2011 Junqueira - Manual para Detecção de Trypanossoma Cruzi

MANUAL DE CAPACITAO
NA DETECO DE
Trypanosoma cruzi
PARA MICROSCOPISTAS DE
MALRIA E LABORATORISTAS
DA REDE PBLICA
Laboratrio de Doenas Parasitrias

Expanso Rio Negro
Medicina Tropical
IOC-Fiocruz
Mdulos I, II e III
2 edio
2011
I
INSTITUIES FINANCIADORAS DESTA PUBLICAO
Laboratrio de Doenas Parasitrias, IOC-Fiocruz;
Fundao Oswaldo Cruz;
Organizao Pan-Americana da Sade (OPAS);
Departamento de Controle de Doenas Tropicais
Negligenciadas, OMS;
APOIO
Departamento de Controle de Doenas Tropicais
Negligenciadas, OMS;
Rede ePORTUGUSe da OMS.
Inclui CD com o contedo do Manual em formato PDF e material

de apoio.
Todos os direitos reservados. permitida a reproduo total ou

parcial desta obra, desde que seja citada a fonte e no seja para ou
qualquer fim comercial.
II
MANUAL DE CAPACITAO NA DETECO DE
Trypanosoma cruzi PARA MICROSCOPISTAS DE MALRIA E
LABORATORISTAS DA REDE PBLICA
EDITOR
Jos Rodrigues Coura
Pesquisador Titular /Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina
Tropical do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) da Fundao Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ), Brasil.
AUTORES
Angela Cristina Verissimo Junqueira
Pesquisadora do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina Tropical do
Instituto Oswaldo Cruz (IOC) da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Brasil.
Responsvel pela elaborao do curso piloto original, do material didtico
das aulas terico-prticas e professora.
Teresa Cristina Monte Gonalves

Pesquisadora do Setor de Entomologia Mdica e Forense do Laboratrio
de Transmissores de Leishmanioses do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) da
Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Brasil.
Responsvel pela elaborao do material didtico das aulas terico-prticas
do Mdulo III e professora.
Carlos Jos de Carvalho Moreira

Pesquisador do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina Tropical do
Instituto Oswaldo Cruz (IOC) da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Brasil.
Colaborador nos Mdulos I e II, revisor da montagem final do material escrito
e professor.
CONSULTORES
Pedro Albajar Vias
Mdico Coordenador do Programa de Controle da Doena de Chagas,
Departamento de Controle de Doenas Tropicais Negligenciadas, Organizao
Mundial da Sade (OMS). Consultor e professor.
III
Antnio Evandro Melo de Oliveira
Ex-Diretor-Presidente da Fundao de Vigilncia em Sade do Estado
do Amazonas (FVS-AM).
Bernardino Cludio de Albuquerque

Diretor-Presidente da Fundao de Vigilncia em Sade do Estado do
Amazonas (FVS-AM).
Jacenir Reis dos Santos Mallet

Pesquisadora/Chefe do Setor de Entomologia Mdica e Forense do Laboratrio
de Transmissores de Leishmanioses do IOC/FIOCRUZ.
Catarina Macedo Lopes

Tecnologista do Setor de Entomologia Mdica e Forense do Laboratrio de
Transmissores de Leishmanioses do IOC/FIOCRUZ. Consultora e colaboradora
na montagem da maioria das imagens do material impresso do Mdulo III.
COLABORADORES
Preparao de todo o material didtico para as aulas prticas dos Mdulos I/
II e envio de todo o material para os municpios alvo das capacitaes.
Equipe do Laboratrio de Doenas Parasitrias do Instituto Oswaldo Cruz/
FIOCRUZ:
Aline Andrade Santos
Amanda Coutinho de Souza
Deise Lucide de Oliveira Bras
Elton Batista de Faria
Jos de Souza Nogueira
Laura Cristina dos Santos
Maria Celeste Dias Spata
Maria Jos de Souza
Renata Bortolasse Miguel
Samuel Ferreira de Deus
Vanessa da Costa Neves
IV
Preparao de lminas de formas de cultura do T.cruzi
Laboratrio de Ixodides - Referncia Nacional em Vetores de Ricktsias do
IOC/FIOCRUZ:
Renato da Silva Jnior
Preparao do material didtico para as aulas prticas do Mdulo III.

Equipe do Setor de Entomologia Mdica e Forense do Laboratrio de
Transmissores de Leishmanioses do IOC/FIOCRUZ:
Adalberto Jos da Silva
Ana Paula Rufino Amaro Santanna
Cristina Santos da Silva
Leandro Borges Ramos
Nathanielly Rocha C. de Lima
Shnia Patrcia Corra Novo
Simone Caldas Teves
Simone Castro Simes de Souza
Simone Patrcia Carneiro de Freitas
Willian Marques
Preparao de parte das imagens, arte grfica das apostilas e modelagem 3D.
Equipe do Servio de Produo e Tratamento de Imagens do IOC/Fiocruz:
Genilton Jos Vieira
Angelo Chafin
Bruno Eschenazi da Silveira
Helosa Maria Nogueira Diniz
Leonardo Perim
Rodrigo da Cunha Mexas
Mrcio Gndara
V
Preparao de imagens, diagramao e projeto grfico da edio atual:
Marcello Pelliccione (projeto grfico e diagramao)
com o suporte da Equipe do Servio de Comunicao Visual (SCV-ICICT/
FIOCRUZ):
Bob Moreira (tabelas)
Flvia de Carvalho (diagramao)
Mara Lemos (diagramao)
Valria de S (capa)
Preparao das cpias reprogrficas.

Equipe do Departamento de Ensino do IOC/Fiocruz:
Vanir Quintanilha Lamaro
Rosimeri Melo Sousa
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Anlia Celencina Fagundes Gomes
Tcnica de Nvel Superior da Secretaria de Estado da Sade (SESAU), Estado
de Tocantins.
Envio de manuais e modelos de ficha do Programa de Controle da Doena
de Chagas.
Armando Carlos Lopes e Soraya Batoreu de Azevedo

Departamento de Manuteno de Equipamentos DEMEC/FIOCRUZ.
Pelo auxlio nos clculos da fora centrfuga e fornecimento da tabela de
converso.
Cleber Galvo
Pesquisador do Laboratrio Nacional e Internacional de Referncia em
Taxonomia de Triatomneos.
Cesso de exemplares de diferentes espcies de triatomneos, da Coleo
Entomolgica Herman Lent, para ilustraes da apostila.
VI
Daniel Tapias Morales
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (USP).
Pela preparao de parte das imagens da tese de doutorado da pesquisadora
Angela C. V. Junqueira, apresentada no Departamento de Parasitologia da
USP, que foram utilizadas nesta apostila.
Elizabeth Luz Snchez Roman

Laboratrio de Zoonosis Parasitaria (LZP), Centro Nacional de Salud (CNSP),
Instituto Nacional de Salud (INS) - Peru.
Traduo do texto para o Espanhol na verso da apostila empregada no Curso
de Capacitao realizado em Quito (Equador), 2008.
Franois Noireau*
Pesquisador do Institut de Recherche pour le Dveloppement (IRD),
Montpellier, France.
Cesso de algumas imagens de Triatoma infestans que ilustram parte do
Mdulo III da apostila.
Jane Margaret Costa von Sydaw

Pesquisadora e Curadora da Coleo Entomolgica do IOC/Fiocruz.
Cesso do exemplar da espcie Panstrongylus geniculatus para ilustrao da
apostila.
Jos Borges Pereira

Pesquisador do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina Tropical
IOC/Fiocruz.
Fornecimento da cepa de T.cruzi (VL) empregada para infectar camundongos,
visando obteno de lminas de formas evolutivas do T.cruzi empregadas
nas aulas prticas.
Jlio Cesar Miguel

Tcnico do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina Tropical - IOC/
FIOCRUZ.
Preparao de lminas de fluorescncia para ilustrao.
* In memoriam.
VII
Marco Aurlio Peregrino da Silva
Professor da Universidade do Rio de Janeiro - UNIRIO.
Fotografias de alguns exemplares de triatomneos que ilustram parte do
Mdulo I/II da apostila.
Mariangela Ziccardi de Camargo Salles

Pesquisadora do Laboratrio Interdisciplinar de Pesquisa Mdica do IOC/
Fiocruz.
Fornecimento do isolado de T. rangeli utilizado no preparo das lminas
empregadas nas aulas prticas do Mdulo I/II e fotografias da pg. 122.
Matheus de Oliveira Rachid

Reviso ortogrfica do texto.
Mirko Rojas Cortez

Programa Nacional de Control de Chagas (PNCCH), Ministerio de Salud, La
Paz, Bolvia.
Cesso de uma das imagens de Triatoma infestans que ilustra o Mdulo III
da apostila.
Regina Ungerer
Mdica e Coordenadora da Rede ePORTUGUSe da Organizao Mundial da
Sade (OMS).
Difuso e distribuio mundial.
Sergio Luiz Bessa Luz

Pesquisador do Centro de Pesquisa Lenidas e Maria Deane/Fiocruz.
Apoio logstico no Estado do Amazonas para o curso piloto.
Sonia Gumes Andrade

Pesquisadora do Centro de Pesquisa Gonalo Moniz/Fiocruz.
Cesso das imagens de formas amastigotas de T. cruzi em diferentes
tecidos.
VIII
Prefcio
Esta apostila, originria do Laboratrio de Doenas Parasitrias do
Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, foi idealizada para cursos de capacitao
de tcnicos no diagnstico parasitolgico da infeco chagsica, na
identificao de vetores e na conduta com pacientes com doena
de Chagas na Amaznia Brasileira desde 2006, se transformou, em
2008, em um Manual para uso nos nove pases da Regio Amaznica,
graas ao apoio da Organizao Pan-Americana da Sade. Neste ano
de 2012 est sendo lanada a 2 edio revisada e atualizada para
ser distrubuda seguindo o mesmo fluxo da primeira. A apostila
o fruto do esforo de vrios profissionais - pesquisadores, tcnicos
e estudantes, particularmente das Dras. Angela Cristina Verissimo
Junqueira e Teresa Cristina Monte Gonalves (coordenadoras) e dos
Drs. Carlos Jos de Carvalho Moreira e Pedro Albajar Vias, e tantos
outros consultores e colaboradores, relacionados no seu incio com as
respectivas instituies a que pertencem.
O primeiro curso de capacitao de tcnicos, organizado pela Dra.
Angela C. V. Junqueira, foi realizado no Municpio de Barcelos, na
Microrregio do Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil, em janeiro
de 2006, como curso piloto, considerando que nesse Municpio o
Laboratrio de Doenas Parasitrias do IOC/Fiocruz mantm uma
extenso, onde vem desenvolvendo pesquisas de campo nos ltimos
20 anos. Tendo em conta o sucesso do primeiro curso e feitos os
ajustes necessrios, durante os anos de 2006 a 2007, o referido curso
foi ministrado nos Laboratrios Centrais de Sade Pblica (LACEN) e
trs centros de pesquisa nas capitais dos nove estados da Amaznia
Brasileira, com apoio operacional e financeiro de Mdicos Sem
Fronteiras (MSF). Essa iniciativa teve um grande xito, considerando
que, desde ento, um aumento expressivo no nmero de casos agudos
tem sido notificado naqueles estados. No ano de 2008, mais dois
cursos foram ministrados no interior da Amaznia dentro do mesmo
modelo proposto no curso de 2006. O mesmo ocorreu de 2009 a
2011, nos estados de Tocantins e Par.
IX
A estrutura do curso modular, com a seguinte organizao:
Mdulo I (Terico)
Apresentao do curso
Doena de Chagas e seu agente etiolgico
Diagnstico Laboratorial - Uma abordagem geral
Conduta com o indivduo infectado e notificao
Caracterizao do T. cruzi
Mdulo II (Terico e prtico)

Diagnstico Parasitolgico do Trypanosoma cruzi
Aulas tericas e prticas
Mdulo III (Terico e prtico)

Identificao, biologia de triatomneos e mtodos de coleta
Aulas tericas e prticas
Os Mdulos I e II so ministrados em conjunto, na parte da

tarde, durante cinco dias teis da semana, visando no interromper
as atividades de rotina dos tcnicos; sendo essa mesma conduta
implementada no Mdulo III (mdulo opcional).
Diante da experincia acumulada nos 14 cursos ministrados na
Amaznia Brasileira, estamos certos de que esse modelo de curso
poder ter o mesmo xito nos demais pases da Regio Amaznica.
Rio de Janeiro, outubro de 2011.
Prof. Dr. Jos Rodrigues Coura

Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias - Medicina Tropical
Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz./
X
Cronograma Modelo do Curso de Capacitao
Tema das Aulas (Mdulo I e Mdulo II) Datas Horrios
Apresentao do curso: seus objetivos e metas. ___ / ___ / ___ 13:30 s 15:00
Mdulo I - Doena de Chagas: agente etiolgico; reservatrios; vetores; mecanismos de transmisso; manifestaes segunda-feira
clnicas e tratamento.
Dr. Jos Rodrigues Coura / Dr. Pedro Albajar Vias
Intervalo 15:00 s 15:15
Doena de Chagas: agente etiolgico, reservatrios, vetores, mecanismos de transmisso, manifestaes clnicas e 15:15 s 16:15
tratamento. (continuao)
Dr. Jos Rodrigues Coura / Dr. Pedro Albajar Vias
Diagnstico laboratorial - uma abordagem geral. 16:30 s 18:30
Dra. Angela C. V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira.
Conduta com o indivduo infectado: avaliao epidemiolgica e notificao dos casos. ___ / ___ / ___ 13:30 s 15:00
Consideraes na coleta de dados: preenchimento de questionrio epidemiolgico (modelo do Min. da Sade do Brasil). tera-feira
Dra. Angela C. V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira
Apresentao de um vdeo do Ministrio da Sade sobre Doena de Chagas
- Fim do Mdulo I -
Mdulo II - Diagnstico laboratorial - uma abordagem especfica: diagnstico parasitolgico. 15:15 s 16:15
Dra. Angela C.V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira.
T.cruzi: ciclo evolutivo no mamfero e no vetor. 16:30 s 18:30
Aula prtica: identificao de T.cruzi em lminas de sangue, fezes e em macerado do tubo digestivo do vetor.
Dra. Angela C. V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira.
Aula prtica: identificao de T.cruzi em lminas de sangue, fezes e em macerado do tubo digestivo de Triatomneos. ___ / ___ / ___ 13:30 s 15:00
Desenhar as formas visualizadas ao microscpio. (continuao) quarta-feira
Aula prtica: identificao de T.cruzi em lminas de sangue, nas fezes e em macerado do tubo digestivo do 15:15 s 16:45
vetor. Verificao de ninhos de amastigosta em corte histolgico. Desenhar as formas visualizadas ao microscpio.
(continuao) Dra. Angela C. V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira
Discusso de alguns casos agudos relatados na literatura cientfica, com enfoque ao diagnstico parasitolgico. 17:00 s 18:30
T.rangeli: ciclo evolutivo no mamfero e no vetor. ___ / ___ / ___ 13:30 s 15:00
Aula prtica: identificao de T.rangeli em lminas de sangue. quinta-feira
Dra. Angela C .V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de Carvalho Moreira
T.rangeli: ciclo evolutivo no mamfero e no vetor. 15:15 s 16:15
Aula prtica: identificao de T.rangeli em lminas de sangue. Desenho das formas evolutivas visualizadas na lmina.
(continuao)
Dra. Angela C .V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de Carvalho Moreira
Blastocritdia: ciclo evolutivo no inseto vetor. Aula prtica: identificao de Blastocritdia em triatomneos infectados 16:30 s 18:30
experimentalmente.
Dra. Angela C.V. Junqueira - Dr. Carlos Jos de C. Moreira
- Fim do Modulo II -
Avaliao dos conhecimentos tericos que foram repassados no Mdulo I e II ___ / ___ / ___ 13:30 s 15:00
(10 questes: 5 sobre o mdulo I e 5 sobre o mdulo II) sexta-feira
Avaliao prtica: identificao de T.cruzi e T. rangeli em diferentes amostras biolgicas. 15:15 s 16:15
Correo das duas avaliaes junto com os alunos. 16:30 s 18:30
Apresentao do vdeo sobre o Instituto Oswaldo Cruz.
Encerramento das Atividades
As aulas do Mdulo I so direcionadas aos profissionais de sade que atuam no programa de vigilncia e controle. O Mdulo II visa capacitao exclusiva de
microscopistas. pr-requisito que os microscopistas participem dos mdulos I e II, sendo o nmero limitado ao mximo de 10 profissionais para o mdulo II. Cada
profissional receber um formulrio para ser preenchido, que tem como objetivo verificar o seu perfil e tempo de atuao na funo atual.Vide pasta verde aps o
cronograma.
XI
Tema das Aulas (mdulo III) OPCIONAL Datas Horrios
Ordem Hempetra: posio sistemtica, conhecimento geral de triatomneos e cimicdeos. ___ / ___ /____ 13:30 s 15:00
Dra. Teresa C. M. Gonalves segunda-feira
Subfamlia Triatomiae: morfologia externa, morfologia interna e fisiologia. 15:15 s 16:15

Dra. Teresa C. M. Gonalves
Subfamlia Triatominae: biologia das principais espcies e aspectos ecolgicos das espcies Amaznicas. 16:30 s 18:30
Mtodos de coleta, preservao e transporte de triatomneos. ___/ ___ / ____ 13:30 s 15:00
Dra. Teresa C. M. Gonalves tera-feira
Aula prtica: mtodos de coleta, preservao e transporte de triatomneos. Preenchimento da Ficha de 15:15 s 16:15
Notificao.
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos utilizando a chave dicotmica. 16:30 s 18:30
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos utilizando a chave dicotmica. ___ / ___/ ____ 13:30 s 15:00
Dra. Teresa C. M. Gonalves quarta-feira
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos utilizando a chave dicotmica. 15:15 s 16:45
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos atravs da chave dicotmica. 17: 00 s 18:30
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos atravs da chave dicotmica. ___ / ___/ ____ 13:30 s 15:00
Dra. Teresa C. M. Gonalves quinta-feira
Aula prtica: identificao das espcies de triatomneos atravs da chave dicotmica. 15:15 s 16:15
Outros mtodos de identificao de triatomneos: moleculares e bioqumicos. 16:30 s 18:30

Dra. Teresa C. M. Gonalves - Dra. Angela C. V. Junqueira
Avaliao dos conhecimentos tericos que foram repassados no Mdulo III ___ /___ / ____ 13:30 s 15:00
(10 questes do mdulo III) sexta-feira
Dra. Teresa C. M. Gonalves - Dra. Angela C. V. Junqueira
Avaliao prtica: identificao das principais espcies de triatomneos. 15:15 s 16:15

Correo das duas avaliaes junto com os alunos. 16:30 s 18:30

Apresentao do vdeoTriatomneos - o elo de uma enfermidade.
Encerramento das Atividades do mdulo III.
XII
Sumrio
MDULO I
INTRODUO: Doena de Chagas na Regio Amaznica . . . . . . . . . . . . . . 01
1. O Trypanosoma cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 06
1.1 Diferentes estdios evolutivos do T. cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 08
1.2 Ciclo do T. cruzi no vertebrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 Ciclo do Trypanosoma rangeli no vertebrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4 Ciclo do T. cruzi no invertebrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Ciclo do T. rangeli no invertebrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. Outra espcie de tripanosomatdeo encontrada nos triatomneos . . . . . 14
2.1 Blastocrithidia sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3. Ciclos biolgicos de transmisso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.1 Ciclo domstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.2 Ciclo peridomstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3 Ciclo silvestre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.4 Ciclo de transmisso oral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4. Diagnstico laboratorial da infeco pelo T.cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.1 Exames parasitolgicos diretos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.1 Gota de sangue examinada a fresco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.2 Distenso fina e gota espessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.3 Mtodos de concentrao de parasitas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.1.4 Informaes complementares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2 Exames parasitolgicos indiretos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.2.1 Xenodiagnstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.2.2 Hemocultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2.3 Xenocultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2.4 Inoculao em animais de laboratrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5. Emprego dos mtodos parasitolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.1 Caso suspeito de Chagas agudo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.2 Caso suspeito de Chagas congnito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
6. Diagnstico molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
6.1 Reao em cadeia da polimerase (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
6.2 PCR qualitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
6.3 PCR quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
6.4 Estudo comparativo entre a PCR e outros mtodos de deteco do T. cruzi . . . . . . 42
6.5 Vantagens e desvantagens do emprego da PCR na deteco do T. cruzi . . . . . . . . 43
7. Diagnstico sorolgico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
7.1 Diagnstico individual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
7.2 Inquritos soroepidemiolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
7.3 Avaliao das provas sorolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
7.4 Provas/testes mais utilizados atualmente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
7.4.1 Imunofluorescncia indireta - IFI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
XIII
7.4.2 Hemaglutinao indireta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
7.4.3 Ensaio imunoenzimtico - ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
7.4.4 Western-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
7.4.5 Testes de execuo simplificada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
7.5 Aplicao dos mtodos sorolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
7.5.1 Triagem de indivduos de bancos de sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
7.5.2 Triagem de indivduos de regies endmicas para realizao dos exames
parasitolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
7.5.3 Modelo de investigao epidemiolgica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
8. Complexo Trypanosoma cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
8.1 Caracterizao biolgica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
8.2 Caracterizao bioqumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
8.3 Caracterizao molecular utilizando kDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
8.4 Caracterizao molecular utilizando DNA nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
8.4.1 Tipagem pelo gene de mini-exon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
8.4.2 Tipagem pelo DNA polimrfico amplificado (RAPD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
8.4.3 Tipagem atravs das regies intergnicas dos genes ribossmicos . . . . . . . . 65
8.4.4 Tipagem por microssatlites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
8.4.5 Classificao atual por DTUs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
MDULO II
1. Mtodos parasitolgicos diretos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.1 Fundamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.2 Coleta da amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2. Protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1 Exame de sangue a fresco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1.1 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.2 Distenso fina ou esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.2.1 Confeco e colorao das distenses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.3 Gota espessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76
2.3.1 Coleta de sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
2.3.2 Protocolo de colorao 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
2.3.3 Protocolo de colorao 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3. Outros mtodos de colorao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.1 Giemsa tamponado (aps hidrlise cida) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.2 Colorao de lminas de fezes de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.3 Colorao de lminas de fezes e de tubo digestivo de triatomneos . . . . . . . . . . . 85
3.4 Tcnica de colorao de lminas de fezes baseado nos mtodos dos laboratoristas
de Tocantinpolis (TO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4. Avaliao das coloraes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.1 Esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.2 Gota espessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90
5. Procedimento bsico para exame do material corado . . . . . . . . . . . . . . . 91
6. Preparo de solues para colorao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
XIV
6.1 Soluo corante de Giemsa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
6.2 Soluo de Errecart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
6.3 Giemsa alcalino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
6.4 Composio da gua tamponada utilizada na colorao de Giemsa (pH=6,8) . . . . 93
6.5 Composio do tampo de colorao (pH=7,2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
6.6 Corantes e diluentes para o mtodo de Walker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
7. Procedimentos de exame de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
7.1 Exame das fezes de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
7.2 Exame do tubo digestivo de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
7.3 Exame da hemolinfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
7.4 Exame da glndula salivar (diagnstico diferencial com T. rangeli . . . . . . . . . . . . . 98
8. Recomendaes importantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
ANEXOS DOS MDULOS I E II

1. Morfometria do Trypanosoma cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
2. Morfologia das formas epimastigota e tripomastigota do T. cruzi . . . . . 117
2.1 Aspectos morfolgicos do T. cruzi e do T. rangeli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
2.2 Tripomastigotas encontrados em esfregaos do sangue de macacos-de-cheiro
naturalmente infectados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
2.3 Aspectos morfolgicos de formas sanguneas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
3. Portaria n 2472 de 31/08/2010 - D.O.U., 01/09/2010 . . . . . . . . . . . . . 124
4. Ficha de notificao de Doena de Chagas aguda - SINAN . . . . . . . . . . 126
5. Proposta de fluxograma para notificao de casos de infeco
por T. cruzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .128
6. Proposta de fluxograma para notificao de casos de infeco
por T. rangeli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
7. Proposta de fluxo de reviso e controle de qualidade das lminas com
amostras de sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
8. Proposta de fluxograma para conduta a partir da coleta/captura de
triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131
9. Mtodo tradicional de avaliao de parasitemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
10. Avaliao da pesquisa de DCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
10.1 Avaliao 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
10.2 Avaliao 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
10.3 Avaliao 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
11. Clculo do fator de correo de um microscpio . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
12. Clculo da fora centrfuga relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
12.1 Clculo do raio mximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
12.2 Clculo de g ou rpm a partir de duas variveis conhecidas . . . . . . . . . . . . . . . 140
12.3 Utilizando o nomograma de fora centrfuga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
12.4 Utilizando a frmula matemtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
13. Procedimento de puno digital para coleta de sangue . . . . . . . . . . . . 143
14. Montagem permanente de lminas coradas utilizando Entellan . . . 145
XV
15. Principais procedimentos de biossegurana em laboratrio de
parasitologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
15.1 Regras gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
15.2 Principais equipamentos de proteo individual (EPIs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
16. Conceitos e normas referentes desinfeco, esterilizao e limpeza . 151
17. Principais compostos desinfetantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
MDULO III
1. Estudo dos triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
1.1 Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
1.2 Posio sistemtica dos triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
2. Aspectos gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
2.1 Morfologia externa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
2.2 Conhecendo e diferenciando os gneros de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
3. Aspectos da biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
3.1 Ciclo de vida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
3.2 Resistncia ao jejum e defecao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
3.3 Disperso dos triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
3.4 Inimigos naturais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4. Aspectos da ecologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4.1 Tipos de ambiente onde os barbeiros podem ser encontrados . . . . . . . . . . . . . 176
4.1.1 Domiciliar e peridomiciliar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4.1.2 Silvestre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
5. Algumas espcies da Amaznia legal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
5.1 Ilustrao das espcies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
6. Morfologia interna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
6.1 Sistema digestivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
6.2 Sistema respiratrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
6.3 Sistema circulatrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
7. Chaves dicotnicas para identificao das espcies de triatomneos . . 190
8. Relao das espcies de triatomneos descritas ou revalidadas . . . . . . 230
9. Morfologia externa dos triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
9.1 Aspectos morfolgicos externos e nomenclatura das estruturas . . . . . . . . . . . . . 237
9.2 Ilustraes das chaves dicotnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
10. Tcnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
10.1 Captura de triatomneos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
10.2 Transporte dos insetos coletados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
10.3 Montagem dos triatomneos coletados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
10.4 Investigao entomolgica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
10.5 Disseco do inseto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
10.6 Identificao da fonte alimentar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
10.6 Material utilizado para disseco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
ANEXOS DO MDULO III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
XVI
A DOENA DE CHAGAS
NA REGIO AMAZNICA
Jos Rodrigues Coura, Carlos Jos de Carvalho Moreira, Angela C.V. Junqueira
Laboratrio de Doenas Parasitrias, Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz
Av. Brasil, 4365 Rio de Janeiro RJ 21040-360
O risco da doena de Chagas se tornar endmica na Regio

