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prticas de Laboratrio
Sumrio
- Indroduo .......................................................................01
- Tecidos Epitelial ..............................................................01
- Tecido Conjuntivo ...........................................................02
- Tecido sseo ...................................................................06
- Tecido Muscular ..............................................................09
- Tecido Nervoso ...............................................................13
- Tcnica Bsica de Histologia ..........................................17
- Obteno das Peas .........................................................17
- Fixao ............................................................................18
- Principais Fixadores ........................................................20
- Principais Solues Fixadoras .........................................22
- Desidratao ....................................................................24
- Diafanizao ou Clarificao ..........................................25
- Impregnao/ e Incluso ................................................ 25
- Microtomia .....................................................................25
- Colorao ........................................................................29
- Coloraes Especiais ......................................................35
- Descalcificao ...............................................................37
- Descalcificadores ............................................................40
- Indroduo a Biologia Celular ........................................43
- Indroduo a Imunohistoquimica Bsica.........................48
INTRODUO
A tcnica histolgica constitui o conjunto de processos a que se submetem os
tecidos, neste caso de origem animal, a fim de que possam ser observados de maneira
significativa e adequada permitindo o diagnstico histolgico ou patolgico.
O QUE HISTOLOGIA?
a parte da Biologia que estuda os tecidos (do grego, hydton, tecido + logos, estudo).
Tecido Epitelial
Clulas geralmente polidricas, justapostas, entre as quais encontra-se pouca
substncia extracelular, tm vida limitada e se renovam constantemente.
Possuem adeso mtua, podem apresentar estruturas como vilosidades e clios.
Pode
epitelial glandular)
Pode ser especializado na captao de estmulos provenientes do ambiente
(neuroepitlios)
Revestem a superfcie externa e as cavidades do corpo (tecido epitelial de
revestimento) Esses epitlios dividem o organismo em compartimentos funcionais e tm
papel importante na absoro dos nutrientes - revestimento da superfcie interna do
intestino.
Os epitlios de revestimento so divididos de acordo com critrios morfolgicos,
tendo em vista o nmero de camadas que o constitui e a forma das clulas na camada mais
superficial:
-Epitlio Simples Pavimentoso - revestimento dos vasos (endotlio), da cavidade
peritoneal, pericrdia e pleural (mesotlio). Funo: movimentao das vsceras (mesotlio)
e transporte ativo por pinocitose (endotlio).
-Epitlio Simoples Cbico - revestimento do ovario, intestino. Funo: revestimento,
proteo, lubrificao e absoro.
-Epitlio Estratificado Pavimentoso - revestimento da pele, boca e esfago. Funo:
proteo e dificulta a perda de gua.
-Epitlio Estratificado de Transio - revestimento interno da bexiga e parte das vias
urinrias. Funo: proteo.
-Epitlio Estratificado Prismtico - conjuntiva do olho, serve para proteo.
-Epitlio Pseudo Estratificado - revestimentos da traquia e brnquios. Funo:
proteo e transporte de partculas estranhas para o exterior.
Tecido Conjuntivo
Diversos tipos de clulas, separadas por abundante material intercelular sintetizado
por elas e constitudo por fibras, uma substncia fundamental amorfa e pelo plasma
intersticial.
As fibras do conjuntivo so de trs tipos principais: colgenas, reticulares e
elsticas.
quantidade de R.E. e Aparelho de Golgi. Tem como funo sintetizar e secretar anticorpos
(protenas especficas denominadas imunoglobinas).
5- Clula Adiposa clula especializada no armazenamento de gordura. Ser
descrito posteriormente.
6- Leuccitos So constituintes normais do tecido conjuntivo, porm so oriundos
do sangue. Os leuccitos mais freqentes no tecido conjuntivo so os neutrfilos, os
infilos e os linfcitos. Sero detalhados posteriormente.
Tecido Conjuntivo
Frouxo
Denso
Tecido Adiposo
Tecido Elstico
Tecido Reticular
Tecido Mucoso
Tecido Cartilaginoso
Tecido sseo
Tecido Conjuntivo Frouxo mais comum, preenche espaos entre as fibras e feixes
musculares serve de apoio para o tecido epitelial e forma camada em torno dos vasos
sangneos e linfticos. um tecido delicado, flexvel e pouco resistente s traes.
em
associao
com
macromolculas
de
proteoglicanas
(protenas
Tecido sseo
um dos mais resistentes e rgidos do corpo humano. Constituinte principal do
esqueleto, serve de suporte para as partes moles e protege rgos vitais, como os contidos
na caixa craniana e torcica. Aloja e protege a medula ssea, formadora das clulas do
sangue, proporciona apoio aos msculos esquelticos, transformando suas contraes em
movimentos teis. Alm destas funes, os ossos funcionam como depsito de clcio,
fosfato e outros ons, armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada.
um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por trs tipos de clulas, que
so:
1 - Osteoblastos: Geralmente esto situadas na periferia do tecido sseo j formado.
Tem como funo secretar a parte orgnica da matriz (fibras e protenas).
2 - Ostecitos:
ou
pelo
processo
de
ossificao
endocondral.
ossificao
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Tecido Muscular
responsvel pelos movimentos corporais.
Suas clulas so alongadas caracterizadas pela presena de grande quantidade de
filamentos citoplasmticos responsveis pela contrao.
De acordo com suas caractersticas morfolgicas e funcionais, podem-se distinguir
nos mamferos trs tipos de tecido muscular.
