sigla e a data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuio, os
tubos, bales ou Erlenmeyers so arrolhados com algodo ou tampas metlicas especiais,
e levados esterilizao. A temperatura e o tempo de exposio durante a esterilizao
dependem da composio e da quantidade de meio de cultura. Aps a esterilizao, os
meios so resfriados espera-se 72 horas antes de us-los ou estoc-los em frigorificos, a
fim de que se possa detectar algum tipo de contaminao, ou falha de esterilizao.

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49

Identificao de Bactrias em Meios de Cultura Preparados com Gelatina


Quando terminar aula, voc deve ser capaz de:

Mostrar a existncia de bactrias em diferentes partes;


Explicar como as bactrias contaminam o meio de cultura;
Objectivos

Observar o desenvolvimento das bactrias na placa de petri;

1 Pacote de gelatina incolor;


1 Caldo de galinha em p;
1 Copo de gua.
Duas placas de petri;
Cotonetes;
Etiquetas adesivas;
Materiais

Caneta
Microscpio ptico
Lmina,
Lamela,
Esptula
Luvas.

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50

1. Dissolver a gelatina incolor na gua ou aquecer a gelatina at


estar no estado lquido.
2. Entorne a gelatina nas duas placas de petri e adicione o caldo.
Desta forma obtm-se
se o meio de cultura.
3. Passar cotonete no cho ou entre os dentes, ou ainda entre os
dedos
edos dos ps (de preferncia depois ficar por um tempo
Procedimentos

fechados dentro dos sapatos). Pode ainda, usar um dedo sujo.


4. Esfregue levemente o cotonete sobre o meio de cultura para
contamin-lo.
5. Marque nas etiquetas adesivas que tipo de contaminao foi
feito.
6. Depois de trs dias, com o microscpio observe os
microrganismos presentes no meio de cultura.

1. Descreva as alteraes que ocorrem aps os trs dias.


2. Desenhe as estruturas observadas.
Auto-avaliao

3. O que necessrio para que um microrganismo se desenvolva?


4. Cite lugares que podem ser apropriados para as bactrias?

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ecificado no documento.

51

Observao de bactrias do ar e do ambiente de trabalho.


Introduo
Os microrganismos, principalmente as bactrias pode ser encontrado em quase todos os
ambientes, no solo, na gua, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato
gastrointestinal, pele). Frequentemente tais bactrias no esto associadas a nenhum
prejuzo.
A microbiota intestinal desempenha importante
importante papel na defesa do organismo contra
certas infeces; existem estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o
desenvolvimento das defesas imunolgicas. Ao mesmo tempo em que desenvolve
atividades benficas, a microbiota pode ser responsvel por
p uma srie de doenas
oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao uso constante de drogas
imunossupressoras e antibiticos.
Muitas infeces causadas por bactrias so adquiridas por contato direto ou veiculadas
por alimentos. Ao contrrio do
do que se pensava antigamente, a disseminao de
bactrias patognicas pelo ar e poeira no ocorre com grande frequncia, pois de um
modo geral, no sobrevivem por longos perodos no ambiente externo. Entretanto, estas
vias de transmisso podem ser de grand
grandee importncia em determinadas situaes. No
caso de bactrias esporuladas a transmisso area mais importante. Os alimentos so
uma importante via de transmisso de doenas bacterianas como a shigelose e a
salmonellose.

Verificar a existncia de microrganismos em diferentes ambientes.


Mostrar a importncia dos critrios bsicos de higiene,
Objectivos

Evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais.

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3 Placas de petri com gelatina


Estufa bacteriolgica
Cotonete esteril
Materiais

Pina

52

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53

1. Presena de microrganismos no ar
a) Retire a tampa das placas contendo gelatina e deixe abertas no
ambiente durante 15 minutos. Incube as placas por 3 a 5 dias a
30C.
2. Presena de microrganismos no laboratrio
a) Inocule as placas contendo gelatina, para isso proceda da
seguinte maneira:
b) Enumere as trs placas, sendo que na:
Procedimentos

Placa 1 - passe o cotonete estril na superfcie de qualquer objecto do


laboratrio e depois na superfcie da gelatina. Tome cuidado para no
n
ferir o meio de cultura.
Placa 2 - toque a superfcie da gelatina em vrios pontos com os dedos
(no lavados);
Placa 3 coloque um fio de cabelo sobre a superfcie do meio de
cultura atravs do uso de uma pina estril.
c) Incube as placas por 3 a 5 dias a 30C.
d) Descrever em termos gerais a aparncia dessas colnias
(tamanho, textura, cor, etc).