Amaznica (a maior floresta tropical do mundo, habitada por mais
de 30 milhes de pessoas) est relacionado intensa migrao de
pessoas de reas com incidncia significativa da doena, carregando
parasitos e vetores j adaptados ou pela adaptao de vetores e
animais silvestres (infectados com o Trypanosoma cruzi) ao domiclio
humano, em consequncia do desflorestamento incontrolado na
regio. A grande regio no Brasil e no conjunto dos pases amaznicos,
correspondendo a uma vasta rea de 7.702.264 km2 (Figura 1),
denominada Panamaznia.
Mais de 25 espcies de triatomneos silvestres de nove gneros e
dezenas de espcies de reservatrios j foram descritas na regio, a
maioria infectada pelo Trypanosoma cruzi.
A invaso das casas por triatomneos silvestres adultos (que vivem
em palmeiras prximas) atrados pela luz muito frequente na regio
amaznica (Figura 2).
Da mesma forma, a presena de animais silvestres, principalmente
Didelphis marsupialis, com elevadas taxas de infeco pelo T. cruzi tem
sido encontrada no peridomiclio e intradomiclio naquela regio.
Um nmero crescente de casos agudos da doena de Chagas
tem sido descrito praticamente em todos os nove pases da regio
amaznica, alguns deles em surtos epidmicos atribudos a transmisso
oral atravs de alimentos contaminados (sucos de frutas, carne mal
cozida de animais silvestres e outros alimentos contaminados).
1
Figura 1: Panamaznia. Seu territrio ocupado pelos seguintes pases: Bolvia,
Brasil, Colmbia, Equador, Guiana, Peru, Suriname, Venezuela
e o territrio ultramarino da Frana, a Guiana Francesa.
Casos crnicos da doena com cardiopatia grave tm sido

documentados, principalmente em coletores de fibra da piaava na
regio do Rio Negro, na Amaznia Brasileira.
Um programa de vigilncia que contemple os perfis de transmisso
na Panamaznia deve ser implementado de forma continuada
e uniforne nos prximos anos. consenso que em curto e mdio
prazo se evite a endemizao da doena de Chagas na regio.
Aes planejadas de controle e preveno devem ser inseridas para
2
evitar que se reproduza o perfil das reas endmicas clssicas com
estabelecimento do triatomneo no intra e peridomiclio.
Em 2004 foi criada a Iniciativa Internacional para Vigilncia e
Preveno da Enfermidade de Chagas na Regio Amaznica (AMCHA),
j tendo sido realizada a 6 reunio e diversos cursos para treinamento
de tcnicos, no reconhecimento do T. cruzi em lminas na rotina do
diagnstico de malria.
Figura 2: Habitat de triatomneos silvestres e de Didelphis

marsupialis infectados com T. cruzi na regio amaznica.
3
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216, 2006.
5
1. O Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi (Chagas 1909), um protozorio

pertencente ao filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora,
classe Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida, subordem
Trypanosomatina e famlia Trypanosomatidae.
Essa espcie de parasita desenvolve o seu ciclo de vida em
hospedeiros vertebrados (mamferos) e invertebrados (triatomneos),
onde assume estdios evolutivos diferentes (Hoare 1972). Assim como
outros Kinetoplastidas, o T. cruzi contm uma organela caracterstica,
chamada cinetoplasto. O DNA, ou KDNA, contido nessa organela
constitui-se de molculas organizadas em forma de maxicrculos e
minicrculos.
Entre os hospedeiros mamferos do T. cruzi est o homem,
no qual se desenvolve uma infeco cuja resultante a doena de
Chagas. Essa infeco autctone nas Amricas, onde se estima uma
prevalncia entre 10 a 12 milhes de pessoas infectadas.
Entre as possveis formas de transmisso do T. cruzi ao homem,
as consideradas mais importantes so a vetorial ou contaminativa
(entre 70 e 90 % dos casos), a transfusional (1 a 20 %) e a congnita
(0.5 a 10 %).
Na vetorial a contaminao ocorre por solues de continuidade
na pele ou mucosas ntegras em contato com fezes infectadas
eliminadas durante ou aps o repasto sanguneo. At a presente
data j foram descritas 141 espcies de triatomneos, potencialmente
transmissoras do T. cruzi, classificadas em 5 tribos e 15 gneros. A
transmisso transfusional pode variar entre 12,5% e 25% para cada
500 ml de sangue total transfundido, especialmente na ausncia de
controle de qualidade em bancos de sangue.
Acredita-se que a transmisso congnita ocorra principalmente
aps o segundo trimestre de gestao. Outros modos de transmisso
so: por via digestiva (oral), tipicamente em forma de surtos; acidental
6
e atravs de transplantes de rgos. Excepcionalmente, pode ocorrer
a transmisso por via sexual e por vetores no triatomneos (ex:
Cimicdeos).
O T. cruzi pode ser encontrado infectando hospedeiros nos mais
diferentes ectopos: nos desertos norte-americanos, nos altiplanos
andinos, nas florestas amaznica e atlntica e no complexo caatinga-
cerrado-pampa mido. Dentre esses ectopos, alguns albergam
outras espcies de tripanossomos (Figura 3), como o Trypanosoma
rangeli (Tejera 1920), que compartilha com o T. cruzi a capacidade de
infectar mamferos e triatomneos (Tabela 1). O T. rangeli, porm, no
patognico para o homem apesar de ser encontrado infectando o
mesmo. Esses dados devem ser considerados nos estudos envolvendo
ambas as espcies, j que compartilham formas evolutivas semelhantes.
O esquema do ciclo evolutivo e a forma de transmisso vetorial de
ambas as espcies so expostos nas pginas seguintes.
Tabela 1: Exemplos de subgneros e espcies de tripanossomas,

com a seco de desenvolvimento no vetor e tipo de
transmisso e fluido infectado segundo Hoare (1972).
7
(*) No existe consenso sobre a classificao taxonmica do T. rangeli.
Alguns autores o classificam na seco Stercoraria e outros na Salivaria,
apesar da transmisso ser principalmente inoculativa. Os autores sugerem
como leitura complementar o captulo Tripanossomase rangeli do livro
Dinmica das Doenas Infecciosas e Parasitrias. (Coura et al., 2005).
Figura 3: Origem geogrfica de 4 diferentes grupos de T. rangeli

(A , B , C , D ) identificados no estudo filogentico
de Maia da Silva, F. et al. (2004).
1.1 DIFERENTES ESTDIOS EVOLUTIVOS DO T. cruzi
O T. cruzi apresenta formas evolutivas com aspectos morfolgicos

distintos, tanto no organismo vertebrado como no inseto vetor.
A superfcie celular dessas diferentes formas constituda por
macromolculas de composio varivel, o que reflete na interao
do parasita com a clula hospedeira. Alm das trs principais formas
abordadas nas pginas seguintes, uma srie de outras formas
intermedirias podem tambm ser observadas.
8
A forma amastigota de multiplicao intracelular encontrada em
mamferos e tambm em cultivo celular (Figura 4).
Depois que os tripomastigotas invadem as clulas (por fagocitose,
endocitose ou penetrao ativa), para no serem destrudos
pelo sistema imune do hospedeiro, transformam-se nas formas
amastigotas.
Estas se localizam nas fibras musculares esquelticas, cardacas
e lisas, clulas do sistema monoctico fagocitrio, sistema nervoso
central e sistema nervoso perifrico. Em pacientes imunodeprimidos
esse tropismo pode se modificar.
Figura 4: Forma amastigota de T. cruzi: B) amastigota em um macrfago;

C) amastigota no corao; D, E) amastigotas no megaesfago.
Fotografias de Snia Gumes Andrade - CPqGM/FIOCRUZ.
9
O epimastigota a forma de multiplicao no intestino do inseto
(Figura 5). A multiplicao ocorre por diviso binria longitudinal. Essa
forma, tambm encontrada nos meios axnicos (in vitro), est presente
na fase exponencial de crescimento. Os antgenos de superfcie de
epimastigota so tradicionalmente utilizados nas provas sorolgicas
de diagnstico e como antgeno nas reaes de imunofluorescncia
indireta.
Figura 5: Forma epimastigota de T. cruzi: A) desenho;

B) epimastigota em esfregao de fezes de triatomneo.
Desenho de Bruno Eschenazi. Fotografia de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
O tripomastigota uma forma do T .cruzi que no se multiplica.

encontrado no inseto vetor (tripomastigota metacclico), no sangue
e espao intercelular e tambm na cultura de clulas. As formas
encontradas no sangue podem apresentar-se com morfologias
distintas, podendo ser classificadas como forma delgada, larga e muito
larga (polimorfismo). Na figura 6 apresentam-se exemplos da forma
larga e delgada.
Figura 6: Forma tripomastigota de T. cruzi. A) desenho;

B, C) formas larga e delgada do T. cruzi, respectivamente.
Desenho de Bruno Eschenazi. Fotografias de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
10
1.2 CICLO DO Trypanosoma cruzi NO vertebrado
O triatomneo infectado, ao sugar o sangue, deposita suas fezes
contendo formas tripomastigotas metacclicas normalmente perto
do local da picada. Essas formas penetram por uma soluo de
continuidade na pele ou atravs das mucosas ntegras. Dentro do
organismo do vertebrado, os tripomastigotas invadem diferentes
tipos de clulas, transformando-se em amastigotas. O parasita tem
tropismo por clulas musculares estriadas e lisas, macrfagos e
tambm por clulas epiteliais e fibroblastos. As formas amastigotas
dividem-se por diviso binria, formando pseudocistos que se
rompem. Dentro destes pseudocistos, os amastigotas transformam-
se em tripomastigotas que so liberados, aps a ruptura da clula,
atingindo a circulao sangunea, indo infectar novas clulas (Figura
7 A).
1.3 CICLO DO Trypanosoma rangeli NO vertebrado

At hoje no conhecida a forma e o local da multiplicao
do parasita nos hospedeiros vertebrados. No homem a infeco
considerada benigna e pode persistir por at um ano e meio sem
manifestaes clnicas. De forma excepcional, em 1951, o Dr. Torrealba
(apud Pessoa, S. B.), em seus estudos na Venezuela, relatou casos
agudos da infeco no homem, descrevendo sintomas equivalentes
infeco por T. cruzi, como febre, poliadenite, hepatoesplenomegalia
e anemia (Figura 7 B).
1.4 CICLO DO T. cruzi NO Invertebrado

O inseto vetor pica os hospedeiros vertebrados infectados,
sugando tripomastigotas presentes na corrente sangunea. As formas
tripomastigotas transformam-se em epimastigotas e esferomastigotas,
medida que migram pelas diferentes pores do intestino do inseto. As
formas epimastigotas colonizam preferencialmente o intestino mdio.
Neste local, as formas epimastigotas multiplicam-se intensamente
por diviso binria. Aps ocorrer a adeso do parasita ao epitlio,
atravs do flagelo, alguns desses epimastigotas transformam-se em
11
Figura 7: Esquemas representativos dos ciclos
de vida do T. cruzi (A) e do T. rangeli (B).
Figura adaptada de REY, L. Parasitologia. 3 ed.: Guanabara Koogan, 2001, por
Bruno Eschenazi, Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
tripomastigotas na poro final do tubo digestivo (ampola retal). As

formas resultantes dessa transformao, denominada metaciclognese,
so denominadas tripomastigotas metacclicas (formas infectantes),
que so encontradas principalmente no reto do inseto vetor. As formas
esferomastigotas tambm podem transformar-se diretamente em
formas metacclicas. As formas infectantes so eliminadas com as fezes
ou com a urina, quando o inseto pica novamente um outro indivduo,
pois esses insetos tm o hbito frequente de defecar durante ou logo
aps o repasto sanguneo. O processo de metaciclognese ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor. Este fenmeno regulado
pela interao de produtos da secreo intestinal e por produtos
derivados da digesto do sangue ingerido (Carvalho-Moreira et al.,
2003),assim como pela falta destes ltimos (reduo de nutrientes),
pois os triatomneos por vezes podem ficar privados de alimentao
por muito tempo na natureza. A metaciclognese pode tambm ser
conseguida in vitro, em condies qumicas definidas atravs do
estresse nutricional, atravs da incubao em um meio de diferenciao
artificial denominado TAU 3AAG, por exemplo.
12
1.5 CICLO DO T. rangeli NO Invertebrado
O T. rangeli foi descrito pela primeira vez na Venezuela, em 1920
(Tejera, 1920), como sendo uma espcie de parasita encontrada
exclusivamente na Amrica Central e na Amrica do Sul, onde
apresenta maior prevalncia na primeira e no Noroeste da Amrica do
Sul. Compartilha hospedeiros mamferos e vetores com o T. cruzi. A
primeira descrio de infeco humana comprovada no Brasil foi feita
por Coura et al., em 1996. Em condies naturais, o triatomneo ingere
o sangue de algum mamfero infectado com as formas tripomastigotas
sanguneas. Essas se transformam em epimastigotas na parte mdia
do trato digestivo do triatomneo. O T. rangeli consegue atravessar o
epitlio do intestino do barbeiro, invadindo a hemolinfa. Uma vez na
hemolinfa, ativa o sistema de defesa do inseto. Quando consegue
escapar deste sistema de defesa, o parasita atinge as glndulas
salivares, onde realiza a metaciclognese, transformando-se na
forma tripomastigota metacclica infectante, que ser transmitida a
outro mamfero pela picada. A seguir, so mostradas a anatomia do
tubo digestivo do triatomneo e a morfologia das principais formas
evolutivas do T. cruzi e do T. rangeli no inseto vetor (Figuras 8A, 8B e
8C).
13
Figura 8: Anatomia interna do triatomneo (A) e principais formas
evolutivas do T. cruzi (B) e T. rangeli (C) no inseto vetor.
Figuras desenhadas por Bruno Eschenazi, elaboradas por
Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
2. OUTRA ESPCIE DE TRIPANOSOMATDEO ENCONTRADA

NOS TRIATOMNEOS
2.1 Blastocrithidia sp
Alguns triatomneos capturados no campo podem albergar

naturalmente o tripanossomatdeo monogentico Blastocrithidia sp. A
forma de transmisso ocorre quando um inseto se alimenta das fezes
de outro inseto (coprofagismo-CO) ou quando ele se alimenta em outro
inseto (canibalismo-CA), porm na natureza isso no frequente. As
possibilidades de contaminao aumentam quando os triatomneos
so mantidos em reas restritas, como ocorre nos insetrios, quando
o jejum prolongado. Nessas situaes eles tendem a praticar a
coprofagia e possivelmente o canibalismo, o que facilita o processo
de transmisso. As figuras 9 e 10 demonstram respectivamente o ciclo
evolutivo e formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.
14
Figura 9: Ciclo da Blastocrithidia sp.
Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi, Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira
do site: http//:parasitology.informatik.uniwuerzburg.de/login/n/h/0163.html).
Figura 10: Formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.

Foto de Angela C. V. Junqueira.
15
3. CICLOS BIOLGICOS DE TRANSMISSO
Segundo Dias (1958) e Forattini (1980), o ciclo primitivo do T.

cruzi de natureza enzotica, circulando o parasita entre vetores e
reservatrios silvestres (Figura 11). A doena de Chagas humana
uma situao recente, causada pelo crescimento e disperso da
populao humana com a consequente aproximao dos locais onde
existe esse ciclo.
Podemos dizer que a doena de Chagas foi e continua sendo
uma endemia basicamente rural, de populaes de baixa renda e de
pouca cultura, que vivem em condies precrias, onde ela no foi
erradicada, favorecendo a domiciliao de algumas espcies vetoras,
dando origem ao chamado ciclo domstico do parasita. Entretanto,
esse quadro vem se modificando com o sucesso de alguns programas
de controle.
Figura 11: Ciclos biolgicos do Trypanosoma cruzi.

Ref: Pessoa, S. 1962. Domiciliao dos triatomneos e epidemiologia da doena de Chagas.
Arq. Hig. Sade Pub. 27 (92): 161-171.
16
Outros perfis tm sido descritos. Triatomneos silvestres podem
infectar o homem e os animais domsticos em seu habitat natural,
levando ao aparecimento de casos ocasionais da doena de Chagas,
denotando a no necessidade de triatomneos domiciliados para que
ocorra a transmisso vetorial.
As pginas seguintes ilustram diferentes modelos de ciclos
biolgicos do T.cruzi e algumas das principais espcies de triatomneos
existentes na Regio Amaznica. Nos ltimos anos vem merecendo a
ateno o nmero crescente de casos agudos na regio onde no
tm sido descritas espcies domiciliadas com exceo do Triatoma
maculata.
3.1 CICLO DOMSTICO

Os triatomneos, que so insetos estritamente hematfagos,
podem encontrar em algumas habitaes humanas as condies
ideais de sobrevivncia, possuindo abrigo e oferta alimentar, tornando-
se insetos domiciliados (Figura 12A). Esse fenmeno (domiciliao)
tornou a transmisso vetorial o principal mecanismo primrio da
propagao da doena de Chagas. A domiciliao e a colonizao
mostraram-se eficientes para certo nmero de espcies, como por
exemplo, o Triatoma infestans no Brasil.
3.2 CICLO PERIDOMSTICO

Algumas espcies de triatomneos podem assumir uma biologia
especial, adaptando-se a viver em reas em torno das habitaes
humanas, como telheiros, stos, chiqueiros, galinheiros etc, nutrindo-
se do sangue de animais domsticos, conforme o exemplo da Figura
12 B. No Brasil, entre as principais espcies de tritomneos encontradas
neste modelo de ciclo biolgico, podemos citar o Triatoma sordida e
T. pseudomaculata.
importante ressaltar que uma mesma espcie pode ser encontrada
tanto no domiclio como no peridomiclio.
17
Figura 12: Ciclos biolgicos domstico (A) e peridomstico (B) do T. cruzi.
Desenho de Bruno Eschenazi e Angela C.V. Junqueira.
3.3 CICLO silvestre

O aparecimento da doena de Chagas ocasional, como demonstrado
em algumas reas da Regio Amaznica, vem sendo verificado entre os
trabalhadores que extraem as fibras da palmeira Leopoldinia piassaba.
Esses trabalhadores ficam expostos ao contato com triatomneos da
espcie Rhodnius brethesi, denominados localmente de piolhos da
piaava, que habitam a referida palmeira. Esse contato contnuo,
uma vez que o extrativista fixa sua moradia perto do local de extrao.
A Figura 13 demonstra possveis formas de infeco do homem

no ambiente silvestre pelo T. cruzi: por exposio ao vetor durante
o trabalho de extrao da fibra (Figura 13A) ou pela exposio
picada durante noite em colocaes, nos locais de acampamento
(Figura 13B).
18
Figura 13: Ciclo biolgico do T. cruzi, em reas de extrativismo da
Regio do Mdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil (A, B).
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-
Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
19
3.4 CICLO DE TRANSMISSO ORAL
A transmisso por via oral acontece pela ingesto de alimentos
contaminados com o parasito. Essa contaminao pode ser natural ou
externa. A natural ocorre pela ingesto de carne crua ou mal cozida
de animais infectados, ou pelo leite materno (situao espordica
e rara); a contaminao externa ocorre pela deposio de fezes ou
urina de triatomneos sobre o alimento ou mesmo de secreo anal
de marsupiais infectados.
Segundo Barreto (1979), esse tipo de transmisso (oral) usual
entre os mamferos do ciclo silvestre da tripanossomase americana,
que ingerem triatomneos ou a carne de mamferos infectados. Com
relao ao homem no havia muitos relatos na literatura, porm a
partir da ltima dcada vrios casos tm sido descritos na Amaznia
brasileira, grande parte deles atribudos ingesto de suco de frutos
de palmeiras contaminados com a forma infectante do T.cruzi, oriunda
de triatomneos infectados (Tabela 2). S na Amaznia brasileira j
foram descritas 25 espcies de triatomneos (Aguilar et al., 2007),
estando algumas delas representadas na pgina seguinte (Figura 14).
No ciclo biolgico a seguir, est representado o possvel modelo
de transmisso oral ocorrido no municpio de Mazago, no Estado
do Amap, onde foram registrados 17 casos de infeco aguda de
doena de Chagas. Valente et al. (2009) atriburam a provvel fonte de
infeco ao suco de aa preparado em mquina eltrica, possivelmente
contaminada com fezes ou tubo digestivo de triatomneos infectados
(Figura 15).
Em maro de 2005, ocorreu um surto da doena em Santa Catarina,
onde os dados epidemiolgicos, levantados por tcnicos do Ministrio
da Sade e da Secretaria Estadual de Sade, indicavam que a nica
fonte de infeco comum seria a ingesto de caldo de cana contendo
formas infectantes do T. cruzi. Os trabalhos de campo sugeriram que
a contaminao tenha ocorrido durante a moagem da cana-de-acar
junto com inseto vetor infectado, vindo da mata prxima ao local de
processamento do caldo.
20
Figura 14: Algumas espcies vetoras da Regio Amaznica.
Fotos: Rodrigos Mxas e Marco Aurlio P. da Silva. Layout: Rodrigos Mxas.
21
Figura 15: Ciclo biolgico do T. cruzi em outra rea da Regio Amaznica.
Fonte: boletim Informativo sobre vigilncia epidemiolgica da doena de Chagas
FUNASA- Instituto Evandro Chagas.
Tabela 2: Casos de Doena de Chagas Aguda no Brasil de 2007 a 2010.
Fonte: SVS/MS. Dados sujeitos modificao. Dados atualizados at agosto de 2011.

http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto.cfm?idtxt=31454
22
4. DIAGNSTICO LABORATORIAL DA INFECO PELO
Trypanosoma cruzi
Segundo Luquetti & Rassi (2000): ... o diagnstico da infeco

pelo T. cruzi deve ser apoiado pela epidemiologia, pela clnica e
confirmado quanto etiologia, pelo diagnstico laboratorial que
oferece importantes subsdios, desde que realizados com tcnicas
apropriadas, reagentes adequados e seguindo as boas prticas de
laboratrio.... Podemos tomar isso como uma norma a ser seguida.
Dentro do conhecimento geral do curso da infeco, imprescindvel
que fique consolidado o conceito de que a infeco pelo T. cruzi
no homem apresenta duas fases. A fase inicial ou fase aguda
caracterizada pela relativa facilidade com que se evidencia o parasito
no sangue perifrico, com manifestaes clnicas gerais de porta de
entrada do parasito; tais manifestaes so caractersticas e conduzem
suspeita imediata de uma infeco aguda, e que se confirma com
a deteco do parasito no sangue. importante ressaltar que nem
sempre essas manifestaes se fazem presentes. Em contraste, na fase
seguinte, ou fase crnica, ocorre a diminuio do nmero de parasitos
na corrente sangunea, sendo por isso difcil seu encontro no exame
parasitolgico direto. Neste caso, utilizam-se mtodos parasitolgicos
indiretos e de enriquecimento, que demonstram maior sensibilidade
que os diretos e que permitem o isolamento do parasita para estudos
de identificao e caracterizao. Na fase crnica ocorre um perodo
de latncia clnica, na maioria dos casos, cujas manifestaes podem
aparecer anos aps a infeco (Prata, 1968; Dias & Macedo, 2005).
O diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi pode ser

dividido, didaticamente, em 3 categorias: parasitolgicos, moleculares
e sorolgicos. Alguns autores dividem em apenas dois grupos:
parasitolgicos e sorolgicos.
Os mtodos parasitolgicos baseiam-se na demonstrao do
parasito sob a forma de tripanossoma no sangue e outros lquidos
orgnicos, ou ento sob a forma de leishmania (amastigotas) nos
23
tecidos. Segundo o procedimento, esses mtodos so classificados
em diretos e indiretos, conforme mencionado anteriormente.
Recentemente, com o surgimento da tecnologia da PCR (Polymerase
Chain Reaction), um grande avano foi conseguido no diagnstico dos
agentes infecciosos. No final da dcada de 80, vrios ensaios surgiram
utilizando a PCR na deteco do T. cruzi, ficando demonstrada a sua
maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos clssicos.
A PCR consiste na sntese enzimtica, in vitro, de milhes de cpias de
uma sequncia especfica de DNA do patgeno.
A outra linha de procedimentos adotados a dos mtodos

sorolgicos, que tm como princpio a ligao antgeno (Ag)-anticorpo
(Ac), cuja ligao pode ser revelada por protocolos com fundamentos
tcnicos distintos.
A grande maioria dos testes utilizados na rotina baseia-se na

pesquisa de Acs no soro ou plasma, sendo bem menos usual a deteco
de Ags. Seu emprego no diagnstico da infeco bem abrangente, o
que se deve em grande parte a sua elevada sensibilidade, otimizao
e custos relativamente baixos em relao aos outros mtodos, sendo
o mtodo laboratorial de escolha nas triagens de doadores de sangue
e inquritos epidemiolgicos.
fundamental que fique bem compreendido que A DCA corresponde

ao perodo inicial da infeco pelo Trypanosoma cruzi em mamferos,
podendo apresentar-se aparente ou inaparente. Define-se basicamente
pela alta parasitemia detectvel por exames parasitolgicos diretos
do sangue, tendo durao geralmente efmera no ser humano (entre
trs e oito semanas), podendo ser letal em crianas de baixa idade e
indivduos imuno-comprometidos ou evoluir para uma forma crnica
de longa durao que se caracteriza por baixssima parasitemia e
um elevado e consistente teor de anticorpos da classe IgG (Figura
16). Desta forma, o mtodo de escolha para o diagnstico estar
condicionado fase da infeco apresentada pelo indivduo.
24
Figura 16: Curva parasitmica nas fases aguda e crnica da doena de Chagas.
Fonte: Manual Prtico de Subsdeo Notifio Obrigatria no SINAN, disponvel no
site http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf
4.1 EXAMES PARASITOLGICOS DIRETOS

Demonstram a presena da infeco atravs da visualizao dos
parasitos ao microscpio ptico. Tm alta especificidade e sensibilidade
na fase inicial da infeco (casos agudos) e muito baixa sensibilidade
nos casos crnicos.
4.1.1 GOTA DE SANGUE examinada A FRESCO
Pesquisa direta do parasito na amostra biolgica, sem submet-
lo a processos de fixao e colorao. O sangue colocado entre
a lmina e a lamnula e examinado ao microscpio ptico com o
aumento de 400 vezes (400 x). Os parasitos so visualizados pelos
seus rpidos movimentos por entre as hemcias, que so por eles
deslocadas (Luquetti & Rassi, 2000).
4.1.2 DISTENSO FINA E GOTA ESPESSA
Como no mtodo anteriormente citado, a tcnica baseia-se na
pesquisa direta do parasita na amostra clnica, que submetida a
processos de fixao e colorao. O sangue pode ser coletado por
puno venosa ou digital, de preferncia sem o anticoagulante, que
25
altera a fixao do material. As tcnicas que empregam colorao
permitem a caracterizao morfolgica do T. cruzi e a sua diferenciao
do Trypanosoma rangeli, sendo importante sua utilizao onde as
duas espcies so encontradas coabitando. Nesse exame poderemos
encontrar diferentes formas de T. cruzi presentes no sangue perifrico
(Figura 17).
Figura 17: Exemplo de diferentes formas tripomastigotas de T.cruzi presentes no

sangue de camundongos infectados experimentalmente (polimorfismo):
A) formas finas; B) formas largas; C) formas muito largas.
Fonte: Brener Z., Chiari E. Variaes morfolgicas observadas em diferentes amostras de
Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 5, p. 220-224, 1963.
4.1.3 Mtodos de concentrao de parasitas

