fmvz-unesp

FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU

Curso de Ps-Graduao em Zootecnia Nutrio e Produo Animal

ELETROFORESE

Joerley Moreira & Rodrigo Garfallo Garcia

Zootecnistas





  "!$# %&!')(*+!-,/.)!0#%1!-2!435"46
798;:<>=?0:@A8;B:DCAEGF HI"A$H8;JK?$:LJ
MN"OQP"RTSUPWVXNYUS[Z]\N_^`NWaTSUb"ZcN_d`NWeYfZg Zfhi Pj`hWRUZi&Y[\>kfaTS[RQi Pg
lQm"nQop[qmsrWtuQoWvQw&xyo)p{zUm|Q}Qm~"o"m"q"mw tmQQTzUm|&
 > X 0c y[QfQQ
>s> 9 > 0$ 
robertoroca@fca.unesp.br
ELETROFORESE
1- INTRODUO

A eletroforese pode ser definida como o movimento de uma molcula

carregada (ion) em um campo eltrico. O termo eletroforese foi criado por Michaelis,
em 1909, para descrever a migrao de colides sob a influncia de um campo
eltrico. Eletroforese representa, portanto, a migrao de ons submetidos corrente
eltrica. Seu princpio simples: molculas com carga negativa migram para o polo
positivo (anodo), e molculas com carga positiva migram para o polo negativo
(catodo). Trs componentes bsicos so necessrios para se realizar uma
eletroforese: um campo eltrico, que obtido atravs de uma fonte de corrente
contnua, um suporte onde a molcula pode migrar e a prpria molcula carregada.

1.1- IONIZAO DAS MOLCULAS

A carga de uma molcula o resultado da ionizao de seus grupos

dissociveis. Essa ionizao depende do pH do meio e do pK do grupo dissocivel.
O grau de pH. O grau de dissociao pode ser estimado pela equao de Hederson-
Hasselbalch.
pH = pK + log {base conjugada}/{cido conjugado}
A migrao diferencial das molculas ou seja, a sua separao em um campo
eltrico, resulta das diferentes quantidades de ions carregados em um determinado
pH.

1.2- MIGRAES IONICAS

A eletroforese visa a separao de molculas em funo de suas cargas

eltricas, de seus pesos moleculares e de suas conformaes, em suportes porosos
e tampes apropriados, sob a influncia de um campo eltrico contnuo.
A carga preponderante de uma molcula protica funo dos seus
aminocidos. Em pH neutro, por exemplo, os componentes lisina (Lys), arginina
(Arg) e histidina (His) contribuem com carga positiva, enquanto os radicais de cido

1
glutmico (Glu) e cido asprtico (Asp) exercem carga negativa. Sendo substncias
anflitas, as protenas adquirem carga positiva ou negativa em funo do pH. ,
portanto, conveniente manter o pH do meio estvel durante a eletroforese, mediante
o uso de solues-tampo. O sistema-tampo consiste de duas partes: o tampo do
gel, usado no preparo do gel, e o tampo dos eletrodos (catodo/anodo), usado nos
respectivos tanques.
Em virtude do contato eltrico dos plos com as solues-tampo dos
tanques haver participao dos componentes dos respectivos tanques na
neutralizao da base formada no catodo e do cido formado no anoda. As
solues-tampo estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente eltrica,
mas geralmente elas so inertes no processo eletrofortico.
O tampo deve, portanto , Ter acentuada condutividade eltrica.
costume serem aplicados, para este propsito, eletrlitos de 0,05 e 0,5 M.
Em geral, solues-tampo mais concentradas fornecem melhor resoluo, embora
o tempo de separao seja maior.
Quando uma molcula com carga lquida Q colocada em um campo
eltrico S, sofre efeito de uma fora de campo F que depende do campo eltrico
e da carga da molcula.
F=S*Q
O campo eltrico S a relao entre voltagem (V) e a distncia entre os
eletrodos (d).
F = V/d*Q
A velocidade de migrao de uma molcula carregada pode ser alterada,
portanto, mudando a distncia entre os eletrodos bem como alterando a voltagem do
sistema.
Na ausncia de uma fora de resist6encia, a molcula acelera at encontrar o
eletrodo. Entretanto, isso no ocorre devido resistncia resultante da frico com o
suporte. A fora de frico F uma funo do tamanho e da forma da molcula,
viscosidade da soluo e velocidade de migrao como mostra a equao de
STOKES.
RNv
F = 6
F = Fora de frico
R = Raio da molcula
N = Viscosidade do meio