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54

1. Qual a finalidade prtica de se conhecer os microrganismos do


ambiente? E do laboratrio de microbiologia?
2. Quais as precaues que devem ser tomadas para controlarem os
Auto-avaliao

contaminantes do laboratrio?
3. Neste experimento, houve influncia do meio de cultura
cu
no
aparecimento de bactrias? Justifique sua resposta. Pesquise sobre
fontes nutricionais requeridas por bactrias.

Observao e Isolamento de bactrias halofitas no peixe seco


salgado.
Introduo
As halobactrias so contaminantes habituais do peixe seco salgado. Crescem
sua superfcie, como manchas avermelhadas, e tm um cheiro caracterstico
a peixe podre, mesmo quando o peixe est em perfeitas condies de
utilizao. As halobactrias do gnero Halobacterium so cilndricas e tm
movimento por flagelos; as do gnero Halococcus so esfricas.

Identificar as bactrias halofitas


Caracterizar as bactrias halofitas
Objectivos

Isolar as bactrias halofitas

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55

Peixe seco que apresente zonas vermelhas e cheiro intenso


Agua destilada
Azul metileno
Pina
Materiais

Bisturi
Pipetas Pasteur plstica
Sal
Tubo de ensaio
Ansa de repicagem
Placas com meio de cultura slido
Parafilme ou pelcula aderente
Estufa a 40C
Microscpio ptico
Laminas e lamelas

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56

1. Observao de bactrias halofitas


Com o bisturi corte um pequeno pedao de peixe na parte
avermelhada;
Coloque o pedao num tubo de ensaio contendo 1 a 2ml de
soluo salina (20%).
Procedimentos

Agite bem.
coloque numa lmina e
Com uma pipeta retire uma gota e coloque-a
tape com lamela;
Observe ao microscpio ptico;
Por irrigao, adicione azul metileno, retire o excesso de gua
com papel de filtro
Observe ao microscpio, usando primeiro a objectiva de 4x e
depois com a objectiva de imersoo de 60x.
Explique o que observou antes e depois de adicionar o azul
metileno.

2. Isolamento de bactrias halofitas.


Esfregue um pedao de peixe duma zona que esteja vermelha
numa placa com meio de cultura slido.
Sele a placa com tiras de parafilme ou pelcula aderente.
Coloque na estufa a 40C,
Passados alguns dias, identifique as colnias vermelhas, e faa
placas de isolamento a partir de colnias isoladas. (Podem
tambm fazer-se
se placas de individualizao.)
Retire uma poro de clulas duma colnia
col
isolada, com uma
ansa de repicagem.
Depositar essas clulas numa gota de meio lquido, colocada
sobre uma lmina e cubra com lamela.
Observe ao microscpio tentando distinguir os microrganismos.

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57

Observao de Acetobacter no Vinho Fermentado.


Introduo
As principais espcies de Acetobacter,, utilizadas na produo de vinagre,
apresentam se nas formas de bacilos e cocos, formando correntes e
apresentam-se
filamentos.
As bactrias acticas necessitam do oxignio do ar para realizarem a
acetificao. Por isso multiplicam-se
se mais na parte superior do vinho que
est a ser transformado em vinagre, formando um vu conhecido como
me do vinagre. Esse vu pode ser mais ou menos espesso de acordo com
o tipo de bactria.

Identificar microscopicamente as acetobacter


Mostrar a estrutura das acetobacter
Objectivos

Microscpio ptico;
Lminas;
Lamelas
Actividade

Pina de madeira;
Lamparina de lcool;
Papel de filtro;
Soluo de azul metileno;
leo de Imerso;
gua destilada;
Vinho fermentado

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documento.

58

1. Retire um pouco da pelcula fina formada superfcie do


vinho fermentado;
2. Espalhe o material na lmina, utilizando a tcnica do
esfregao;
3. Seque o esfregao ao ar durante alguns minutos;
4. Fixe o esfregao pelo calor, passando 3 vezes a face inferior
na chama da lamparina;
5. Faa a colorao com a soluo de azul metileno e deixe
actuar durante 1 a 2 minutos;
Terminologia

6. Remova o corante do esfregao por imerso em gua;


7. Retire, cuidadosamente, o excesso de gua com papel de
filtro.
8. Seque ao ar a zona do esfregao.
9. Sem colocar lamela, coloque a lmina no microscpio e
proceda sua focagem com a objetiva de 4x.
10. Coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e
observe com a objectiva de imerso de 60x.
6
11. Faa um esquema legendado do que observa.