So mtodos que permitem a investigao direta do parasita
na amostra clnica concentrada por centrifugao. Entre os mais
empregados na rotina laboratorial esto o micro-hematcrito
(Secretaria Nacional de Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade.
Doena de Chagas Aguda: Manual prtico de Subsdio Notificao
Obrigatria no Sinan- http://portal.saude.gov.br/saude/), o mtodo
de pesquisa do parasita no creme leucocitrio (Rey, L. Mtodos e
tcnicas usuais em parasitologia. In: Parasitologia. 3 Ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001. p.788) e o mtodo de concentrao de
Strout (Strout, 1962).
26
No MTODO DE MICRO-HEMATRCRITO examina-se o sangue do
paciente com anticoagulante, aps centrifugao, em um microtubo
capilar.
Para tal, o sangue pode ser coletado inicialmente em tubo coletor
com EDTA ou heparina e ento transferido, por capilaridade, para
um microtubo capilar seco. O sangue pode ser tambm coletado,
por puno digital, empregando o prprio microtubo capilar com
anticoagulante.
Deve-se preencher, aproximadamente, 2/3 do microtubo por
capilaridade. Para isso, inclinar com cuidado o tubo contendo o
sangue e introduzir uma das extremidades do microtubo no interior
do mesmo; o sangue entrar por capilaridade. Sugerimos encher pelo
menos dois microtubos por amostra suspeita.
Aps o preenchimento, limpar externamente, com papel
absorvente, o lado do microtubo que entrou em contato com o sangue.
Aps a limpeza, o lado do microtubo que ficar mais distante do
centro do rotor da centrfuga dever ser vedado/selado com massa
selante apropriada. Durante esse processo, fechar a extremidade
oposta do microtubo com o dedo; isso evitar que o sangue escorra na
massa durante o procedimento de vedao. A seguir, pressionar uma
das extremidades do microtubo na massa selante em movimento de
rotao, preenchendo 0,3 - 0,5 cm do microtubo com massa.
Depois de vedado, o microtubo deve ser transferido para uma
microcentrifuga apropriada e centrifugado por 5 a 10 minutos a
160 g (Figuras 18A e B). Colocar o capilar na centrfuga de micro-
hematcrito com a extremidade vedada para o lado externo. Os
microtubos devem estar balanceados, ou seja, um microtubo capilar
em posio oposta ao outro. Imediatamente aps a centrifugao,
o tubo deve ser levado ao microscpio onde examina-se o creme
leucocitrio (interface entre as camadas de plasma e hemcias),
empregando aumento de 100x (Figuras 18 C e D). Outra opo ,
com cuidado e utilizando equipamentos de proteo individual para
27
evitar contaminao acidental, quebrar o microtubo na regio prxima
ao creme leucocitrio e retir-lo para exame entre lmina e lamnula
com aumento de 400x. Frente a casos suspeitos com exame inicial
negativo, o mtodo deve ser repetido em horrios diferentes durante
alguns dias (WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional de
Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda:
Manual Prtico de Subsdio Notificao Obrigatria no Sinan).
Figura 18: Centrfuga de microhematcrito (A, B), microcapilar aps a

centrifugao (C), microcapilar montado em lmina para exame
ao microscpio e destaque da rea a ser examinada (D).
Fotografias de Carlos Jos de Carvalho Moreira e desenhos de Bruno Eschenazi.
No MTODO DE STROUT, coleta-se 5 a 10 ml de sangue sem

anticoagulante e faz-se uma dupla centrifugao. Aps a primeira
centrifugao a 160 g por 3 minutos, o sobrenadante separado sendo
novamente centrifugado a 400 g por 20 min. O sedimento resultante
ento examinado entre lmina e lamnula com aumento de 400x.
(WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional de Vigilncia
em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda: Manual
prtico de Subsdio Notificao Obrigatria no Sinan).
28
Na busca de um protocolo para exame do CREME LEUCOCITRIO,
utilizado na rotina de deteco de T.cruzi no sangue, nos foi enviado
o empregado pelo Laboratrio Central de Sade Pblica (LACEN) do
estado do Par (Email: lacen@sespa.pa.gov.br). Nesse protocolo, o
sangue (10 ml) coletado em tubos com anticoagulante e centrifugado
a 1500 r.p.m. por 10 minutos (Rey, 2001). Logo aps a centrifugao,
retira-se, inicialmente, empregando-se uma pipeta, toda a camada
superior de plasma, mantendo no tubo a interface fina que contm
os glbulos brancos e a camada de clulas sanguneas vermelhas
inferior. Aps a retirada do plasma, com o auxlio de uma outra pipeta,
coleta-se a camada mais clara de glbulos brancos (creme leucitrio
ou buffy coat), tendo o cuidado para no pipetar junto a camada
de clulas sanguneas vermelhas. Esse creme leucitrio poder ser
diretamente examinado entre lmina e lamnula com aumento de
400x ou utilizado para a confeco de um ou mais esfregaos que
sero desemoglobinizados e fixados. Neste caso, aps a fixao, cora-
se pelo Giemsa (1ml de gua tamponada + 2 gotas de corante) durante
25 minutos. Por ltimo, a lmina lavada com gua tamponada e
deixada para secar na temperatura ambiente. A(s) lmina(s) corada(s)
dever(o) ser examinada(s) no microscpio ptico com aumentos
de 400x e 1000x (lente de imerso).
O LACEN do estado da Bahia (Email: lacen.diretoria@bahia.ba.gov.
br ou lacen.copram@bahia.ba.gov.br) tambm utiliza a tcnica citada
anteriormente, porm, recomenda no caso de resultado negativo (e
de disponibilidade de material), transferir o creme e o sobrenadante
para outro tubo e centrifugar a 1800-2000 r.p.m. durante 5 minutos.
Fazer um novo esfregao e seguir o mesmo procedimento em relao
colorao e exame microscpico.
Existem tambm outros mtodos, como o QBC (Quantitative
Buffy Coat) e o mtodo de concentrao em gradiente de Ficoll-
Hypaque.
29
O MTODO DO QBC consiste na concentrao dos parasitos pela
centrifugao do sangue, em tubos de micro-hematcrito, combinada
com a colorao dos cidos nucleicos do parasito pelo fluorocromo
denominado Laranja de Acridina. um teste de alto custo por envolver
microscopia fluorescente e tubos previamente preparados com
anticoagulante e corantes especiais. Em estudo experimental usando
a tcnica do QBC, Amato Neto e colaboradores (1996) detectaram o
T. cruzi em camundongos, na fase aguda da infeco, at uma diluio
do sangue de 1/10.000. Os equipamentos necessrios realizao do
exame esto representados a seguir (Figura 19).
Figura 19: Equipamentos e materiais utilizados na Tcnica do QBC (A-D).

Fonte: sites www.qbcdiagnostics.com e www.labessentials.com/Lumin_fluorescence_microscopy.htm
O MTODO DE CONCENTRAO DE FICOLL-HYPAQUE se baseia

na centrifugao de sangue heparinizado (6 ml) em gradiente de
Ficoll-Hypaque (3 ml) (Budzko & Kierszenbaum, 1974). Consiste na
centrifugao do sangue com anticoagulante a 400 g durante 20 min.
Como o Ficoll possui uma densidade maior que a dos linfcitos, porm
menor que os glbulos vermelhos e granulcitos, aps a centrifugao
os glbulos vermelhos e os polimorfonucleares passam pelo Ficoll
formando um pellet no fim do tubo. As clulas mononucleares ficam na
interface entre o plasma e o Ficoll, junto camada de mononucleares,
onde o parasito dever ser pesquisado (Figura 20).
Os mtodos de concentrao tm sido empregados com sucesso
na suspeita de casos agudos de reativao da infeco (Sartori et al.,
1995; Sartori et al., 1998; Galhardo et al., 1999; Santos et al., 2002 e
Oliveira et al., 2010).
30
Figura 20: Fundamento do mtodo de concentrao de Ficoll-Hypaque..
Esquema de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
4.1.4 INFORMAES COMPLEMENTARES:
4.1.4.1 DETECO DIRETA DO T. cruzi NO LQUIDO

CEFALORRAQUIDIANO
Em pacientes com co-infeco Chagas-HIV e pacientes chagsicos
imunocomprometidos por terapia supressiva, que apresentem sinais
e sintomas de reagudizao da infeco, a pesquisa parasitolgica
direta de T. cruzi no deve se restringir apenas ao sangue perifrico,
mas ser tambm realizada no lquido cefalorraquidiano (Figura
21). importante alertar que, para se obter amostra de lquido
cefalorraquidiano, necessrio um profissional qualificado e
experiente. Casos agudos, com envolvimento do Sistema Nervoso
Central (SNC), tambm requerem amostras biolgicas diferenciadas e
a realizao de exames complementares de diagnstico. Uma srie de
artigos na literatura tem relatado a presena de T. cruzi por mtodos
parasitolgicos diretos e indiretos realizados de amostras obtidas por
puno medular.
31
Figura 21: Formas tripomastigotas de T.cruzi no fluido cerebroespinhal.
Fonte: Oliveira, L R; Assis, L L T; Maltos, A L; Cali, M C F R; Moraes-Souza, H. Reativao da doena de
Chagas com envolvimento do sistema nervoso central durante tratamento de linfoma no Hodgkin.
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 32(3):269-272; 2010.
4.1.4.2 CONSERVAO DAS AMOSTRAS AT O ENVIO

SORO: 2 a 8C (geladeira), at 5 dias; -20C (freezer), at 15 dias.
EXAME PARASITOLGICO: as lminas devem ser enviadas aps
o esfregao ou a gota espessa estarem secos. Devero conter os
dados de identificao do paciente. As lminas no fixadas devem ser
enviadas at 24 horas; As fixadas devem ser enviadas at 7 dias aps a
confeco. Enviar temperatura ambiente. Para maiores informaes
consultar o Manual de coleta, acondicionamento e transporte de
material biolgico para exames laboratoriais da FUNED, no link:
<http://funed.mg.gov.br/wpcontent/uploads/2011/11/manual_
transporte_coleta_2011.pdf>.
4.1.4.3 CONVERSO DE g EM r.p.m.
Como as centrfugas mais antigas no permitem fazer a converso
de g em r.p.m. e vice-versa, no prprio equipamento, elaboramos um
exerccio para que o tcnico do laboratrio possa fazer essa converso
(Vide pginas 140-142 dos ANEXOS DOS MDULOS I E II).
32
4.2 EXAMES PARASITOLGICOS INDIRETOS
Os mtodos parasitolgicos indiretos, ou de enriquecimento,
costumam ser empregados na fase crnica da infeco, onde a
pobreza de formas tripomastigotas no sangue perifrico torna difcil a
demonstrao diretamente na amostra biolgica. Essa deteco pode
ser realizada por 4 mtodos indiretos: xenodiagnstico, hemocultura,
xenocultura e inoculao em animais de laboratrio.
4.2.1 XENODIAGNSTICO (Brumpt, 1914)
Seu resultado depende diretamente da espcie de triatomneo
empregada e do nmero de ninfas utilizadas (Dias, 1940; Schenone
et al., 1969; Cerisola et al., 1974; Borges-Pereira et al., 1996).
Tem sensibilidade de 13% at 50% em indivduos sorologicamente
positivos, na fase crnica da infeco. empregado como mtodo
confirmatrio no acompanhamento laboratorial de pacientes
chagsicos (Castro et al., 1983) e na avaliao teraputica na infeco
chagsica crnica (Canado et al., 1969).
O xenodiagnstico pode ser direto (tradicional - in vivo) ou indireto
(artificial - in vitro). No xenodiagnstico direto, 40 exemplares de
triatomneos, de uma determinada espcie, so acondicionados em
quatro pequenas caixas de madeira ou de plstico. As caixas so cobertas
com fil ou morim (para permitir a alimentao dos insetos) e estes
tecidos so fixados com elsticos. Essas caixas devem ser devidamente
identificadas com os dados do paciente. Na sequncia, as caixas so
colocadas diretamente sobre a pele do paciente, para a alimentao
dos insetos, conforme a sequncia de fotografias a seguir (Figura 22).
No xenodiagnstico indireto, os triatomneos ingerem o sangue
(coletado com anticoagulante) do hospedeiro vertebrado por meio de
uma mamadeira de vidro ou frascos de modelos diversos (Nicolle &
Woff, 1943; Rutledge et al., 1964). Os frascos so revestidos com uma
fina membrana natural ou artificial que permite o contato da pea bucal
do inseto com o sangue contido no mesmo (Figura 23). importante
que este sangue seja mantido aquecido a 37C para permitir a atrao
do triatomneo pelo calor (termotropismo). Como membrana artificial
33
utiliza-se normalmente um pedao de preservativo, sem lubrificante,
lavado previamente com gua destilada e seco. No xenodiagnstico
indireto evita-se a reao alrgica picada do inseto.
Figura 22: Montagem das caixas para o xenodiagnstico direto (A, B)

e aplicao do xenodiagnstico direto (C, D).
Fotografias de Rodrigo Mxas (A, B) e Carlos Jos de C. Moreira (C, D).
Figura 23: Xenodiagnstico indireto (A, B).

Fotografias cedidas pelo Dr. Rodolfo A. Devera.
34
Aps a alimentao sangunea devemos verificar e selecionar
apenas as ninfas que se alimentaram (as que apresentam o abdmen
distendido, independente do grau de distenso), colocando-as em um
recipiente maior. O exame das ninfas dever ser realizado aos 45 ou
60 dias aps a alimentao, de acordo com o procedimento padro
adotado no laboratrio. At a leitura, os insetos podero ser mantidos
a temperatura ambiente. Na metade do perodo de tempo entre a
alimentao e o exame, as ninfas devero receber uma alimentao
suplementar de sangue, que poder ser feita em galinha (Gallus
gallus). Esta alimentao importante para a manuteno do T.
cruzi no inseto.
A tcnica utilizada para o exame dos triatomneos est descrita nas
pginas 96/97 do mdulo II.
4.2.2 HEMOCULTURA (Chagas, 1909)
outro procedimento indicado na deteco do T. cruzi na fase
crnica da infeco. Ele se baseia no cultivo da amostra clnica coletada
(sangue, lquor, etc.) contendo o parasito, em meios de cultura
enriquecidos. So utilizados aproximadamente 30 ml de sangue
centrifugado a 4C, sendo o sedimento semeado em tubos com meio
LIT (Liver Infusion Tryptose). Os tubos semeados so incubados
temperatura de 28C, em estufa incubadora de BOD (Chiari & Dias,
1975; Luz et al., 1994). A leitura do exame feita aos 30, 60, 90
e 120 dias aps o cultivo. Aos 120 dias (ltimo exame) realizada
uma centrifugao para exame do sedimento (pellet). A sensibilidade
desse mtodo de cerca de 30% at 79% (varivel e nem sempre
reprodutvel). Este mtodo deve ser o escolhido quando se deseja
isolar o parasito para estudos bioqumicos, biolgicos e moleculares.
4.2.3 Xenocultura
A xenocultura (Bronfen et al., 1989) a semeadura do tubo
digestivo ou fezes do triatomneo em meio LIT. Esse procedimento
possibilita o isolamento de cepas de T. cruzi e controla a qualidade
dos xenodiagnsticos realizados.
35
Como no representa um acrscimo significativo na positividade
dos exames, sugere-se seu uso apenas para controle de qualidade
na avaliao dos xenodiagnsticos. Inicialmente faz-se a esterilizao
externa do triatomneo em Soluo de White, por aproximadamente 1
hora. Posteriormente, retira-se o tubo digestivo do inseto (podendo-
se fazer um pool de alguns insetos), macera-se o contedo e faz-se
a semeadura em meio LIT, contendo antibitico (tudo dentro de uma
capela de fluxo laminar). Incuba-se a 28C e examina-se, pela primeira
vez, aps 20 dias. O procedimento de retirada do tubo digestivo o
mesmo empregado no xenodiagnstico direto e indireto.
Soluo Esterilizante de White: 0,25 g de HgCl2

6,50 g de NaCl
25 ml de HCl concetrado
250 ml de Etanol a 5%
750 ml de H2O
Fonte: Bronfen et al. Isolamento de amostras do Trypanosoma cruzi por xenodiagnstico e hemocultura de
pacientes na fase crnica da doena de Chagas. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz,
v. 84, n. 2, p. 237-240, 1989.
4.2.4 inoculao em animais de laboratrio

A inoculao em animais, dos mtodos anteriormente relatados,
o procedimento menos usual, sendo mais utilizado nos estudos de
patogenicidade das populaes ou clones do T. cruzi. Isso se deve
baixa eficcia do mtodo como demonstrado por alguns autores
(Freitas, 1947). importante ressaltar que este tipo de procedimento
dever ser submetido s Comisses de tica de animais (Figura 24).
Figura 24: Inoculao intraperitoneal

em camundongo.
Fotografia de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
36
5. EMPREGO DOS MTODOS PARASITOLGICOS
Esquema prtico do procedimento diagnstico frente a um caso
suspeito de Doena de Chagas (Ministrio da Sade do Brasil).
5.1 Caso Suspeito de Chagas Agudo

Realizar exame a fresco imediato, repetindo 3 a 4 vezes ao dia durante
alguns dias;
Procurar enriquecer a pesquisa, realizando concomitantemente a
tcnica de micro-hematcrito;
Se no dispuser de microscpio no local, pode-se colher gota espessa
para exame em municpio vizinho, num esquema similar ao do exame
a fresco;
Colher sangue venoso (ou capilar, em papel de filtro) para realizar
imediatamente a pesquisa usual de anticorpos da classe IgG por
tcnicas convencionais, repetindo este exame 3 semanas aps. Uma
viragem do resultado indicar doena aguda;
Pesquisar anticorpo anti T. cruzi da classe IgM (com restries).
5.2 Caso Suspeito de Chagas Congnito

Efetuar a pesquisa direta (ou por micro-hematcrito) do parasito no
cordo umbilical ou venoso (criana), repetindo como relatado no
quadro anterior;
Realizar sorologia convencional para pesquisa de IgG anti T. cruzi
na criana. Repetir a sorologia aos seis ou sete meses de idade a
qual, sendo positiva, sugestiva de doena de Chagas congnita (ou
recentemente transmitida por outra via).
OBS: Os procedimentos anteriormente descritos esto no Manual Prtico

de Subsdio Notificao Obrigatria no SINAN do Minstrio da Sade.
Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf
37
6. DIAGNSTICO MOLECULAR
Tem como alvo a deteco do DNA (cido desoxirribonucleico) e o

RNA (cido ribonucleico) do patgeno. Esta estratgia de diagnstico
tem duas grandes vantagens: no depender da imunocompetncia
do organismo infectado e do tempo de infeco como nos testes
sorolgicos, bem como s detectar o DNA na presena do patgeno
no fluido biolgico, pois esta molcula no permanece livre por muito
tempo no organismo infectado.
6.1 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

um mtodo de sntese enzimtica, in vitro, que permite a
obteno de milhes de cpias de sequncias de DNA. Baseia-se
na programao de ciclos repetitivos de desnaturao, hibridao e
extenso, conseguidos atravs de alteraes sucessivas de temperatura
(Figura 25). A sensibilidade do teste depende, em grande parte, do
nmero de repeties dos segmentos alvos da amplificao (stios),
enquanto que a especificidade depende dos iniciadores (primers)
empregados. um mtodo mais sensvel do que os mtodos
parasitolgicos clssicos de deteco do T. cruzi na fase crnica da
infeco.
O mtodo de PCR permite detectar DNA do parasita em diferentes
amostras biolgicas, tais como:
1) sangue total - Avila et al. (1991) utilizaram uma soluo
composta por 6 M Guanidina HCl - 0.2M EDTA, que permitiu
estocar o sangue coletado, temperatura ambiente para
posterior anlise .
2) soro - Russomando et al. (1992) conseguiram amplificar o T.
cruzi em amostras de soro;
3) lquor - Lages-Silva et al. (2002) comprovaram a existncia de
DNA de T. cruzi no lquor de um paciente chagsico / HIV + ;
38
4) contedo fecal/ tubo digestivo de triatomneos Valejo et al.
(1999) conseguiram amplificar T. cruzi em amostras de tubo
digestivo e hemolinfa de Rhodnius prolixus;
5) cortes de tecidos - Ghul et al. (1997) mostraram ser possvel
detectar DNA de T. cruzi em amostras extradas de tecido
mumificado humano. Vago et al. (2000) verificaram, atravs
da tcnica de LSSP-PCR (low-string single primers-polymerase
chain reaction), a variabilidade gentica da populaco de T.
cruzi presente no tecido cardaco de 13 pacientes chagsicos
e em 5 com megaesfago. Elias et al. (2003) foram capazes,
atravs de uma tcnica de micromanipulaco, de detectar DNA
de T. cruzi em um nico macrfago dissecado diretamente de
uma seco de tecido cardaco.
Figura 25: Reao em cadeia de polimerase (PCR).

Figura modificada por Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.
Fonte: www.sci.sdsu/.../in-vitro-genetics/PCR.gif
39
6.2 PCR QUALITATIVA
A PCR Qualitativa tem como princpio a amplificao in vitro
de sequncias especficas do material gentico (DNA ou RNA) do
organismo alvo (Kleppe et al.,1971) e seu resultado baseia-se
na visualizao do produto amplificado em gel de agarose ou
poliacrilamida (presena - PCR positiva ou ausncia - PCR negativa),
conforme mostra a Figura 26 (A e B). Neste tipo de teste, no se
admite resultado inconclusivo.
Figura 26: A) Resultado padro em gel de agarose corado por brometo de etdio,
depois da amplificao de DNA extrado das amostras de sangue. A banda
de 330 pb presente representativa da amplificao da sequncia especfica
do minicrculo de kDNA de T. cruzi; B) Resultado padro em gel de agarose
corado por brometo de etdio, depois da amplificao do DNA extrado
das amostras de sangue. A banda de 110 representativa da amplificao
da seqncia especfica do gen de globina humana. (Controle)
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia da
polimerase na deteco do Trypanosoma cruzi Chagas 1909 em indivduos na fase crnica da infeco
chagsica. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.
O avano nas tcnicas moleculares com o desenvolvimento da

PCR qualitativa aprimorou as condies de deteco de patgenos,
aliando especificidade e sensibilidade ao diagnstico (Erlich et al.,1991;
Brasileiro Filho & Pena, 1992; Silber et al., 1997). A multiplicao
de uma nica cpia de DNA em milhes de cpias filhas permite a
deteco de agentes etiolgicos antes no detectados pelos mtodos
parasitolgicos tradicionais (Breniere et al., 1995; Junqueira et
al.;1996; Gomes et al; 1999). Assim, o mtodo tem sido amplamente
40
utilizado na identificao de agentes etiolgicos de diferentes doenas,
sendo de escolha quando a quantidade de parasita escassa. Como
exemplo, a identificao de Trypanosoma cruzi em chagsicos crnicos
caracterizados pela baixa parasitemia, pode ser conseguida atrves da
PCR qualitativa (Batista et al., 2010).
A realizao da PCR precedida por uma etapa de extrao do
DNA a partir da amostra a ser estudada, que deve ser muito bem
executada. J foi demonstrado que o protocolo de extrao de DNA
influencia o resultado da PCR. A extrao consiste de: a) lise celular
para a liberao do DNA da clula; b) remoo de protenas que
podem interferir no processo de amplificao ou que degradam o DNA
alvo (DNAses); c) precipitao e concentrao do DNA extrado. Estes
procedimentos podem ser feitos atravs do uso de mtodos in house,
kits comerciais ou preparados comerciais (DNAzol, por exemplo).
Halos et al. (2004) publicaram um estudo com carrapatos, no
qual demonstraram que diferentes protocolos de extrao geram
diferentes resultados e que a combinao de mtodos fsicos e
qumicos mais eficiente do que o uso de apenas um deles. Em
outro estudo sobre extrao de DNA em artrpodes (caros), Desloire
et al. (2006) mostraram que podem ocorrer variaes na positividade
dos resultados de acordo com o estado alimentar do inseto. Em um
estudo-piloto experimental utilizando ninfas de 4 estgio de Rhodnius
brethesi e Panstrongylus megistus infectadas com 10, 100 e 1000 T.
cruzi, foram testados oito diferentes protocolos (Neves 2008, 2010).
Com a maioria dos mtodos no se obteve sucesso na extrao de
DNA, enquanto com dois, sim (surgimento de bandas de 330 pares
de base, que correspondem ao fragmento de DNA do cinetoplasto do
T. cruzi). Dos dois protocolos com os quais se conseguiu extrair DNA,
apenas um foi considerado o mais adequado por obter DNA a partir
de amostras com apenas 10 parasitas. Esses trabalhos so importantes
para demonstrar o quo importante a etapa de obteno de DNA,
para que a PCR seja confivel.
41
6.3 PCR QUANTITATIVA
uma variante da reao de PCR convencional, representando
grande avano nos mtodos moleculares de auxlio do diagnstico,
particularmente por facilitar as tarefas de quantificao da expresso
gnica em determinado tecido ou amostra biolgica.
O princpio do mtodo est baseado na deteco de fluorescncia
no tubo de reao medida que o DNA dupla fita sintetizado,
determinando a quantidade de DNA de uma amostra que foi
amplificada. Isso conseguido atravs de um sistema automatizado
que mede a intensidade de emisso fluorescente.
A PCR em Tempo Real torna possvel, por exemplo, avaliar a carga
parasitria de um paciente chagsico. E tem a grande vantagem de
poder diminuir a contaminao da amostra, porm, apresenta um
custo mais alto do que a PCR qualitativa.
6.4 Estudo comparativo entre a pcr E OUTROS MTODOS

de DETECO do T. cruzi (xenodiagnstico, hemocultura e
pesquisa em lmina)
A tabela 3 apresenta os resultados de um estudo que vem
sendo efetuado pelo Laboratrio de Doenas Parasitrias (antigo
Departamento de Medicina Tropical) do IOC-FIOCRUZ na Regio do
Mdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil, comparando o
resultado de diferentes tcnicas de diagnstico parasitolgico e uma
tcnica de diagnstico molecular em animais silvestres capturados na
Regio. Vide tambm a Figura 38 (pgina 57).
Tabela 3: Comparao entre a PCR e outros Mtodos de Deteco do T. cruzi.
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-
Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
42
6.5 Vantagens e Desvantagens do emprego da PCR na
deteco do T. cruzi
Vantagens:
1) No depender diretamente da imunocompetncia do organismo
infectado e do tempo* de infeco;
2) Possibilitar a avaliao quantitativa da parasitemia;
3) Maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos
clssicos;
4) Somente detectar DNA na presena do parasita nos fluidos
biolgicos, visto que esta molcula no permanece muito
tempo livre no organismo (Barker,1990).
Obs.: * importante ressaltar que, apesar da alta sensibilidade, o

mtodo de PCR apresenta resultados melhores em maior parasitemia.
Desvantagens:
1) Alto custo - todo material importado e descartvel;
2) Contaminao com DNA exgeno, que pode ser evitada
atravs de procedimento de Condies e Condutas Bsicas
Mnimas;
3) No reprodutibilidade de alguns protocolos;
4) Falta de otimizao em se tratando especificamente da deteco
de DNA do T. cruzi.
43
7. DIAGNSTICO SOROLGICO
Baseia-se na deteco de antgenos, anticorpos ou imunocomplexos.
A sensibilidade mais acentuada em relao s provas parasitolgicas.
A grande maioria dos testes automatizada, o que determina um
baixo custo operacional, rapidez e simplicidade de execuo.
No caso da deteco de anticorpos, os nveis iro variar conforme
a fase da infeco (Figura 27).
Figura 27: Perfis dos nveis de anticorpos na infeco chagsica (A-B).

Figuras adaptadas e elaboradas por Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
A formao de anticorpos especficos da classe IgM relativamente

precoce, iniciando-se ao trmino da primeira semana de infeco
e mantendo nveis detectveis durante toda fase aguda. O inverso
verificado com IgG, que comea a ser detectado ao final da fase
aguda. Nessa fase difcil o encontro do parasita no sangue pelos
mtodos parasitolgicos diretos, como pode ser verificado nas curvas
de parasitemia feitas em camundongos infectados com diferentes
cepas (Figura 28).
44
FASE AGUDA X FASE CRNICA
Figura 28: Parasitemia experimental em camundongos nas fases aguda e crnica (A, B).
Figura adaptada por Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
45
As provas sorolgicas podem ser realizadas e utilizadas para:
7.1 DIAGNSTICO INDIVIDUAL
Elucidao de patologias cujos sintomas clnicos no so
suficientes para o diagnstico;
Diferenciao da fase da enfermidade (investigao de IgM/
IgG);
Diagnstico de infeces congnitas;
Seleo de doadores de sangue;
Seleo de doadores e receptores de rgo para transplante;
Avaliao de teraputica especfica.
7.2 INQURITOS SOROEPIDEMIOLGICOS
Estabelecimento da prevalncia da infeco. Ex.: 1 inqurito
nacional nos anos 70 no Brasil;
Avaliao dos programas de controle atravs do
monitoramento de novos casos. Ex.: 2 inqurito nacional
em menores de 5 anos de idade, em fase de publicao dos
dados/Brasil.
7.3 AVALIAO DAS PROVAS SOROLGICAS
A avaliao das provas sorolgicas independe da prevalncia da
enfermidade. Devemos levar em considerao os seguintes fatores:
1) Sensibilidade da prova - a capacidade de um exame se
apresentar positivo quando o paciente realmente portador
da doena que se investiga (VP/VP+FN);
2) Especificidade - a capacidade de um exame dar negativo
quando o paciente no est doente (VN/VN+FP);
3) Eficincia - quando se tem concordncia dos resultados de
indivduos verdadeiros positivos e verdadeiros negativos
com indivduos com e sem infeco, na populao estudada
(VP+VN/VP+VN+FP+FN);
46
4) Reprodutibilidade - a capacidade de obteno de resultados
com valores muito prximos entre si, quando se testa uma
mesma amostra em diferentes ensaios (R);
5) Valor preditivo positivo - a capacidade de um exame positivo
representar um paciente verdadeiramente portador da doena
pesquisada (VP);
6) Valor preditivo negativo - a capacidade de um exame negativo
representar um paciente sadio (VN);
7) Ponto de corte (cut off) - o ponto de corte de um teste
sorolgico o valor que define o limite entre um teste positivo
e um negativo. A escolha deste limiar leva em considerao
as frequncias dos resultados observados nos testes de uma
populao em geral, bem como os de especificidade e de
sensibilidade de um teste (Figura 29).
Figura 29: Cut-off (A, B).
Figura adaptada por Bruno Eschenazi.

Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M.
Diagnstico de Laboratrio das principais
doenas infecciosas, parasitrias e auto-
imunes. Correlao Clnico-Laboratorial.
2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2001.
47
7.4 PROVAS/TESTES MAIS UTILIZADOS ATUALMENTE
7.4.1 Imunofluorescncia indireta-IFI (Fife & Muschel,

1959; Camargo, 1966)
Baseia-se na marcao de anticorpos com corantes fluorescentes
e visualizao ao microscpio de fluorescncia com luz ultravioleta
(Figura 30). A leitura visual (microscpio de fluorescncia). Tem alta
sensibilidade, sendo mais indicado para a fase aguda da infeco
(anticorpos da classe IgM aps a 1a semana). Pode apresentar
reatividade cruzada com outros antgenos, dando origem a resultados
falso-positivos. (Ex.: Leishmania spp).
Figura 30: Imunofluorescncia indireta: A) princpio do mtodo,

B) exemplo de IFI positiva, C) exemplo de IFI negativa,
demonstrando, entretanto, autofluorescncia.
Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de
Laboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
Fotos da IFI de Jlio Csar Miguel- Laboratrio de Doenas Parasitrias- IOC/FIOCRUZ.
48
7.4.2 Hemaglutinao indireta (Knierim,1970; Camargo,
1971)
Baseia-se na sensibilizao de superfcie dos eritrcitos com a
adsoro de antgenos e na reao de anticorpos dirigidos contra
estes antgenos. A reao antgeno-anticorpo provoca a aglutinao
dos eritrcitos (Figura 31). A leitura visual (Figura 32).
uma tcnica accessvel para qualquer laboratrio e de simples
execuo, porm dependendo do kit apresenta problemas de
reprodutibilidade.
A hemaglutinao indireta tambm pode apresentar resultado falso
positivo. Devido a isso, normalmente, so includos nos kits os seguintes
reagentes extras: hemcias no sensibilizadas e 2-mercapto-etanol. O
primeiro empregado devido suspeita de anticorpos anti-hemcia;
neste caso os soros iro aglutinar hemcias no sensibilizadas. O
segundo (2-ME) tem como objetivo eliminar anticorpos IgM naturais,
que tambm podem produzir aglutinao das hemcias.
Figura 31: Princpio do Teste de Hemaglutinao Indireta.

Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de
Laboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
49
Figura 32: Exemplo de resultado de teste de Hemaglutinao Indireta.
Foto: Jos Borges Pereira- Lab. Doenas Parasitrias- IOC/ FIOCRUZ
7.4.3 Ensaio Imunoenzimtico - Elisa (Voller et al., 1976)

Baseia-se na sensibilizao de microplacas (ou prolas) com
antgenos especficos e incubao com anticorpos frente a um
substrato. Um substrato especfico para um conjugado marcado
enzimaticamente com peroxidase (ou fosfatase alcalina), revela a reao.
A leitura feita com auxlio de um leitor de ELISA (espectrofotmetro
automatizado) que mede a intensidade da cor obtida em cada poo. A
intensidade de cor da reao diretamente proporcional quantidade
de anticorpos presentes na amostra (Figura 33).
Esta tcnica, que permite a realizao de vrias amostras de
maneira simultnea, em um curto perodo de tempo, pode ter sua
especificidade e sensibilidade aumentada ou diminuda, dependendo
do Ag que utilizado para sensibilizar a placa (Umezawa & Silveira,
1999). um dos mtodos mais empregados no diagnstico sorolgico
da infeco chagsica.
50
Figura 33: Teste Imunoenzimtico-ELISA
Figura adaptada por Angela C. V. Junqueira, Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.
Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de Laboratrio
das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
51
7.4.4 Western Blot
Um extrato de antgenos separado por eletroforese e transferido
para uma membrana de nitrocelulose. Aps a transferncia, a
membrana cortada em tiras pequenas e a seguir posta em contato
com o soro a ser testado. Aps a incubao, a reao revelada e a
visualizao de banda (especfica) indica reao positiva (Figura 34).
A leitura visual.
O procedimento tcnico laborioso e de custo elevado, por
isso mais utilizado como teste confirmatrio, quando os testes
convencionais so divergentes (no caso da suspeita de infeco
chagsica).
Figura 34: Princpio da reao de Western-blot (A) e resultado de tesa blot

(B): 1) soro de alta reatividade; 2) soro de mdia reatividade; 3) soro de baixa
reactividade (sorologia convencional positiva); 4) soro padro SAPA; 5) soro
sem reatividade; 6) soro de baixa reatividade (sorologia convencional negativa);
7) soro com reactividade para banda de peso molecular superior a 160 kDa
(1 coleta); 8) soro com reatividade para banda de peso molecular superior a
160 kDa (2 coleta, depois de 9 meses); 9) soro de paciente chagsico;
10) soro de baixssima reactividade; 11) soro de indivduo de regio
com infeco por T. rangeli; 12) soro de indivduo de regio com infeco
por T. rangeli; PM - marcadores de peso molecular (kDa) esto esquerda.
Figura A - Adaptada por Bruno Eschenazi e Figura B - Tese doutorado de Junqueira ACV (2005).
52
7.4.5 TESTES DE EXECUO SIMPLIFICADA
Os testes rpidos para diagnstico existentes no mercado tm
como principais caractersticas a rapidez e a simplicidade na execuo,
pois normalmente no demandam equipamento ou conhecimento
qualificado para a realizao do teste ou mesmo interpretao do
resultado permitindo a utilizao tanto de sangue total, como de
plasma ou soro. Seu emprego deve ser destinado a regies onde
o acesso ao diagnstico difcil. Alguns deles tm como princpio
a imunocromatografia de partculas impregnadas com extratos de
T. cruzi em membrana de nitrocelulose, que em caso positivo concentra
a reao antgeno-anticorpo em uma nica fase slida. Exemplos: Stat
-Pak; Stick Chagas Teste (SCT).
Entre os atualmente comercializados para doena de Chagas, para
ilustrar, podemos citar trs deles com fundamentos diferentes:
IDPaGIA um teste de aglutinao de partculas sensibilizadas
com trs peptdeos sintticos. Esses polmeros precipitam
na ausncia de anticorpos, aps centrifugao de suporte
apropriado, passando pelo gel e ficando no fundo do tubo
(reao negativa). No caso da presena de anticorpos anti-T.
cruzi, os polmeros reagem e so retidos na superfcie do gel
(reao positiva). Os polmeros so visveis a olho nu. Apesar
da sua execuo ser relativamente simples, este teste pode no
ser considerado teste rpido, pois necessita de um equipamento
especial.
Chagas stat Pack ASSAy um teste imunocromatogrfico,
que emprega uma combinao de antgenos recombinantes com
alta especificidade contra anticorpos anti-T. cruzi (Figura 35).
IMMUNOCOMB II um teste imunoenzimtico, que emprega
protenas recombinantes do T. cruzi e anticorpos secundrios
contra imunoglobulina humana (Figuras 36 e 37).
53
Figura 35: Procedimento e leitura do CHAGAS STAT PACK ASSAY.
Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi.
Figura 36: Procedimento do teste IMMUNOCOMB II

Figura adaptadas por Bruno Eschenazi.
54
Figura 37: Interpretao de resultado de IMMUNOCOMB II
Figura adaptada por Bruno Eschenazi.
Testes rpidos para deteco da infeco pelo

T. cruzi existentes no mercado
Fonte: Initial table: C Ponce 2007, updated by MSF and

WHO Programme on Control of Chagas disease, in 2011.
55
7.5 APLICAO DOS MTODOS SOROLGICOS
7.5.1 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS EM BANCO DE SANGUE

As provas sorolgicas tm grande importncia para evitarmos a
propagao da infeco chagsica atravs das transfuses de sangue.
A transmisso por essa via pode ser devido a alguns fatores como:
1) No realizao dos testes;

2) Testes realizados de forma inadequada;
3) Testes com baixa sensibilidade.
O risco de transmisso do parasita por transfuso de 500 ml

de sangue total oscila entre 12 e 20%. O T. cruzi tambm pode ser
transmitido pelo plasma e concentrado de hemcias. A transmisso
era mais comum nas transfuses de sangue coletado em doadores
pagos e nas transfuses de sangue total. (Ref.: OMS, Srie de informes
tcnicos 950, Genebra, 2002).
As provas sorolgicas realizadas no Brasil de acordo com o RDC
153/06/2004 Ministrio da Sade so: a) HIV 1+2 (2 testes); b)
Doena de Chagas (ELISA 1 nica prova), c) HTLVI/II, d) Sfilis, e)
Hepatite C e f)Hepatite B (AgHBs e Anti HBc).
As provas empregadas para deteco sorolgica da doena de
Chagas na Fundao Pr-Sangue de So Paulo (FPS) e no Hemocentro
de So Paulo (HSP) so: a) Imunofluorescncia (diluio 1/40) at
04/2003, b) Hemaglutinao (diluio 1/20) at 03/2002 e c) ELISA
antes de 19/11/93 (Portaria MS 1.376 de 19/11/93 - Obrigatrio
realizao de 2 testes de princpios diferentes at 12/2002).
No obstante, apesar das normas estabelecidas pelo Ministrio da
Sade do Brasil, para que no ocorra a transmisso transfusional, a
implementao de Polticas Nacionais de controle em bancos nem
sempre cumprida de maneira uniforme. Parte disso deve-se ao
fato de que, em todo o territrio nacional, nem sempre se faz uso
de mtodos sorolgicos automatizados com alta sensibilidade e
56
especificidade, conforme preconizado. (Ref. OMS, Srie de informes
tcnicos 905, Genebra 2002).
Como forma de uniformizar o padro idealizado, recomenda-se
que sejam feitos, de forma sistemtica, programas externos de controle
de qualidade dos testes sorolgicos utilizados na rotina.
7.5.2 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS DE REGIES ENDMICAS

PARA REALIZAO DOS EXAMES PARASITOLGICOS
O grfico a seguir apresenta o resultado de um estudo, efetuado
pela equipe do Depto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ, em uma
regio endmica do Estado do Piau, Brasil, onde foi comparada a
sensibilidade de deteco de T. cruzi atravs da PCR, do xenodiagnstico
e da hemocultura, em pacientes sorologicamente positivo (Figura 38).
Figura 38: Resultado comparativo de diferentes

tcnicas de diagnstico para doena de Chagas.
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia da
polimerase na deteco do Trypanosoma cruzi Chagas 1909 em indivduos na fase crnica da infeco
chagsica. 1996. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.
57
7.5.3 MODELO DE INVESTIGAO EPIDEMIOLGICA
A maioria das investigaes epidemiolgicas clssicas de doena de
Chagas tem a sorologia como mtodo de triagem inicial. Isso se deve
a sua alta sensibilidade, especificidade e custo em relao aos outros
mtodos de diagnstico. Abaixo temos um organograma elaborado
para a conduta de deteco do T. cruzi em humanos (Figura 39).
Figura 39: Modelo de organograma empregado em estudo efetuado pelo

Depto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ.
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio
Negro-Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
58
8. COMPLEXO Trypanosoma cruzi
Atravs de estudos efetuados com isolados de T. cruzi de

diferentes hospedeiros e regies endmicas distintas foi verificado
que esta espcie de protozorio representada por uma populao
heterognea. Pode-se dizer que o T. cruzi um complexo formado
por populaes, muitas vezes bastante heterogneas, presentes nos
diferentes ciclos de transmisso que podem estar sobrepostos ou
no (Coura JR et al., 1966). importante ter o conhecimento que
empregamos o termo cepa para denominar o isolado obtido de
triatomneos, mamferos naturalmente infectados ou pacientes. A cepa
usualmente consiste de uma populao heterognea de parasitas. Em
1999 foram definidas 2 linhagens principais do T. cruzi, denominadas
T. cruzi I e T. cruzi II, visando a padronizao da nomenclatura a ser
adotada pelos diferentes grupos de pesquisa (Anonymous,1999).
Atualmente, atravs da utilizao de diferentes marcadores
moleculares, foi aceita por consenso a subdiviso do txon T. cruzi em
seis linhagens ou DTUs (Discret Taxonomic Units): T. cruzi I a T. cruzi VI
(Zingales et al., 2009).
A diversidade do T. cruzi tem sido verificada empregando-se
distintos parmetros, que vo desde os morfolgicos aos moleculares.
Para fins didticos, podemos dividir as diferentes metodologias
utilizadas em caracterizao biolgica, caracterizao bioqumica e
molecular. Os principais critrios, at a presente data, esto descritos
a seguir:
8.1 CARACTERIZAO BIOLGICA - curva parasitmica,

taxa de mortalidade, morfologia dos parasitas no sangue
perifrico e estudo histopatolgico
No incio da dcada de 70, Andrade et al. (1970 a, b) e Andrade,
S.G. (1974) iniciaram uma srie de estudos visando caracterizao
biolgica de cepas do T. cruzi e seus perfis histopatolgicos em animais
experimentais. A partir desses estudos foi possvel classificar as cepas
em trs tipos ou biodemas:
59
Biodema I (tipo I) - Cepas altamente virulentas, que se multiplicam
rapidamente, apresentando elevada parasitemia e mortalidade em
camundongos, que morrem entre o 7 e o 12 dias aps a inoculao.
Apresentam o predomnio de formas delgadas e macrofagotropismo
na fase inicial da infeco. Seu prottipo a cepa Y;
Biodema II (tipo II)- Cepas com multiplicao relativamente lenta e
picos de parasitemia irregulares entre o 12 e 20 dias aps a infeco.
Apresentam a predominncia de formas largas e miocardiotropismo.
Possui como prottipo a cepa So Felipe;
Biodema III (tipo III)- Cepas que apresentam picos da parasitemia
tardios, geralmente entre o 20 e 30 dias aps a infeco. Provocam
baixas taxas de mortalidade e apresentam o predomnio de formas
largas e de baixa multiplicao (~ 50 dias aps a infeco). Acometem
principalmente a musculatura esqueltica. Seu prottipo a cepa
Colombiana. Algumas taxas de parasitemia de cepas de biodema III
esto representadas na figura 40.
Figura 40: Taxas de parasitemia em camundongos suos infectados

por cepas do T. cruzi classificadas dentro do biodema III.
Fonte: DEVERA, R.; ILLARRAMENDI, X.; MONTOYA-ARAJO, R.; PIRMEZ, C.; FERNANDES, O.; COURA, J. R.
Biodemes of Trypanosoma cruzi strains isolated from humans from three endemic areas in Minas Gerais
State. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2002, vol.35, n. 4, p. 323-330).
60
8.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA - Eletroforese de
isoenzimas
A tcnica de eletroforese se isoenzimas para a classificao do
T. cruzi foi introduzida por Toy em 1974. Posteriormente, outros
pesquisadores iniciaram estudos de gentica populacional do T.
cruzi com cepas oriundas da Bahia e de diferentes regies do Brasil,
quando caracterizaram trs grupos principais que foram denominadas
zimodemas. (Miles et al. 1977, 1978, 1980). Podemos concluir que
zimodemas so grupos de cepas que apresentam perfis eletroforticos
isoenzimticos semelhantes. Enzimaticamente foram caracterizados
trs grupos do T. cruzi (Figura 41):
a) zimodema I, associado a isolados de marsupiais e triatomneos

silvestres,
b) zimodema II, associado a isolados domsticos,
c) zimodema III, associado ao ambiente silvestre.
Figura 41: Perfis Eletroforticos de diferentes

cepas do Trypanosoma cruzi.
Enzimas: A) PGM; B) GPI e C) ALAT.
Cepas: PER - Peruana (tipo I); 21 SF - So Felipe e
WSL - Wild So Loureno (tipos II) e
COL Colombiana (tipo III).
Fonte: GOMES, Yara de Miranda et al . Caracterizao de uma cepa de Trypanosoma cruzi isolada
de uma zona no endmica no Nordeste do Brasil. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, So Paulo, v.
37, n. 1, 1995. Disponvel em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-
46651995000100014&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 29 Jan 2008. doi: 10.1590/S0036-
46651995000100014
61
8.3 CARACTERIZAO MOLECULAR utilizando DNA do
Cinetoplasto(kDNA) - Anlise do Polimorfismo de Tamanhos
dos Fragmentos de Restrio do kDNA (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism - RFLP)
No final da dcada de 70, Mattei et al. (1977) introduziram a
tcnica de classificao de tripanossomos pela anlise do polimorfismo
dos tamanhos dos fragmentos de restrio do kDNA (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism- RFLP). Nesta tcnica, normalmente
um segmento do genoma amplificado e clivado por endonucleases
de restrio. O produto da clivagem separado por eletroforese e
as variaes dos tamanhos das bandas, assim como as repeties,
constituem os chamados perfis de RFLP.
Posteriormente, Morel et al. (1980) empregaram a tcnica para a
caracterizao genotpica do T. cruzi e propuseram o termo esquizodema
para denominar grupos com perfis semelhantes (Figura 42).
Figura 42: Comparao entre diferentes

isolados de T. cruzi pelo mtodo de
Anlise do polimorfismo de tamanhos
dos fragmentos de restrio do k DNA.
Montagem de Carlos Jos de C. Moreira
8.4 CARACTERIZAO MOLECULAR utilizando o DNA

nuclear
8.4.1 TIPAGEM PELO GENE DE MINI-EXON
O gene que transcrito d origem ao mini-exon est presente no
genoma nuclear dos Kinetoplastida em aproximadamente 200 cpias
repetitivas. Este gene constitudo por 3 regies: o exon, o intron e
62
a regio intergnica. O exon uma sequncia de 39 nucleotdeos
altamente conservada, sendo adicionado ps-transcricionalmente a
todos os RNAs mensageiros nucleares, atuando no processo de trans-
splicing da parasita. O intron moderadamente conservado entre as
espcies de um mesmo gnero ou subgnero. A regio intergnica
do T. cruzi pode ser amplificada por PCR, possibilitando a classificao
em dois grupos principais T. cruzi I e T. cruzi II (Figura 43).
Figura 43A: Representao esquemtica do ensaio de PCR para tipagem de

T. cruzi empregando o gene de mini-exon. A caixa preta representa o mini-exon
de 39 bp, a caixa cinza representa a sequncia do intron (70 bp) e linha espessa
limitado pelos traos vermelhos representa a regio intergnica (484 bp).
Figura adaptada por Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Figura 43B: Gel de agarose corado com brometo de etdio de produtos de PCR para
o gene de mini-exon. As cepas so as seguintes: linhas 1 e 2, cepas de referncia Y
e F (T. cruzi II e I, respectivamente); linhas 3-18, cepas testadas.
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese), Fundao Oswaldo Cruz, Instituto
Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
63
8.4.2 TIPAGEM PELO DNA POLIMRFICO AMPLIFICADO
ALEATORIAMENTE (Randomly Amplified polymorphic DNA - RAPD)
Esta tcnica tem sido utilizada para estudos taxonmicos e de
caracterizao de micro-organismos desde a sua introduo por
Welsh e McCleilland e Willians et al. em 1990. Basicamente uma
reao de PCR que utiliza pequenos primers de sequncias aleatrias
capazes de amplificar regies annimas do DNA nuclear. O produto
da amplificao, quando analisado por eletroforese em gel de
poliacrilamida, demonstra padres de bandas especficas para cada
isolado de um determinado agente infeccioso (Figura 44).
Figura 44: Perfis de RAPD de cepas de T. cruzi originais (O), aps

manuteno em camundongo (C) e meio LIT (L). A. Iniciador 2.
B. Iniciador 4. M, marcador de Peso Molecular, 100 bp.
Cepas P23-1, Ig62, Ig523-2, Ig 520, Ig192-1, Ig539, BE-25 e B84.

cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto
Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Esta tcnica uma ferramenta utilssima para estudos, tanto em

tripanossomatdeos, quanto para outros txons de protozorios
parasitas. Em relao ao T. cruzi o RAPD tem sido utilizado para
obter marcadores de DNA que permitem estabelecer relaes
genticas entre diferentes isolados. Apresenta algumas vantagens
como: a) como se trata de uma tcnica simples no necessita de
64
uma informao prvia sobre a sequncia do DNA a ser estudado;
b) requer pequenas quantidades de DNA para que possa ser realizada;
c) pode ser empregado um nmero limitado de primers ou iniciadores.
As desvantagens so a baixa reprodutibilidade da tcnica e no refletir
geneticamente a variabilidade populacional.
8.4.3 TIPAGEM ATRAVS DAS REGIES INTERGNICAS (IRTs)
DOS GENES RIBOSSMICOS (RFLP- ITS- rDNA)
Os genes que codificam o RNA ribossmico so altamente
conservados tendo potencial para a anlise filogentica. So
encontrados como sequncias repetitivas que codificam para uma
subunidade maior e para outra menor separadas por regies que
no so transcritas, denominadas de espaadores no transcritos
(NTS - non transcribed spacers). Tambm apresentam regies
codificantes denominadas de espaadores internos transcritos (ITS -
internal transcribed spacers) que so pequenas sequncias de grande
variabilidade, flanqueados por segmentos altamente conservados, o
que torna possvel a confeco de iniciadores para PCR que anelam
nessas regies.
Cupolillo et al. (1995) padronizaram uma tcnica desenhando
iniciadores de PCR que permitiram obter um produto de amplificao
correspondente a subunidade 5,8 S e mais os dois ITSs flanqueadores
(Figura 45A). Os produtos da PCR so digeridos com enzimas de
restrio, e aps a eletroforese faz-se a anlise fentica (Figura 45B).
Figura 45A: Locus de um rDNA de Tripanossomatdeo - IR1 e IR2 so

os iniciadores da PCR que anelam-se nas regies codificadoras para
as subunidades menor (SSU) e maior (LSU); ITS representa o
espaador interno transcrito e NTS espaador no transcrito.
Esquema adaptado de Cupolillo, E. et al., 1995. por Carlos Jos de Carvalho Moreira.
65
Figura 45B: Eletroforese em gel de agarose 0,8 % mostrando os
produtos de PCR corados com brometo de etidio e visualizados sob
luz UV. Os produtos correspondem as regies ITS1 + 5.8S + ITS2
do rDNA do T. cruzi: 1) marcador de peso molecular, 1kb; 2) P23orig;
3) P23; 4) P23cam; 5) Ig523orig; 6) Ig523L; 7) Ig523cam; 8) Ig62orig;
9) Ig62L; 10) Ig62cam; 11) B84orig; 12) B84L; 13) B84cam.

cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo
Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
8.4.4 TIPAGEM por microssatlites

Os microssatlites so uma classe de DNA, que se apresentam
de modo repetitivo, em geral em torno de 1 a 6 pares de bases (bp),
que esto presentes de forma dispersa no genoma dos eucariotos.
Baseados no nmero de repeties podem ser denominados mono,
di, tri, tetra, penta e hexanucleotdeos. O elevado polimorfismo dos
microssatlites resultado da variao no nmero de repeties, em
tandem, de um alelo para o outro. Experimentalmente determinou-
se que a taxa de mutao dos loci de microssatlites que pode variar
de 10-6 a 10-2. Essa taxa varia segundo o tamanho da repetio. Desta
maneira, os microssatlites so considerados marcadores de eleio
com aplicaes em reas biomdicas como ecologia, gentica de
populaes e reconstruo filogentica.
66
A metodologia consiste na amplificao pela PCR, usando um par
de iniciadores fluorescentes especficos que flanqueiam o segmento
contendo as repeties, analisando-se posteriormente, o tamanho
dos fragmentos gerados em sequenciador automtico que demonstra
os eletrofluorogramas (picos, Figura 46).
Em T. cruzi a anlise dos microssatlites foi introduzida inicialmente
para estudar a estrutura da populao do parasita, tentando averiguar
se uma determinada cepa era policlonal. Esta tcnica tambm mostrou
utilidade como marcador para reconstruo filogentica.
As cepas que apresentam um ou dois picos (um ou dois alelos,
correspondendo a diploidia) so consideradas monoclonais. O
aparecimento de mais de dois picos nos diferentes loci indicativo da
presena de mais de uma populao (policlonalidade).
Figura 46: Exemplos de possveis resultados obtidos num teste de

microssatlites para T. cruzi. As figuras representam eletrofluorogramas
dos produtos da PCR de cepas hipotticas do T. cruzi para um determinado
locus de microssatlite: A) Perfil mostrando a amplificao de um pico
(cepa monoclonal homozigota) ou dois picos (cepa monoclonal heterozigota);
B) Amplificao de trs ou quatro picos de cepa multiclonal.

cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
67
8.4.5 CLASSIFICAO ATUAL POR DTUs (DISCRETE TYPING
UNIT)
Durante o Simpsio Internacional em comemorao aos 90 anos
da descoberta da doena de Chagas, um grupo de pesquisadores se
reuniu visando a padronizao da nomenclatura do T. cruzi (Anonymous,
1999). Ficou estabelecido que as cepas do T. cruzi seriam agrupadas
em dois principais grupos denominados T. cruzi 1 e T. cruzi 2. As cepas
Tc 1 estariam ligadas ao ciclo de transmisso silvestre e as Tc 2 ao ciclo
domstico, com poucas excees.
Um novo consenso para definir a nomenclatura especfica para
o T. cruzi foi realizado em 2009 (Zingales et al., 2009) e uma nova
classificao foi aceita, baseada em DTUs. Podemos definir DTUs como
grupos de cepas que so geneticamente mais relacionados entre
si do que com outros grupos, sendo identificveis por marcadores
genticos, moleculares ou imunolgicos. Esta nova classificao
levou em considerao o esquema proposto por Lewis et al. (2009),
utilizando novos marcadores em ensaios triplos:
A) Anlise por eletroforese do produto da amplificao pela
PCR do gen da subunidade maior do DNA ribossmico (LSU RNA)
a classificao dada pelo tamanho do fragmento (em pares de
bases);
B) Anlise por eletroforese do produto resultante da digesto
pela enzima de restrio EcoRV do gene de HSP60 (60-kDa heat
shock protein), amplificado pela PCR (PCR/RFLP-HSP60-EcoRV) - a
classificao dada pelo perfil de bandas gerado;
C) Anlise por eletroforese do produto resultante da digesto pela
enzima de restrio HhaI do gene de GPI (glicose-6-fosfato-isomerase),
amplificado pela PCR (PCR/RFLP-HhaI-GPI). Como no caso anterior, a
classificao tambm dada pelo perfil de bandas gerado (Figura 47).
A Figura 48 demonstra os diferentes gentipos do T. cruzi
(classificao atual) e sua distribuio geogrfica.
68
Figura 47: Esquema do triplo ensaio proposto por Lewis et al., 2009.
Figura 48: Distribuio geogrfica dos 6 gentipos do T. cruzi.