1) Tecido muscular liso - formado por aglomerados de clulas fusiformes que no
possuem estrias trnsversais. O processo de contrao lento e no est sujeito ao controle
voluntrio.
2) Tecido estriado esqueltico - formado por feixes de clulas cilndricas muito
longas e multinucleadas, que apresentam estriaes transversais. Tm contrao rpida,
vigorosa e sujeitas ao controle voluntrio.
3) Tecido estriado cardaco - tambm apresenta estrias transversais, formado por
clulas alongadas e ramificadas, que se unem umas as outras por intermdio dos discos
intercalares. Apresentam contraes involuntrias.
Tecido Muscular Esqueltico
As clulas musculares so to diferenciadas e tm caractersticas to peculiares que
seus componentes recebem nomes especiais. Sarcolema = membrana plasmtica;
Sarcoplasma = citoplasma; Retculo sarcoplasmtico = retculo endoplasmtico; e
Sarcossomas = mitocndrias.
As variaes no dimetro das fibras musculares esquelticas dependem de vrios
fatores como o msculo considerado, a idade, o sexo, estado de nutrio e treinamento
fsico. O aumento da musculatura em funo de exerccio fsico no devido a
multiplicao das clulas (diviso mittica), que somente ocorre no tecido muscular liso.
Este aumento deve-se formao de novas miofibrilas e um aumento pronunciado no
dimetro das fibras musculares.
No msculo, as clulas musculares formam as fibras musculares que se agrupam
formando feixes musculares, estes por sua vez agrupam-se para formar o msculo. Todas
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estas estruturas so envolvidas por uma membrana externa de tecido conjuntivo. O epimsio
envolve o msculo, o perimsio envolve o feixe e o endomsio envolve a fibra muscular.
Este tecido mantm as fibras musculares unidas, permitindo que a fora de contrao
gerada por cada fibra individualmente atue sobre o msculo inteiro. Este papel do tecido
conjunt ivo tem grande significado funcional porque na maioria das vezes as fibras no se
estendem de uma extremidade do msculo at a outra. ainda por intermdio do tecido
conjuntivo que a fora de contrao do msculo se transmite a outras estruturas como
tendes, ligamentos e ossos.
O citoplasma da fibra muscular apresenta-se preenchido principalmente por fibrilas
paralelas, as miofibrilas. Estas so cilndricas e correm longitudinalmente clula,
preenchendo quase completamente o seu interior. Ao microscpio ptico aparecem
estriaes transversais, pela alternncia de faixas claras e escuras. A faixa escura
denominada de Banda A, enquanto que a faixa clara denominada Banda I. No centro de
cada banda I aparece uma linha transversal escura denominada Linha Z, enquanto que no
centro da Banda A, existe uma regio de colorao um pouco mais clara denominada
Banda H.
As miofibrilas do msculo estriado contm quatro protenas principais: miosina,
actina, tropomiosina e troponina. Os filamentos grossos so formados de miosina e se
encontram dispostos na Banda A. Os filamentos de actina so finos e esto associados com
a tropomiosina e a troponina. Esto dispostos na Banda I e entre os filamentos de miosina
nas extremidades da Banda A.
A actina apresenta-se na forma de filamentos em dupla hlice. A tropomiosina
uma molcula longa e fina, que se localiza ao longo do sulco existente entre dois filamentos
de actina. A troponina um complexo de trs subunidades; TnT, que se liga fortemente
tropomiosina; TnC, que tem grande afinidade pelos ons de clcio; e TnI, que cobre o stio
ativo da actina onde ocorre a interao entre a actina e a miosina. Cada molcula de
tropomiosina tem um local especfico onde se prende um complexo de troponina.
A miosina uma molcula grande, tem forma de basto. Numa de suas
extremidades, a miosina apresenta um salincia globular ou cabea, que possui locais
especficos para combinao com ATP. nesta parte da molcula que tem lugar todas as
reaes relacionadas com a quebra (hidrlise) do ATP. Nesta parte tambm se encontra o
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Tecido Nervoso
O tecido nervoso acha-se distribudo pelo organismo, interligando-se e formando
uma rede de comunicaes, que constitui o sistema nervoso. Anatomicamente, este sistema
dividido em:
1) Sistema Nervoso Central (SNC) - formado pelo encfalo e medula espinhal;
2) Sistema Nervoso Perifrico (SNP) - formado pelos nervos e por pequenos
agregados de clulas nervosas denominadas gnglios nervosos. Os nervos so constitudos
principalmente por prolongamentos de neurnios (clulas nervosas) situados no SNC ou
nos gnglios nervosos.
O tecido nervoso apresenta dois componentes principais:
1) os neurnios, clulas geralmente com longos prolongamentos; e
2) vrios tipos de clulas da glia ou neuroglia, que sustentam os neurnios e
participam de outras funes importantes.
No SNC h uma segregao entre os corpos celulares dos neurnios e os seus
prolongamentos. Isto faz com que sejam conhecidas no encfalo e na medula espinhal duas
pores distintas, denominadas substncia branca e substncia cinzenta. A substncia
cinzenta
assim
chamada
porque
mostra
essa
colorao
quando
observada
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recebe muitos estmulos, tanto excitatrios como inibitrios, de cujo resultado pode
originar-se um potencial de ao cuja propagao o impulso nervoso.