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59

Estudo dos Fungos


Introduo
Os fungos constituem um grupo de seres vivos bastante heterogneo, so
seres eucariticos, podendo ser multicelulares ou unicelulares. Os
unicelulares sero a base da abordagem deste captulo.
A maior parte dos fungos unicelulares so invisveis a olho nu, podendo ser
observados ao microscpio. Contam-se milhares as espcies de fungo
microscpico, algumas delas bastante conhecidas, como, por exemplo, os
mofos, que se desenvolvem principalmente em lugares hmidos e mal
ventilados ou escuros. Os mofos formam uma espcie de feltro sobre a
superfcie de frutos e hortalias ou de objetos deixados em lugares fechados
e hmidos.
Podem tambm se destacar os fungos microscpicos as leveduras, estes no
apresentam colorao, conhecidos e utilizados pelo homem desde a mais
remota antiguidade. Pode se destacar a levedura da cerveja, que se
acrescenta massa do po para faz-lo crescer, e as leveduras que
provocam a fermentao do sumo da uva, transformando em vinho.

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Observao de Processos Metablicos nos Fungos.


F
Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:

Identificar os processos metablicos dos fungos;


Explicar os processos metablicos dos fungos
Objectivos

gua destilada;
de chvena de acar;
1 Tigela;
1 Tubo de ensaio;
Material

1 Funil;
1 Rolha para fechar o tubo de ensaio;
Algodo;
Azul metileno;
Fermento biolgico.

60

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61

1. Dissolva o fermento biolgico junto com acar numa


tigela;
2. Com o funil, coloque um pouco dessa gua no tubo de
ensaio. Molhe o algodo no azul metileno e coloque-o
coloque na boca do tubo
de ensaio, sem encostar no lquido. FecheFeche-o com a rolha e espere
alguns dias;
3. Observe apss ter passado alguns dias;
Procedimentos

Constatao: o azull vira amarelo (aco dos fungos).


Explicao.
Dentro do tubo de ensaio, a gua com acar fornece o alimento
necessrio para os microrganismos no caso, fungos se desenvolverem.
Os fungos respiram e soltam gs carbnico, o que torna o ambiente do
tubo cido. Com isso, o azul metileno, sensvel alterao de pH, muda
sua cor para amarelo.

Observao de gemulao em leveduras


Introduo
Segundo a classificao proposta por Woese em 1977, as leveduras so
organismos do domnio dos eukarya
eukarya,, reino dos fungos. So estirpes da espcie
Saccharomyces cerevisiae que so importantes no fabrico de po, de vinho e de
cerveja. Esta espcie geralmente obtm energia por fermentao alcolica,
produzindo

etanol, embora tambm tenha capacidade para respirar


respi

aerobiamente. Pode cultivar-se


cultivar se em meios lquidos, como sumo de uva, ou em
placas de meios slidos. As leveduras que constituem o fermento de padeiro
so diplides.

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62

Explicar o mecanismo de gemulao das leveduras


Objectivos

Explicar o mecanismo de gemulao das leveduras


Identificar a reproduo nas leveduras
Material

1. Com a balana analtica, mea 0,25g de fermento biolgico;


2. Dissolva 0,25g de fermento biolgico em 10ml de gua
destilada, obtm-se
se assim a suspenso;
3. Retire 1 ml da suspenso obtida e adicione gua at perfazer 10
ml
4. Com a pipeta Pasteur, retire uma gota de fermento biolgico j
dissolvido na gua e coloque sobre uma lmina; cubra com a
Procedimentos

lamela
5. Observar ao microscpio, comeando pela objetiva de menor
ampliao, percorra a preparao de modo a localizar uma
clula de levedura em diviso

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63

Com base o que observou responda as questes que so colocadas


abaixo:
1. Faa um esquema da observao e a respetiva legenda.

Auto-avaliao

2. Distinga as estruturas observadas dos outros fungos

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64

Crescimento de leveduras no sumo de uva.

Descrever o crescimento das leveduras


Identificar os fatores que permitem o crescimento das leveduras
Objectivos

Sumo com sabor de uva


Fermento biolgico
6 Tubos de ensaio
Material

Medidor de pH
Estufa;
Frigorifico
Microscpio ptico

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ecificado no documento.

65

1. Encher os 6 tubos de ensaios com sumo de uva.


2. Numer-los de 1 a 6.
3. Coloque pequena quantidade de fermento biolgico nos tubos de
ensaio 1, 3 e 5 (Sugesto: utilizar um palito para retirar pedaos
pequenos).
4. Coloque os tubos 1 e 2 numa estufa, os tubos 3 e 4 temperatura
ambiente, e os 5 e 6 no frigorfico. Caso no disponha de estufa,
abra uma cova (num local com humidade) de aproximadamente
90 ou 100cm de profundidade.