2
v = Velocidade de migrao
Quando a fora de resistncia excede a fora de propulso da molcula, no
ocorre a migrao. Quando a fora de propulso excede a fora de resistncia,
ocorre a migrao da molcula carregada. Os fatores que afetam a velocidade de
migrao de uma molcula carregada podem ser obtidos quando a fora de
propulso e a fora de resistncia so iguais:
RNv
F = V/d*Q e F = 6
Igualando as foras:
RNv
V/d*Q = 6
Isolando a velocidade:
RNv
V = V*Q/6
A velocidade de migrao de uma molcula carregada em um campo eltrico,
diretamente proporcional a carga da molcula e a viscosidade da soluo. Quando
o suporte utilizado for um gel de poliacrilamida, o efeito do tamanho dos poros
devem ser considerados.
Como cada molcula devem possuir carga e tamanho especficos, devem
migrar para uma nica posio em um campo eltrico, em um dado intervalo de
tempo. Em uma mistura de ions (protenas por exemplo), cada um deve posicionar
em um lugar nico dentro do campo eltrico.
Submetendo-se extratos proticos ao efeito da corrente eltrica, os seus
componentes ionizados migraro com velocidades individuais.
Com vistas a uma definida enzima, em virtude de sua posio no gel depois
da corrida, essa enzima pode ser revelada, permitindo, em consequncia,
identificaes qualitativas (por sua posio) e quantitativas (pela intensidade de sua
banda).

1.3- CORRENTE ELTRICA

A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem
(corrente) ou, ento, wattagem (potncia) constantes reguladas pela fonte eltrica.
medida que as molculas migram no campo eltrico, a resistncia geralmente
aumenta. Ento, a amperagem diminui sob voltagem constante, ou esta aumenta
sob amperagem constante. As variaes na intensidade da corrente ou na voltagem

3
podem ser detectadas na fonte de energia, anotando-se os respectivos valores no
incio e no final da corrida eletrofortica.
A escolha da voltagem, amperagem ou wattagem feita empiricamente.
A temperatura elevada tende a desnaturar molculas como as protenas, o
que acarreta, no raro, alguma perda de atividade enzimtica. Quanto mais alta a
voltagem ou a intensidade da corrente, maior ser tambm o calor emanado.
Visando manter a temperatura baixa durante a eletroforese, o gel resfriado com o
auxlio de uma coluna de gua fria em dispositivo apropriado inserido na cuba ou
efetuando-se a corrida em geladeira.

1.4- SUPORTES DA ELETROFORESE

A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, slica-gel,

membranas de acetato de celulose e gis de agarosa, de amido ou de
poliacrilamida.
O suporte deve ser qumica e fisicamente inerte de modo a no interferir na
mobilidade das molculas. O poder de resoluo importante na escolha do meio
suporte.
Para enzimas, gis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separao do
que outro suportes. Alm do efeito de carga, a separao d-se de acordo com o
tamanho e a estrutura das molculas (peneiramento molecular). Enquanto o
movimento de protenas de alto peso molecular e retardado pelo pequeno dimetro
dos poros do gel, protenas de baixo peso molecular migram livremente de acordo
com as respectivas cargas.
A escolha do meio de suporte depende de preferncias individuais i dos
objetivos, mas de modo geral, para protenas, gis de poliacrilamida tm sido
preferidos por seu maior poder de resoluo graas a ampla variao controlvel no
dimetro de seus poros. Alm disso, gis de poliacrilamida so muito translcidos, o
que possibilita quantificar a atividade enzimtica por densitmetria. A eletroforese
em gis de amido bem mais barata do que aquela em gis de poliacrilamida, mas
suas lminas no tem porosidade rigorosamente controlvel e a capacidade de
separao , em consequncia inferior.
Por outro lado, gis de amido so compatveis com diferentes sistemas-
tampo, o que permite otimizar a atividade e a distino entre enzimas em funo

4
dos componentes da soluo-tampo e de seu valor de pH. Aps a secagem, esses
gis tornam-se comparavelmente translcidos aos gis de poliacrilamida.

1.5- POROSIDADE DE GIS

A frico e, em consequncia, a velocidade de migrao de macromolculas

em um campo eltrico dependem da porosidade do gel.
Em gis de amido, as cadeias de carboidratos ramificam-se e entrelaam-se o
suficiente para formar uma textura semi-rgida, adquirindo assim, a estrutura de gel e
no de lquido viscoso. Ao contrrio, a porosidade de gis de poliacrilamida
definida pelo teor de seus componentes unitrios: acrilamida e N, N- metileno-Bis-
acrilamida (Bis). Uma soluo de acrilamida apenas, uma vez polimerizada, forma
um lquido altamente viscoso. A concentrao de Bis que determinar a
porosidade dos gis.
Gis de agarosa apresentam porosidade bem alm da obtida em gis de
poliacrilamida. A presena de agarosa, geralmente na concentrao de 0,5 %,
imprime ao gel rigidez mecnica bem maior que a de gis de poliacrilamida sem
agarosa. A agarosa permite a separao de cidos nuclicos, conforme seus pesos
moleculares, de ribossomos e de componentes de tamanhos at 200S.

