Mtodos Cromatogrficos

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html

http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/
 CROMATOGRAFIA

PLANAR COLUNA

CENTRFUGA CCD GASOSA LQUIDA

CP CG CGAR CLSSICA CLAE

 Cromatografia
Histrico
Michael Tswett ()- botnico russo 1906

Etimologia
CHROMA = Cor
Graphein = escrever

Dcada de 30 camada delgada

Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG
http://members.shaw.ca/vict/chemistry_test3.htm
Dcada de 60 CLAE
 Cromatografia

Definio
um processo pelo qual diferentes solutos so separados por uma
dinmica diferencial do processo migratrio em um sistema contendo
uma ou mais fases, das quais uma desloca-se continuamente em uma
dada direo e no qual as substncias exibem mobilidades distintas
devido a diferenas de adsoro,partio, solubilidade, presso de vapor,
tamanho da molecular ou densidade de carga inica.

Parmetros em cromatografia:

Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido)

Resoluo
Pratos tericos
Altura equivalente a um prato terico (HETP)
 Definio

Mtodo fisico-qumico de
separao de substncias

Presena de duas fases:

Estacionria e mvel

Separao ocorre devido a

diferena de interao
entre as substncias e as
fases

Podendo ser uma analise

qualitativa e/ou quantitativa

Cromatografia em papel
 PRINCPIO BSICO

Tcnica de separao e anlise de misturas por

interao dos seus componentes entre uma Fase
Estacionria e uma Fase Mvel.
 Uses for Chromatography

Chromatography is used by scientists to:

Analyze examine a mixture, its components,

and their relations to one another
Identify determine the identity of a mixture or
components based on known components
Purify separate components in order to isolate
one of interest for further study

Quantify determine the amount of the a mixture

and/or the components present in the sample
 Cromatografia: Classificao

1. Forma fsica do suporte

Cromatografia planar: CP e CCD

Cromatografia em coluna CG e CL
-dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica)
-estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico)
-tipo de coluna (aberta/fechada)
-fase estacionria (lquido/slido)

2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou

mecnico)
3.Polaridade das fases utilizadas
 Mecanismos de separao

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
Polaridade da fase estacionria:

Fase normal - Fase estacionria polar

Fase reversa - Fase estacionria apolar
 CCD - exemplos

Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma
solvel na FM
estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil
Thin Layer Chromatography - t.l.c.

Series of spots forms

Compare samples in mixture with
known substances.
Measure Rf values.
Coloured compounds & colourless
compounds.
Separation and identification.
 Pigment Colour RF value

carotene yellow-orange 0.91

pheophytin a grey 0.75

pheophytin b light grey 0.63-0.75

chlorophyll a blue green 0.63

chlorophyll b green 0.58

xanthophylls yellow 0.53

xanthophylls yellow 0.47

xanthophylls yellow 0.32

Eluent: Cyclohexane : propanone :petroleum ether (low boiling point) 5 : 3 : 2

 Cromatografia em Camada Delgada

Mtodo rpido (20-40 min.)

Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)
 Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido

Natureza da amostra x Comportamento cromatogrfico

1.saturados x insaturados > reteno insaturados

2.grupos funcionais
COOH > -OH > -NH3 > -SH > -CHO > C=O > CO2R > OCH3 > CH=CH
e
3. Impedimento estrico

Atividade: I, II ...V ( % de gua adicionada 0----15%)