A poro final do axnio, em geral, muito ramificada e recebe o nome de
telodendro.
A transmisso do impulso nervoso de um neurnio para outro depende de estruturas
altamente especializadas, as sinapses. Embora a maioria das sinapses se estabelea entre o
axnio e o dendrito (axodendrticas) ou entre o axnio e o corpo celular (axossomtica), h
tambm sinapses entre dendritos (dendrodentrticas) e entre axnios (axoaxnicas). H uma
tendncia de se considerar tambm como uma sinapse a terminao nervosa em clulas
efetoras, tais como clulas glandulares e musculares.
Nas sinapses, as membranas das duas clulas nervosas ficam separadas por um
espao de 20-30 nm, denominada fenda sinptica. Essas duas membranas esto firmemente
aderidas entre si, e em alguns casos verificou-se a existncia de filamentos formando pontes
entre as duas membranas.
Sob a designao geral de neuroglia ou glia, incluem-se vrios tipos celulares
presentes no sistema nervoso central ao lado dos neurnios.
Nos preparados corados pela HE as clulas da glia no se destacam bem, aparecendo
apenas os seus ncleos, espalhados entre os ncleos de dimenses maiores dos neurnios.
Calcula-se que haja no sistema nervoso central 10 clulas da glia para cada neurnio,
mas em virtude do menor tamanho das clulas da neuroglia, elas ocupam aproximadamente
a metade do volume do tecido. Distingue-se na neuroglia os seguintes tipos celulares:
astrcitos, oligodendrcitos, microglia e clulas ependimrias.
As clulas da naurologia no geram impulsos nervosos nem formam sinapses.
Todavia, participam do controle da composio qumica do meio onde esto localizados os
neurnios. As clulas gliais possuem na superfcie receptores para molculas
neurotransmissoras, e possuem certas protenas que existem tambm nos neurnios.
Ao contrrio dos neurnios, as clulas da neuroglia so capazes de multiplicao,
mesmo no adulto.
Os astrcitos so as maiores clulas da neurologia, tem muitos prolongamentos e
ncleos esfricos e centrais. Os oligodendrcitos so menores do que os astrcitos e
apresentam poucos prolongamentos. So encontrados tanto na substncia branca como na
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no excedam a 3mm de
espessura. Esse fatiamento pode ser efetuado imediatamente aps a retirada, ou aps um
pequeno perodo de fixao.
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FIXAO
A base para uma boa preparao histolgica a fixao completa e adequada do
tecido a estudar, para tanto devemos obedecer a alguns requisitos.
Intervalo mnimo entre coleta e a fixao
Volume do fixador dever ser no mnimo 10vezes maior que o volume da pea.
Evitar que pequenas peas ( principalmente as de punes por agulha) fiquem coladas
no recipiente.
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Agente Fixador
Poder de Penetrao
Com Coagulao:
lcool
Cloreto de Mercrio
cido Pcrico
Moderado
Moderado
Moderado
Sem Coagulao :
Formol
Moderado
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Tetrxido de smio
Lento
cido Actico
Rpido
importante observar o PH nos fixadores, pois estes podem ocasionar uma retrao
maior no tecido, como tambm alteraes na colorao.
O valor timo do PH nos fixadores de 6,8 a 7,0.
Freqentemente os fixadores so constitudos de um principal, associado
eventualmente a outros. Quase todos os bons fixadores so ,entretanto constitudos de duas
ou mais substncias fixadoras, corrigindo uma , os defeitos da outra.
No entanto , de modo geral , por melhor que seja o fixador sempre ocorre contrao e
diminuio de volume ( entre 20 a 40% ) dependendo do fixador empregado.
PRINCIPAIS FIXADORES
Acetona:
Usada para fixao citolgica, desidrata muito o tecido e o tempo normal de fixao
de 10 a 30 minutos.
cido Actico:
um dos mais usados, entretanto, sempre em combinao com outras substncias
fixadoras. O cido actico tem propriedade de corrigir a ao hidratante de outros
fixadores, evitando- se desse modo artefatos de fixao .
Ele no fixa a proteina citoplasmtica mas , coagula o ncleo da protena, tendo
pouco efeito fixador; no causa endurecimento, penetra bem e dstri o condrioma.
Geralmente empregado em solu aquosa de 0,3 a 5 %.
Tempo de fixao; curto, de 10 a 15 minutos.
cido Pcrico:
Este fixador empregado, associado ao formol ou ao cido actico. Tem ao
fixadora rpida, porm de pequena pene trao, possuindo leve descalsificante e provocando
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edema das fibras colgenas. Aps a fixao, os tecidos devem ser bem lavados em gua de
torneira antes da desidratao pelos lcoois , at que todo fixador seja removido.
Para o preparo da soluo aquosa saturada, a que se usa geralmente, coloca-se
de 1 a 1,5g em 100ml de gua destilada em temperatura ambiente, deixando- se durante 12
a 24 horas ou , se prepara a soluo alcolica com lcool a 80%.
Este fixador fixa as proteinas formando picratos de protena
e a mesma
lcool Etilico :
atualmente est sendo pouco empregado devido a numerosas contra indicaes do seu uso.
A fixao rpida( 1 hora) desde que os fragmentos de tecidos tenham a
espessura ,mxima de fixao , pois, ocorrer contrao do tecido e seu endurecimento ser
muito intenso. O tecido depois de fixado , dever passar do lcool absoluto para 95% e
depois a 80%. As alteraes celulares observadas com a fixao pelo lcool so:
- Agregados de clulas tendem a se contrair, levando formao de grupos
celulares.