1.6- MOBILIDADE DOS IONS

Extratos proticos so obtidos por macerao da amostra em solues

extratoras apropriadas. O extrato protico aplicado no gel e submetido
eletroforese, aps o que os gis, so removidos das molduras e revelados, visando
a deteco de protenas totais ou de enzimas especficas. Para protenas, os gis
so imersos numa soluo de azul-brilhante-de-comssie ou corantes a base de
prata.
Para enzimas especficas, os gis so incubados em solues, contendo os
componentes (substrato, coenzimas, soluo-tampo e sais) necessrios para
revelao das bandas de atividade enzimtica.

2.0- ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO

5
 Gis naturais so de natureza qumica bem variada: protenas como gelatina
e casena, e polissacardeos como amido, gar e pectina. A gua se difunde em gis
pela populao de macromolculas, rendendo porosidade uniforme do gel, o que
garante sua morfologia. Gis apresentam o fenmeno da desidratao, a qual
geralmente lenta. Trata-se de uma forma de intemperismo, a sinerese. O gel,
entretanto, mantm sua morfologia, apesar de se encolher. Por esse motivo, gis
apropriados para eletroforese no se conservam bem por muitos dias.
A porosidade do gel de amido varia conforme sua origem e seu preparo. O
amido em seu estado nativo, constitudo de -amilose e amilopectina. A -amilose
formada por longas cadeias (em torno de 300 unidades) no ramificadas de D-
glucose, cujas unidades so interligadas por ligaes - 1, 4. Em gua, a amilose
forma micelas hidratadas, cujas cadeias polissacardicas assumen a forma
helicoidal. J a amilopectina, embora apresente esqueleto similar ao da amilose,
altamente ramificada, cujos pontos de ramificao so ligaes - 1, 6. Em gua, a
amilopectina forma solues coloidais ou micelares.
Sob aquecimento, a suspenso aquosa de amido torna-se viscosa.
Sua viscosidade aumenta acentuadamente a 65C, ponto em que os grnulos
de amido se desfazem; a partir daqui, medida que a temperatura aumenta, a
viscosidade diminui abruptamente e atinge um valor mnimo e uniforme a 95C.
Neste ponto, a suspenso deve ser desgaseificada e vertida para as molduras
prprias. Aps resfriamento, a suspenso geleifica-se, formando uma rede
tridimensional de polmeros de glucose com ligaes glicosdicas - 1, 6, originrias
da amilopectina. Quando frio, o gel est preparado para receber o extrato protico e
ser submetido eletroforese. A concentrao de gel define a sua consist6encia e
porosidade. Seu preparo relativamente emprico, o que requer habilidade do
pesquisador. Na eletroforese em gel de amido, as molculas, ao migrarem entre as
malhas do gel, esto sujeitas ao efeito de frico e peneiramento molecular,
proporcionando o fracionamento das amostras.
Conforme mencionado anteriormente, a eletroforese em gel de amido
menos onerosa do que a em gel de poliacrilamida, mas suas lminas no
apresentam porosidade controlada, no permitem preparo de gradientes de pH e
sua resoluo inferior. Por ser um polmero natural, a composio do amido pode

6
variar de lote para lote, o que pode afetar suas propriedades de geleificao e
resoluo, tornando-se necessrio, muitas vezes, recalibrar o sistema ao utilizar
diferentes lotes de produtos. Em pH alcalino, o gel de amido exibe ligeiro efeito
eletroendosmtico em direo oposta a da migrao das protenas.
Amido hidrolizado de alta qualidade, prprio para eletroforese,
imprescindvel e encontra-se, atualmente, disponvel no mercado.
Todavia se necessrio, a hidrlise do amido pode ser conduzida no
laboratrio. Para isso, 300g de amido solvel so suspensos em 600mL de soluo
de acetona: HCl concentrado (100:1) a 38,5C.
Cuidados especiais devem ser tomados para impedir a volatilizao da
soluo em hidrlise. Aps 45 minutos de repouso nesta temperatura, interrompe-se
a hidrlise pela adio de 150 mL de soluo aquosa de acetato de sdio 1M. A
seguir. A suspenso filtrada em funil de Buchner e lavada, cuidadosamente, com
gua destilada. Para remover possveis traos remanescentes de acetato,
resuspende-se o amido em gua destilada e, aps 12 horas de repouso, filtra-se a
suspenso em funil de Buchner, lava-se novamente com gua destilada e, por
ultimo, com acetona. A seguir, seca-se o amido a 45-50C. Durante a hidrlise, a
temperatura deve ser rigorosamente controlada.

