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Esterilizao de Meios e Equipamentos

Profa. Eliana Moss Alhadeff


Prof. Nei Pereira Jnior
Motivos para o uso da esterilizao ou desinfeco

Contaminantes podem competir por nutrientes com o micro-organismo


agente do processo;

Contaminantes podem produzir substncias inibidoras ao processo, ou


mesmo que decomponham o produto;

Contaminantes podem produzir substncias que venham a dificultar a


etapa de separao do produto;

Contaminantes podem produzir substncias txicas que tornem o


produto inapropriado para o consumo.
ESTERILIZAO
Esterilizao de um meio ou ambiente a operao
destinada a eliminar todas as formas vivas
(vegetativas ou esporuladas), seja por destruio ou
remoo.
Calor
Agentes fsicos Radiao (raios X, , UV)
Filtrao

Desinfeco a eliminao por morte ou a inibio


do crescimento de micro-organismos contaminantes
atravs do emprego de uma substncia qumica. Sua
ao extremamente seletiva sendo funo do
micro-organismo e das condies ambientais.
Tcnica Forma de ao
Calor Seco Destri os microrganismos atravs da oxidao de seus constituintes
qumicos. Dependendo do contedo de gua na clula, pode ocorrer tambm
a coagulao de protenas.
Calor mido O vapor dgua saturado destri os microrganismos atravs da desnaturao
irreversvel de protenas. O vapor sob presso favorece a transferncia de
calor atravs da condensao que ocorre no material, levando a um rpido
aumento de temperatura, e pela manuteno ou aumento do nvel de
hidratao no interior das clulas, favorecendo a coagulao das protenas.
Os carboidratos tambm sofrem alteraes, sendo muitas vezes
caramelizados, gerando produtos txicos.
Irradiao por A radiao UV (220 a 300 nm) absorvida de modo mais significativo pelos
ultravioleta cidos nuclicos. Purinas e pirimidinas (260 nm); aminocidos aromticos
(UV) como triptofano, fenilalanina e tirosina (280 nm); bases de pirimidinas so
mais sensveis que de purinas, ocorrendo ligaes cruzadas entre pirimidinas
adjacentes na mesma fita de DNA (cido desoxirribunuclico) formando
dmeros. O RNA tambm sofre ao do UV (dmeros de hidrato de uracila).
Radiao Radiaes ionizantes eletromagnticas alfa (), beta (), gama (), raios X,
ionizante raios catdicos, alm de prtons, nutrons e eltrons de alta energia, atuam
em grupos qumicos do DNA causando mutaes. A radiao , com alto
poder de penetrao, gera perxidos e radicais livres, que desestruturam o
equilbrio bioqumico dos micro-organismos, mesmo esporulados.
Desinfeco Ao
xido de Etileno Age como agente alquilante, substituindo um tomo de hidrognio de
grupos funcionais de protenas, cidos nuclicos e outra molculas
(carboxila livre, amino ou sulfidrila) pela molcula de xido de etileno
aberta (CH2CH2O-), bloqueando grupos ativos das molculas e a
desnaturao de protenas.
Glutaraldedo Age na superfcie da clula atravs de interaes glutaraldedo-
protenas, principalmente com grupos amina livres das protenas da
camada peptdeoglicana das bactrias.

+ SH SH-CH2-CH2OH

Enzyme
xido de etileno Inativada
ESTERILIZAO
Desinfectante : Agente qumico capaz de promover
desinfeco.
Antissptico : Agente qumico aplicvel em
pessoas e animais, com capacidade de eliminar
micro-organismos patognicos.
Assepsia : Remoo e continuidade da excluso
de microrganismos patognicos ou indesejados.
Biocidas : Agentes capazes de causar a morte de
micro-organismos.
Biostticos : Agentes capazes de impedir a
reproduo de micro-organismos, sem
necessariamente mat-los.
Ordem descendente de resistncia a
Germicidas Qumicos e nvel de atividade
requerido para a esterilizao
TIPO DE MICRO-ORGANISMO NVEL DE ATIVIDADE REQUERIDO