- O citoplasma se contrai fortemente.
- Os ncleos so distorcidos morfologicamente.
- O citoplasma se retrai e se acumula na membrana do lado oposto ao qual o
fixador penetrou na clula.
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MATERIAL DURO
Para material mais duro se utiliza o formol Glicerinado, onde se obtm
uma boa fixao e uma melhora na hora do corte.
Frmula: Preparar um litro de formol a 10%.
Retirar desse 50ml e acrescentar 5ml de glicerina medicinal.
Ex. Muito bom para tero.
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Carnnoy:
lcool Absoluto.........................60,0ml
Clorofrmio................................30,0ml
cido Actico Glacial................10,0ml
um dos fixadores mais rpidos e penetrantes. O tempo de fixao de
em mdia 3 horas, e usado geralmente para diagnsticos urgentes.
Tem sido muito empregado em citologia nos esfregaos hemorrgicos
para a retirada de sangue ,pois destri as hemceas. No necessrio lavagem em gua
aps a fixao.
Bouin
cido picrico soluo saturada......................375ml
Formalina 37-40%..........................................100ml
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FAA
lcool 70.......................................................... 85ml
Formalina 37-40 %.............................................10ml
cidoActico glacial...........................................5ml
Fixador muito usado na Botnica
Artefatos de fixao: quando usarmos cido actico, devemos observar este processo,
pois o tempo alm do estabelecido endurece os tecidos e prejudica os procedimentos
futuros. Os fixadores a base de cloreto de mercrio precipitam nos tecidos e s vezes tornase invivel para os procedimentos de imunohistoqumica. Em algumas situaes os
fixadores so especficos, por exemplo o Bouin utilizado para estudo do glicognio.
DESIDRATAO.
o processo de retirada de gua do interior da clula. A gua alm de prejudicial, no
se mistura parafina. Para se conseguir a infiltrao suficiente da parafina na incluso,
necessrio que o tecido esteja completamente desidratado.
O lcool etlico o agente mais usual empregado neste processo, sendo utilizado em
uma srie crescente (70%, 80%, 90% e 100%).
O volume de lcool dever ser de 10 a 20 vezes maior do volume da pea.
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DIAFANIZAO OU CLARIFICAO.
Consiste na infiltrao dos tecidos por um solvente da parafina, que seja ao mesmo
tempo desalcolizante. A parafina no se mistura com gua nem com lcool. Ambos devem
ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido.
O solvente mais usado o xilol, e destina-se completa retirada de gua, lcool e
tambm da gordura por ventura existente no material.
A denominao clarificao, refere-se ao processo de desalcoolizao e infiltrao do
solvente da parafina devida ao ndice de refrao dos lquidos empregados para este fim.
O tecido, ou melhor as peas assim tratadas tornam-se semi- translcidas, ou quase
transparentes.
Entre os reagentes mais usados na fase de diafanizao, podemos citar os seguintes:
XILOL
TOLUOL
CLOROFRMICO
LEO DE CEDRO
BENZOL OU BENZENO
TER DE PETROLEO
e outros.
IMPREGNAO
O processo de impregnao dos tecidos se faz por meio da parafina. A parafina um
dos vrios produtos da destilao (refinao) do petrleo, sendo uma mistura de carbonetos
saturados.
A finalidade da impregnao eliminar completamente o xilol contido no material e
a total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e a gordura, antes existentes
no tecidos. Este processo serve tambm para preparar o material par cortes, removendo o
clarificante, endurecendo-o e dando- lhe a consistncia adequada para que possa ser cortado.
Tambm podemos citar como agentes de infiltrao ou impregnao a celoidina, a
goma arbica, parafina plstica, polietino glicol, parafina esterificada e carbovax..
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INCLUSO.
A parafina o meio de incluso mais usado. Este mtodo o de menor custo e o que
oferece algumas vantagens, entre outras, a possibilidade de conservar os blocos
indefinidamente. A incluso feita em caixas apropriadas, em uma temperatura de
60C.Unsando-se parafina em temperatura muito alta prejudica-se o material.
importante, transferir o material diretamente do ltimo banho de parafina para o
molde de incluso, o mais rpido possvel para evitar que se forme vcuo em volta do
material e que este venha se soltar durante o processo de corte.
MICROTOMIA.
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COLORAO
Devemos ter sempre em considerao, que bons resultados de uma colorao devemse a vrios fatores, dentre eles temos que reconhecer a valia de um bom aliado, nosso eterno
companheiro O Corante. Mas alm disso devemos observar o seguinte.
O mecanismo das coloraes est relacionado a dois fatores igualmente importantes:
- Os corantes
- Elementos a corar.
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Para haver colorao necessrio que o material corante se fixe sobre o tecido, para
isso devemos ter por um lado um material bem processado e na espessura ideal, e por outro
o corante dever estar dissolvido nas propores indicadas e no solvente ideal. Os corantes
se classificam tambm em cidos e bsicos. Ao corantes bsicos (com elemento ativo
bsico) coram os elementos cidos do tecido, como o ncleo que denominamos basfilos.
Os corantes cidos atuam de maneira inversa, coram os elementos bsicos por meio
dos seus cidos, e esses elementos so denominados de acidfilos.