2.1- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Preparo Do Gel
1- Suspenda 39g de amido em 150mL de soluo-tampo do gel (gel 13-14%),
temperatura ambiente, em frasco Kitazato, sob agitao constante. A soluo-
tampo do gel varia de acordo com a espcie estudada. Existem vrias
composies que podem ser encontradas em livros de bioqumica ou biologia.
2- Adicione suspenso 150 mL da mesma soluo, procurando lavar as paredes
do frasco.
3- Cozinhe a suspenso em forno de microondas, agitando-a fortemente a cada 40
segundos no incio e a cada 10 segundos aps o aquecimento, antes de atingir a
fervura, para que o cozimento seja homogneo. Aps o cozimento, a suspenso
torna-se viscosa e transparente.
4- Mantenha a suspenso no forno de microondas at a fervura.

7
5- Tampe o frasco com uma rolha de borracha e adapte sua sada lateral a uma
bomba de vcuo, para eliminao das pequenas bolhas de ar formadas durante
o cozimento.
6- Verta cuidadosamente a suspenso de amido nas molduras de acrlico. A fim de
uniformizar a superfcie do gel e evitar o excesso de evaporao, cubra o gel
com uma placa de vidro. Assim que o gel atingir a temperatura ambiente,
mantenha-o em geladeira pelo menos por 30 a 60 minutos antes de aplicar as
amostras e proceder eletroforese.

2.1.1- APLICAO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE

1- Remova a placa de vidro que cobre o gel.

2- A cerca de 2.5 cm de uma das extremidades, corte o gel com auxlio de
escalpelo ou lmina prpria. O corte deve ser perpendicular e atingir a face
inferior do gel.
3- Afaste a menor poro do gel para facilitar a aplicao das amostras.
4- Triture pequena poro do tecido (que se deseja estudar) em pequeno volume
)10 a 20 l) de tampo do gel ou aplique amostras previamente preparadas e
armazenadas em tubos Eppendorf a 85C. Alguns materiais exigem tampes de
extrao mais complexos.
5- Aplique, sequencialmente, ao longo da face cortada do gel maior as amostras
adsorvidas nas tiras de papel-filtro (12 x 5mm), fazendo com estas cubram
completamente a espessura do gel. conveniente aplicar tambm soluo de
azul-de-bromofenol, quer em tira prpria, quer juntamente com uma das
amostras, para monitorar a migrao.
6- Apoie o suporte do gel sobre as cubas.
7- Empregue o sistema-tampo gel/eletrodo adequado, de acordo com o material
estudado.
8- Conecte o gel s cubas dos eletrodos, mediante uma ponte de pano, tipo Perfex,
ou similar, previamente embebida na soluo tampo.
9- Ligue o aparelho e faa o devido controle eltrico, usando-se voltagem (V),
corrente (I) ou potncia (W) constantes, dependendo do sistema-tampo
gel/eletrodo empregado.

8
 10- Anote todos os dados da condio da corrida (V, A, W) aferidos no aparelho.
Isso importante para monitorar a anlise e diagnosticar possveis problemas
durante a eletroforese.
11- Faa uma pr-corrida eletrofortica durante 15 minutos, a fim de que o material
em estudo seja liberado das tiras de papel contendo o extrato para o gel.
12- Desligue o aparelho, desconecte o gel das cubas e remova as tiras do papel filtro
com o auxlio de uma pina cirrgica. Mediante o uso de cotonete, limpe a face
cortada do gel onde foram aplicados os extratos.
13- Apoie o suporte do gel sobre as cubas e cubra-o com um plstico, deixando livre
cerca de 2 cm em cada extremidade. Esse procedimento evita a evaporao de
gua durante a eletroforese.
14- Conecte o gel s cubas e religue o aparelho, tendo o cuidado de anotar os dados
de voltagem, potncia e corrente.

2.1.2-PROBLEMAS COMUNS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A

ELETROFORESE

Problema Causa Provvel Sugesto

Formao de O amido no foi bem misturado Prepare nova suspenso, certificando-
grumos na com a soluo-tampo. se de que o amido seja adicionado,
suspenso pouco a pouco, soluo-tampo e
quente sob constante agitao, a fim de se
obter uma suspenso bem
homognea.
Gel flcido e Excesso de soluo-tampo Adicionar quantidade certa de
aquoso adicionada. Cozimento soluo-tampo. Aumentar o tempo
insuficiente do amido. Tempo de cozimento. Resfriamento num
insuficiente para o resfriamento tempo adequado
do gel.
Gel rgido e Congelamento do centro do gel Mudar o sistema de resfriamento.
difcil de fatiar devido ao gelo usado para Diminuir o tempo de cozimento de gel.
resfri-lo. Cozimento excessivo
do amido.