Bactria esporulante Alto

Micobactria Alto a Intermedirio

Vrus pequenos ou no lipdicos Alto a intermedirio

Fungos Intermedirio a baixo

Bactria vegetativa Baixo

Vrus mdios ou lipdicos Baixo


DESINFECO : Agentes qumicos
DESINFECTANTE OU CONCENTRAO APLICAES NVEL DE
ANTISSPTICO ATIVIDADE
Compostos Fenlicos Soluo aquosa at Instrumentos, Intermedirio
5% superfcies para baixo
lcoois : Pele, instrumentos Intermedirio
Etanol ou Isopropanol 70 90 % cirrgicos, (bacilus,
lcool e Iodo 70 + 0,5 a 2,0 % I termmetros fungos e virus)
Iodo : Iodoform 1% Pele, pequenos intermedirio
Tintura de iodo 2 % I + 2 % iodato + cortes, guas e
70 % lcool piscinas
Compostos Clorados Soluo aquosa at gua, superfcies Baixo
Hipocloritos e 0,5 % cloro livre no metlicas, (baclus ou
Cloraminas equipamentos virus no
lcteos lipdicos)
Compostos Quaternrios de 0,1 - 0,2 % Sanitizao de Baixo
Amnio ambientes e
equipamentos
Compostos de Mercrio 1,0 % Pele, instrumentos Baixo
Mertiolate e Mercriocromo
DESINFECO : Agentes qumicos
Qumicos Esterilizantes CONCENTRAO APLICAES NVEL DE
(eliminam endoesporos ATIVIDADE
bacterianos)
xido de Etileno 400 a- 800 mg/litro embalagens Alto

- propiolactona 2 a 5 mg/litro Uso restrito por Alto


ser cancergeno
Glutaraldedo e 2 % Instrumentos e Alto
surfactante equipamentos (micobactrias
especializados e bactrias
esporuladas)
Formaldedo 4 a 8 % (p/v) Instrumentos, Alto para
soluo aquosa reas fechadas, intermedirio
equipamentos (bactrias
(forma gasosa, esporuladas)
220C, 60-80 %
umidade)
DESINFECO : Agentes qumicos

O tempo de exposio para se atingir um determinado nvel de


destruio microbiana depender do desinfetante escolhido, da
concentrao, do tempo, da temperatura e das caractersticas da
populao microbiana contaminante (tipo e nmero).

Agente de desinfeco Contaminante(s) alvo Tempo requerido

Soluo de etanol a 70 % Bactrias; maioria dos fungos 10 minutos


e vrus lipdicos

Soluo de perxido de Esporos de bactrias aerbias 60 minutos


hidrognio a 10 % (ca. de 108 esporos)

Soluo de formaldedo a Esporos bacterianos 18 horas


8 % e isopropanol a 70 %
Endoesporo Bacteriano
Forma desidratada e resistente ao calor, congelamento, substncias
qumicas e radiaes;

Dipicolinato de clcio na capa.

The endospore consists of the bacterium's DNA, ribosomes and large amounts of dipicolinic acid.
Dipicolinic acid is a spore-specific chemical that appears to help in the ability for endospores to
maintain dormancy. This chemical comprises up to 10% of the spore's dry weight.
Brock Biology of Microorganisms(2003)
DESINFECO : Agentes qumicos
ESTERILIZAO PELO CALOR
Processo Contnuo: Meio em Fermentao com
aspecto sadio (Espuma formada e evoluo de CO2).
Processo Contnuo: Contaminao com
formao de biofilme bacteriano
Reaes de escurecimento em meios de
cultivo catalisadas pela temperatura
T