Exemplos de corantes bsicos: Verde de Metila, Violeta Cresil, Tionina, Azul de
Toluidina, Hematoxilina etc.
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particular que as diferenciam umas das outras. Algumas so vantajosas para certos
elementos e desvantajosas para outros. Num mesmo corte, tambm determinadas
coloraes exigem um fixador em particular para por em evidncia algumas estruturas. Por
isso, um estudo aprofundado na microtcnica requer diferentes coloraes e mtodos.
Como foi mencionado,anteriormente, no s o corante o responsvel por algum fracasso,
devemos observar e ter em conta o seguinte:
Qualidade do corante: Sempre que comearmos uma nova colorao temos que
investigar a procedncia do corante, bem como a marca. Existem muitos produtos, dentre
os quais achamos os de boa e os de m qualidade. O grau de perfeita purificao de
relevante importncia nos bons resultados da tcnica. Um dos maiores problemas a m
qualidade dos corantes. Poucas marcas renem as perfeitas condies de purificao e
estudos demonstram que muitos corantes tinham misturas como sais ou dextrina.
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- Nome
- Composio qumica
- Massa molar
- Descrio (lquido ou p)
- Utilidades (Ex: histotecnologia, citologia, farmacologia)
- Certificado de pureza
- Verificar o aspecto e uniformidade e, principalmente, a umidade.
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Basocromos: so formados por uma base corante e um cido indiferente, por exemplo
Pardo de Bismark, Tionina, Azul de Toluidina.
Anfocromos ou Neutros: resultam da unio de uma base corante e um cido corante
A metacromasia deve-se ao fato de que certos elementos captam as molculas livres
da base corante, formadas por hidrlise nas solues aquosas.
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em ebulio adiciona-se xido de mercrio. Esfrie o recipiente com gua fria abundante.
Filtrar antes do uso e adicionar algumas gotas de cido actico glacial.
Eosina
Soluo Estoque.
- 10g ..........Eosina Y
-25ml ........gua Destilada
-475ml ......lcool Etilico
Eosina Soluo de Trabalho
-50ml .........Eosina soluo estoque
-150ml .......lcool 95%
-4ml ...........cido Actico Glacial
-200ml .......gua Destilada.
Se quando passou pela Hematoxilina e ficou muito corada a lmina usamos o lcool
cido para descorar um pouco. ( Colorao regressiva)
-lcool cido
-0,5ml ..........cido Clordrico concentrado
-99,5ml ........lcool 70%
Lavar rpidamente e observar no lcool cido e aps gua corrente.
Depois levar at a gua de Amnia.
-gua de Amnia.
-1ml .............Hidrxido de Amnio 28
-100ml ........gua Destilada
Logo aps lavar um pouco em gua corrente e seguir a colorao normal
Tricrmico de Goldner.
Goldner A
-0,2g
Ponceu de Xilideno
-0,1g.............Fucsina cida
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-0,1g.............Orange G
-300ml..........gua destilada Actica a 0,2%
Goldner B
0,2mg...........Light- green SF , ou Verde Luz.
100ml...........gua destilada ctica a 0,2 %
Soluo gua Destilada Actica a 0,2 %
Usada para fazer rpidas lavadas entre os corantes Goldner A e B e o cido
Fosfotungstico.
COLORAES ESPECIAIS.
Picrosirus. ( Resina)
-100ml...................Sol. Saturada de c.Pcrico
-0,1g........................Srus Red F3Ba
-Corar por 45 min, em estufa a 60 na soluo Picrosirus.
-Lavar em gua destilada
-Hematoxilina por 2 minutos, secar e montar
-Resultados; Vermelho- Fibras colgenas:
Amarelo- Fibras elsticas, musculares,epitlio,hemceas
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Tcnica.
Desparafinar ,hidratar,corar na Hematoxilina e lavar em gua corrente.
Corar na Sol. A por 5min.
Escorrer e passar diretamente para a Sol. B de 10 a 30 min.
Lavar em 3 banhos de lcool a 95%
Clarificar e montar.
Resultado; ncleo roxo, fibras colgenas em azul, citoplasma rseo e hemaceas em
amarelo.
0,6g
Verde Luz, SF
0,3g
c. Fosfotungstico
0,8g
gua Destilada
100ml
0,5ml
gua Destilada
100ml
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OBS.:
Depois de pronta a lmina com a lamnula, se esta estiver com resduos de entel ou
blsamo passa-se um bom bril seco que esta fica em perfeitas condies.
gua sanitria: se ficar resduos de colorao na lmina aps colocarmos a lamnula,
colocamos em um rpido mergulho neste produto que retirar a colorao excedente.
DESCALCIFICAO
Para que se possa examinar o tecido sseo ou tecido com reas de descalcificao,
deve-se antes de processar, fixar, incluir, e cortar o material.
A descalcificao do tecido sseo baseia-se na propriedade dos minerais contidos nos
ossos tornarem-se solveis em cidos diludos. Qualquer cido capaz de fornecer sais de
clcio solveis em gua, poder ser utilizado no processo.
Os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaos
(cerca de 4 mm) com serra adequada, antes da fixao, pois quanto menor o tamanho mais
rpido ser a descalcificao. S depois de completada a fixao que se coloca a
soluo descalcificadora,
Como agentes descalcificadores so empregados geralmente os cidos: ntrico,
frmico, tricloractico, clordrico, pcrico, sulfossalicclico, EDTA, etc. O cido ntrico
possui uma ao duas vezes mais rpida do que o cido frmico, mas este ltimo preserva
melhor o tecido para a colorao posterior. A Dulcia Tnica um agente descalcificador
muito usado na patologia, a qual encontrada no mercado como um lquido para
permanente de cabelo (da marca Loreal) que no laboratrio serve como agente
descalcificador de unha e ajuda no amolecimento de blocos duros.