9
Gel de F6orma do gel fora de nvel. Preparar um novo gel nivelando
espessura Vazamento dos lados da frma. adequadamente a frma do gel e
irregular prender firmemente os grampos.
No deteco Solues corantes misturadas Uso de corantes e solues
de bandas impropriamente. Deteriorao apropriadas e na quantidade
dos produtos qumicos ou das adequada.
solues-tampo.
Arraste de Baixa fora inica do tampo Verificar a presena de bolhas de ar
bandas a partir da amostra ou quantidade no gel. Rever as solues tampo.
da origem insuficiente do mesmo.
Presena de bolhas de ar no
gel. Presena de amilose no
extrato cru.

2.1.3- CORTE DO GEL EM FATIAS

Com o auxlio de guias e mediante o uso de um fio de nilon, corte o gel

horizontalmente em fatias de, aproximadamente, 1 mm de espessura. Retire,
cuidadosamente, as fatias e distenda-as em frmas tipo pirex, para receber solues
corantes especficas.

10
Figura 1 Preparo do gel de amido.
Eletroforese e colorao. A: desgaseificao
da suspenso de amido, B: adio da
suspenso de amido na forma de gel, C:
corte do gel, D: aplicao da amostra.
FIGURA 2 Cont. E: gel sobre as
cubas, F e G: laminao do gel
aps eletroferese, H: colorao.

2.1.4- REVELAO DE PROTENAS EM GIS

Aps a eletroforese, os gis so corados em solues apropriadas para

revelao de bandas de protenas totais ou enzimas especficas. Para protenas
totais, a eletroforese usualmente desenvolvida em gis de poliacrilamida, em
virtude de seu maior poder de resoluo. Para enzimas, tanto o gel de amido quanto
o gel de poliacrilamida podem ser empregados satisfatoriamente, e os mtodos de
revelao so essencialmente os mesmos.

Figura 3 I: Colorao e revelao do gel. A: 6-fosfogluconato

desidrogenase, B: superxido dismutase, C: segregao
aloenzimtica em prognie de Tanatephorus cucumeris.

2.1.5- SECAGEM DO GEL

Os mtodos empregados para secagem dos gis variam dos mais simples,
rpidos e baratos aos mais complexos, demorados e dispendiosos. O mtodo usado

11
deve preservar a tonalidade de colorao das bandas e manter, ao mximo, a
integridade do gel, evitando rachaduras e encolhimento, que mascaram ao padres
eletroforticos. H disponveis no mercado e eficientes e sofisticados secadores de
gis que funcionam a vcuo e sob temperaturas relativamente elevadas.

2.1.5.1- Mtodo do bastidor

Aps colorao e fixao, o gel mantido em soluo constituda de metanol

(65%) e glicerol (0.5%), sob agitao lenta, durante 15 minutos, a fim de remover o
excesso de gua contido nos poros do gel. Uma folha de papel-celofone bem
poroso, ou similar, encharcada de gua, estendida sobre o arco interno de um
bastidor de madeira, apoiado sobre um disco de isopor com espessura igual
largura do bastidor e dimetro ligeiramente inferior ao da sua circunferncia interna.
O gel colocado sobre a folha de papel-celofone e, a seguir, coberto com outra
folha de celofone, igualmente encharcada de gua e de mesma dimenso. Para
facilitar a secagem, o conjunto gel-bastidor mantido em posio vertical,
temperatura ambiente, por 24 horas. Posteriormente o gel removido dos
bastidores, etiquetado e arquivado para anlise dos resultados.

2.1.5.2- Mtodo da Placa de Vidro

Mergulha-se o gel em uma soluo aquosa de metanol (65%) e glicerol

(0.5%), por 1 a 4 minutos. A seguir, o gel colocado sobre uma lmina de papel-
celofone distendida sobre uma placa de vidro, sendo o excesso de gua removido
por adsorso, mediante o uso de papel-filtro. Uma Segunda folha de celofone de
mesma dimenso deve ser distendida sobre o gel, tendo-se o cuidado de remover
as bolhas que se formarem entre o gel e o celofone. O tempo de secagem pode ser
de duas a quatro horas, a 50C, em forno com ventilao forada.

Figura 4
Representao
diagramtica do aparato
utilizado para secagem
do gel de amido e
poliacrilamida
12
2.1.6- DOCUMENTAO DE RESULTADOS EM GEL

2.1.6.1- Fotografia Convencional

A cmera fotogrfica acoplada a um sistema de iluminao com luz

incidente e transmitida. Os braos flexveis da luminria permitem a focalizao da
luz sobre o gel. Muitas vezes apenas a luz transmitida suficiente para sensibilizar o
filme e obter fotos de boa qualidade.

