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INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Isolamento e Identificao de
Micro-organismos do Solo
2010
PARTE 1 - Teoria
1- Introduo
O solo uma camada viva, que recobre a superfcie terrestre entre a litosfera e a
atmosfera. Os solos so constitudos de trs fases: slida (minerais e matria orgnica),
lquida (soluo do solo) e gasosa (ar). Essas fases podem ser encontradas em diferentes
propores, dependendo de fatores como tipo de solo e forma de utilizao. produto do
intemperismo sobre um material de origem, cuja transformao se desenvolve em um
determinado relevo, clima, bioma ao longo de um tempo e est em evoluo permanente.
O solo o resultado de algumas mudanas que ocorrem nas rochas. Estas mudanas
so bem lentas, sendo que as condies climticas e a presena de seres vivos so os
principais responsveis pelas transformaes que ocorrem na rocha at a formao do
solo.
2 - Microbiologia do Solo
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influncia na gnese e manuteno da organizao dos constituintes do solo,
principalmente nos horizontes superficiais.
Um solo frtil apresenta bactrias, fungos, algas, protozorios e vrus, que podem
atingir um total de bilhes de organismos por grama. A proporo e a quantidade de
micro-organismos variam com a profundidade e a composio dos solos, conforme se
pode observar na Tabela 1.
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Tabela 1 - Quantidade de Micro-organismos no Solo
4.1 - Bactrias
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Figura 1 - Estrutura de uma bactria
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As bactrias podem ser identificadas por meio da tcnica de colorao de Gram.
Durante o processo de colorao de Gram, as clulas so tratadas com cristal violeta
(corante primrio) e em seguida com uma soluo de iodo, o que resulta na formao de
um complexo cristal violeta-iodo (CVI) dentro das clulas. Quando uma bactria Gram-
negativa tratada com etanol, o lipdeo na membrana externa dissolvido e removido, o
que rompe a membrana externa e aumenta a sua permeabilidade. Assim, o complexo
corante pode ser removido, descorando a bactria Gram-negativa, que pode ento ser
tingida com o corante de fundo safranina. Em bactrias Gram-positivas, etanol faz com
que os poros no peptideoglicano se contraiam, e o complexo corante CVI permanece no
interior da clula.
4.2 - Actinomicetos
4.3 - Fungos
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alm disso, os miclios melhoram a estrutura fsica do solo. Os gneros mais comuns so
Penicillium, Mucor, Rhizopus, Cladosporium, Aspergillus.
4.4 - Algas
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PARTE 2 - Prticas
2 - Principais etapas
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1 Prtica Apresentao/Preparo de vidrarias para uso no laboratrio
de Microbiologia
1.1 - Autoclave (calor mido) - Seu funcionamento baseia-se no vapor dgua sob
presso. utilizada para esterilizao de materiais usados em microbiologia e meios de
cultura.
1.4 - Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro ou de poliestireno cristal, com tampa
rasa, destinada ao cultivo de micro-organismos em meio slido.
1.6 - Pipeta graduada ou sorolgica - Utilizada para diluio, inoculao, etc. Deve conter
um tampo de algodo no bocal.
1.7 - Esptula de Drigalsky - Basto de vidro com formato de tringulo em uma das
extremidades. usado para distribuir de forma homognea uma cultura lquida sobre o
meio de cultura slido contido na placa de Petri.
1.8 - Cabo de Kolle - Cabo em cuja extremidade h um fio de platina ou outra liga
metlica (nquel-cromo) que pode ser reto (agulha) ou encurvado (ala). Serve para
semear micro-organismos em meio slido ou lquido.
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1.11 - Pina para lmina - Servem para fixar uma lmina com material que vai sofrer
colorao, podendo ser de metal ou madeira;
2.2 - Tubos de cultura - se estiverem com culturas, devem ser inicialmente autoclavados
(120C, 20min), o meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com gua e sabo e
deixadas por algumas horas em soluo detergente. Depois disso so passadas em gua
corrente e secas. Aps a lavagem, e antes da esterilizao, os tubos so arrolhados
firmemente com algodo, de modo que ao ser pego somente pela rolha o tubo no se
solte. A esterilizao deve ser feita em autoclave, quando j possuem meio de cultura em
seu interior.
2.3 - Placas de Petri - se estiverem usadas devem ser autoclavadas (121C, 20min), o
meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com gua e sabo e deixadas por algumas
horas em soluo detergente. Depois disso so passadas em gua corrente e secas. Juntar
tampa e fundo adequadamente e acondicionar para esterilizao em portas-placa ou
embrulhar em grupos de cinco com papel Kraft. Identificar o material e datar. Esterilizar
em autoclave a 121C por 30 minutos. Secando em seguida em estufa a 100C.