Reao de Maillard
Caramelizao

Em ambos os casos, ocorrem degradaes dos carboidratos


(acares), conduzindo modificao na composio dos meios de
cultivo e reduo do seu valor nutricional para a clula;
A reao de Maillard se d com interveno de amino-cidos e
acares redutores, enquanto a caramelizao se d com
acares redutores e no-redutores sem participao de amino-
cidos;
R HC =O + R1 NH2
Reao de Maillard
Reaes de escurecimento em meios de
cultivo catalisadas pela temperatura
Nas duas transformaes, os produtos de degradao
formam compostos escuros e de alto peso molecular.
No caso da reao de Maillard, estes compostos contm
nitrognio em sua molcula e recebem o nome de
MELANOIDINAS; tornando, tanto o(s) acar(es) quanto
a(s) fonte(s) de nitrognio, NO BIODISPONVEIS;
Fatores que afetam a reao: temperatura (quanto
maior, maior a taxa de reao); tempo de exposio ao
calor (idem); pH (valores baixos inibem [< -NH2] e altos
aceleram); natureza do acar que se relaciona com sua
atividade (poder redutor: xilose > arabinose > hexoses >
dissacardeos);
Reaes de escurecimento em meios de
cultivo catalisadas pela temperatura
A reao de Maillard tambm chamada de
escurecimento no-enzimtico, distinto daquele
produzido por enzimas comuns em vegetais, as
peroxidases, que atuam sobre compostos fenlicos
(polifenis) dando origem a produtos de intensa cor
escura.
Polifenol oxidase
Polifenis Pigmentos escuros

Necessidade de controle rgido da temperatura e do


tempo de exposio durante o processo de
esterilizao para preservao/manuteno da
integridade do meio de cultivo.
ESTERILIZAO

Resistncia ao calor mido

Organismo Resistncia relativa


Escherichia coli 1
Esporos bacterianos 3.000.000
Esporos de bolores 2 a 10
Virus/bacterifagos 1 a5
Coagulao da albumina do ovo

Temperatura de Coagulao (oC) 180

160
140

120

100

80

60

40
0 10 20 30 40 50 60
Contedo de gua (%)

Contedo de gua (%) 50 25 15 5 0


Temperatura de coagulao (oC) 56 76 96 149 165
ESTERILIZAO
TML (temperatura mnima letal) : a menor temperatura na qual se
observa o incio da destruio do micro-organismo contaminante, atravs
da ao do calor. funo do micro-organismo e do meio ambiente.

psicroflicos
hipertermoflicos
mesoflicos

termoflicos

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temperatura (oC)
ESTERILIZAO
A esterilizao pelo calor pode se dar de acordo com as
seguintes modalidades:

1. Calor seco (165 oC/2 h) instrumental e vidraria

2. Calor mido
2. 1. Presso atmosfrica (at 100 oC)
2. 1.1. Vapor fluente (100 oC por 15-30 min)
2. 1.2. Tindalizao (TML < Te < 100 oC por 15-30 min)
[por 3 vezes consecutivas]
2. 1.3. Pasteurizao (TML < Te < 100 oC por 15-30 min)
2. 2. Vapor saturado sob presso (T > 100 oC)
[usualmente 121oC por 20 min]
Pasteurizao
Mtodo Clssico do leite: 630 C por 30 min.

Alta temperatura e curto tempo (HTST): 720C por 15 seg

Tratamento de Temperatura ultra-elevada: 1400 C por seg


Pasteurizao
Descontnua
ESTERILIZAO
A esterilizao de meio e equipamento pode ser
efetuada de duas maneiras:

a. esterilizao de biorreator e meio conjuntamente

Aquecimento Vapor indireto (serpentina ou jaqueta)


Vapor direto (diluio do meio)
Eltrico (pouco usado por ser caro)

Resfriamento gua fria


Fluido refrigerante

b. esterilizao de biorreator e de meio separadamente


TIPOS DE TRANSFERNCIA DE CALOR NA ESTERILIZAO
DESCONTNUA DE MEIOS DE CULTIVO

Aquecimento com Aquecimento


vapor direto Eltrico

Aquecimento com Resfriamento


vapor indireto indireto
TEORIA DA ESTERILIZAO PELO CALOR

Ln N

T constante
K
dN
KN
d

(min)
N : no de micro-organismos sobreviventes aps exposio a uma
temperatura T por um tempo ;
K: constante da velocidade de destruio trmica do micro-organismo,
medida em tempo-1.
TEORIA DA ESTERILIZAO PELO CALOR

K : a forma de contaminante mais resistente.