Figura adaptada de: WHO, how, what and where? Nature Outlook, v. 465, n. 7301, p. 58-59, Jun. 2010.
69
1. MTODOS PARASITOLGICOS DIRETOS
1.1 Fundamento
Conforme relatado anteriormente, os mtodos parasitolgicos
diretos baseiam-se na pesquisa direta do parasita na amostra clnica.
Eles podem ser realizados em laboratrios clnicos com condies
mnimas de equipamentos, porm necessrio que o profissional
tenha passado por um treinamento de reconhecimento do parasito.
Nesse treinamento, o T. cruzi deve ser diferenciado de outras espcies
de tripanossomas que infectam tambm o homem.
Nas pginas seguintes nos deteremos em protocolos que se baseiam
na demonstrao do parasito em lmina, que so procedimentos
simples sendo necessrio apenas como equipamento um microscpio.
importante voltar a ressaltar que os mtodos parasitolgicos diretos
s apresentam alta sensibilidade na presena de parasitemia patente,
sendo por isso o mtodo de escolha na suspeita de casos agudos ou
de reativao da infeco.
1.2 Coleta da Amostra

A obteno da amostra de sangue pode ser realizada diretamente
por puno digital ou venosa. Vide Figura 21 na pgina 144 dos Anexos
dos Mdulos I e II.
2. PROTOCOLOS
2.1 EXAME DE SANGUE A FRESCO

O exame a fresco do sangue mais sensvel que o esfregao corado
e deve ser o mtodo de escolha na suspeita de infeco aguda. Por
outro lado, no possibilita uma boa visualizao das caractersticas
morfolgicas do parasito, por isso recomenda-se em caso positivo fazer
distenses coradas com objetivo de fazer um diagnstico morfolgico
diferencial com o Trypanosoma rangeli, um outro tripanossoma que
tambm infecta o homem e compartilha vetores comuns com o T.
cruzi.
71
No Consenso Brasileiro em Doena de Chagas, desenvolvido por
especialistas brasileiros, sugerida a seguinte conduta diagnstica:
caso os exames diretos sejam negativos, devem ser usados os mtodos
de concentrao, tais como micro-hematcrito, teste de Strout ou
QBC (Quantative Buffy Coat). Estes mtodos apresentam 80 a 90% de
sensibilidade e so recomendados quando houver suspeita de doena
de Chagas aguda e o exame direto a fresco resultar negativo.
2.1.1 PROCEDIMENTO
1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por puno

digital ou venosa, no meio da lmina e cobrir com uma lamnula
(20x20 ou 22x22). Se for realizada a contagem de parasitos
empregar a lamnula 22x22.
2) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando objetiva de
maior poder ampliador (ideal 40X);
3) Se negativa, recomenda-se diariamente fazer vrias lminas
em coletas peridicas, antes de dar o exame como negativo.
2.2 DISTENSO FINA OU ESFREGAO

A distenso fina permite a identificao das estruturas morfolgicas da
espcie alvo de reconhecimento, porm a sensibilidade do diagnstico
menor que a da gota espessa. Isto ocorre em virtude da menor concentrao
do sangue. Tambm proporciona a classificao morfolgica do parasita
por permitir uma melhor visualizao dele. Entretanto, a gota espessa, por
ter uma maior quantidade de sangue desemoglobinizado, apresenta uma
maior probabilidade de se visualizar o parasito na amostra.
Para a confeco da distenso fina devemos utilizar uma lmina biselada
ou escantonada para espalhar o sangue, trabalhando em uma superfcie
plana horizontal. Devemos formar um ngulo de aproximadamente 45
com a lmina biselada e, logo aps a mesma entrar em contato com a
gota de sangue, espalh-la com um rpido movimento para frente, para
formar uma camada fina, sem atingir o final da lmina. Mais detalhes da
confeco sero fornecidos a seguir. A distenso fina deveria permitir
72
uma menor perda de parasitas, se comparada com a gota espessa, por ser
fixada e no ser submetida desemoglobinizao (Figura 1). As distenses
finas conservam por maior tempo a colorao original e resistem mais ao
atrito aps a remoo do leo de imerso.
Figura 1: Seco de esfregao. Desenho adaptado por Helosa Maria Nogueira Diniz.
Fonte: PRAT, J.G.; TRAID, M.C.; MORAIS, P.; ANDRADE, S.L. (orgs) Combatendo a Malria no Parque Nacional
do Ja e Resex do Rio Unini. Barcelona: Nucli destudis per a lAmaznia de Catalunya- NeAC, 2009.
2.2.1 CONFECO E COLORAO DAS DISTENSES
1 ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAO DAS LMINAS

1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por puno
digital ou venosa, na extremidade da lmina. Tocar a gota de
sangue com a borda estreita da lmina sem canto (lmina
extensora), formando um ngulo de 45 com a face superior
da lmina (Figura 2A);
2) Fazer com a lmina extensora um ligeiro movimento para trs,
at encostar na gota de sangue. Deixar que a gota se difunda
uniformemente, ao longo da borda da lmina extensora, por
capilaridade (Figura 2B);
3) Levar a lmina para frente, de forma que ela carregue a gota de
sangue que se quer estender numa camada delgada e uniforme.
essencial escorregar a lmina extensora de uma s vez, sem
deter-se. O movimento de extenso deve ser uniforme. O
73
sangue dever ser puxado pela lmina e no empurrado pela
mesma (movimento suave, Figura 2C).
4) Deixar secar temperatura ambiente ou em uma estufa a 28 C.
Figura 2: Modo de estender a gota de sangue: A) O ngulo entre a lmina

e a lmina extensora deve ser de 45 ; B) Aproximando as duas, a gota de
sangue se distende por capilaridade imediatamente; C) O sangue carreado pela
borda da lmina, que se impulsiona para frente em um movimento rpido e leve;
D) Detalhe da lmina extensora (bizelada).
Fonte: BEAK, W.; PAULETE, J. Sangue: Tcnicas de Citologia e Histologia.
Rio de Janeiro: Editora Livros Tcnicos e Cientficos, 1 v., 1976, 306 p.
2 ETAPA: COLORAO PELO MTODO DE GIEMSA

Neste tipo de colorao descrito, utilizamos o corante Giemsa. A
soluo de Giemsa destina-se a colorao de esfregaos do sangue ou
da medula ssea in vitro, consistindo numa soluo tampo de tiazina
e eosinato concebida para a colorao de elementos figurados do
sangue. Esse corante poder ser utilizado em separado ou em conjunto
com o corante May-Grnwald. O Giemsa, que cora especificamente os
grupos de fosfato do ADN, liga-se a regies onde h alta quantidade
de ligaes A-T (Adenina - Timina).
Em uma colorao bem feita, os ncleos celulares apresentaro
diversos tons de prpura. A colorao citoplasmtica apresentar
diversos tons de azul a corde-rosa claro. As etapas esto descritas a
seguir:
74
1) Fixar as lminas com lcool metlico livre de acetona durante 1
a 2 minutos temperatura ambiente (pela nossa experincia 1
min o suficiente);
2) Corar as distenses com soluo de Giemsa, preparada no
momento da colorao na concentrao de 1 volume de Giemsa
para 9 volumes de gua tamponada (pH 6,8) (preparao do
corante e da gua tamponada em Preparo de Solues, no
item 6);
3) Colocar o corante sobre a lmina ou imergir em frasco de vidro
tipo Coplin (Figura 3), deixando por cerca de 5 a 10 minutos;
4) Lavar a lmina em gua da torneira (fluxo fino);
5) Escorrer a gua e deixar secar.
Fonte: SIMONS, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976. 476p.
Figura 3: Frasco de Coplin.

Fotografia de Marcello Pelliccione.
OBS: O exame da gota distendida deve ser empregado em caso de

suspeita de infeco aguda, porm tem pouca sensibilidade no caso
dos parasitos no serem abundantes. Tem a vantagem de possibilitar
uma boa visualizao da morfologia do parasita. conveniente
fazer vrias lminas, antes de dar o caso como negativo. Quanto
mais antigo o esfregao maior o tempo de colorao. Um esfregao
novo, geralmente, requer de 10 a 15 min para se corar. (Fonte:
Beak, W.; Paulete J. Sangue: Tcnicas de Citologia e Histologia. Rio
de Janeiro: Editora Livros Tcnicos e Cientficos, 1 v., 1976, 306 p.).
75
2.3 GOTA ESPESSA
um mtodo simples e eficaz de diagnstico, alm de ter baixo
custo. A gota espessa tambm o mtodo oficialmente utilizado
no Brasil, para o diagnstico da malria. Sua tcnica baseia-se na
visualizao do parasito, atravs de microscopia tica, aps colorao
pelo mtodo de Walker ou Giemsa.
Permite a diferenciao especfica dos parasitos a partir da anlise
de sua colorao, da morfologia e de seus estdios de desenvolvimento
no sangue perifrico, devido a sua alta concentrao.Para a confeco
da gota espessa, podemos colocar pequenas gotas de sangue nas
posies relativas aos vrtices de um quadrado imaginrio e uni-las
com um movimento circular utilizando um palito descartvel ou o
vrtice de uma lmina comum (Figura 4).
Figura 4: Gota espessa.

Desenho de Carlos Jos de C. Moreira.
Como dissemos anteriormente, nos procedimentos acima descritos

devemos, preferencialmente, utilizar o sangue sem anticoagulante,
pois essas substncias dificultam a fixao do sangue, fazendo com
que o esfregao ou a gota espessa possam desprender-se durante
o procedimento de colorao ou durante a lavagem posterior
colorao. O material deve ser corado no mximo at 72 horas
aps a confeco. No caso da gota espessa, a desemoglobinizao
fica prejudicada se esse perodo for superior a 72 horas. A Figura 5
representa um esquema de um corte transversal de uma gota espessa
e o que ocorre aps a desemoglobinizao.
76
Figura 5: Corte trasnversal de uma gota espessa e o que ocorre aps a
desemoglobinizao. Desenho adaptado por Helosa Maria Nogueira Diniz.
Fonte: PRAT, J.G.; TRAID, M.C.; MORAIS, P.; ANDRADE, S.L. (orgs) Combatendo a Malria no Parque Nacional
do Ja e Resex do Rio Unini. Barcelona: Nucli destudis per a lAmaznia de Catalunya-NeAC, 2009.
Os corantes utilizados para corar distenses sanguneas ou gotas

espessas so chamados de pancrmicos. uma mistura de corantes
de caractersticas neutras, dependentes do pH da soluo corante,
que em condies apropriadas coram os componentes nucleares e
citoplasmticos dos leuccitos, com predominncia de tons vermelhos
(quando cidos) e azulados diversos (quando bsicos).
A soluo de colorao deve ser feita com certa antecedncia e
apenas uma pequena quantidade deve ser colocada em uso; para isso,
aconselha-se transferir a mesma para um pequeno frasco com conta-
gotas, o que tem como objetivo evitar a hidratao de toda a soluo
estoque. O corante deve ser mantido no frasco original, bem vedado,
temperatura ambiente e ao abrigo da luz solar. Sob essas condies,
permanece estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do
frasco. Na prtica diria o corante utilizado sob forma de gotas.
Devemos utilizar um pequeno frasco com conta-gotas, que possa ser
periodicamente alimentado com o corante do frasco estoque.
Alguns corantes so solues alcolicas, por isso devemos tomar
os cuidados inerentes ao uso do lcool em laboratrio.
Devemos evitar pipetar o corante com o uso da boca. A ingesto
acidental do metanol (presente em alguns corantes e tambm
77
utilizado como fixador) pode ser fatal, dependendo da quantidade
absorvida. As solues corantes so para uso exclusivo in vitro. Seu
manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se o contato com pele e
mucosas. Em caso de contaminao acidental, lavar a rea afetada
em gua corrente. O descarte do corante utilizado dever obedecer
aos critrios de biossegurana estabelecidos pelo laboratrio.
Normalmente para a colorao de lminas necessitamos do
seguinte material:
1) Pissetas (frascos plsticos de lavagem);

2) Uma placa de acrlico (placa cncava para colorao);
3) Frasco conta-gotas;
4) Suporte prprio para colocar as lminas na horizontal (para
uma parte do processo de colorao);
5) Suporte prprio para colocar as lminas na vertical (para secar
as lminas na ltima etapa da colorao);
6) Relgio marcador de tempo com alarme;
7) Proveta graduada de 100 ml;
8) Papel absorvente;
9) Soluo de azul de metileno fosfato;
10) gua tamponada;
11) Soluo do Corante.
78
2.3.1 COLETA DE SANGUE
1) Separar duas lminas limpas deixando-as em superfcie plana
e horizontal;
2) Colocar uma das lminas sobre uma superfcie plana e
manuse-la pelas extremidades, evitando tocar as superfcies.
A lmina deve estar com etiqueta autoadesiva para o registro
da identificao; a alternativa usar lmina com extremidade
esmerilhada, onde a identificao feita com lpis;
3) Calar luvas de ltex descartveis;
4) Limpar vigorosamente a pele de local de puno (parte lateral
do segundo ou do terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou,
em lactentes, o dedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou
algodo embebido em lcool a 70%; posteriormente, enxugar
com gaze ou algodo secos;
5) Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril segurando-o
firmemente (puxar a tampa de uma s vez). Segurar o dedo
a ser puncionado entre o polegar e o indicador da mo do
operador e puncionar o local de maneira firme e rpida.
Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algodo
secos;
6) Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter
uma outra gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar
para no tocar o ponto de sada do sangue. Segurar a lmina
firmemente pelas bordas da extremidade onde se encontra
a etiqueta de identificao. Aproximar a lmina ao dedo do
paciente pela face onde consta a identificao, at tocar o
alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele). Se a
quantidade de sangue for insuficiente, pode-se colocar outra
gota ao lado da primeira ou at duas.
OBS: Este o protocolo utilizado rotineiramente nos laboratrios

de malria. Coletamos, em um canto da lmina, 4 pequenas
gotas de sangue, uma perto da outra, e no outro canto
mais 4, tambm uma perto da outra (vide Figuras 6A e 6B).
79
2.3.2 GOTA ESPESSA (PROTOCOLO 1)
1 ETAPA: PREPARAO DAS LMINAS

1) Coletar o sangue por puno digital ou venosa, cujo
detalhamento segue no protocolo seguinte.
2) Aplicar 4 gotas na parte central da lmina, de maneira que
fiquem prximas umas das outras. Tais gotas so reunidas para
formar uma mancha circular de um centmetro de dimetro ou
quadrada; usa-se para isso a ponta de outra lmina (Figura 6);
Figura 6: Confeco da gota espessa: A) Colocar 4 gotas de sangue

formando um quadrado; B) Unir as gotas enchendo o quadrado;
C) Esfregao e gota espessa distendidos, na mesma lmina.
Figurada adaptada por Angela C. V. Junqueira.
Fonte: PESSOA, S B. Parasitologia Mdica. 9a Ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1002 p.
3) Conservar a lmina assim preparada em lugar abrigado, at

que fique seca. Isto se obtm no mnimo aps 1 hora;
4) Uma vez seca a camada espessa de sangue, desemoglobiniz-
la colocando a lmina em posio vertical e mergulhada em
um frasco contendo gua destilada morna;
5) A desemoglobinizao verifica-se, geralmente, aps 10 minutos.
Ao retirar a lmina da gua, nota-se que o sangue perdeu sua
cor, tornando-se esbranquiado.
80
2 ETAPA: COLORAO PELO GIEMSA
1) Aps a desemoglobinizao, sem fixar a preparao, empregar
o mtodo comum de colorao pelo Giemsa;
2) Em 2 ml de gua destilada acrescentar 3 gotas de Giemsa (vide
soluo me no item Preparao de Solues) e agitar bem.
Cobrir a lmina, j desemoglobinizada, com o Giemsa diludo
e deixar cerca de 15 minutos;
3) Passados os 15 minutos, lavar a lmina em gua destilada e
deixar secar.
OBS.: A gota espessa permite a concentrao dos parasitos, pois, em

lugar de uma nica gota de sangue, empregam-se 3 a 4 gotas, por
outro lado, no possibilita uma boa visualizao das caractersticas
morfolgicas do parasita, conforme j relatado. tambm conveniente
fazer coletas peridicas, antes de dar o caso suspeito como negativo.
2.3.3. GOTA ESPESSA PROCOLOLO 2: MTODO DE

COLORAO DE WALKER
MATERIAL NECESSRIO:
Alm do material anteriormente descrito necessitamos de gua

tamponada de uma soluo de azul de metileno fosfato e da soluo
de Giemsa.
1a ETAPA: DESEMOGLOBINIZAO PELA SOLUO HIPOTNICA

DE AZUL DE METILENO
1) Quando a amostra de sangue em gota espessa estiver bem
seca (cerca de 20 minutos ou mais ps-coleta), aplicar sobre
a mesma a soluo de azul de metileno fosfatado e deixar por
dois minutos. Testar este tempo antes de empreg-lo na rotina,
pois s vezes ele bem menor;
2) Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte).
81
2a ETAPA: COLORAO PELA SOLUO DE GIEMSA
1) Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie
da placa de acrlico (invertida);
2) Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota de
corante para 1ml de gua tamponada. Homogeneizar;
3) Despejar a soluo recm-preparada na placa de acrlico, onde
j est a lmina invertida;
4) Deixar corar por 10 minutos (testar esse tempo antes de
empreg-lo na rotina);
5) Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte);
6) Deixar secar ao calor suave (Figura 7).
Figura 7: Lmina de gota espessa: A) antes da desemoglobinizao;

B) aps a desemoglobinizao; C) corada pelo Giemsa.
Fotografias de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
OBS: I. A colorao pelo mtodo Walker consiste em primeiro lugar no

tratamento da gota espessa pela soluo de azul de metileno fosfatado
para ser desemoglobinizada. Em segundo lugar a colorao pelo corante
de Giemsa;
II. Nesse mtodo no recomendvel imergir a lmina na soluo azul
de metileno (pr-colorao) e na gua tamponada (lavagem) em copos,
em virtude da contaminao destas solues repetidamente usadas
por vrios dias, favorecendo a proliferao de bactrias e fungos. Para
evitar essa desvantagem, utilizar as solues contidas em pissetas
(frasco usado para lavagem atravs de jatos do lquido nele contido)
para enxaguar as amostras de sangue fixadas. O aumento do consumo
compensado com a boa qualidade das preparaes, livre de artefatos
e contatos com solues contaminadas por sangue.
82
3. OUTROS MTODOS DE COLORAO:
3.1 GIEMSA TAMPONADO (APS HIDRLISE CIDA)

recomendado para amostras de sangue e de cultura.
1) Fixar com metanol durante 10 minutos (no mximo);
2) Escorrer o metanol da lmina e deix-la secar;
3) Cobrir cada lmina com HCl (cido clordrico) 5N (*) e deixar por
10 minutos. Aps, lavar bem as lminas sob um fluxo delicado
de gua corrente, durante aproximadamente 2 minutos. (no
deve ficar resduo de HCl). Deixar a lmina secar;
4) Cobrir cada lmina com a soluo corante preparada com 1-2
gotas de Giemsa para cada ml do tampo de colorao (vide
preparo do tampo em Preparo de Solues). Corar durante
01h10min (em mdia);
5) Lavar as lminas rapidamente sob um fluxo delicado de gua
corrente e deixar secar.
Notas importantes:
a) indubitavelmente melhor corar lminas por este mtodo com

esfregaos feitos no mesmo dia. Observa-se assim uma colorao
bem definida, com ausncia de rastros de colorao no meio de
cultura fixado na lmina conjuntamente com o parasita, prejudicando
o resultado da leitura;
b) de extrema importncia adicionar somente HCl 5N em, no mximo,

5 lminas por vez. Se houver aplicao numa quantidade maior de
lminas, durante a lavagem de cada uma a reao prosseguir acima
do perodo desejado nas outras, ocasionando a digesto de estruturas-
alvo do parasita.
c) Ao aplicar o HCl, procurar sempre fazer um colcho fino desta

substncia sobre a lmina (1 gota por campo) Isto tambm evita a
digesto excessiva do material pelo cido;
83
d) Se possvel, corar lminas de cultura preferencialmente recm
repicadas (em mdia de 4 dias de cultivo para Tripanossomas) em
meio monofsico (LIT, por exemplo). Coloraes realizadas em
meio envelhecido ou bifsico (como meio NNN+LIT, por exemplo)
no apresentam resultados excepcionais como os feitos sob esta
recomendao. aconselhvel substituir o tempo de colorao para
45 min. ou por outro melhor perodo de acordo com observaes
prvias.
e) Pode-se encurtar a colorao para 1 hora, utilizando-se para isto 3

gotas de Giemsa para cada mililitro de tampo. Cobre-se toda lmina
com esta soluo, tendo o cuidado com manuseio, pois manipulaes
excessivas induzem a precipitao do corante, ocasionando borres
de Giemsa na lmina.
OBS: (*) A passagem pelo HCl opcional sendo particularmente

indicada nas situaes em que se deseja visualizar com clareza a posio
relativa do ncleo e cinetoplasto (estudo da diferenciao celular).
Pode no produzir os melhores resultados em esfregaos de sangue.
Nota: Esta tcnica d excelentes resultados e uma adaptao

daquelas utilizadas por IKITAWA & OGURA (1954), MHLPFORDT (1963),
e CARVALHO (1973), combinando a hidrlise cida a frio da reao de
Feulgen e a subsequente colorao do material com Giemsa tamponado.
3.2 COLORAO DE LMINAS DE FEZES DE TRIATOMNEOS

(Usando corante Giemsa)

1) Com o auxlio de duas pinas, coletar as fezes atravs de uma
delicada compresso no abdmen do inseto, sem o sacrifcio
do mesmo;
2 ETAPA: COLORAO
1) Misturar as fezes obtidas com uma gota de soluo de Errecart
(vide preparo do tampo em Preparo de Solues) e uma ou
84
duas gotas de plasma humano ou de outro mamfero, que se
saiba isento de hemoparasitas;
2) Espalhar a mistura como um esfregao espesso de sangue,
deixar secar, de preferncia durante 12-24 horas;
3) Corar pelo Giemsa, com bicarbonato de potssio, sem fixar;
4) Lavar com cuidado, mergulhando a lmina em gua destilada;
5) Deixar secar e examinar.
3.3 COLORAO DE LMINAS DE FEZES E DE TUBO

DIGESTIVO DE TRIATOMNEOS (Utilizando os corantes May-
Grnwald e Giemsa)
Neste tipo de colorao utilizamos 2 corantes diferentes: May-

Grnwald e Giemsa. Esses dois corantes so utilizados atravs de
um mtodo de colorao mais demorado, em que aps a fixao e
a colorao pelo May-Grnwald, utilizamos uma segunda colorao
com soluo de Giemsa. Obtemos, com isso, uma colorao melhor,
evidenciando o ncleo e o cinetoplasto do T. cruzi com tonalidades
distintas.
O corante May-Grnwald, um corante neutro sendo composto
pela mistura de um corante cido, a eosina, e por um corante bsico,
o azul de metileno. Ambos so solveis em lcool metlico. Os
elementos cidos celulares (DNA e RNA) sero corados seletivamente
pelo corante bsico com a predominncia de tons vermelhos. Os
elementos bsicos celulares (protenas) sero seletivamente corados
pelo corante cido com a predominncia de tons azulados.

1) Sacrificar o triatomneo com clorofrmio ou ter;
2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do
abdmen;
3) Com a ajuda de pinas, retirar todo o tubo digestivo do inseto,
atravs de movimentos de trao;
85
4) Macerar todo o contedo em duas ou trs gotas de soluo
fisiolgica;
5) Misturar o contedo do tubo digestivo do inseto com soro
humano inativado ou de outro mamfero, que se saiba isento
de hemoparasitas;
6) Realizar as distenses e deixar secar as lminas overnight
temperatura ambiente ou em uma estufa a 28C.
2 ETAPA: COLORAO
1) Cobrir toda a lminas com May-Grnwald (soluo de eosina
azul de metileno segundo May-Grnwald comercial) por 3
minutos ( testar o tempo de colorao de 1a 3 minutos em no
mximo 10 lminas);
2) Adicionar a soluo NaHCO3 (Bicarbonato de Sdio) a 1%,
homogeneizar e deixar durante 1 minuto (podemos utilizar a
gua da torneira desde que esta tenha o pH ~7,0);
3) Remover o fluido e cobrir as distenses com soluo de Giemsa
(30 gotas para 10 ml de gua destilada ou da bica) durante 1
hora;
4) Desprezar o corante e lavar as lminas em gua corrente (fluxo
fino).
OBS: 1. Segundo Maekelt (The American Journal of Tropical Medicine

and Hygiene, v.13, n.1, p.11-15, 1964), esta tcnica de exame do tubo
digestivo permite revelar um maior nmero de exemplares infectados;
2. Em nosso Laboratrio utilizamos a gua da torneira em substituio
ao Bicarbonato de Sdio, pois o pH, em nossa regio, prximo de 7.0;
3. Verificamos que a secagem em estufa a 28C, durante 2 horas,
apresentou um bom resultado.
86
3.4 TCNICA DE COLORAO DE LMINAS DE FEZES BASEADO
NO MTODO DOS LABORATORISTAS DE TOCANTINPOLIS (TO).
(Carlos Marinho Pereira, Jos da Silva Costa e Natanael Pereira
Macedo)
MATERIAL NECESSRIO:
1) Placa de colorao (mesa de descanso, Figura 8);
OBS: Caso no possua uma placa de acrlico para colorao,
uma similar pode ser improvisada com material de PVC
de forma que a placa possua forma ligeiramente cncava.
2) Soluo salina (ou soro fisiolgico);

3) Soluo de azul de metileno;
4) Soluo de Giemsa;
5) Pisseta com gua destilada (caso no tenha gua tamponada);
6) Instrumentos: seringas de 1mL, lminas, pipetas de 1mL, pinas,
copos.
Figura 8: Placa de PVC para colorao de lminas.