 Cromatografia em papel

Compostos hidrossolveis, cidos

orgnicos e ions metlicos
Princpio: partio (solubilidade)
Quantidade de amostra necessria
10-3 a 10-6 g
Tipos: ascendente, descendente,
bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - gua retida na celulose
(papel Whatman)
Mtodos de deteco: fsico-
qumicos
Anlise qualitativa: Rf (fator de
reteno) - problema :
reprodutibilidade
Anlise quantitativa: densitmetro,
extrao dos solutos
Adsoro depende:
Tipos de adsorventes:
natureza qumica do G- aglutinantes (gesso amido ou
adsorvente talco)

rea de superfcie/ H- sem aglutinante (p/ CL)

tamanho da partcula P-camada preparativa

porosidade da partcula F- contm fluorescncia

R- adsorvente sem aditivo
- atividade- - >stios ativos

Critrios para escolha da fase mvel:

analitos devem ser solveis diferentemente
no deve haver reao entre analitos/FM e
FM/FE
 Comparao

CP CCD

Vantagens: Vantagens:
tcnica simples maior sensibilidade
no requer mais rpido
instrumentao sofisticada > repetibilidade
baixo custo < difuso
> faixa de aplicao
Desvantagens: reveladores reativos
uso limitado permite aquecimento
alargamento de banda-difuso- Desvantagens
pouca alternativa de reveladores degradao de compostoslbeis
devido grande superfciede
exposio
dificuldades na quantificao
Cromatografia Lquida em coluna aberta
Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (HPLC)
 Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado,
caros
Sistemas de injeo:vlvulas de volumes definidos
Colunas de guarda
Colunas: recheios
materiais porosos com partculas
de dimetros o mais homogneo possvel e de
dimetro igual ou menor a 10 um (em geral)
Silica e
Alumina.
Colunas com fase ligada
silica como suporte
A) formao do ster silicato (Si- O
- R)
B)formao da ligao siloxano (Si- O
- SiR)
C)Ligao Si- C
At 60.000 pratos tericos
Detector:
Alta sensibilidade
Resposta rpida para todos os compostos da amostra
Insensvel mudanas na Fase mvel
Insensvel mudanas de temperatura
Resposta independente para a fase mvel
Resposta linear
No deve destruir a amostra
Fcil operao
Fornecer informaes qualitativas
Detector Uv
- Vis
Detector de Fluorescncia
Detector de arranjo de diodos
Detector de ndice de Refrao
Detectores eletroqumicos

Quantificao:
Calibrao Externa
Calibrao Interna
 Cromatografia a Gs

Rapidez
Alto poder de separao
Separao de vrias classes
de compostos em uma anlise
Amostras volteis
Compostos termicamente
estveis

Sensibilidade (ppm - ppb) Tcnicas auxiliares p/

identificao
Facilidade de registrar dados
Variedade de detetor
(especificidade)
 Cromatografia a Gs: aplicaes

Anlise de cidos graxos e triglicerdeos

Anlise de micotoxinas
Anlise de compostos volteis responsveis pelo
aroma caracterstico de alimentos
Anlise de aucares
Anlise de amino cidos
Anlise de pesticidas
Anlise de frmacos
etc
etc
 Cromatografia a Gs: tipos

Cromatografia Gs-Slido
FE: slidos (slica, carvo grafitinizado,
polmeros porosos)
Princpio de reteno:(adsoro, volatilidade)

Cromatografia Gs-Lquido ***

Lquido mantido estacionrio em suporte inerte
Princpio de reteno: solubilidade, volatilidade
 Cromatografia a Gs: Instrumentao

Gs de arraste (FM)
H2, N2, He, Ar
Funo: transporte da amostra
Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro
 Cromatografia a Gs: Instrumentao
Injetor

Colunas empacotadas -
cmara de aquecimento
Colunas capilares:
split
splitless
on- collum

Cuidados:
Introduzir qtddes reprodutveis
de amostra
Vaporizar totalmente a amostra
sem decomp-la
No discriminar compostos
 Cromatografia a Gs: Instrumentao
Colunas - tipos

Parmetro Coluna empacotada Coluna capilar

Diam. Int. (mm) 1-4 0,15 - 0,75
Compri/o (m) 1-3 10 -100
Pratos tericos 2400 3000
Espessura F.E.(m) 5 0,5 - 2
Vazo gs (ml/min) 20 - 60 1- 5
Vol. amostra (l) 02 - 20 0,001- 0,5
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
 Cromatografia a Gs: Instrumentao
Colunas - fase estacionria (FE)

Apolar: hidrocarbonetos no aromticos, silicones (ex.: SE-30) -

P.E.