K = K (mo; meio; T)

dN
KN
d
Integrando a equao, temos que:


N
dN N
N N 0 K d Ln K
o
No
No : nmero de micro-organismos no incio da exposio a
temperatura T, correspondente a = 0.
TEORIA DA ESTERILIZAO PELO CALOR

Clulas de bactrias

Endoesporos bacterianos
Tempo de Reduo Decimal (D)

Tempo de exposio do meio temperatura T que reduza a um


dcimo o nmero de contaminantes :

No
Ln KD D
N

Se No = 100 e N = 10 , logo :

100
2,303 Log KD D
10

Assim : 2,303
D
KD
DEPENDNCIA DE K COM A TEMPERATURA

Equao de Arrhenius

E

RT
K A. e

Onde: A : constante de Arrhenius;


E : energia aparente de ativao de destruio (Kcal/mol);
R : constante dos gases perfeitos;
T : temperatura absoluta (K);
Linearizando a equao, temos que:

E 1 E 1
Ln K Ln A Log K Log A
RT 2,3 R T
DEPENDNCIA DE K COM A TEMPERATURA

Equao de Arrhenius E 1
Ln K Ln A
RT

Ln K

E/R

1/T (K-1)
Determinao de E tendo as curvas de destruio trmica:

LnK
Ln N/No K3 K1
T3 E/R
K2 K2
K1
T2 K3
T1

q (min)

T1 > T2 > T3 1/T1 1/T2 1/T3 1/T


Esterilizao HTST (High Temperature Short Time)

Energia de ativao de destruio de alguns esporos


bacterianos e de algumas vitaminas
Vitamina / microrganismo E (Kcal/mol)
Vitamina A 14,6
cido flico 16,8
cido ascrbico 23,1
lcool pantotenlico 21,0
Cianocobalamina 23,1
Cloridrato de tiamina 22,0
Bacillus stearrothermophilus 67,7
Bacillus subtilis 76,0
Clostridium botulinum 82,0
Anaerbico NCA 3679 72,4
Esterilizao HTST (High Temperature Short Time)
Eesporos bacterianos = 50 - 85 Kcal/mol
Evitaminas = 10 25 Kcal/mol

Grfico de Arrhenius para micro-organismo contaminante


e nutrientes termossensveis

Ln K

(D K)mo Emo/R (K)mo > (K)nt

(D K)nt Ent/R

1/T2 1/T1 1/T


Inativao de Tiamina contida em meios de
fermentao, por ao do calor

Temperatura de Tempo de Esterilizao * Perda de Tiamina


Esterilizao (oC) (min) (%)

100 843 99,9


110 75 89
120 7,6 27
130 0,851 10
140 0,107 3
150 0,015 1

*Tempo de esterilizao necessrio para atingir um grau de esterilidade


(No/N) = 1016, para destruio de esporos de B. stearothermophilus.
Fonte: Wang et al. (1979)
Cintica de destruio de nutrientes termolbeis
Degradao do nutriente termossensvel temperatura constante :

S2
Ln K nutriente e
S1

Variao da constante de velocidade de destruio trmica do


nutriente com a temperatura :

E nutriente
K nutriente Anutriente exp
RT
Demonstre analiticamente que ocorre proporcionalmente uma
maior destruio de micro-organismos contaminantes, em
relao degradao de nutrientes termolbil, ao aplicar o
princpio do HTST.
Eficincia de Esterilizao e Grau de Esterilidade