Procedimentos

5. Deixe durante 5 dias avaliando os seguintes parmetros:


pH
Cheiro
Turbidez
Libertao do gs CO2
6. Interprete os resultados.

Multiplicao de leveduras em condies aerbias e


anaerbias
Introduo
As leveduras so organismos pertencentes ao reino dos fungos que apresentam
uma grande variedade de formas no que respeita a mobilizao de energia das
substncias energticas. Podem obter energia em condies de anaerobiose
(ausncia de oxignio), como na fermentao
fermentao alcolica, em que molcula de
glicose degradada em dixido de carbono e etanol ou lcool etlico, que se
pode traduzir na seguinte equao qumica:
C6H12O6

6CH3CH2OH + 2CO2 + Energia

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66

O processo acima descrito bastante


bastante til na indstria para o fabrico do po e da
cerveja, em que uma das espcies mais utilizadas a Sacchoromyces cervisae.
Em condies aerbias (presena de oxignio) as leveduras degradam
completamente a molcula de glicose em gua e dixido de carbono,
carbon que se pode
traduzir pela seguinte equao:
C6H12O6 + 6O2

CO2 + H2O + Energia

A presena de dixido de carbono pode ser detetada utilizando substncias


indicadoras da sua presena, como a gua de cal, que turva quando este est
presente.
Ao completar
completa esta aula, voc ser capaz de:

Explicar as diferentes formas de aquisio de energia pelas


leveduras
Objectivos

Caracterizar a multiplicao das leveduras em condies de


anaerobiose e aerobiose

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Garrafas termos de 1L
Termmetro
Gobels
Varetas de vidro
Tubos de vidro dobrados ou tubos plsticos
Pipetas
Material

Microscpio ptico
Laminas e lamelas
Soluo de glicose a 30%
gua de cal
Suspenso de leveduras

67

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68

1. Faa uma montagem de dois dispositivos experimentais como os


que se observa na figura 16.
2. Identifique cada uma das garrafas
3. Coloque no interior de cada garrafa termo soluo de glicose at
cerca da metade da altura
4. Agite a suspenso de levedura e de seguid
seguida adicione cerca de 100
ml da suspenso a cada uma das garras termo.
5. Agite bem a mistura com auxlio da vareta
6. Retire uma gota e observe ao microscpio com objetiva de 60x
Terminologia

7. Procure contar o nmero de leveduras no campo do microscpio


8. Tape as garrafas com as rolhas como se observa na figura 12
9. Regista a temperatura observada nos termmetros e o aspeto da
gua de cal em cada uma das situaes
10. Ao fim de 48 horas, repita as observaes efetuadas inicialmente
e registe os resultados
11. Procure registar o cheiro detetado
tado em cada uma delas

Figura 16:: Dispositivo experimental

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69

1. Reflita sobre as vantagens de agitar a mistura da soluo de


glicose e da suspenso de leveduras
2. Indique o nmero de leveduras em cada amostra
3. Indique a temperatura em cada uma das situaes
4. Procure interpretar a alterao da temperatura registada
Auto-avaliao

5. Elabore um quadro de resultados (no de leveduras, temperatura e


aspeto de agua de cal)
6. Indique em qual das situaes ocorreu produo de lcool
7. Em qual das situaes
es a agua de cal ficou mais turva
8. Procure explicar a quantidade de leveduras observada em cada
uma das situaes.

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Observao de ascsporos de Saccharomyces cerevisiae


Ao completar esta aula, voc deve ser capaz de:

Caracterizar os ascsporos das leveduras


Identificar os ascsporos nas leveduras
Objectivos

Cerveja 2M;
Agar ou Gelatina
cido actico laboratorial ou vinagre de cozinha
Hidrxido de potssio (ou potassa custica - KOH)
Acar comum ou sacarose
gua destilada
Medidor de pH
Placas de Petri esterilizadas
Material

Etanol
Esptula ou ansa de repicagem
Balana analitica
Bquer de 100 e 250ml
Pipetas de 0,5ml

70

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71

1. Preparao do meio de esporulao


a) Coloque 100ml de gua destilada num copo de vidro.
b) Adicione cerca de 2,5g de KOH,
c) Adicione vinagre de cozinha ou cido actico laboratorial, at o
pH se situar entre 6 e 7.
d) Adicione 0,05g de sacarose (na falta de balana com
sensibilidade adequada, introduza a ponta do dedo indicador na
sacarose; sacudir com o polegar a sacarose aderente para o meio
em preparao). Ateno:: os dedos devem estar secos
e) Dissolva 4g de gelatina e um volume de gua necessrio para
perfazer 200ml;
f) Deite o meio preparado para a placa de Petri;
2. Inoculao de clulas de Saccharomyces cerevisiae em meio
Procedimentos

de esporulao
a) Retire com a pipeta uma porco
orco de 0,2ml da suspenso de
clulas contida na cerveja para
ra o meio contido numa placa.
b) Espalhe com a vareta de vidro dobrada em L.
c) Deixe temperatura ambiente.
d) Aps pelo menos 1 dia, retire uma poro de clulas, com uma
esptula ou uma ansa de repicagem.
e) Suspenda essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma
lmina.
f) Cobra com lamela e observe ao microscpio ptico.