O Bouin, EDTA e cido ntrico 1% so geralmente usados na descalcificao de
medula ssea. Quando usado o cido ntrico deixa-se o material neste por 12 horas, em
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Conforme alguns autores no recomendado lavar a pea que acabou de ser descalcificada,
j outros indicam que deve se colocar no sulfato de sdio.
Eventualmente uma rea de calcificao poder ser encontrada e, tecido includos no
momento do corte pelo micrtomo. Neste caso melhor mergulhar o bloco no
descalcificador por aproximadamente 1 hora, tempo suficiente para descalcificar o tecido
necessrio para o exame. Esta medida menos prejudicial ao tecido do que inverter o
processo. Mas vale salientar que o processo somente eficaz para a preservao do tecido
sseo.
No final, quando j se tem a lmina pronta, se for detectado um borro na basofilia, motivo
fixao, para que se recupere esta lmina (colorao), corta-se novamente e faz-se a fase
inicial at a gua destilada. Depois trata-se essa lmina com cido peridico a 0,5% por 20
minutos e segue-se normalmente a colorao.
Quando nota-se que a lmina ficou opaca bom utilizar soluo de iodo alcolico.
O tecido sseo um material comum no laboratrio; seu preparo exige muito cuidado. A
princ pio, ele fixado e depois descalcificado: utiliza-se vrios descalcificadores como
cido tricloractico, cido ntrico e outros. Devemos tomar muito cuidado, o excesso de
descalcificao prolongada, destri a basofilia dos tecidos, consequentemente a colorao
ruime dificulta a interpretao do diagnstico. Quando isto ocorrer, devemos fazer um
tratamento com cido peridico a 0,5% por uma hora, depois corar pelo mtodo desejado.
Este mtodo melhora a colorao.
A descalcificao da medula ssea pode ser realizada com cido ntrico a 1% em overnight.
Este processo no prejudica as estruturas celulares. Aps a descalcificao da medula e de
outros tecidos sseos, devemos neutraliz- los utilizando carbonato de clcio a 4% por 15
minutos, depois lav- los bem por 30 minutos em gua corrente. A lavagem no deve ser em
excesso. A diafanizao dos ossos tamb m deve ser menor que outros tecidos, a
permanncia por muito tempo no xilol provoca endurecimento excessivo.
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DESCALCIFICAO DE OSSO
Procedimento:
-Deixar de molho na gua ou colocar o material que se queira estudar enterrado (por alguns
dias);
-Deixar descalcificar por 72 horas (dependendo de descalcificador);
-Lavar em gua corrente pelo menos 12 horas (facultativo);
-Colocar no fixador ( escolha) e dar continuidade no processo.
DESCALCIFICAO DE DENTE
Deixar no cido frmico 50% e citrato de sdio 20% por aproximadamente 90 dias.
DESCALCIFICADORES
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Soluo A:
gua destilada.............................................250ml
Citrato de Sdio...............................................50g
Soluo B:
gua destilada..............................................125ml
cido frmico puro......................................125ml
No instante do uso juntar partes iguais da soluo A e B.
Este descalcificador preserva bem a morfologia de tecido embora seja muito lento,
recomendados para fragmentos de tamanho pequeno.
um dos reativos mais usados para a descalcificao. Mesmo em solues muito diludas,
sua ao rpida mas tem o inconveniente de causar um entumecimento aprecivel dos
tecidos. Isto, pode ser resolvido adicionando a ele tampes, ou solues tampes, como por
ex.: sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou ainda, us- lo diluindo em lcool combinado com
cido crmico.
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EDTA, Tetrasdio...............................................................7g
Tartarato de Sdio e Potssio............................................80g
Tartarato de Sdio............................................................1,4g
cido Clordrico..........................................................1200ml
gua destilada..............................................................9000ml
A escolha das marcad das drogas deste descalcificador tem que ser criteriosa na
qualificao.
Todo tecido tem que estar fixado e recortado no tamanho correto, preferencialmente fixado
durante a noite.
Submeter o tecido ao descalcificador em no mximo 8 horas, sendo conforme tamanho e
concentrao de clcio no framento o tempo pode variar de 2,4,6,8 horas ou ainda ser
necessrio mais tempo, e neste caso nunca deixe o fragmento no descalcificador durante a
noite, repita a operao durante o dia.
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Histrico
1590: Inveno dos microscpios pelos holandeses Francis e Zacarias Janssen, fabricantes
de culos. Seu microscpio aumentava a imagem de 10 a 30 vezes e foi usado pela primeira
vez para observar pulgas e insetos.
1838 - 1839: Schwann emitiram a Teoria Celular: Todos os seres vivos (animais e
vegetais) so formados por clulas.
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Leis celulares
Classificao de Bizzozero
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Clulas estveis: clulas dotadas de ciclo vital mdico ou longo, podendo durar
meses ou anos. Produzidas durante o perodo de crescimento do organismo essas clulas s
voltam a ser formadas em condies excepcionais, como na regenerao de tecidos (uma
fratura ssea, por exemplo). Dentre as clulas estveis, podemos citar: ostecitos (sseas
adultas), hepatcitos (clulas do fgado), clulas pancreticas, muscular lisa, etc.