No N
Eficincia de esterilizao : 100
No

Grau de esterilidade : No
N

Determine o grau de esterilidade sabendo que a


eficincia de esterilizao de 99,99999999 %.
Esterilizao Descontnua

T (oC)
N1 < N0 N < N2 < N1
Te

TML N0 N

Tamb
N0

o 1 2 3
(min)
Aquecimento e Resfriamento
TIPOS DE TRANSFERNCIA DE CALOR NA ESTERILIZAO
DESCONTNUA DE MEIOS DE CULTIVO

Aquecimento com Aquecimento


vapor direto Eltrico

Aquecimento com Resfriamento


vapor indireto indireto
A dificuldade de resoluo analtica

Exemplo : aquecimento por vapor direto

N1 1 1
dN N0
N N K d Ln K d
N1 0
0 0


1 1
E E
A e RT
d A exp d
0 0 RT 1
0 1
ESTERILIZAO EM BATELADA
Perfis temperatura versus tempo
Tipo de transferncia Relao temperatura , ou
de calor vs tempo

Vapor direto
T T0 1 s
1 hs
;
M c T0 M
(hiperblico)
Aquecimento eltrico
T T0 1 q

M c T0
(linear)
Aquecimento indireto
com vapor
T TH 1 e
UA
;
T0 TH
Mc TH
(exponencial)
Resfriamento indireto
com fluido refrigerante

T TH 1 e


Wc '
UA

1 e Wc
'

; To Tco
Mc Tco
(exponencial)
ESTERILIZAO EM BATELADA
Perfis temperatura versus tempo
T : temperatura absoluta, oK;
: tempo, min; s; h;
A : rea de transferncia de calor, m2;
c : calor especfico do meio, Kcal/Kg.oC;
c : calor especfico do fluido refrigerante, Kcal/Kg.oC;
h : entalpia do vapor relativa temperatura do meio a esterilizar, Kcal/Kg;
M : massa inicial do meio na esterilizao em batelada, Kg;
q : taxa de transferncia de calor, Kcal/s;
s : vazo mssica de vapor, Kg/s; Kg/min; Kg/h;
To : temperatura inicial do meio, oK;
TH : temperatura da fonte de aquecimento, oK;
TCO : temperatura de entrada do fluido refrigerante, oK;
U : coeficiente global de transferncia de calor, Kcal/m2.oC.h;
W : vazo mssica do fluido refrigerante, Kg/s; Kg/min; Kg/h.
Clculo de esterilizadores descontnuos
( em batelada)

Problema : K .d ??????????????

Resoluo :
Conhecendo-se :
Exigncias de esterilidade (No/N);

Curvas de destruio (Ln No/N vs ) a vrias


temperaturas, para elaborao da curva Ln K vs 1/T;

Curvas de aquecimento e resfriamento.


Clculo de esterilizadores descontnuos
( em batelada)
Problema : K T . d ?

Aquecimento Resfriamento

1.8 1.8
1.8
1.6
80 1.6 1.6
12
1.4
1.2
K (T ( )) d
24
1.4
1.2 K (T ( )) d
1.4
1.2
K (min )
-1

1 1 0 1

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6


0.4 0.4 0.4
0.2 0.2 0.2
0 0 0
20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25
tempo (min) tempo (min)
Clculo de esterilizadores descontnuos
( em batelada) Modelagem funo
do sistema adotado
para o tratamento trmico
K = K(T)
K = K(T())
T = T()

AQUECIMENTO RESFRIAMENTO
K K
Ke Ke

KML
KML
0 1 2 3

A R
Teorema do Valor Mdio
f(x)
f x dx
f x
f(x) x2 x1
Com isto pode-se definir KM e K*M
como sendo os valores mdios
respectivos da constante de
destruio nos intervalos de
x1 x2 x aquecimento e resfriamento.