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documento.

72

Isolamento de leveduras de caldo de cana-de-acar


cana acar
Isolar as leveduras a partir de caldo-de--cana
Objectivos

Caldo de cana fermentado (24horas)


Meio de glicose-agar (GA) ou glicose--gelatina
4 Placas de Petri estreis
Tubos de ensaio estreis
Materiais

Tubo de ensaio para fermentao com caldo glicosado (CG)


Estufa a 400C

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73

1o dia:: Adicione o meio de cultura s placas. Dissolva a gelatina at que


solidifique. Com uma ala de platina, deite uma gota do caldo na
superfcie do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por
esgotamento seguindo os esquemas abaixo:

Figura. Dispositivo experimental

Procedimentos

2o dia: observe as colnias que cresceram e escolha as colnias tpicas


de leveduras.
Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais
como: tamanho, cor, forma, consistncia, brilho. Transfira com ala de
platina parte da colnia para um tubo com GA ou GG e para um tubo
com meio de CG. Incube numa estufa a 400C.
3o dia:: analise o crescimento no tubo com caldo glicosado e observe se a
levedura fermentativa. Realize uma observao in vivo e com
colorao simples. Anote os aspectos microscpicos do microrganismo
em estudo, tais como: tipo de reproduo (fisso, gemulao,
esporulao), presena de grnulos, de vacolos
vacolos.

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74

Observao de bolor negro do po (Rhizopus


(Rhizopus sp)
sp
Introduo.
O bolor negro do po ((Rhizopus sp)) um zigomiceto que se desenvolve a partir
de esporos que crescem, formando hifas cenocticas haplides. Tais hifas se
ramificam e formam um miclio. Na ponta das hifas aparecem os esporngios.
Estes produzem esporos que se espalham e, atingindo um local adequado com
matria orgnica que possa ser decomposta, sofrem mitoses, originando novos
fungos.

Mencionar as caractersticas do Rhizopus sp


Distinguir as estruturas do Rhizopus sp
Objectivos

Po
Bisturi
gua com detergente (2 ml de detergente
ergente-manoxol-para 100 ml
de gua)
Materiais

Lamelas
Laminas
Placa de petri
Microscpio ptico.
Estereoscpio binocular

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75

1. Coloque um pedao de po hmido numa placa de petri. Deixe-o


Deixe
exposto ao ar durante algumas horas e mantenha-o
mantenha sempre
hmido;
2. Cubra a placa com a respetiva tampa e coloque-a
coloque num lugar
quente, de preferncia as escuras;
3. Observa a placa diariamente durante um perodo de 5 a 7 dias,
procurando identificar o incio do aparecimento de bolores;
4. Ao stimo dia, observe o po ao estereoscpio binocular;
5. Faa o respetivo desenho;
Procedimentos

6. Utilizando a pina, retire um pouco do fungo e monte na lamela


e adicione uma gota de detergente,
detergente, de seguida cubra com a lamela;
7. Observe ao microscpio;
8. Faa um esquema com a respetiva legenda.

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76

Referencias Bibliogrficas
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ptica e Biologia Celular. Universidade Pedaggica, Departamento de Biologia Maputo, 2008
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Equipamentos Utilizados na Prtica Analtica Microbiolgica, 5a edio, CEFET-PE, 2007
MARGAA, Joo et al, Introduo a Microbiologia (Manual para Professores e Estudantes do Ensino
Bsico e Secundrio), 2004
MARQUES et al: Manual de Laboratrio de Microbiologia. Recife Pernambuco 1998
MARQUES, Eva et al: Tcnicas Laboratoriais de Biologia, Bloco I, Porto editora, s/d
MONDES, Adriane More & KESSLER, Camila Carvalho: Aulas Prticas de Microbiologia para
Odontologia. Universidade Federal de Santa Catarina, Centros de Cincias Biolgicas, Departamento
de Microbiologia e Parasitologia, 2003.
PINTO, Pedro: Tcnicas Laboratoriais de Biologia (Caractersticas dos Organismos Procariontes).
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