Figura 5 Aparato utilizado para fotografias convencionais de gis: a-base, b-haste-

suporte, c- luminria, d- lmpadas de 200W, e- cmara fotogrfica e f-
transiluminador para luzbranca.

2.1.6.2- Fotografia Digital

A fotodocumentao digital feita mediante o uso de um sistema

computadorizado que permite a captura, a visualizao e o processamento de
imagens de bandas de protenas e cidos nuclicos reveladas em gis. O sistema
consiste de uma cmara escura de mesa, tendo internamente um transiluminador
mvel de luz ultravioleta (UV) para gis corados com brometo de etdio para cidos

13
nuclicos ou transiluminador de luz branca para gis de protenas ou enzimas
coradas.
Em virtude de seu alto custo atualmente, este sistema ainda inacessvel
maioria dos laboratrios, mas suas considerveis vantagens em relao aos
mtodos convencionais de documentao de resultados em gis justificam o seu
uso.

Figura 6 Sistema de fotodocumentao digital: a) cmara

escura de mesa, contendo internamente um transiluminador
de luz ultra violeta (UV) ou de luz branca; b) cmara de
vdeo, munida de lente zoom; c) monitor; d) impressora
trmica; e e) computador.

3.0- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

3.1- Fundamentos

Gis de poliacrilamida so formados por copolimerizao de acrilamida e Bis-

acrilamida (Bis) na presena de persulfato de amnia e tetrametiletilenodiamina
(TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED
catalisa a liberao de radicais livres de persulfato que, por sua vez, iniciam a
polimerizao. O sistema riboflavina-TEMED exige fotoenergia para iniciar o

14
polimerizao. A fotodecomposio da riboflavina libera radicais livres que
promovem a polimerizao.
A polimerizao ocorre pela formao de radicais livres de acrilamida obtidos
qumica ou fotoquimicamente. A polimerizao para render gis, requer ligaes
entre as cadeias de poliacrilamida geradas por molculas de Bis. Na falta de Bis, por
copolimerizao, causa reticulao entre as cadeias de poliacrilamida.
O dimetro dos poros do gel funo das concentraes de acrilamida e Bis
(T%). Para separao de molculas maiores, usam-se gis com menor teor de
acrilamida.
Para protenas desnaturadas, empregam-se, comumente, gis com gradiente
de concentrao. Analogamente a gis comuns, a concentrao do gradiente
escolhida de acordo com o peso molecular das protenas em estudo. Na prtica,
confeccionam-se gis em gradiente, na faixa de 7% a 16% de acrilamida. Na
eletroforese de protenas desnaturadas, o SDS (dodecilsulfato de sdio) e o
mercaptoetanol aniquilam o efeito de cargas das molculas proticas nativas. Neste
caso, as separaes se do segundo o peso molecular, e a migrao
consequncia to-somente das cargas negativas do SDS, causando efeito de
peneiramento molecular. Quanto maior a molcula, menor a mobilidade.

Figura 7 Efeito da concentrao de acrilamida sobre o

dimetro dos poros do gel.

15
Tabela 1 Faixa de concentrao de acrilamida (T%) em relao ao peso molecular
das protenas a serem separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
Concentrao de acrilamida (T%) Faixa tima de peso molecular (kDa)
3-5 >100
5-12 20-150
10-15 10-80
>15 <15

3.2- SISTEMAS DE ELETROFORESE

Gis em placa tm sido comumente usados por serem mais fceis de

manusear e permitirem comparao de vrias amostras num mesmo gel em
condies idnticas de eletroforese. Em algumas situaes, contudo, gis em tubos
so ainda usados, especialmente na primeira direo da eletroforese bidimensional.
Quanto a posio do gel, o sistema de eletroforese pode ser vertical ou horizontal,
quanto aos tampes e respectivos valores de pH, o sistema pode ser contnuo ou
descontnuo.
No sistema contnuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampo usado na
preparao da amostra e do gel o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. No
sistema descontnuo, os ons tamponante do gel so diferentes daqueles dos
eletrodos. O sistema descontnuo consiste de gis formados por fases de diferentes
porosidades e valores de pH. Alm disso, a soluo-tampo do gel distinta
daquela dos eletrodos.

Figura 8 Sistemas de eletroforese. A- vertical: a) tanque do eletrodo, b) cavidade do

gel, c) gel e d) eletrodo e B- horizontal: a) tanque do eletrodo, b) eletrodo, c) ponte
eletrolca (Perfex), d) gel e e) ponto no gel de aplicao das amostras.