1 3

K . d e
K . d
0 *
KM K M 2

1 0 3 2
Integral de Simpson
1
h
K . d 3 K 0 2M 4 N K n
0

K
M = K2 + K4 + K6 + ....... + K2n-2
Ke
N = K1 + K3 + K5+ ....... + K2n-1
KML
n = nmero de intervalos (par)

h = intervalo :
1 0 0 1
h
n n intervalos

E
Aplicar no aquecimento e no resfriamento : K n A. e RTn
Esterilizao Descontnua
dN fornece :
A aplicao da equao : KN
d
N0
a. Etapa de Aquecimento : Ln K M 1 0 A
N1

b. Etapa de esterilizao propriamente dita:

N1
Ln K e 2 1 K e e
N2

N2
c. Etapa de Resfriamento : Ln K M 3 2 R
N
Esterilizao Descontnua

Somando-se as equaes, tem-se que equao :

N 0 N1 N 2
Ln K e e A R
N1 N 2 N
N0
Ln Ke e A R
N
1 N0 A R
e Ln
Ke N Ke
Esterilizao Descontnua (Batelada) e Contnua
Vantagens da esterilizao contnua:
Aumento da produtividade (maiores temperaturas e
menores tempos de operao) e menor destruio de
constituintes do meio;

Melhor controle de temperatura;

Facilidade de controle automtico;

Reduo do tempo ocioso;

Regularidade da demanda por vapor;


Esterilizao Contnua

Usam-se dispositivos que permitem atingir a temperatura de


esterilizao instantaneamente, bem como resfriar o meio
rapidamente at a temperatura de processo;

No h problema em se resolver a integral K .d j que K


pode ser considerado uma constante.
Situaes :
Planta industrial j instalada possuindo uma seo de utilidade
que gera vapor com propriedades j definidas (caso A);

Seo de espera j dimensionada, no havendo restrio na


gerao de vapor com qualquer propriedade (caso B).
Esterilizao Contnua

Conhecendo-se :

grau de esterilidade (N0/N);

curvas de destruio trmica (Ln N0/N vs ), para


elaborao da curva Ln K vs 1/T.

Caso A : dada a temperatura Te informar e :


Ln N 0
determina-se Ke (Arrhenius) e resolve-se :
e N
Ke
Caso B : dado e , informar a temperatura Te :
Ln N 0
resolve-se : Ke N , determina-se a Te (Arrhenius)
e
Esterilizao Contnua

2 - 3 min

O tempo de esterilizao depende da vazo volumtrica F, do


dimetro interno da tubulao cilndrica (di) e do comprimento (L).
.
Esterilizao Contnua
2
3

4 6

1 Meio contaminado
2 Vapor 7
3 Seo de espera 1
4 Vlvula de expanso
5 Vcuo
6 Flash cooler
7 Meio estril
7
Dimensionamento de Esterilizador Contnuo

Supondo o esterilizador um tubo cilndrico de comprimento L e


dimetro interno di, tem-se que :

2
d i

L

4
F
L
e
di

Onde : F a vazo volumtrica (m3/min) e e o tempo de


esterilizao (min).
Esterilizador Contnuo e Bioprocesso Contnuo
Supondo que o meio estril, aps resfriado temperatura do
bioprocesso, direcionado para a alimentao de biorreator que
opera com processo contnuo, em estado estacionrio.

vapor
F
F
F
L S1
So
S1
Meio contaminado X1
Xo = 0 X1
Po = 0 P1 P1
Meio estril
Esterilizador Contnuo e Bioprocesso Contnuo
No esterilizador :

d i2
L
No Ea 4
Ln Ke e K e A exp F
N R Te e

No biorreator : Balano de massa para substrato

dS1 dS1
V FS o FS1 V
dt acumulado dt consumido
X
X1 V 1
0 F S o S1 V YX
F
S
YX
S S o S1
Pasteurizador Esterilizao Descontnua