Clulas permanentes: clulas de ciclo vital muito longo, coincidindo, geralmente,
com o tempo de vida do indivduo. So produzidas apenas durante o perodo embrionrio.
Na eventual morte dessas clulas, no h reposio, uma vez que o indivduo nasce com o
nmero completo e necessrio de suas clulas permanentes. Essas clulas simplesmente
aumentam de volume (exceo lei de Driesch), acompanhando o crescimento do
indivduo. Como permanentes, podemos citar as clulas nervosas (neurnios) e as clulas
musculares estriadas.
Observao de clulas
Principais corantes
DNA Feulgem
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Vrus
Clulas procariontes
Clulas Eucariontes
Bactrias
So unicelulares e hetertrofos. Alguns so importantes no ciclo do nitrognio e
outros so agentes patognicos.
Estruturas celulares:
Membrana Plasmtica - visvel somente ao microscpio eletrnico. Em cortes
extremamente finos, apresenta uma estrutura trplice, sendo constituda por duas faixas
densas, cada qual com aproximadamente 20 Angstrons de espessura, e uma faixa central
clara com 35 Angstrons de espessura. Elstica e lipoprotica, atua selecionando as
substncias que entram ou saem da clula (permeabilidade seletiva), de acordo com suas
necessidades. A membrana celular tambm reveste estruturas celulares: carioteca,
lisossomos, complexo de Golgi, cloroplasto, mitocndria, retculo endoplasm tico; que so
formadas por membranas idnticas membrana plasmtica.
Parede celular - Ocorre na clula vegetal e um reforo externo, formado
geralmente por celulose. Nos fungos a parede celular formada de quitina.
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Na base do clio ou flagelo, encontra-se a organela que lhes d origem, denominada corpo
basal ou cinetossomo (antigo centrolo).
Imunohistoqumica bsica
necessrio um conhecimento bsico de alguns princpios de imunologia (antgeno,
anticorpo) para compreenso mais adequada dos mtodos de imunoperoxidase.
Em resumo imunohistoqumica um conjunto de mtodos de deteco de antgenos
em cortes histolgicos altamente dependente do processo de fixao.
-Estudo poderoso para deteco de estruturas bioqumicas e sequncias ao nvel celular.
-Localizao de antgenos em clulas utilizando anticorpos especficos.
-O produto da reao visvel ao microscpio.
Importncia da imunohistoqumica:
Na patologia a imunohistoqumica assume papel de fundamental importncia.
As neoplasias so neoformaes teciduais (benignas ou malignas) que apesar de se
originarem em tecidos normais, muitas vezes perdem sua capacidade de difereno celular
(no caso das malgnas) tornando impossvel um diagnstico morfolgico (baseado nas
caractersticas de forma de leso).
Da a necessidade da imunohistoqumica para elucidar a origem tecidual e portanto
o diagnstico da leso.
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-Antgeno
uma substncia estranha no organismo que estimula a formao de um anticorpo
especfico e que reagir com este anicorpo especfico.
O termo antgeno se d a qualquer molcula que possa ser reconhecida pelos
elementos do sistema imune adaptativo, quer dizer, clulas T, clulas B ou ambas.
Os antgenos so capazes de reagir especificamente com os anticorpos induzidos,
possuem reas restritas em sua molcula que determinam a especificidade, denominadas
determinantes antignicos ou eptopos,
Isto quer dizer que em uma mesma molcula de antgeno podem existir vrios
determinantes antignicos e que, quando inoculada em um animal, provocar a produo de
vrios anticorpos com especificidade para cada um dos eptopos.
Para que uma molcula tenha a capacidade antignica esta deve cumprir alguns
requisitos:
Tamanho da molcula. Em geral, a molcula deve ser maior que 10 kD. Para que uma
molcula menor se torne antignica, deve ser inoculada com molculas adjuvantes ou
formar complexos com protena de seu hospedeiro.
Presena de grupos qumicos ativos. Mesmo tendo um peso molecular adequado
capacidade antignica das molculas, dependem da presena de determinados radicais
qumicos cidos ou bsicos e grupos aromticos como anis benznicos.
Estrutura conformacional do determinante antignico. Nos antgenos proticos to
importante o tipo de aminocido que formam a macromolcula como a sua disposio nela.
As cadeias de polipeptdeos lineares so menos antignicas que as cadeias ramificadas,
levando-se em conta o mesmo peso molecular.
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Mtodos
Direto: Emprega um anticorpo primrio j marcado com uma enzima.
Indireto: J foi conduzido um anticorpo secundrio.
ABC: Sistema indireto onde aumenta o sinal da reao.
Strepto Avidina e Biotina marcados ( aplicao de anticorpo primrio e secundrio marcado
com biotina).
Polmero marcado
Vantagens da Imuno
Morfologia preservada;
Identifica uma nica protena;
Auxilia no diagnstico;
Pode ser considerada como outra colorao especial no arsenal diagnstico.
Limitaes:
Especificaes do anticorpo
Geralmente no um mtodo quantitativo.
Mtodo complexo, caro, trabalhoso.
Imaginao do histotcnico o limite.