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2 Prtica - Preparo de meios de cultivo/Esterilizao pelo calor.
1 - Definio
2 - Exigncias Nutritivas
Podem ser classificados de acordo com diferentes critrios, desde a forma em que
se apresentam at sua finalidade.
Quanto apresentao: lquidos, slidos ou semi-slidos.
Quanto origem dos constituintes: naturais ou sintticos.
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Quanto natureza dos constituintes: meios minerais, meios orgnicos, meios mistos
e meios complexos (adio de fatores de crescimento).
Quanto finalidade: meios de cultivo, meios de enriquecimento, meios de
identificao, meios diferenciais, meios especiais e meios para conservao.
4 - Normas de Preparao
Embora cada meio de cultura tenha sua composio prpria ou detalhes tcnicos
especiais para o preparo, todos os meios devem ser preparados obedecendo algumas
regras bsicas. Em geral, todas as substncias devem ser solubilizadas. No caso de meios
slidos, primeiramente prepara-se o meio lquido, solubilizando individualmente os
componentes e somente ao final adiciona-se o gar, cuja solubilizao s ocorre numa
temperatura superior a 60oC. Os sais, a peptona e os acares devem ser solubilizados em
gua fria, enquanto que o extrato de carne e de levedura em gua ligeiramente aquecida.
Finalizada a solubilizao o pH do meio deve ser ajustado para o valor desejado com
soda ou cido, distribudo em recipientes adequados e esterilizado.
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Esterilizar a 121oC/15 min.
Obs.: Para cada um dos meios acima, preparar 250 mL de meio lquido.
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3 Prtica - Isolamento de micro-organismos do solo - plaqueamento.
1 - Definio
2 - Tcnicas de Plaqueamento
2.1- Superfcie
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Figura 2 Tcnica da diluio sucessiva para o plaqueamento de amostra de solo.
Exemplo de clculo:
n de colnias = 54
diluio = 10-5
Total: 54 10-5 = 54 x 105 = 5,4 x 106 UFC/g de amostra
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4 Prtica - Descrio das colnias selecionadas/isoladas no
plaqueamento. Repique.
1 - Leitura da Placa
Examina-se a placa contra a luz, por ambos os lados, procurando colnias isoladas
que sero marcadas (Figura 1). Em seguida, com auxlio da lupa, observa-se
cuidadosamente estas colnias marcadas e numera-se aquelas que, pelo aspecto, parecem
provir de espcies diferentes.
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2 - Caractersticas Morfolgicas das Colnias
b) Forma:
c) Elevao:
d) Bordos:
e) Estrutura da superfcie:
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3 - Repique
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5 Prtica - Observao/descrio das culturas repicadas e de sua
tolerncia ao oxignio./Preparaes microscpias I: a fresco
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2 - Preparaes microscpias I: a fresco
Essas preparaes podem ser coradas ou no. Neste caso, os corantes empregados
so os corantes vitais, ou seja, no comprometem a vida da clula. H difuso do corante
no lquido celular. Ex: azul de metileno usado para pesquisa de clulas vivas.
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3 - Observaes das Preparaes
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6 Prtica - Preparaes microscpias II: fixadas e coradas
1.2 - Fixao
A Marchoux
- Mtodo qumico
- Mecanismo: precipitao das protenas celulares pelo etanol
- Execuo: cobrir o esfregao com etanol, escorrer e flambar.
Calor
- Mtodo fsico
- Mecanismo: coagulao das protenas celulares.
- Execuo: passar o esfregao pela chama do bico de Bunsen de duas a trs vezes.
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1.3 - Colorao: As clulas fixadas podem sofrer diversos processos de colorao, sendo
o mais importante a colorao de Gram.
Colorao de Gram - Tcnica segundo Hucker
- Cobrir a preparao com Gram I (soluo de cristal violeta). Deixar 60 segundos.
Escorrer e lavar com gua corrente.
- Recobrir com gotas de Gram II (soluo de Lugol). Deixar 30 seg. Escorrer e lavar.
- Tratar com Gram III (etanol) at descorar. Escorrer e lavar.
- Recobrir com Gram IV (soluo de safranina). Deixar 5-7 seg. Escorrer, lavar e secar.
Neste caso as clulas so observadas com a objetiva de imerso. Para tal, colocar
diretamente sobre a preparao uma gota de leo e levar ao microscpio para focalizar.
As preparaes deste tipo so observadas com bastante luz (condensador elevado e
diafragma bem aberto).
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2 - Observaes das Preparaes
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