Foto: Marcello Pelliccione.
87
1 ETAPA: COLETA DA AMOSTRA
1) Injetar 3 ou mais gotas de soluo salina pela parte posterior
do abdmen com seringa de 1 ml. Proceder da mesma forma
inclusive se o triatomneo estiver vivo. A soluo salina dilui as
fezes facilitando a visualizao em lmina.
2) Comprimir o abdmen do inseto com o uso de pinas para
retirada das fezes. A prtica de insero da agulha seguida
da compresso do abdmen pode eventualmente permitir
a retirada de algum material oriundo do tubo digestivo
juntamente com as fezes.
3) Deixar secar por ~ 2 a 3 horas.
2 ETAPA: FIXAO PELO LCOOL METLICO
1) Fixar com lcool metlico por ~ 1 minuto.
2) Deixar secar por ~ 10 min.
3 ETAPA: PR-COLORAO PELA SOLUO DE AZUL DE
METILENO
1) Imergir a lmina em soluo de azul de metileno (em copo)
rapidamente (~ por 2 segundos);
2) Enxaguar: Imergir a lmina em gua destilada (em copo)
rapidamente (~ por 2 segundos).
4 ETAPA: COLORAO PELA SOLUO DE GIEMSA
1) Colocar a lmina com o lado da amostra (de fezes ou tubo
digestivo macerado) para a superfcie da placa de colorao;
2) Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de 1 gota de
corante para 1ml de gua destilada. A prtica de filtrar o corante
Giemsa antes de preparar a soluo contribui para melhorar a
qualidade do corante, e portanto, do resultado da colorao.
Filtrar com papel filtro ou filtro descartvel de caf;
3) Aplicar esta soluo na placa cncava de colorao, sob a lmina
invertida. A tcnica de colocar a lmina invertida sobre o lado
cncavo da placa permite um maior contato da amostra com o
88
corante, resultando numa boa qualidade das preparaes, com
menor possibilidade de confuso por artefatos que dificultam
ou impossibilitam o exame das lminas;
4) Deixar corar por ~ 30 a 40 minutos;
5) Enxaguar imergindo rapidamente a lmina em um copo com
gua destilada (~ por 2 segundos);
6) Secar por aproximadamente 15 minutos (de acordo com a
temperatura e a umidade local).
OBS.: Desprezar as solues de azul de metileno, gua e

corante colocadas em copos e placa durante o preparo
das lminas. No reutiliz-los para evitar contaminao.
4. AVALIAO DAS COLORAES:
4.1 ESFREGAO
1) A colorao do esfregao est na dependncia da espessura
da camada de hemcias, bem como do mtodo de colorao.
2) O esfregao deve apresentar uma pelcula fina e uniforme que
no chega s bordas, com diminuio progressiva do sangue
em direo ao final da lmina, sem alcanar a extremidade,
mas formando franjas.
3) A cor do esfregao pode variar do cinza-claro ao rosceo plido,
sendo padro o seguinte:
Leuccitos: ncleo azul-escuro ou prpura; o citoplasma dos
neutrfilos, com granulaes finas e rosa; dos eosinfilos rseo;
Plaquetas: azul ou prpura;
Plasmdio: cromatina nuclear vermelha ou prpura; citoplasma
pode variar de azul-claro;
Granulaes de Schuffner: rosa ou vermelha. A sua presena
claramente definida, nas hemcias parasitadas pelo P. vivax ou
P. ovale, um bom indicador de colorao satisfatria.
89
4.2 GOTA ESPESSA
1) Quando a desemoglobinao adequada, os elementos
aparecem sobre um fundo claro.
2) Na espessura perfeita, cada campo microscpio (objetiva de
imerso) deve apresentar 10 a 20 leuccitos, em mdia;
3) As cores dos elementos normais devem ser comparadas na
seguinte ordem:
Os restos das hemcias azuis;
As plaquetas de rosa-vivo violeta;
Os ncleos de leuccitos, geralmente azul-profundo violeta;
Os grnulos finos dos neutrfilos, alguns rosa, outros azul-
violeta;
Os grnulos grossos dos eosinfilos, em vermelho-cobre
profundo;
O citoplasma dos linfcitos, em azul-plido;
Os moncitos, com fino estroma cinza-azulado.
No exame de gota espessa, o fundo deve estar claro, o mais limpo

possvel e branco. A cromatina e o citoplasma dos plasmcitos so
facilmente visualizados respectivamente nas cores vermelho-rosado
e azul. O pigmento malrico, que no se cora, tambm aparece
com nitidez e a cor varia do castanho ao escuro, sendo mais visvel,
entretanto, nas preparaes descoradas e no sangue a fresco em tubo
capilar (QBC).
As preparaes supercoradas e precipitadas pelo corante Giemsa
podem ser rapidamente descoradas pelo lcool metlico para exame.
90
5. Procedimentos bsicos para exame do material
corado
Antes de iniciar o exame, limpar as superfcies superiores das

lentes oculares e inferiores das objetivas, condensador e espelho
com papel macio e absorvente. O p depositado na parte interna
dos tubos do corpo binocular pode ser removido com jatos de ar
produzidos por uma pera de borracha;
Adaptar a lmina s presilhas da platina mecnica e a seguir
ajustar a lmina de modo que uma rea da amostra a ser
examinada coincida com o orifcio de iluminao;
Regular o sistema de iluminao do microscpio, fechando um
pouco o diafragmaris ou abaixando o condensador. Regular a
intensidade da luz atravs do reostato ou do balo de vidro, se
for o caso;
Posicionar a objetiva de 10x na direo da amostra e fazer a
focalizao com o boto macromtrico at que surjam os
leuccitos, no caso de amostras de sangue. A seguir ajustar o
foco com o boto micromtrico. Examinar at encontrar um
campo com maior nmero de leuccitos;
Focalizado o campo, adicionar leo de imerso no centro do
mesmo e girar o revlver at a objetiva de imerso (100x). Abrir
o diafragmaris e levantar o condensador;
Examinar os campos microscpicos movimentando os parafusos
de avano frontal e lateral do carro (charriot) com a mo direita
e boto micromtrico com a esquerda. Buscar os campos que
apresentem maior homogeneidade na distribuio das clulas;
Terminado o exame, baixar a platina, retirar a lmina e registrar os
resultados. Colocar a lmina invertida sobre um papel absorvente,
para que haja absoro do leo. No usar xilol e nem tolueno
para a remoo do leo de imerso. Aps absoro, acondicionar
as lminas em caixas apropriadas para futura reviso;
91
No usar tambm solvente como lcool, xilol ou tolueno para
a limpeza dos componentes do equipamento. O leo mineral
facilmente removido por papel absorvente, passado sobre a
lente de imerso;
Aps o uso, o microscpio dever ser coberto com uma capa
plstica ou colocado na caixa original. A caixa dever sempre
conter um saco de slica-gel para manter o ambiente interno
seco. Em reas de elevada umidade, como a Amaznia, a
utilizao de estufas de madeira, dotadas de uma lmpada de
25 watts constantemente acesa, mais eficiente que o uso da
slica. O ambiente constantemente seco ideal, pois impede o
desenvolvimento de fungos no sistema de lentes;
Outro cuidado importante sempre transport-lo pela
estativa (brao), com apoio da mo sob a base, e nunca pelos
parafusos.
6. Preparo de Solues para a Colorao
6.1 SOLUO CORANTE DE GIEMSA
Corante de Giemsa em p. . . . . . . . . . . . . . . 1 g
Glicerina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 ml
lcool metlico puro . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 ml
Adicionar o p do corante em um gral. A seguir, acrescentar

a glicerina, aos poucos, misturando com o auxlio de um pistilo.
Aquecer em uma placa a 60 C por 2 horas. Aps as 2 horas,
adicionar o lcool metlico lentamente, homogeneizando a soluo.
Transferir para um frasco contendo prolas de vidro que iro facilitar
a dissoluo. Amadurecer a soluo, deixando em repouso por 7-14
dias. Posteriormente, filtrar em papel de filtro e transferir para um
frasco mbar. Conservar em lugar fresco.
Fonte: Simons, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976.
476p
92
6.2 SOLUO DE Errecart
Formol comercial (40%). . . . . . . . . . . . . . . 1 ml

cido Actico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 ml
Soluo Fisiolgica . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml
6.3 GIEMSA ALCALINO
Adicionar uma soluo a 1 % de Bicarbonato de potssio soluo

corante, na proporo de uma gota daquela para cada 10 ml do
corante.
Fonte: Pessoa, S B. Parasitologia mdica. 9a ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1002 p.
6.4 COMPOSIO DA GUA TAMPONADA UTILIZADA NA

COLORAO DE GIEMSA (pH=6.8)
Soluo A
Frmula: KH2PO4 (fosfato de potssio monobsico)
Peso Molecular: 136.09
Preparar uma soluo estoque 0,15 M: 9,08 g, qsp 1 litro de H2O
Soluo B
Frmula: Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico)
Peso Molecular: 141.96
Mistura para se obter 100 ml de gua tamponada.
Fonte: SIMONS, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976. 476p.
93
6.5 COMPOSIO DO TAMPO DE COLORAO (pH 7,2)
Solues estoque
Soluo A
Frmula: NaH2PO4.2H2O (fosfato de sdio monobsico)
Peso Molecular: 177,96
Preparar uma soluo estoque 0,2 M: 35,59 g qsp 1 litro de H2O
Soluo B
Frmula: Na2HPO4.12H2O. (fosfato de sdio dibsico)
Peso Molecular: 357, 96
Tampo de Colorao:
Prepare o Tampo utilizando 100 ml da soluo estoque + 900 ml

de gua destilada e estoque a 4 C.
Fonte: Sousa, M.A. Biologia e taxonomia de tripanosomatdeos. Apostila do Curso de Ps-
graduao em Biologia Parasitria. Rio de Janeiro, IOC-FIOCRUZ, 2000. 57 p.
OBS: Sendo necessrio ajuste o pH a 7,2 com HCl ou NaOH.
6.6 CORANTES E DILUENTES PARA O MTODO DE WALKER
Soluo de azul de metileno fosfatado

1) Pesar as seguintes substncias:
Azul de metileno (medicinal em p).................1,0g
Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4).....1,0g
Fosfato de sdio bibsico (Na2HPO4)................3,0g
Misturar em gral seco.
2) Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250ml de gua destilada,
de chuva ou mineral sem gs.
94
Mistura de sais fosfatados (gua tamponada 6.4)
1) Pesar as seguintes substncias:
Fosfato de potssio monobsico. . . . . . . . 4,0g
Fosfato de sdio bibsico. . . . . . . . . . . . . . 6,0g
Misturar em gral seco.
2) Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 1.000ml de gua
destilada, de chuva ou mineral sem gs.
Soluo Alcolica de Giemsa

1) Pesar e medir as seguintes substncias:
Giemsa em p. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,75g
Glicerol (P.A.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 ml
lcool metlico (P.A.). . . . . . . . . . . . . . . . . 65 ml
2) Transferir o Giemsa em p para um gral; a seguir ir acrescentando

muito lentamente o glicerol, sempre misturando at formar uma
massa homognea. Por ltimo adicionar o lcool metlico tambm aos
poucos. Assim que estiver bem dissolvido, transferir para um frasco
escuro (mbar) contendo dentro algumas prolas de vidro. Inicialmente
agitar vrias vezes ao dia, at obter completa homogeneizao; depois
deixar em repouso alguns dias e, antes de usar, filtrar em papel de
filtro.
95
7. PROCEDIMENTOS DE EXAME DE TRIATOMNEOS:
7.1 EXAME DAS FEZES DE TRIATOMNEOS

1) Fazer uma pequena compresso no abdmen do inseto e
depositar as fezes ou urina obtida sobre uma lmina que j
dever conter um pequeno volume de salina, homogeneizar o
material com a extremidade de uma lmina e cobrir a seguir
com uma lamnula (20x20 ou 22x22);
3) Se for positiva, recomenda-se fazer uma distenso e corar o
material, com o mesmo objetivo j descrito anteriormente.
7.2 EXAME DO TUBO DIGESTIVO DE TRIATOMNEOS

2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do
abdmen (Figuras 9A e B);
3) Com a ajuda de pinas retirar todo o tubo digestivo do inseto,
atravs de movimentos de trao (Figuras 9C e D);
4) Macerar todo o contedo em duas ou trs gotas de soluo
fisiolgica;
5) Colocar o macerado sobre uma lmina que j dever conter
um pequeno volume de salina, homogeneizar o material com
a extremidade de outra lmina e cobrir a seguir com uma
lamnula (20x20 ou 22x22);
7) Se for positiva, recomenda-se fazer uma distenso e corar o
material, com o mesmo objetivo j descrito anteriormente.
96
Figura 9: Sequncia de retirada do tubo digestivo do inseto para exame.
Fotografias de Marco Aurlio Peregrino.
7.3 EXAME DA HEMOLINFA (diagnstico diferencial com

Trypanosoma rangeli)
2) Fazer um pequeno corte em qualquer uma das patas por onde
fluir a hemolinfa;
3) Depositar a hemolinfa sobre a lmina e cobrir com uma
lamnula;
4) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando o aumento de
400 X.
97
7.4 EXAME DA GLNDULA SALIVAR (diagnstico diferencial
com Trypanosoma rangeli)
1) Aps a retirada da hemolinfa, fazer a conteno do inseto,
atravs do uso de uma pina, apertando-o contra uma lmina
de vidro;
2) Com outra pina puxar a cabea do inseto de modo a decapit-
lo e a expor as glndulas salivares;
3) Examinar as glndulas salivares entre lmina e lamnula.
8. RECOMENDAES IMPORTANTES:
As lminas empregadas devem estar bem limpas e
desengorduradas. Para desengordurar, deixar as lminas imersas
em uma soluo de lcool etlico mais ter (proporo de 9:1).
Nunca empregar lminas que apresentem manchas causadas
pela oxidao;
As lminas usadas podem ser limpas em gua com sabo em
p (1 colher de sopa cheia para cada litro dgua), deixando em
repouso por 48 horas. Depois devem ser muito bem enxaguadas
e enxutas com uma toalha limpa;
Sempre ter em mente os cuidados com biossegurana, utilizando
os equipamentos de proteo individuais (EPIs), como luvas de
ltex, jalecos, protetores faciais, etc;
Quando empregar gua da torneira, verificar o pH, pois existem
significativas variaes de pH conforme a fonte da gua;
Testar o fixador e os corantes, antes do uso, pela primeira vez, ou
aps um longo perodo de estocagem. Sempre utilizar produtos
de qualidade e evitar produtos hidratados;
Deixar as lminas secarem em local arejado e em superfcie
plana. A dessecao rpida das clulas indispensvel para uma
boa conservao morfolgica. Quando possvel, coloc-las em
uma estufa a 28 C, principalmente em locais com alta umidade.
Nunca usar aquecimento para sec-las;
98
Em uma boa preparao a distenso deve ser delgada, isto ,
as clulas devem estar estendidas em uma nica camada, sem
superposio e nem formao de gros ou flocos. No caso de
amostra de sangue, os glbulos brancos devem apresentar
colorao roscea. Sua imagem deve ser clara, ntida e uniforme,
no contendo manchas de corante nem bolhas de ar ou falhas,
assim como rupturas ou pontos de desagregao;
As distenses, feitas a partir de sangue coletado com
anticoagulante, devem ser coradas at o perodo de 30 min, para
se evitarem deformaes celulares;
imprescindvel que seja colocada uma etiqueta contendo o
nome do paciente e a origem (nome, n de registro, local e a
data de obteno da amostra biolgica). O rtulo deve ser escrito
a lpis e colado na borda da lmina. Se a lmina tiver a borda
esmerilhada, escrever na parte fosca;
Sempre fazer um teste prvio para estimar o tempo de colorao
ideal;
No protocolo da gota espessa, tanto a desemoglobinizao como
as etapas de colorao e lavagem devem ser executadas muito
cuidadosamente, a fim de no desorganizar ou desprender a
camada de sangue no fixada;
As lminas, aps serem coradas, devem ser guardadas em caixas
apropriadas at o momento da leitura ou em papel absorvente;
A amostra corada deve ser examinada ao microscpio,
empregando a objetiva de imerso (100X).
99
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112
1. MORFOMETRIA DO Trypanosoma cruzi
o procedimento tcnico onde so mensuradas, em centmetros

ou milmetros, as imagens desenhadas das formas evolutivas do
T.cruzi. Esse desenho efetuado a partir da imagem real do parasita,
vizualizada ao microscpio ptico, projetada sobre o papel, utilizando-
se umacmara clara acoplada ao microscpio (Figura 1A). Aps efetuar
o desenho, as medidas so feitas com o auxlio de rgua ou curvmetro.
O curvmetro um aparelho utilizado para as mensuraes no papel
(Figura 1B).
Figura 1: A) Microscpio ptico com cmara clara acoplada; B) curvmetro.

Fotos de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Antes do iniciar os desenhos, necessrio estabelecer a escala para

mensurao e para isso ser necessria a aquisio de uma lmina
micromtrica. Ao observarmos a lmina micromtrica, ao microscpio
ptico, verificamos que na mesma existem vrios traos, ou seja,
uma escala maior de 1 mm com subdivises maiores de 0,1mm e
subdivises menores de 0,01 mm, que seria o mesmo que 1000 m
com subdivises de 10 m (Figura 2).
113
Figura 2: Fotografia da lmina micromtrica e esquema
mostrando as divises de 10 micmetros.
Fotografia e esquema por Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Estes traos, que representam o segmento da escala da lmina

micromtrica, sero projetados, com auxlio de uma cmara clara,
sobre o papel onde ser realizado o desenho. Ao fazer a projeo
sobre papel, traar, uma linha reta equivalente a 10 m, baseando-se
sempre na escala de uma lmina micromtrica e medir posteriormente
com uma rgua para ver a medida em milmetros.
Ao fazer a correlao entre os valores da escala da lmina
micromtrica e o correspondente quando essa escala projetada
sobre o papel e medida em mm, torna-se possvel aferir o tamanho
do parasita a partir dos desenhos que sero efetuados sobre o papel
(Figura 3), na etapa seguinte. Dividindo-se o valor medido no papel
pelo valor referente na lmina micromtrica temos o fator de correo,
que representa a ampliao da imagem no papel (aumento em relao
ao tamanho real).
Figura 3: Desenhos de
formas tripomastigotas
de T. cruzi.
Fonte: Junqueira, CVJ, 2005

(tese de doutorado).
114
Aps o desenho, dever ser feita a mensurao percorrendo o
curvmetro pela parte mediana do parasita de acordo com o segmento
de interesse. O desenho abaixo (Figura 4) apresenta as diferentes
medidas morfomtricas possveis.
A medida obtida no curvmetro (mm) ser ento comparada com
o trao desenhado no papel, o qual representa a imagem da escala
da lmina micromtrica. A partir da mensurao pelo curvmetro
podemos calcular o tamanho real de qualquer parasita desenhado
dividindo-se o valor obtido pelo fator de correo.
Exemplo:
Considerando, por exemplo, que a medida de 10 micrmetros
traada no papel tenha 25 mm podemos calcular o fator de correo
dividindo 25 mm por 0,01mm (10 micrmetros). O fator de correo
ser 2.500 (25 mm 0,01), ou seja, o desenho no papel estar
aumentado 2.500 vezes. Para calcular o tamanho real de um outro
parasita que tenha no papel 30 mm de comprimento, teremos que
dividir 30 por 2500, nesse caso 0,012mm (12 micrmetros).
Figura 4: Esquema com as diferentes medidas morfomtricas.

Fonte: Junqueira, CVJ, 2005 (tese de doutorado).
115
Abreviaes:
C comprimento de corpo sem o flagelo livre
FL comprimento do flagelo
PN distncia que vai da extremidade posterior ao meio do ncleo
L largura do corpo (sem membrana ondulante)
NA distncia do meio do ncleo a extremidade anterior
T comprimento do corpo incluindo o flagelo
PK distncia que vai da extremidade posterior ao meio do cinetoplasto
KN distncia do meio do cinetoplasto ao meio do ncleo
kDNA dimetro do cinetoplasto
A tabela abaixo demonstra as mensuraes de diferentes ndices

morfomtricos de uma lmina de Trypanosoma cruzi feita a partir de
uma lmina, corada com Giemsa, confeccionada com uma amostra
de sangue de gamb.
Tabela 1: Mensuraes de diferentes ndices morfomtricos

de uma lmina de Trypanosoma cruzi.
116
2. MORFOLOGIA DAS FORMAS EPIMASTIGOTA E
TRIPOMASTIGOTA DO T. cruzi
Figura 5: Morfologia de uma forma epimastigota (A)

e de uma forma tripomastigota (B).
Fotos de Carlos Jos de Carvalho Moreira. / Desenhos adaptados por Carlos Jos de Carvalho Moreira e
Angela C. V. Junqueira. / Fonte: site http://webs.cb.uga.edu/~striepen/medpara/tryps3.ppt
2.1 ASPECTOS MORFOLGICOS do T. cruzi E DO T. rangeli
Formas tripomastigotas de T. cruzi, em lminas de sangue de

indivduos com suspeita de malria.
117
Figura 6: Morfologia de formas tripomastigotas sanguneas.
Fotografias de Maria Celeste D. Spata e Angela C. V. Junqueira.
Formas de T. cruzi, em lminas de tubo digestivo de triatomneos

infectados experimentalmente.
Figura 7: Morfologia de formas tripomastigota (A) e epimastigotas (B,C).

Fotografias de Maria Celeste D. Spata.
Formas de T. rangeli, em lmina de sangue, glndula salivar e

hemolinfa de triatomneos infectados experimentalmente.
Figura 8: Morfologia de formas do T. rangeli no sangue (A),

hemolinfa (B) e nas fezes (C).
Fotografias de Maria Celeste D. Spata.
118
Tabela 2: Diagnstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi pela morfologia,
no vertebrado, no vetor e em meio de cultura.
Fonte: Coura, J.R.; CARVALHO-MOREIRA, C.J.; Junqueira, A.C.V.; Tripanossomase rangeli. In: Dinmica
das Doenas Infecciosas e Parasitrias. 1a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan , 2005. p. 685-689.
119
Figura 9: Prancha com diferentes formas do T. cruzi.
Fonte: HOARE, C.A. The Trypanosomes of Mammals: A zoological monograph. 1 ed. Oxford
and Edinburgh: Blackwell 749 p. Scientific publications LTD, 1972, 749 p.
120
Figura 10: Prancha com diferentes formas do T. rangeli.
Fonte: HOARE, C.A. The Trypanosomes of Mammals: A zoological monograph. 1 ed. Oxford
and Edinburgh: Blackwell 749 p. Scientific publications LTD, 1972, 749 p.
121
2.2 TRIPOMASTIGOTAS ENCONTRADOS EM ESFREGAOS
DO SANGUE DE MACACOS-DE-CHEIRO NATURALMENTE
INFECTADOS
Figura 11: A e B so tripanosomas semelhantes ao T. samirii;

C, D e E, Trypanosoma minasense; e F, T. rangeli.
Fonte: BARCELOS, M.Z.C. Tripanosomas de Macacos-de-cheiro: o que o Trypanosoma

saimirii Rodhain, 1941?. 1995. 100p. (dissertao de mestrado),
Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro.
122
2.3 ASPECTOS MORFOLGICOS DE FORMAS SANGUNEAS
Figura 12: Formas trofozotas de Plasmodium falciparum (1a, 1b), trofozotas de

Plasmodium vivax (2a, 2b) e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (3a, 3b).
Fotografias de Angela C.V. Junqueira.
123
3. PORTARIA N 2472 DE 31/08/2010 - D.O.U., 01/09/2010
pgina 1
124
pgina 2
125
4. FICHA DE NOTIFICAO DE DOENA DE CHAGAS AGUDA -
SINAN
pgina 1
126
pgina 2
Observao: Apenas a deteco do T. cruzi em amostras de sangue pelos

mtodos parasitolgicos diretos confirmatria de DCA.
127
5. PROPOSTA DE FLUXOGRAMA PARA NOTIFICAO DE
CASOS DE INFECO POR T. cruzi
Figura 14: Fluxograma adaptado por Junqueira,

A.C.V., Moreira, C.J.C. e Mamede-Oliveira, S.
128
6. PROPOSTA DE FLUXOGRAMA PARA NOTIFICAO DE
CASOS DE INFECO POR T. rangeli
Figura 15: Fluxograma elaborado por Junqueira, A.C.V. e Moreira, C.J.C.
129
7. PROPOSTA DE FLUXO DE REVISO E CONTROLE DE
QUALIDADE DAS LMINAS COM AMOSTRAS DE SANGUE
Figura 17: Fluxograma elaborado por Junqueira, A.C.V. e Mamede-Oliveira, S.
130
8. PROPOSTA DE FLUXOGRAMA PARA CONDUTA A PARTIR
DA COLETA/CAPTURA DE TRIATOMNEOS
Figura 16: Fluxograma elaborado por Junqueira, A.C.V. e Giordano-Dias, C.M.
131
9. Mtodo tradicional de avaliao de parasitemia
semiquantitativa (em cruzes) para malria que
pode ser empregado na contagem do T. cruzi
Utilizar os mesmos critrios estabelecidos para a contagem de

Plasmodium sp. para as lminas onde forem detectadas formas
tripomastigotas sanguneas, enumerados abaixo:
1) Nmero de campos a examinar = 100.
2) Nmero inferior a 40 parasitos nos 100 campos examinados:
anotar o nmero encontrado. Por exemplo: 37 formas
tripomastigotas sanguneas.
3) Quando o nmero total de parasitos contados situar-se entre
40 e 60 parasitos por 100 campos, registrar: 1/2 (meia cruz).
4) A partir de um parasito por campo, o resultado ser registrado
como uma, duas, trs ou quatro cruzes, conforme a tabela a seguir
(tabela 3):
Tabela 3: Avaliao semiquantitativa

de parasitemia para malria.
Figura 18: Adaptado de MINISTRIO DA SADE. SECRETARIA DE VIGILNCIA

Exemplo de EM SADE 2005. Manual de diagnstico laboratorial da malria
Contador manual (Serie A. Normas e Manuais Tcnicos). Ministrio da Sade, Secretaria
de clulas. de Vigilncia em Sade. Braslia: Ministrio da Sade, 116p.
OBS: Para a contagem ter um valor semiquantitativo de suma

importncia que a lmina contenha uma distribuio uniforme do sangue.
132
10. AVALIAO DA PESQUISA DE DCA NOS MUNICPIOS
QUE TIVERAM MICROSCOPISTAS/LABORATORISTAS
CAPACITADOS PARA A DETECO DE T. cruzi NO EXAME
DIRETO
10.1 Avaliao 1 - AVALIAO ATRAVS DOS RESULTADOS

DAS LEITURAS DAS LMINAS DOS MICROSCOPISTAS DE
MALRIA
Antes de ser implantada de forma ampla a vigilncia da doena

de Chagas compartilhada com a vigilncia da Malria na Amaznia
Brasileira, como parte de um estudo piloto, estamos estudando a
possibilidade de que seja avaliada junto com os responsveis pelo
Programa de Malria do Ministrio da Sade, a possibilidade de que os
dados da Ficha de Notificao/SINAN/Malria sejam compartilhados
com as seguintes informaes adicionais na referida ficha:
47. Realizada pesquisa de Trypanosoma sp. na lmina:

1. Sim
2. No
48. Caso sim, resultado do exame:

1. Negativo
2. T. cruzi (Tc)
3. T. rangeli (Tr)
4. Infeco mista (Tc+Tr)
5. Dvida na identificao da espcie do gnero Trypanosoma
133
49. Parasitemia em cruzes*:
1. < + (menor que meia cruz);
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
4. ++ (duas cruzes);
5. +++ (trs cruzes);
6. ++++ (quatro cruzes).
50. No caso de infeco mista (Tc+Tr) a parasitemia em cruzes:

a) T. cruzi
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
----------------------------------------------
b) T. rangeli
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
6. ++++ (quatro cruzes)
*Estimativa da densidade parasitria (vide pgina 134).
134
Atravs da anotao dos dados acima na Ficha de Notificao/
SINAN/Malria, ser possvel um aumento na notificao dos
casos de doena de Chagas aguda (DCA). Essa informao seria
disponibilizada para a equipe do Programa Nacional de Controle da
Doena de Chagas (PNCDCh/SVS/MS) permitindo um estudo da
busca passiva dos casos de DCA na Amaznia Brasileira. Um caso
ndice dever desencadear a busca ativa de outros casos positivos,
pois a ele podem estar associados outros tantos casos de Doena de
Chagas Aguda (DCA) como de Doena de Chagas Crnica (DCC). Essa
investigao dever se iniciada, imediatamente, atravs da pesquisa
direta dos comunicantes do caso ndice.
Ressaltamos, que para que isso ocorra, a equipe do Programa de
Malria dever ser consultada e aprovar tal incluso.
10.2 Avaliao 2 - AVALIAO ATRAVS DOS LABORATORISTAS

RESPONSVEIS PELA LEITURA DA CONTAGEM ESPECFICA DE
LEUCCITOS NAS PROVAS DE HEMOGRAMA
1.Realizada pesquisa de Trypanosoma sp. na lmina para contagem

especfica de leuccitos:
1. Sim 2. No
2. Caso sim, resultado do exame:

1. Negativo
2. T. cruzi (Tc)
3. T. rangeli (Tr)
135
3. Parasitemia em cruzes*:
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
4. No caso de infeco mista (Tc+Tr) a parasitemia em cruzes:

a) T. cruzi
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
----------------------------------------------
b) T. rangeli
2. + (meia cruz);
3. + (uma cruz);
*Estimativa da densidade parasitria (vide pgina 134).
136
10.3 Avaliao 3 - AVALIAO ATRAVS DOS LABORATORISTAS
QUE EFETUARAM OUTRAS PROVAS PARASITOLGICAS DIRETAS
DE CONCENTRAO: Mtodo de Strout, Microhematcrito
ou QBC
1. Realizada pesquisa de Trypanosoma sp. anteriormente na gota

espessa:
1. Sim
2. No
2. Caso sim, qual o resultado da gota espessa:

1. Negativo
2. T. cruzi (Tc)
3. T. rangeli (Tr)
3. Qual o resultado das provas parasitolgicas diretas de

concentrao:
1. Negativo
2. Positivo para Tripanosoma sp.
Para confirmar a identificao dever ser efetuada uma

distenso (esfregao) do material para identificao da espcie.
137
11. CLCULO DE FATOR DE CORREO DE UM MICROSCPIO
(Brener, 1961)
MATERIAL:
- Microscpio objetiva de 40x
- Lamnula - tamanho 22x22
- Pipeta de Salhi ou pipeta automtica dividida em 5l
- Lmina tamanho comum
CLCULO:
Colocar 5l de sangue, com pipeta de Salhi (ou micropipeta
automtica) na lmina e sobre esta lamnula 22x22. Distribuir esse
sangue por toda a lamnula. Contar quantos campos existem de um
lado ao outro da lamnula, no sentido horizontal e vertical, pelo menos
3 vezes. Feito isto, calcular a mdia.
Ex.: contagem horizontal = 49 campos microscpicos
contagem vertical = 49 campos microscpicos
Aps achar a mdia, no caso 49, calcular o total de campos

presentes por toda a lamnula. Ex:
49 x 49 = 2401 (total de campos)
Como a contagem feita em 50 campos, dividir o nmero total
de campos da lamnula por 50, com a finalidade de achar o fator de
correo da lamnula. Logo, 2401 / 50 = 48,02.
No exemplo acima o fator de correo 48.
CONTAGEM DO NMERO DE PARASITOS:

Aps verificar o nmero de formas tripomastigotas em 50 campos
microscpicos, multiplicar este valor pelo fator de correo.
Exemplo: 1 forma tripomastigota em 50 campos = 1 x 48 = 48 formas
138
1 forma tripomastigota em
50 campos = 1 x 48 = 48 formas
1 trao = 10 campos / 5 traos= 50 campos
12. CLCULO DA FORA CENTRFUGA RELATIVA (FCR/G) A

PARTIR DO NMERO DE ROTAES POR MINUTO (RPM) ou
CLCULO DO NMERO DE ROTAES POR MINUTO (RPM) A
PARTIR DA FORA CENTRFUGA RELATIVA (FCR/G)
12.1 CLCULO DO RAIO MXIMO
Em primeiro lugar temos que conhecer com exatido o raio de
rotao da centrfuga, que depende do tipo de rotor utilizado. Nem
todos os fabricantes de centrfuga informam esta medida no manual
do aparelho. Neste caso, devemos efetuar os procedimentos descritos
a seguir:
Como a figura ilustra, o raio deve ser medido desde o centro do
rotor at o final dos tubos, quando em rotao. A seta indica o raio
mximo ( Rmax ), que corresponde medida do centro do eixo at a
parte mais externa dos tubos (Figura 19).
Figura 19: A figura ao lado exemplifica

diferentes tipos de rotores: mvel ou
horizontal (caso 1), em ngulo fixo
(caso 2) e vertical (caso 3).
Fonte: Princpios Bsicos da Centrifugao

(Modificada do site: www.coleparmer.com/
techinfo/techinfo.asp?htmlfile=basiccentrifugatio
n_PO.htm&ID=911)
139
12.2 CLCULO DE g OU rpm A PARTIR DE DUAS VARIVEIS
CONHECIDAS:
A seguir demonstraremos duas possibilidades de fazer as

converses atravs do uso de uma escala denominada nomograma de
fora centrfuga ou atravs da utilizao de uma frmula matemtica.
12.3 UTILIZANDO O NOMOGRAMA (*) DE FORA

CENTRFUGA:
Aps a mensurao do raio de rotao da centrfuga, podemos
utilizar o nomograma de fora centrfuga impresso abaixo, onde as
escalas A, C e B representam respectivamente raio, g (fora centrfuga
relativa - gravidades) e rpm (velocidade - revolues por minuto).
No exemplo do nomograma: para encontrar a fora centrfuga
relativa (g) a uma distncia radial de 10 cm do centro de rotao
(10 cm de raio), ao se operar a centrfuga a uma velocidade de 3000
rpm, temos que colocar uma rgua na tabela, conectando o ponto de
10 cm na escala de rotao do raio com o ponto de 3000 rpm na
escala de velocidade. Veja o ponto de interseco na escala de fora
centrfuga relativa. No nosso caso, ser igual a 1000 g (Figura 20).
(*) A nomografia um processo de clculo usado pela engenharia

para a resoluo de problemas matemticos utilizando grficos
chamados de nomogramas. Estes so traados a partir de
um conjunto de eixos convenientemente dispostos, em forma
ordenada, permitindo resolver grupos de problemas semelhantes.
12.4 UTILIZANDO A FRMULA MATEMTICA:

FCR (fora centrfuga relativa ou g) = 0,00001118 x r x N2, onde:
FCR (fora centrfuga relativa) = g
r = raio de rotao (cm)
N = velocidade de rotao (rpm)
Fonte: Campbell, J M; Campbell J B. Matemtica de Laboratrio: aplicaes mdicas e biolgicas.
So Paulo: Ed. Roca, 1986, 348 p.
140
Exemplo 1: tendo o valor de rpm e querendo calcular o valor de g
No caso do exemplo acima, em que utilizamos o nomograma,

onde temos o raio igual a 10 cm e o nmero de rotaes por minuto
igual a 3.000, podemos calcular o valor de g pela frmula. Ento:
g (FCR) = 0,00001118 x 10 x N 2
g = 0,0001118x (3.000) 2
g = 0,0001118 x 9.000.000
g = 1.006,2, ou seja, g = ~ 1.000, que foi o valor encontrado no
nomgrafo, no caso do exemplo anterior.
Figura 20: Nomograma.

Fonte: Campbell, J M; Campbell J B. Matemtica de Laboratrio: aplicaes
mdicas e biolgicas, So Paulo: Ed. Roca, 1986, 348 p.
141
Exemplo 2: tendo o valor de g e querendo calcular o valor de
rpm
O Manual Prtico de Subsdio Notificao Obrigatria no SINAN,
que explica a tcnica de micro hematcrito, recomenda centrifugar 75
l de sangue incoagulvel em tubo capilar, entre 5 e 10 minutos a 160
g em microcentrfuga. Podemos aplicar a frmula para achar o valor
correspondente a rotaes por minuto (rpm), partindo do princpio de
que a centrfuga s apresente escala para rpm. Supondo que o raio da
minha centrfuga seja de 15 cm, teramos:
160 = 0,00001118 x 15 x N2
160 = 0,0001677 x N2
160 / 0,0001677 = N2
954.084,67 = N2 N2 = 954.084,67
N= 954.084,67, ento, N= 976,77 rpm (~ 980 rpm).
142
13. PROCEDIMENTO DE PUNO DIGITAL PARA COLETA
DE SANGUE VISANDO O PREPARO DE GOTA ESPESSA OU
ESFREGAO
1) Calar luvas de ltex descartveis e limpar vigorosamente a pele

do local de puno (parte lateral do segundo ou terceiro dedo
da mo, lbulo da orelha ou, em lactentes, o dedo grande do
p ou calcanhar) com gaze ou algodo embebido em lcool a
70%; posteriormente, enxugar com gaze ou algodo secos;
2) Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter
outra gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar para
no tocar o ponto de sada do sangue;
3) Segurar a lmina firmemente pelas bordas da extremidade
onde se encontra a etiqueta de identificao;
4) Aproximar a lmina ao dedo do paciente (pela face onde consta
a identificao) at tocar o alto da gota de sangue (evitando o
contato com a pele). Se a quantidade de sangue for insuficiente,
pode-se colocar outra gota ao lado da primeira;
5) Colocar a lmina, com a face para cima, na superfcie de
trabalho;
6) Com o canto e os primeiros 5 mm da borda maior da segunda
lmina, espalhar o sangue formando um retngulo de tamanho
e espessura adequado (aproximadamente 1,2 cm2);
7) Limpar o local puncionado com gaze ou algodo embebido em
lcool a 70% e, se necessrio, pression-lo;
8) Secar a lmina (em temperatura ambiente, ar morno, caixa
com lmpada ou estufa), cuidando para que o sangue no se
fixe por calor excessivo;
9) Para iniciar a pr-colorao, esperar at que o sangue esteja
totalmente seco. Caso contrrio pode haver perda total de
material.
Fonte: Adaptado de MINISTRIO DA SADE. SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE 2005. Manual de
diagnstico laboratorial da malria (Serie A. Normas e Manuais Tcnicos).
Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia: Ministrio da Sade,116p.
143
Figura 21: Procedimento para coleta de sangue.
Fonte: RPUBLIQUE DMOCRATIQUE DU CONGO/MINISTRE DE LA SANT/PROGRAMME NATIONAL

DE LUTTE CONTRE LE PALUDISME ( apud MINISTRIO DA SADE. SECRETARIA DEVIGILNCIA
EM SADE. Manual de diagnstico laboratorial da malria (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos).
Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia: Ministrio da Sade, 2005. 116 p.
144
14. Montagem permanente de lminas coradas
utilizando entellan *
1) Aps a finalizao do procedimento de colorao, pegar com

um basto de vidro aproximadamente uma gota de Entellan
(ou mais, dependendo da quantidade de material sobre a
lmina) e depositar sobre o esfregao. Tomar o cuidado de
colocar o entellan de uma s vez, formando uma gota nica,
homognea e sem bolhas;
2) Pegar uma lamnula limpa em lcool-ter 1:1 e coloc-la sobre
a gota de Entellan. Essa etapa tambm deve ser realizada
com cuidado, procurando depositar a lamnula de forma mais
paralela possvel em relao lmina e de uma vez s, evitando
ao mximo a formao de bolhas;
3) Em seguida, a lmina dever ser colocada na horizontal em
bancada ou suporte sem inclinao, para que o Entellan
se espalhe lentamente por capilaridade ao longo de toda a
lamnula. Deve-se aguardar a lmina estar completamente seca
para ser analisada em microscpio tico (aumento de 1000
vezes). Isso demora mais de 24 horas;
4) Se a amostra corada ocupar grande parte do comprimento da
lmina empregar uma lamnula retangular (tipo a usada na
tcnica de fluorescncia indireta). importante que todo o
espao ocupado pela amostra biolgica sobre a lmina fique
coberto com uma lamnula;
5) Se o Entellan endurecer, colocar um pouco de xilol dentro do
frasco e a seguir deixar aquecer por algumas horas;
6) Verificar o tipo de corante usado na colorao, pois no caso
do Entellan ele tende a descorar a lmina, caso tenha sido
utilizado eosina azul de metileno.
* Caso no disponha de Entellan, empregar blsamo do Canad sinttico.
145
15. Principais Procedimentos de Biossegurana
em LABORATRIOS DE PARASITOLOGIA
Devemos sempre ter em mente que o laboratrio um

ambiente hostil, onde convivem no mesmo espao equipamentos,
microorganismos, pessoas, reagentes inflamveis, solues, papis,
etc.
As boas prticas de biossegurana em qualquer laboratrio so
condutas que visam evitar os casos de Infeces Adquiridas no
Laboratrio (IAL). As pessoas mais expostas a riscos de IAL so as
que trabalham nos laboratrios clnicos e de pesquisa, por causa do
manuseio em larga escala de materiais potencialmente infectantes.
Abaixo esto relacionadas algumas das principais normas
para evitarmos acidentes laboratoriais e consequentemente nos
contaminarmos:
15.1 REGRAS GERAIS

Antes de entrar no laboratrio prenda o cabelo, coloque uma
cala comprida de tecido resistente; calce sapatos fechados
anti-derrapantes (de preferncia sapatos de couro) e vista uma
camisa de algodo grosso (figura 23);
Antes de comear as atividades laboratoriais, coloque os
Equipamentos de Proteo Individual (EPI) adequados. Eles
sero relacionados mais a frente;
Lave as mos antes e imediatamente aps o manuseio de
materiais qumico e biolgico independente do contato direto;
Nunca pipete com a boca. S use pipetadores automticos ou
manuais (exemplo: peras de borracha);
Na tentativa de identificar um produto qumico, nunca inale o
contedo de frascos que tenham perdido o rtulo;
Nunca prepare, beba ou coma alimentos dentro do laboratrio;
146
Nunca fume no laboratrio;
Nunca guarde alimentos em geladeiras e congeladores utilizados
para armazenamento de material biolgico e/ou qumico e vice-
versa;
Se voc apresentar alguma ferida na mo, no pulso ou em
qualquer outra parte do corpo que venha a ficar exposta durante
o trabalho no laboratrio no trabalhe com material patognico
ou qumico;
Evite transportar materiais qumicos e/ou biolgicos com agentes
patognicos vivos de um lugar para outro no laboratrio. Isso
aumenta o risco de acidentes. Use caixas apropriadas para esse
fim (figura 22).
Figura 22: Tipo de caixa selecionada durante o curso de transporte

de material biolgico, desenvolvido pela CIBio/IOC.
Fonte: Informe do IOC; Publicao do Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz - Ano XII - n0 44 - 30/11/2006.
OBS: O transporte de amostras biolgicas gera basicamente dois

tipos de preocupaes: a) temperatura de transporte e o tempo;
b) condies de biossegurana de quem realiza o transporte e daqueles
que possam vir a ter contato eventual com o material transportado.
147
15.2 Principais Equipamentos de Proteo Individual
(EPIs)
Dispositivos ou equipamentos utilizados para proteo individual
do profissional e na preveno de acidente nas atividades de trabalhos
executados em setores e unidades que oferecem riscos de acidentes.
15.2.1 GORRO - O gorro a medida de proteo que evita a

contaminao dos cabelos por aerossis, micropartculas constitudas
por microorganismos, matria orgnica e por fragmentos expelidos
pela boca.
Abaixo temos algumas observaes para o correto uso dos
gorros:
Prender o cabelo;
Cobrir todo o cabelo com o gorro;
Deixar as orelhas protegidas pelo gorro;
Evitar brincos;
Ao retirar o gorro, puxe-o pela parte superior central e descarte-o
no recipiente de resduos.
15.2.2 VISEIRA FACIAL ou CULOS DE PROTEO - Devem ter a

melhor transparncia possvel no distorcendo as imagens. Protegem
os olhos e o rosto contra espirros decorrentes de procedimento que
envolva material molhado, radiao de fontes eletromagnticas (laser,
microondas, ultravioleta, raios x e radiao trmica), fadiga visual
associado luz muito forte, fraca ou reflexo.
Abaixo temos algumas observaes para o correto uso de viseiras
ou culos de proteo:
O visor facial deve ser lavado, aps o trabalho, com gua e sabo
se houver sangue ou secreo visvel, aps cada procedimento,
enxaguando abundantemente com gua corrente;
148
Alm da lavagem com gua e sabo, deve-se fazer uma
desinfeco com produto qumico adequado ao material que
constitui o visor ou dos culos. Aos mais friveis, que sofrem avaria
com glutaraldedo ou lcool a 70%, utilizar gua oxigenada;
Esses procedimentos devem ser realizados protegendo as mos
com luvas.
15.2.3 LUVAS - As luvas servem como barreira de proteo, prevenindo

contra a contaminao das mos durante a manipulao de material
contaminado. O uso das luvas no substitui a necessidade da lavagem
das mos porque elas podem apresentar pequenos orifcios no
aparentes ou danificar-se durante o uso, podendo contaminar as
mos quando removidas.
Abaixo temos algumas observaes para o correto uso das luvas:
Usar luvas de ltex sempre que houver chance de contato com
sangue, fludos do corpo, trabalho com microrganismos e animais
de laboratrio;
No usar luvas fora da rea de trabalho;
No abrir portas usando luvas;
No atender telefone usando luvas;
Nunca reutilizar as luvas, e sempre descart-las de forma segura.
15.2.4 MSCARA - Oferecem proteo contra partculas, substncias

cidas, substncias alcalinas, aldedo e para outras substncias
txicas.
Podem ter diferentes constituies. Mscaras descartveis com
paredes duplas ou triplas so fundamentais para a proteo contra a
inalao ou ingesto de aerossis pelos profissionais e na transmisso
de microorganismos.
149
15.2.5 JALECOS - So usados para formar uma barreira de proteo
e reduzir o risco de transmisso de microrganismos. Previnem a
contaminao das roupas, protegendo a pele da exposio a sangue
e fluidos corpreos, salpicos e derramamentos de material infectado.
Devem sempre ser de mangas longas, confeccionados em algodo
ou fibra sinttica (no inflamvel).
Abaixo temos algumas observaes para o correto uso de jalecos:
Uso de jaleco permitido somente nas reas de trabalho;
Os jalecos nunca devem ser colocados no armrio onde so
guardados objetos pessoais;
Devem ser descontaminados antes de serem lavados.
OBS.: Devemos trabalhar seguindo todas as recomendaes citadas
anteriormente, pois um agente infeccioso pode estar presente em
diversos fluidos corporais como sangue, licor, urina, smem, etc.
Figura 23: Paramentao completa.

Fotografia de Carlos Jos de C. Moreira.
150
16. CONCEITOS E NORMAS REFERENTES Desinfeco,
Esterilizao E Limpeza;
16.1 DESINFECO - processo fsico ou qumico que inativa ou destri

a maioria dos microrganismos patognicos de objetos inanimados e
superfcies, com exceo de esporos bacterianos;
16.2 Esterilizao - processo fsico ou qumico que destri todas as

formas de vida microbiana, ou seja, bactrias nas formas vegetativas e
esporuladas, fungos e vrus.
16.3 Limpeza - processo sistemtico e contnuo para a manuteno

do asseio ou, quando necessrio, para a retirada de sujidade de uma
superfcie.
OBS: Resoluo RDC-ANVISA n 302, de 13-10-2005
Item 5.8 - Limpeza, Desinfeco e Esterilizao.
5.8.1 - O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem

possuir instrues de limpeza, desinfeco e esterilizao, quando
aplicvel, das superfcies, instalaes, equipamentos, artigos e materiais.
5.8.2 - Os saneantes e os produtos usados nos processos de limpeza

e desinfeco devem ser utilizados segundo as especificaes do
fabricante e estarem regularizados junto a ANVISA/MS, de acordo com
a legislao vigente.
Em caso de dvidas sobre algum tipo de procedimento recomendamos

o site: http://www.anvisa.gov.br
151
17. PRINCIPAIS COMPOSTOS DESINFETANTES
17.1 lcoois - so mais utilizados os lcoois etlico e isoproplico.
So bactericidas, eliminando tambm o bacilo da tuberculose, os
fungos e os vrus. No tem efeito contra os esporos bacterianos.
Sua concentrao ideal est entre 60 e 90% por volume. Causam a
desnaturao das protenas quando na presena de gua.
17.2 COMPOSTOS BICLORADOS - geralmente usam-se os hipocloritos
de sdio ou clcio. Tem amplo espectro de antimicrobiano e ao
rpida. Alguns fatores levam sua decomposio, interferindo em
suas propriedades: temperatura, concentrao, presena de luz e pH.
Acredita-se que estes produtos agem por inibio de algumas reaes
enzimticas dentro das clulas, por desnaturao de protenas e por
inativao do cido nuclico.
17.3 FORMALDEDO - usado como desinfetante ou esterilizante

nas formas gasosa ou lquida. comumente encontrado como
formalina, sendo esta sua diluio aquosa a 37%. A formalina um
potente bactericida, fungicida, agindo tambm contra vrus, bacilos
da tuberculose e esporos bacterianos. Tem uso limitado por ser um
composto cancergeno.
17.4 PERXIDO DE HIDROGNIO (gua oxigenada) - um

composto bactericida, esporicida, fungicida, eliminando tambm os
vrus. Agem produzindo radical hidroxila livre que ataca a membrana
lipdica, o DNA e outros componentes essenciais vida da clula.
usado como desinfetante em concentrao de 3%, para superfcies
no orgnicas. No usado como esterilizador, pois tem atividade
inferior do glutaraldedo.
17.5 FENIS - agem como veneno protoplasmtico, penetrando e

rompendo a parede celular por precipitao de protenas. Em baixas
concentraes, causa morte celular por inativao dos sistemas
enzimticos essenciais manuteno da integridade da parede
152
celular. So usados para desinfeco do ambiente hospitalar, incluindo
superfcies de laboratrios e artigos mdico-cirrgicos.
17.6 COMPOSTOS IODADOS - tem ao desinfetante, bactericida,
viricida, fungicida e esporicida. O composto iodado penetra a parede
celular dos microorganismos rompendo a sua estrutura e inativando a
sntese das protenas e do cido nuclico. So exemplos de compostos
iodados a polivinilpirrolidona iodada, e o iodophor (Biocid).
17.7 GLUTARALDEDO - largamente utilizado como desinfetante e
quimioesterilizador. Sua soluo aquosa necessita de pH alcalino para
eliminar esporos bacterianos. Age alterando o DNA e o RNA, bem
como a sntese protica dos microorganismos. mais comumente
usado como desinfetante de alto nvel para equipamento mdico.
txico, e, portanto, o pessoal que o manuseia deve se proteger usando
luvas e culos.
17.8 COMPOSTOS QUATERNRIOS DE AMNIA - so agentes de

limpeza, porm podem ser inativados por material orgnico, no
sendo mais utilizados como desinfetantes ou anti-spticos. Tem sua
ao antimicrobiana, atribuda inativao de enzimas produtoras de
energia, desnaturando protenas essenciais das clulas e rompendo
a membrana celular. So recomendados para sanitarizar superfcies
como cho, mveis e paredes (meio hospitalar).
Fontes: Kalil , E.M.; da Costa, A.J.F. Desinfeco e esterilizao. Acta Ortopdica edica Brasileira, v. 2, p.1-
4,1994. Disponvel em:<http://www.dms.ufsc.br/mip5131/arquivos/Desinfeccao.pdf>
McDONNEL, G.; RUSSEL, D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance.
Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.1, p.147-179, 1999.
OBS.: I. Quando iniciar um novo procedimento imagine os possveis

casos de acidente, como evit-los e o que fazer caso eles ocorram. Isso
torna o socorro muito mais rpido e eficiente, podendo salvar vidas;
II. Todas as informaes acima devero ser complementadas com leitura
dos Manuais de Biossegurana e com um curso no referido tema;
III. O bom senso associado com o conhecimento tcnico tanto das
medidas de biossegurana quanto dos mecanismos de transmisso dos
agentes infecciosos e parasitrios so extramente importantes, tanto
para saber praticar a proteo individual como a dos que nos rodeiam.
153
1. ESTUDO DOS TRIATOMNEOS
1.1 INTRODUO
Os insetos, distribudos em diferentes ordens, constituem o grupo
representado pelo maior nmero de espcies. Entre essas, est a ordem
Hemiptera, subdividida em trs subordens: Heteroptera, Stenorryncha
e Auchenorryncha. Na primeira, encontram-se os percevejos e, nas
duas ltimas, as cigarras e os pulges (Grimaldi & Engel, 2005).
Os percevejos so insetos com aparelho bucal do tipo picador-
sugador, e podem apresentar trs tipos de hbito alimentar: fitfago,
que se alimenta de seiva vegetal, predador, que se alimenta do
sangue (hemolinfa) de outros invertebrados, e o hematfago, que
se alimenta do sangue dos vertebrados.
Essa diversidade de hbito alimentar pode ser identificada pelo
nmero de segmentos do aparelho bucal que, nos fitfagos, de
quatro segmentos, nos predadores, de trs segmentos, de forma curva
e, nos hematfagos, tambm de trs segmentos, porm reto (Figura 1).
Figura 1: Morfologia do aparelho bucal: A) fitfago (aparelho bucal de quatro

segmentos); B) predador (aparelho bucal de trs segmentos, curvo);
C) hematfago (aparelho bucal de trs segmentos, reto); I 1 segmento;
II 2 segmento; III - 3 segmento; IV 4 segmento.
Desenho: Rubens Mello
155
A subordem Heteroptera formada por 88 famlias (Grazia et
al., 2008; Schuh & Slater, 1995; Triplehorn & Jonnson 2011), dentre
as quais a Reduviidae, que possui 22 subfamlias (Weirauch 2008),
representada em sua maioria por percevejos predadores, exceto
Triatominae que hematfaga.
Esta subfamlia Triatominae subdividada em 5 tribos, onde esto
includos os 15 gneros e suas respectivas espcies. Para se ter uma
ideia, at meados de 2010 eram conhecidas 141 espcies (Tabela 1)
(Jurberg et al., 2009). A maioria dessas ocorre nos pases do continente
americano e encontrada no ambiente silvestre, participando ou no do
ciclo de transmisso do parasito T. cruzi. Uma nica espcie cosmopolita
e algumas outras poucas, do gnero Triatoma e Linshcosteus, so
encontradas apenas no continente asitico (Schofield & Galvo 2009).
Segundo Caranhas et al. (2011), so considerados 18 gneros.
Os triatomneos so conhecidos por diversos nomes nas
diferentes regies onde so encontrados. No Brasil, so conhecidos
pelos seguintes nomes: Barbeiro, Chupo, Chupana, Finco, Bicudo,
Percevejo, Bicho-de-parede, Bicho-de-parede preto, Chupa-pinto,
Percevejo-do-serto, Percevejo francs, Percevejo gaudrio, Percevejo
grande, Procot, Prorocot, Barato, Bruxa, Piolho-de-piaava, Quiche
do serto, Rondo, Vunvun, Cascudo. (Lenko & Papavero 1979), Cafeco,
na lngua indgena Wai-Wai (Comunicao pessoal Teresa Cristina M.
Gonalves). Na Colmbia e Venezuela: Pito. No Equador: Chinchorro
e para Rhodnius pictipes utilizam o nome Gruf e Mansch. No Peru:
Chirimacha e na Bolvia tem o nome de Chinche (Lenko & Papavero 1979).
156
Tabela 1: Relao do nmero de espcies existentes nas tribos, gneros de
triatomneos e seus habitats em ambiente natural.
157
1.2 POSIO SISTEMTICA DOS TRIATOMNEOS
Reino: Animalia (Metazoa)
Filo: Arthropoda
Subfilo: Atelocerata (classificao antiga: Mandibulata)
Classe: Hexapoda (classificao antiga: Insecta)
Subclasse: Pterigota
Ordem: Hemiptera
Subordem: Heteroptera
Superfamlia: Reduvioidea
Famlia: Reduviidae
Subfamlia: Triatominae
comum referirmo-nos a esses insetos como hempteros,

reduvideos ou triatomneos. Entretanto, com base nessa classificao,
conclui-se que o termo mais apropriado seja triatomneo, uma vez
que se restringe a todos os espcimes da subfamlia Triatominae.
Fonte: BUZZI, Z.J. Entomologia didtica - 4. ed - Curitiba: Ed. UFPR. 348p., 2005.
158
2. ASPECTOS GERAIS
2.1 MORFOLOGIA EXTERNA

Os insetos da ordem Hemiptera, tambm chamados de percevejos,
apresentam um cheiro caracterstico em decorrncia da presena de
glndulas odorferas (de cheiro) situadas na regio do trax. Nos
triatomneos, a responsvel pelo odor caracterstico a glndula de
Brindley.
Os triatomneos, como todos os insetos, possuem o corpo dividido
em trs regies: cabea, trax e abdmen (Figura 2). Na cabea, esto
localizados: o aparelho bucal, olhos compostos e ocelos alm dos
rgos sensoriais que so as antenas. A estrutura onde as antenas
esto inseridas denomina-se tubrculo antenfero e sua localizao
auxilia na diferenciao dos trs principais gneros: Triatoma,
Panstrongylus e Rhodnius.
O trax, formado pela unio de trs segmentos (protrax,
mesotrax e metatrax), apresenta, em cada um deles, os apndices
locomotores, ou seja, trs pares de patas e dois pares de asas. Cada
um destes segmentos acrescido de um sufixo que ir determinar
a sua localizao, ou seja, dorsal - noto, ventral esterno e lateral -
pleura. Assim, os segmentos dorsais so identificados como pronoto,
mesonoto e metanoto; os segmentos ventrais proesterno, mesoesterno
e metaesterno e os laterais propleura, mesopleura e metapleura.
Esta nomenclatura importante na medida em que utilizada na
sistemtica.
O primeiro segmento torcico dorsal tem forma de trapzio e
denomina-se pronoto. Esta estrutura dividida em lobo anterior e
lobo posterior e pode apresentar tubrculos, ou seja, estruturas em
forma de espinhos com ponta arredondada. O segundo segmento
torcico , em sua maior parte, coberto pelo pronoto e a nica regio
visvel, denominada escutelo, tem formato triangular (Figura 2A).
159
O terceiro segmento reduzido e pouco visvel (Figura 2A). O
primeiro par de asas est inserido no mesonoto e apresenta a metade
anterior coricea e a posterior membranosa, denominada, por isso, de
hemlitro (hemi = metade; litro = asa). Em determinadas espcies,
a colorao do primeiro par de asas pode auxiliar na identificao. O
segundo par membranoso e no tem importncia na sistemtica.
Figura 2: Triatoma maculata: A) vista dorsal; B) vista ventral.