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Colorao por tingimento uma reao qumica entre cidos (eosina) e bsicos (azul de
toluidina)
Imunocitoqumica (protenas)
Torna visvel protenas de interesse em preparao de tecido ou clulas mantendo seu
contexto anatmico.
Uso de um anticorpo (protena) para detectar um antgeno (protena) determinada no tecido.
Deve ser estabelecido uma forma de ligao para formar um complexo estvel entre
a protena e o anticorpo.
Vantagens:
-Quantitativo
-Mtodo mais avanado para entender biologia celular no contexto anatmico
-Pode detectar molculas de RNA para clula.
Limitaes:
-Mtodo caro, trabalhoso.
-Requer conhecimento de biologia.
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Fixao:
-Preservar a morfologia tal qual o estado natural
-Preservar antgenos e seus stios antignicos para o necessrio reconhecimento.
A fixao um dos aspectos mais crticos da colorao de imunohistoqumica,
portanto, as seguintes condies devem ser observadas:
As amostras do tecido no podem ficar completamente secas, e devem ser colocadas no
fixador o mais rpido possvel. Esfregaos celulares devem ser fixados o mais rapidamente
possvel a fim de garantir a preservao do antgeno.
Pequenos blocos de tecido, de no mximo 2 cm de comprimento por 4 mm de espessura
devem ser colocados em um mnimo de 200 mL de fixador. Pedaos maiores de tecido
impediro a penetrao completa do fixador, o que resultar em uma colorao
inespecfica.
Aps a fixao, as amostras de tecido devem ser rigorosamente lavadas para eliminar
excessos de fixador que possam causar artefatos de colorao.
O fixador mais prtico e provavelmente o melhor para diversas finalidades a formalina
tamponada a 10 %, devido a sua caracterstica de ligaes cruzadas.
Temperatura
-Alta: aumenta a velocidade de fixao e tambm de decomposio
-Processamento
Aps a fixao, as amostras de tecido devem ser desidratadas, limpas e inclusas de
acordo os procedimentos de rotina de processamento. Para se obter os melhores resultados
em imunohistoqumica, as amostras devem ser inclusas em parafina pura pois esta pode ser
completamente e facilmente removida do tecido no momento da colorao. O plstico
contido em alguns meios de incluso frequentemente de difcil remoo, e pode causar
colorao inespecfica alm da inibio da colorao especfica. Visto que muitos
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Recuperao antignica
Processamento e incluso
Desparafinao
Anticorpos
uma protena srica que formada em resposta exposio de um antgeno e
reage especificamente com esse antgeno formando imunocomplexos quer no prprio
organismo ou em condies laboratoriais.
Anticorpos pertencem a um grupo de protenas conhecidas como imunoglobulinas
(Ig). esto divididas em cinco classes: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Cada imunoglobulina
composta por duas cadeias pesadas idnticas (H) e duas cadeias leves (L) idnt icas (fig. 1).
As cadeias pesadas diferem em antigenicidade e propriedades estruturais determinando,
portanto, classe e subclasse das imunoglobulinas. As cadeias levesso do tipo Kappa ou
Lambda. A maioria dos anticorpos empregados em imunohistoqumica pertence a classe
IgG de imunoglobulina e apenas alguns so da classe IgM.
Os anticorpos so obtidos atravs da imunizao de animais com antgenos
especficos e podem ser classificados em poli e monoclonais.
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Imunoglobulina
Classes de Imunoglobulina
Limitaes
Ttulos altos
Impuresas
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Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais so produzidos,IN VITRO, por clones de clulas
plasmticas importalizadas. Ao contrrio dos policlonais reagem apenas com uma molcula
(epitopo)presente no antgeno. podem ser produzidos em larga escala pois a clula
imortalizada normalmenteexpandida em meio de cultura.
Limitaes
Coloraes menos intensas que com os policlonais
Alguns podem apresentar baixa afinidade por antgenos que sofreram fixao. ( s em
reatividade se for por congelao, se fixas ele no reconhece.).
Os eptopos alvos devem sobreviver aps a fixao do tecido. Em alguns casos o
antgeno pode ser identificado pelo uso de policlonais porm se o eptopo em questo no
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Digesto enzimtica.
Vantagens:
Rpida, pode ser utilizada em automao
Limitaes:
Alguns anticorpos no apresentam bons resultados.
Verifique o que diz a bula que acompanha o produto.
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Panela a vapor
Vantagens:
Protocolos padronizados.
Processamento de muitas lminas simultaneamente.
Temperatura constante
Limitaes:
Dificuldade para calibrao.(H um desgaste no termostato e h certa dificuldade em
manter a temperatura exata pelo tempo indicado).
Banho Maria
Vantagens:
Limitaes:
Temperatura constante.
Resultados reprodutveis.
de equilbrio.
Colorao de fundo
O que
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Imunoglobubinas Endgenas.
Pode ser reconhecida pela colorao inespefica de vasos e clulas plasmticas.
Desaparece quando o anticorpo secundrio
Recuperao antignica pode aumentar a colorao de fundo.
Coloraes tricromicas
pH (1,5 - 3,0) aumenta a afinidade dos corantes cidos pelo colgeno.
importante observar a gua destilada (melhor a gua deionizada).
Na colorao quando for fixado na formalena, chegando na gua destilada deixar 1 hora
no cido pcrico soluo saturado.
Todo o corante levado na estufa que se desprega no se usa mais.
Na hematoxilina (bsica) sempre deixar um tempo maior em relao aos corantes cidos.
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