16
3.3- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Preparo das amostras

Efetue a extrao de protenas ou material desejado. Misture uma parte do
extrato (0.5mL) com outra (0.5mL) do tampo da amostra. No caso da anlise de
protenas desnaturadas, use tampo da amostra contendo SDS e -mercaptoetanol
ou DTT e ferva as amostras por 10 minutos para completar a desnaturao.

Material
1- Estojo para preparo das placas do gel
2- Aparelho para controle eltrico (fonte de energia)
3- Vitrine vertical metalfrio ou geladeira comum
4- Pipetas automticas com respectivas ponteiras, bqueres e provetas.

Componentes Acrlicos
Acrilamida/Bis (30% T; 2.6% C):
a) 73 g de acrilamida;
b) 2 g de Bis;
c) 250 mL de gua deionizada.
Filtre a soluo e armazene em geladeira (a 10C), no escuro.

Tampo do gel Separador ou de Corrida

Tris-HCl, pH 8.9:
a) 45.75 g de tris base.
b) Adicione aproximadamente 60mL de gua deionizada, que deve ser previamente
aquecida para eliminar O2 dissolvido e facilitar a dissoluo. Titule com HCl
concentrado para pH 8.9.
c) Complete o volume para 100 mL, filtre a soluo e armazene-a em geladeira.

Tampo do gel Empilhador

Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8:
a) 7.475 g de tris base.
b) Adicione aproximadamente 80 mL de gua deionizada e titule com HCl para pH
6.8.

17
c) Complete o volume para 100 mL, filtre a soluo e armazene-a temperatura
ambiente.

Tampo do Tanque (Eletrodo)

Tris-glicina, pH 8.9:
a) 63.2 g de Tris base.
b) 39.9 g de glicina.
c) Adicione aproximadamente 900 mL de gua.
d) Complete o volume para 1.000 mL. O pH da soluo fica em torno de 9.2. No
ajuste o pH. Filtre a soluo e armazene-a em geladeira (10C). Dilua a soluo a
1:10 antes do uso; o pH cair, aproximadamente, para 8.9.

Soluo-Estoque de SDS
a) 10 g de SDS.
b) Complete o volume para 100 mL com gua deionizada.

Tampo da amostra
a) Para Protenas nativas
a) 5 mL de glicerol.
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8
c) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.
d) Complete o volume para 25 mL e armazene a soluo, em alquotas, em
congelador a 20C.

b) Para Protenas Desnaturadas

a) 5 mL de glicerol.
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8.
c) 0.5 mL de -mercaptoetanol ou 0.39 g de ditiotreitol (DTT).
d) 5 mL de soluo de SDS 10%.
e) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.
f) Complete o volume para25 mL e armazene a soluo, em alquotas, em
congelador a 20C.

18
Persulfato de Amnia
a) 0.05 g de persulfato de amnia.
b) 0.5 mL de gua desmineralizada.

Obs:. Use sempre soluo fresca, preparada imediatamente antes do uso.

3.4- PREPARO DO GEL

Sistema PAGE
O termo PAGE representa eletroforese em gel de poliacrilamida.
usado para anlise do padro de enzimas e outras protenas nativas. A
concentrao de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos
componentes que se deseja analisar.
Rotineiramente, usam-se gis na faixa de 7.5 a 10%. Para variar a
concentrao de acrilamida no gel, para um mesmo volume de soluo, basta alterar
o volume da soluo estoque de acrilamida-Bis em relao ao da gua, as
quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas.
To logo sejam preparadas as solues de persulfato e TEMED, deve-se
aplicar a soluo nas molduras do gel. A geleificao se processa dentre de poucos
minutos.
Com o auxlio de uma seringa, aplique a soluo do gel separador no espao
entre as placas de vidro at a altura de 1.5 cm abaixo da extremidade inferior do
pente. Imediatamente aps, complete com gua destilada o espao entre as duas
placas para uniformizao da parte superior do gel e para sua proteo contra
oxignio, que inibe a polimerizao. Aps a polimerizao em temperatura ambiente,
remova a gua sobrenadante por decantao e uso de papel-filtro e introduza a
soluo do gel empilhador. A seguir, insira um pente de teflon nessa soluo. Em
seguida polimerizao, remova o pente e enxge as cavidades resultantes com
soluo-tampo do tanque, diluda razo de 1:10. Remova tambm o excesso de
tampo com o auxlio de papel adsorvente (papel higinico ou papel-filtro).