Polar: contm grande quantidade de grupos polares (Ex.:

Carbowax)- interaes tipo pontes de hidrognio

Intermediria: grupos polares ou potencialmente polares em

esqueleto apolar (Ex. SE-52)

Escolha da coluna:
Polaridade da fase estacionria,
dimetro e espessura do filme
quantidade de amostras, tempo
de anlise, presso (velocidade da FM), temperatura do forno
Comprimento
pratos tericos
 Cromatografia gasosa: Instrumentao
Colunas - fase estacionria (FE)

Abreviao de algumas fases estacionrias

DEGA- adipato de dietileno glicol
DEGS- succinato de dietileno glicol
SE
- 30- metil silicone
OV- 11- 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M- polietilnoglicol
Programao de temperatura
 Cromatografia a Gs: Instrumentao
Detetor - requisitos

Alta sensibilidade
Baixo nvel de rudo
Faixa linear ampla p/ a resposta
Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos,
especficos)
Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura
Destrutivos/ no destrutivos
 Cromatografia gasosa: Instrumentao
Detetor -Tipos

Ionizao de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal)

FM = hidrognio ou nitrognio, destrutivo

Condutividade trmica (resposta universal, no destri a amostra) - FM

= helio ou hidrognio,no destrutivo

Captura de eltrons (seletivo p/ halognios orgnicos, nitrilas, nitratos e

organometlicos) FM = nitrognio, no destrutivo

Terminico (seletivo p/ compostos contendo N e P)

Formao de ons pela combusto
da amostra na presena de H2 e O2.
Origina corrente eltrica no coletor
gerando um sinal do qual a
combusto do gs de arraste
descontada
O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram
eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente
constante que ser registrada como linha de base.
Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar
eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo
proporcional concentrao do composto.
 Cromatografia a Gs: Anlise qualitativa

Tempo de reteno
Tempo de reteno relativo
Co-cromatografia com padres (spiking)
Grficos p/ sries homlogas
ndices de reteno (Kovats, ECL)
Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)
Tr= tempo de reteno
Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer
a coluna
Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm
 Cromatografia a Gs:Anlise quantitativa

Normalizao
Relao concentrao Padro interno
x
Padro externo
rea do pico
Fator de resposta
 Normalizao:
Todo componente produz um pico (f)
A resposta do detector dependente apenas da
concentrao (f)

Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas
Padres em concentraes prximas amostra
Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo
 Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma
determinada classe de substncias
Fator de resposta= concentrao/rea

Para um padro contendo a

mesma concentrao de trs
substncias diferentes com
reas A1, A2 e A3

Se assumirmos um fator
como 1,00 por ex. f3 =1,00
Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada
uma calculada utilizando estes fatores:

Exemplo .Uma amostra contm X, Y e Z.

O padro contm 200 mg de cada em 100mL de solvente.
A injeo de 5uL resulta em:

Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8

Fy = 1190/660 = 1,8
II. A anlise da mostra-
problema resulta em:

Multiplica-se cada pico por seu fator:

X= 90 x 5,8 Y = 265 x 1,8 e Z = 460 x 1

rea total = 450 + 477 + 460 = 1387
Depois calcula-se a % de rea

Z deve estar presente em todas as amostras

Esse mtodo corrige a diferena de volume a cada injeo
Padronizao interna
Uma substncia conhecida adicionada em concentrao
definida em todos os padres e nas amostras;
No co-elui com a amostra
estvel e detectado na concentrao em que se encontra

Etapas:

Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as

reas e concentraes do PI e da substncia de interesse

Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo

estoque do padro interno (PI)