19
 Sistema SDS-PAGE
Este sistema aplicado no estudo de protenas desnaturadas por
aquecimento na presena de SDS e -mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). Ele visa
determinao do peso molecular de protenas. O mtodo empregado similar a ao
anterior, PAGE, exceto que SDS adicionado s solues do gel, e aos tanques dos
eletrodos. A cada 30 mL de soluo do gel separador e 15 mL do empilhador, usam-
se respectivamente, 200 e 100 mL de SDS a 10%.
Aos tanques adicionam-se 10 mL da mesma soluo para cada 1.000 mL de
soluo-tampo diluda a 1:10. Amostras fervidas contendo SDS e -mercaptoetanol
ou DTT so aplicadas no gel.

Figura 9 Preparo do gel de poliacrilamida, Figura 10 Cont... E) colocao do

eletroforese e colorao: A) suporte para placas,
espaadores e pente de teflon, B) cuba para pente de teflon, F) remoo do
eletroforese, C) montagem das placas, D)
aplicao da soluo de acrilamida. excesso de soluo de acrilamida e
lavagem das cavidades com soluo-
tampo do tanque, G) aplicao das
3.5- APLICAO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE
amostras e eletroforese, H) remoo
do gel, I) colorao e J) conjunto de
Em cada cavidade do gel aplique, cuidadosamente 75 L do extrato de
bandas de protenas reveladas no
protena. A quantidade de amostra a ser aplicada depende da concentrao de
gel.
protena e da atividade enzimtica. Complete os volumes das cavidades com
soluo-tampo de tanque diluda (1:10) e adicione, respectivamente, nos tanques

20
 superior e inferior 500 e 1.000 mL dessa mesma soluo. Calibre o aparelho para
100 V.
Quando a linha frontal do azul-de-bromofenol atingir o gel separador, regule o
aparelho para 200 V.

3.6- PROBLEMAS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A ELETROFORESE

Problema Causa Provvel Sugesto

Gel no M qualidade de acrilamida ou Use reagentes com alto grau de
polimeriza Bis. Soluo velha de pureza e com idoneidade. Usar
acrilamida/Bis ou de persulfato solues recm-preparadas. A
de amnia. soluo de persulfato deve ser
preparada no momento do uso.
Gel Concentrao excessiva de Bis Verifique as concentraes e pesos
esbranquiado de acrilamida e Bis.
Gel quebradio Concentrao excessiva de Bis Verificar a concentrao adequada
de Bis.
Rachaduras no Expanso e contrao da Reduza a concentrao de Bis. Use
gel acrilamida provocadas pela placas devidamente limpas
produo de calor durante a
polimerizao.
Fraca colorao Receita inadequada Verifique a receita, pois comum a
de bandas ocorrncia de erros em receitas.
No deteco de Polaridade reversa. Baixa Verifique a polaridade. Aumente a
bandas concentrao de amostra. concentrao da amostra. Verifique
Corrida muito rpida ou muito as concentraes das soluo-
demorada. tampo e se a corrente
adequada.

21
3.7- REVELAO, FOTOARQUIVAMENTO E SECAGEM DE GIS

Assim que a linha frontal do azul-de-bromofenol atinja aproximadamente 0.5

cm da extremidade inferior do gel, a eletroforese, por via de regra, ser interrompida.
Para molculas de baixa mobilidade anodal, entretanto, torna-se conveniente
prolongar a corrida mesmo aps a sada do azul-de-bromofenol do gel. Aps a
eletroforese, os gis so removidos cuidadosamente, das placas e imersos numa
soluo de colorao. A revelao de bandas proticas , usualmente, feita com
azul-de-coomassie (Brilliant Blue)0.1%.
Outros corantes recomendados para protenas baseiam-se no emprego de
prata coloidal ou na reduo de Ag+. Ainda apreciadas tcnicas que se valem de
amido black, fucsida bsica e preto B de Sudam. Para enzimas, os gis so
imersos em solues apropriadas contendo substrato, coenzimas, etc. necessrios
atividade de cada enzima.
Aps a revelao, os gis so fixados em soluo aquosa de glicerol 10% e, a
seguir, fotoarquivados ou desidratados.

4.0- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALFENAS, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Protenas Afins. Fundamentos e Aplicaes em

Plantas e Microorganismos. Editora Viosa, Viosa, Universidade Federal de Viosa, 1998, 574p.

ALFENAS, A. C. et ali. Eletroforese de Protenas e Isoenzimas de Fungos e Essncias

Florestais. Viosa, Universidade Federal de Viosa, 1991, 242p.

CONN, E. E. & STUMPPF, P.K. Introduo Bioqumica. 4 Edio So Paulo, Edgard Blucher,
1980, 525p.

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bioqumica. 2 Edio So Paulo,

Sarvier, 839p., 1995.

SANTOS, C. D. Apostila de Bioqumica Prtica Aplicada Agricultura. Lavras, Universidade

Federal de Lavras, 1997, 89p.

STRYER, L. Bioqumica. 4 Edio Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1000p., 1996.

22