Foto: Catarina Macedo
160
O abdmen constitudo por onze segmentos e apresenta
lateralmente o conexivo, placa dorsal e ventral que permite a distenso
do abdmen no ato da alimentao. Nos adultos o 8 e 9 segmentos
so modificados para formar a genitlia externa (Figura 2B) e nas
formas jovens somente a ninfa de 5 estdio apresenta placas genitais
que permitem distinguir o futuro sexo (Figura 3). No caso de fmeas, o
8 segmento apresenta, na margem posterior, uma depresso (Figura
3A), enquanto que, nos machos, esta reta (Figura 3B).
Figura 3: Diferenciao do sexo das ninfas de 5 estdio de Triatoma maculata de

acordo com o bordo posterior do 8 segmento abdominal ventral:
A) fmea, com depresso mediana; B) macho, reto (Gonalves et al. 1985).
7st, 8 st e 9 st esternitos dos 7, 8 e 9 segmentos, X) tubo anal; A) nus.
Desenho: Teresa.Cristina M. Gonalves.
Entre os adultos, nas fmeas apenas os segmentos ventrais so

modificados para formar a genitlia (Figura 4A), enquanto que nos
machos, ambos os segmentos, dorsal e ventral, modificam-se (Figura
4B). O 8 em uma estrutura convexa que envolve o 9 segmento,
denominado pigforo (Figura 4B). Esse apresenta uma abertura
posterior onde est inserido um par de parmeros e, na margem inferior,
uma estrutura de importncia taxonmica, o processo mediano do
161
Figura 4: ltimos segmentos abdominais ventrais de Triatoma maculata.
A) fmea: placas genitais, gonocoxitos do 8 e 9 segmentos (Gc 8 e Gc9),
gonapfises do 8 e 9 segmentos (Gp 8 e Gp9) ; B) macho: segmentos
abdominais ventrais modificados em estruturas da genitlia,
8 segmento e 9 segmento ou pigforo.
Fotos: Teresa Cristina M Gonalves.
pigforo. No seu interior, encontra-se o falo, rgo copulador, que

constitudo do edeago e do aparelho articular (Figura 5). O falo possui,
em seu interior, vrias estruturas quitinizadas unidas por membrana,
que podem ter aspectos diferentes entre as espcies, auxiliando na
diferenciao destas. Entre elas cita-se o falosoma, o suporte do falosoma
(Figura 6 A e B), e o processo mediano de pigforo (Figura 7).
162
Figura 5: Estruturas da genitlia externa de machos.
Adaptado por Teresa Cristina M. Gonalves
Figura 6A: Estruturas da genitlia externa de machos: diferenas entre

os falosomas de dez espcies do gnero Rhodnius.
Desenho: Lent & Jurberg 1969.
163
Figura 6B: Estruturas da genitlia
externa de machos: variao
intraespecfica do suporte do falosoma
de oito exemplares de Triatoma
dimidiata.
Figura 7: Processo mediano do pigforo de espcies do gnero Rhodnius.

164
2.2 CONHECENDO E DIFERENCIANDO OS GNEROS DE
TRIATOMNEOS
Para a identificao dos gneros e das espcies, utiliza-se a
chave dicotmica que vem publicada em vrias obras especializadas.
Essa chave baseia-se na descrio de uma srie de caractersticas
relacionadas com a forma, o tamanho e a colorao de vrias estruturas
do corpo do inseto, possibilitando identificar a espcie em questo.
A diferenciao dos trs principais gneros de interesse mdico
pode ser feita atravs da localizao do tubrculo antenfero, isto , do
ponto de insero das antenas na regio anteocular (Figura 8).
Gnero Panstrongylus apresenta a cabea curta, de aspecto

robusto, com a insero das antenas antes da metade da regio
anteocular, ou seja, na regio imediatamente anterior aos olhos
compostos (Figura 8A);
Gnero Triatoma apresenta a cabea de tamanho mdio, com
a insero das antenas na metade da regio anteocular, ou seja,
na metade da distncia entre os olhos compostos e o clpeo
(Figura 8B);
Gnero Rhodnius apresenta a cabea alongada, com a insero
das antenas aps a metade da regio anteocular, ou seja, prxima
ao pice da cabea (Figura 8C).
165
Gnero Panstrongylus
Gnero Triatoma
Gnero Rhodnius
Figura 8: Diferenciao dos principais gneros pelo ponto de insero do

tubrculo antenfero: A) Panstrongylus - tubrculo antenfero situado antes da
metade da regio anteocular; B) Triatoma - tubrculo antenfero situado na
metade da regio anteocular; C) Rhodnius - tubrculo antenfero situado aps a
metade da regio anteocular. Indicao do ponto de insero do tubrculo ( );
mensurao da regio anteocular ( ).
Adaptado por Teresa Cristina M. Gonalves e Angela C. V. Junqueira.
166
A colorao, tambm denominada de padro cromtico do inseto,
uma caracterstica muito importante na identificao das espcies
de triatomneos. Entretanto, algumas espcies apresentam variao
cromtica intraespecfica, isto , uma mesma espcie pode apresentar
colorao diferente. Essa confirmao feita atravs de estudos muito
especficos, denominados de anlises bioqumicas e moleculares.
Como exemplo, cita-se Triatoma infestans, espcie que apresenta
trs padres cromticos denominados mataral, clair e darkmorph
(Figura 9).
Triatoma infestans - Darkmorph

Foto: Franois Noireau.
Triatoma infestans Triatoma infestans

Silvestre - Mataral Clair
Foto: Mirko Rojas. Foto: Franois Noireau.
Figura 9: Diferentes padres cromticos de Triatoma infestans.

Fonte: NOIREAU, F., CORTEZ, M.R. & GRTLER, R. Los Focos Silvestres de Triatoma infestans en Bolivia. In:
Triatominos de Bolivia y la enfermedad de Chagas. Ministerio de Salud y Desportes,
Programa Nacional de Chagas, Bolivia, 2007. p. 205-213.
167
3. ASPECTOS DA BIOLOGIA
3.1 CICLO DE VIDA

Os triatomneos apresentam trs fases de desenvolvimento: ovo,
ninfa e adulto. As ninfas, tambm chamadas de formas jovens, so
diferentes dos adultos porque no tm asas nem genitlia formada.
Entretanto, 5o estdio apresentam placas genitais que permitem
diferenciar macho de fmea, conforme mencionado anteriormente
(Figura 4).
A fmea inicia a postura aproximadamente entre 20 a 30 dias
aps a cpula. A colorao dos ovos inicialmente branca leitosa e,
medida que o embrio se desenvolve, torna-se rosada at atingir
a colorao avermelhada, indicando que o embrio est formado e
prximo ecloso do ovo (Figura 10A). Entretanto, em R. brethesi os
ovos apresentam colorao acinzentada clara, que vai escurecendo
conforme o desenvolvimento do embrio.
Essa colorao avermelhada deve-se presena da nitroforina,
uma substncia presente na hemoglobina, encontrada no sangue
que a fmea ingeriu. Esses podem ser colocados soltos ou presos
ao substrato (Figuras 10B e 10C), neste caso fator importante para a
disperso das espcies.
O perodo de incubao de aproximadamente duas semanas. A ecloso
ocorre quando o oprculo se solta do ovo permitindo que a ninfa saia.
Inicialmente esta tem colorao rosada, devido presena da nitroforina, e no
perodo de uma hora, o contato com o ar faz com que a colorao definitiva
se estabelea em tons de marrom ou preto, dependendo da espcie. Este
fato tambm observado a cada ecdise, ou seja, na troca do tegumento do
estdio anterior pelo estdio que est iniciando. Uma vez desprendido do
corpo, o tegumento liberado recebe o nome de exvia (Figura 10D).
Atravs do Microscpio Eletrnico de Varredura, que possibilita
analisar as estruturas em aumento muito grande, foi possvel verificar
que a casca dos ovos pode apresentar ornamentaes diferentes,
contribuindo para a identificao de espcies (Figura 11).
168
Figura 10: A) ovos de triatomneos soltos no ambiente: em detalhe;
A1) ovo eclodido, A2) ovo embrionado; A3) medida aproximada do ovo;
B) ovo de Rhodnius brethesi colado na palha da piaaba;
C) ovos colados na pena de ave; D) exvia.
Foto e montagem: Catarina Macedo (A e C) e Teresa Cristina (B e D).
169
Figura 11: Detalhe das clulas exocoriais do ovo em microscopia eletrnica
de varredura (3300x): A) Triatoma maculata; B) Triatoma pseudomaculata.
Fotos: Wanderley de Souza, Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 80, p. 263-276, 1985.
Cada perodo compreendido entre uma muda e outra denominado

de estdio. Ao todo so cinco estdios de ninfas seguidos de um
adulto alado, completando um ciclo que pode variar de seis meses a
dois anos, dependendo da espcie (Figura 12).
Para que os insetos mudem de um estdio para outro necessrio
que ocorra, no mnimo, um repasto sanguneo, porque a distenso
abdominal junto com outros fatores (fatores proteicos), provenientes
da alimentao sangunea (hemoglobina), que vo ativar as clulas
neurossecretoras. Estas por sua vez iro desencadear uma srie de
mensagens ao crebro, que sero responsveis pela produo dos
hormnios da muda (ecdisona) e do crescimento (hormnio juvenil).
O hormnio do crescimento, mesmo na fase adulta da fmea,
importante para a maturao dos ovos.
170
Figura 12: Ilustrao do ciclo evolutivo de Rhodnius brethesi. Escala = 2,5 mm.
Foto e montagem: Catarina Macedo.
171
Entretanto, a complementao do ciclo biolgico depende de
fatores abiticos, como a temperatura, que deve estar entre 27 e 30
C, e a umidade relativa entre 60 a 100%, dependendo da espcie.
Quando essas condies esto muito alteradas, as ninfas podem no
conseguir realizar a muda e morrer presas exvia, podendo tambm
ocorrer alteraes morfolgicas aps a ecdise, a diminuio drstica
da postura e a ecloso dos ovos. A temperatura, alm de outros
fatores do ambiente externo (posio geogrfica, ectopos) (Caro-
Riao et al. 2009; Hochkirch et al. 2008; Jaramillo 2002), bem como
isolamento fsico entre as populaes domiciliadas e peridomiciliadas
(Schater-Broider et al. 2004), podem exercer influncia na morfologia.
O tempo de desenvolvimento um dado importante para as aes
de controle, uma vez que as borrifaes devem atuar de modo que os
insetos no cheguem fase adulta, consequentemente, diminuindo
as chances de recolonizao do ambiente que foi tratado.
A hematofagia praticada em todos os estdios do ciclo evolutivo
e na fase adulta, tanto a fmea quanto o macho tambm so
hematfagos. Do ponto de vista epidemiolgico, este fato importante
porque aumenta a chance de transmisso do parasito Trypanosoma
cruzi. As ninfas de quinto estdio so as que ingerem maior quantidade
de sangue. Na fmea o sangue de extrema importncia para a
maturao dos ovrios e a oviposio.
3.2 RESISTNCIA AO JEJUM E DEFECAO

Aps a alimentao inicia-se o processo da digesto do sangue.
Nesse perodo, ocorre a produo do corpo gorduroso, massa sem
forma que cobre e envolve os rgos internos na cavidade do corpo
do inseto (hemocele), cuja colorao pode variar de branca leitosa
a amarelo claro. Esse tem como funo acumular reservas nutritivas,
permitindo ao inseto permanecer um tempo razovel sem se alimentar.
A esse perodo dado o nome de resistncia ao jejum.
172
Entre os triatomneos esse perodo de resistncia ao jejum maior
nas ninfas de 5 estdio, entretanto, pode variar entre as espcies.
Segundo Canale et al. (1999), o maior perodo foi observado para
a espcie T. vitticeps (180 dias) e o menor para T. brasiliensis (58
dias).
A resistncia ao jejum tem sua importncia para o planejamento
de programas de controle ao vetor, na medida em que, os insetos
que esto alimentados podem ficar por um longo perodo longe do
contato com a superfcie que foi tratada com inseticida. Desta forma,
os insetos podem voltar a se alimentar e recolonizar o domiclio aps
o trmino do poder residual do inseticida.
O tempo de defecao outro aspecto de extrema importncia
para caracterizar a capacidade de transmisso do parasito pelo
triatomneo, uma vez que aqueles que depositam suas fezes sobre o
hospedeiro tm maior chance de transmitir o parasito do que aqueles
que defecam fora da fonte alimentar (Figura 13).
Na falta do hospedeiro, esses insetos tambm podem realizar o
coprofagismo, isto , alimentar-se das fezes eliminadas por outros
triatomneos, e o predatismo, ou seja, alimentar-se do contedo
intestinal (sangue do vertebrado) ou do contedo abdominal (sangue
do inseto ou hemolinfa) (Figura 14).
Figura 13: Rhodnius brethesi

defecando sobre o hospedeiro.
Foto: Carlos Jos C. Moreira.
173
Figura 14: Ninfa de 5 estdio de Triatoma brasiliensis,
realizando o predatismo em ninfa de barata (Blattidae).
Foto: Catarina Macedo.
3.3 DISPERSO DOS TRIATOMNEOS

O tamanho das populaes de insetos em seu ambiente natural
depende da presena de hospedeiros (fonte alimentar), uma vez
que, aumentando o nmero de triatomneos, cada inseto passa
a ter menores quantidades disponveis de sangue. Essa reduo
alimentar afeta diretamente o desenvolvimento do inseto e faz com
que os adultos, machos e fmeas, saiam em busca de outras fontes
alimentares. Desta forma, ocorre a disperso dos triatomneos, outro
aspecto importante para as aes de controle.
Essa disperso pode ocorrer atravs de dois mecanismos: um
passivo, atravs do qual ele transportado por algum animal, como
por exemplo: colado na pena das aves (Figura 10 D) ou em objetos
pelo prprio homem (vestimentas, folhas de palmeiras); e outro ativo,
quando ele se desloca por meio do voo ou caminhando.
A disperso ativa est diretamente associada com o estado
nutricional das formas adultas, a elevada temperatura e a regulao da
174
densidade das populaes (Lehane & Schofield 1981, 1982, Williams
& Schofield 1985, Lehane et al. 1992). Nos adultos, com longo perodo
de jejum, as reservas nutritivas so utilizadas no desenvolvimento dos
msculos torcicos, responsveis pelo batimento das asas, conforme
sugere Gringorten & Friend (1979) para R. prolixus, o que corrobora a
captura de insetos adultos nas armadilhas, sem contedo estomacal.
A destruio dos ecossistemas naturais (ambiente de mata)
geralmente ocasiona a fuga da fauna local, contribuindo para o
processo de disperso de espcies de triatomneos silvestres para
dentro de casa.
A ao do homem (antrpica) no meio ambiente contribui de
forma significativa para que ocorra a disperso, uma vez que,
afugentando ou levando morte os hospedeiros, faz com que os
triatomneos saiam em busca de alimento (Barreto 1967, Forattini et
al. 1971, 1979). Nesse movimento, os triatomneos podem ser atrados
por uma fonte luminosa e invadir o peridomiclio ou o domiclio.
A disperso tambm pode ocorrer quando a infestao domiciliar
atinge uma taxa elevada. Nesse caso, podem ocorrer a invaso e
recolonizao de reas que passaram pelo processo de borrifao.
No ambiente domiciliar o que leva disperso o crescimento das
espcies domiciliadas, fazendo com que invadam reas tratadas.
A capacidade de voo destes insetos pode variar dependendo do
seu habitat. As espcies silvestres mantm maior capacidade de voo.
De acordo com Schofield & Matthews (1985), Triatoma infestans
apresentou uma distncia mdia de voo em torno de 200 m, enquanto
que, Schweigmann et al. (1988), verificaram voos com mais de 1 km.
Entretanto, nas populaes domsticas a capacidade de voo pode
ser progressivamente reduzida (Schofield et al. 1999), conforme a
observao que evidenciou a completa atrofia dos msculos torcicos
em populaes mantidas em laboratrio.
175
3.4 INIMIGOS NATURAIS
Assim como todos os animais, os triatomneos tambm tm
inimigos naturais, como os artrpodes em geral que incluem insetos
(louva-a-deus, percevejos, besouros, baratas, moscas e formigas),
outros artrpodes (aranhas, caros, pseudoescorpies, centopias) e
os parasitos de ovos, nesse caso todos da ordem Himenoptera.
4. ASPECTOS DA ECOLOGIA
4.1 TIPOS DE AMBIENTES ONDE OS BARBEIROS PODEM SER

ENCONTRADOS
4.1.1 DOMICILIAR E PERIDOMICILIAR
Os triatomneos vivem em diferentes tipos de ambientes silvestres
associados a mamferos, aves e rpteis, que servem como fonte de
alimentao. As crescentes alteraes nestes ambientes acarretam na
invaso e colonizao do domiclio, principalmente nas construes
de pau-a-pique, onde se escondem entre as frestas e rachaduras
(Figura 15). No peridomiclio, podem colonizar galinheiros, currais,
amontoados de telhas, tijolos e paiis (Figura 16).
4.1.2 SILVESTRE
No ambiente natural, os triatomneos ocupam ambientes variados,
onde cada espcie encontra aquele local que apresenta condies
favorveis ao seu desenvolvimento. Algumas espcies de Triatoma
Figura 15: Tipos de construes comumente encontradas em reas rurais dos estados
brasileiros: A) residncia de pau-a-pique; B) residncia construda com madeira e palha.
Fotos: Catarina Macedo.
176
Figura 16: Tipos de ambientes no peridomiclio:
A) amontoado de tijolos; B) amontoado de telhas.
Fotos: Teresa Cristina M. Gonalves.
podem ser encontradas exclusivamente, em ninhos de pssaros ou

em buracos nas rvores prximas aos ninhos, (Figura 17), enquanto
outras ocorrem em reas onde as formaes rochosas so abundantes
ou no interior de cavernas associadas a morcegos (Figura 18).
As espcies que compem o gnero Rhodnius tm como habitat
mais comum as palmeiras (babau, buriti, inaj, etc.), ambiente onde
so encontrados pssaros, pequenos roedores e lacertdeos que
servem de fonte alimentar (Figura 19).
No h muita informao sobre os tipos de ambientes silvestres
onde so encontradas as espcies do gnero Panstrongylus. Os
poucos registros existentes indicam que esto associados s tocas
de animais no solo (buraco de tatu e ocos em rvores) (Figura 20).
Entretanto, so diversos os registros de ocorrncia de espcies desse
gnero invadindo o ambiente domiciliar, atrados pela luz.
177
Figura 17: Ninhos de aves so habitat, onde comumente h o registro da
ocorrncia de espcies dos gneros Rhodnius e Psammolestes:
A) ninhos de graveteiros; B) ninho em destaque.
Figura 18: Afloramentos rochosos onde comum encontrar espcimes de

triatomneos associados aos mamferos e pequenos roedores e lacertdeos.
178
Figura 19: Tipo de habitat de espcies do gnero Rhodnius: A) aspecto geral de uma
palmeira de babau; B) cacho de frutos da palmeira; C) detalhe de postura de Rhodnius
no interior do cacho; D) espcime de Rhodnius neglectus encontrado na palmeira.
Figura 20: Tipos de ambiente natural onde so encontradas espcies do gnero

Panstrongylus: A) buraco no solo; B) oco de rvore.
179
5. ALGUMAS ESPCIES DA AMAZNIA LEGAL
So oito os pases que constituem a Amaznia Legal: Brasil, Bolvia,

Colmbia, Equador, Guiana, Peru, Suriname e Venezuela, e o territrio
ultramarino francs, a Guiana Francesa. Encontram-se listadas abaixo
algumas espcies:
Tribo Cavernicolini
Cavernicola lenti colorao marrom escuro, com duas manchas
amareladas no hemlitro (Figura 23);
Cavernicola pilosa corpo abundantemente piloso, exceto a
membrana do hemlitro. Cor marrom escuro preta (Figura 23);
Tribo Rhodniini
Rhodnius brethesi colorido preto com manchas e listras
marrom-claras, na superfcie da cabea e pescoo, pronoto,
escutelo, hemlitro, conexivo e superfcie ventral do abdmen
(Figura 22);
Rhodnius neglectus colorido marrom claro, com manchas da cor
marrom-escuro na cabea, pronoto, escutelo, crio e conexivo, e
reas amareladas no abdmen ventral, no conexivo, na coxa e
trocanter (Figura 22);
Rhodnius pictipes colorido marrom amarelado e com manchas
de cor marrom-escuro em vrias regies do corpo e apndices;
aspecto geral sarapintado (Figura 22);
Rhodnius prolixus colorao marrom amarelado com manchas
marrom-escuras em vrias regies do corpo e dos apndices
(Figura 22);
Rhodnius robustus colorido marrom amarelado, com muitas
manchas de cor marrom escuro em vrias regies do corpo e nos
apndices (Figura 22);
180
R. prolixus, R. robustus, R. nasutus e R. neglectus so espcies com
caracteres morfolgicos muito semelhantes e formam o complexo
prolixus (Lent & Wygodzinsky 1979, Barrett 1988). Atualmente, foram
adicionadas a este complexo as espcies Rhodnius domesticus e
Rhodnius neivai (Dujardin et al. 1999, Carcavallo et al. 2000, Lyman
et al. 1999, Monteiro et al. 2000, Monteiro et al. 2003). Embora haja
dificuldade na identificao de R. nasutus e R. neglectus, esta no to
acirrada quanto a existente entre R. prolixus e R. robustus. Atualmente,
a variabilidade gentica encontrada em R. robustus deu origem ao
complexo robustus (Monteiro et al. 2003, Pavan & Monteiro 2007).
Tribo Triatomini
Eratyrus mucronatus colorido geral marrom escuro ou preto.
Regio lateral do pescoo e no abdmen ventral amarelado.
Crio com marcas vermelhas subapical (Figura 23);
Triatoma maculata colorao geral marrom-escuro preta, com
uma mancha amarelo-clara, laranja amarelada ou vermelho-clara
na cabea, pescoo e trax (Figura 21);
Panstrongylus diasi - colorido marrom amarelado, com reas de
cor marrom-escuro no pronoto e conexivo;
Panstrongylus geniculatus colorido marrom-claro ou marrom-
alaranjado claro com manchas de cor marrom-escuro ou preta em
vrias partes do corpo. Superfcie do corpo sem pelo (Figura 21);
Panstrongylus herreri* colorido dorsal marrom-claro amarelado,
ventralmente marrom-escuro ou preto. Manchas dorsais, variando
de colorao marrom-escuro preta, presentes na cabea,
pescoo, pronoto escutelo, hemlitro e conexivo (Figura 21);
Panstrongylus lignarius* colorido dorsal marrom-claro e ventral
ferruginoso, marrom-escuro ou preto (Figura 21);
(*) De acordo com Galvo et al. (2003), P. herreri passou a sinonmia de

P. lignarius.
181
5.1 Ilustrao das espcies
Figura 21: Espcies do gnero Panstrongylus e Triatoma da Amaznia Legal.

182
Figura 22: Espcies do gnero Rhodnius da Amaznia Legal.
183
Figura 23: Espcies do gnero Cavernicola e Eratyrus da Amaznia Legal.
184
Panstrongylus rufotuberculatus colorido geral marrom-escuro
ou preto com manchas de cor marrom-claro amarelado ou
avermelhadas na cabea. Hemlitro com colorido esverdeado
plido (Figura 21).

6. MORFOLOGIA INTERNA
6.1 SISTEMA DIGESTIVO

O sistema digestivo dos triatomneos dividido em trs partes:
intestino anterior, intestino mdio e intestino posterior. Desses, o
intestino mdio ainda dividido em duas regies: estmago e intestino
(Lacombe 1957) (Figuras 24 e 25).
6.1.1 INTESTINO ANTERIOR
precedido pelo rostro, que, em repouso, est preso parte
inferior da cabea e mantm, no seu interior, os estiletes bucais,
mandbulas e maxilas. As primeiras so responsveis pela perfurao
do tecido e as segundas pela suco do sangue do hospedeiro,
bem como pela injeo das substncias produzidas pelas glndulas
salivares. Essa suco realizada pela faringe curta e musculosa, que
tem continuidade com o esfago mais alongado.
As glndulas salivares so em nmero de trs pares e localizam-
se na cavidade torcica, presas regio mediana do esfago.
Nessas glndulas, so produzidas substncias anticoagulantes e
vasodilatadoras que auxiliam na alimentao do inseto.
6.1.2 INTESTINO MDIO
Compreende a maior poro do tubo digestivo do triatomneo
e formado pelo pr-mesntero (estmago) e ps-mesntero
(intestino). O estmago, quando cheio de alimento, ocupa grande
parte da cavidade do corpo do inseto, empurrando os outros rgos
para os lados.
6.1.3 INTESTINO POSTERIOR
constitudo pela ampola retal, um saco muscular com considervel
185
capacidade de distenso, onde desembocam os quatro tbulos de
Malpighi de tamanhos variveis. Esses so responsveis pela retirada
dos resduos metablicos da cavidade do corpo, tambm denominada
de hemocele, originando a urina. Na ampola retal, ficam contidas fezes
e urina para serem eliminadas, posteriormente, pelo reto.
Nos insetos infectados, os tripanosomas metacclicos, formas
infectantes para o hospedeiro vertebrado, so encontrados na ampola
retal, de onde so expulsas junto com as fezes ou com a urina. As
espcies consideradas vetores em potencial tm, por hbito, defecar
no ato da alimentao e neste momento que estas formas do
parasito so depositadas sobre o hospedeiro.
6.1.4 GLNDULAS SALIVARES

As glndulas salivares tem grande diversificao quanto ao nmero,
tamanho, forma nos diferentes triatomneos. Em geral, localizam-
se na cavidade torcica, junto parte inicial do tubo digestivo,
onde encontram espao suficiente para seu desenvolvimento.
O deslocamento para a regio abdominal resulta dos eventuais
movimentos peristlticos dos rgos vizinhos. As glndulas salivares
so em nmero de trs pares, utilizando-se a nomenclatura D1, D2 e
D3, para cada um deles: o par D1 corresponde s glndulas principais,
o D2 s glndulas suplementares e o par D3 s glndulas acessrias.
Em todas as espcies de triatomneos estudadas, so encontrados trs
pares de glndulas salivares, com exceo do gnero Rhodnius, que
no apresenta a tpica glndula D3. De forma geral, as glndulas D1 e
D2 tm cor branco-leitosa ou um pouco amarelada, como ocorre em
P. megistus. Entretanto, no gnero Rhodnius as glndulas D1 e D2 so
alongadas e de cor avermelhada (Barth 1954; Lacombe 1999) (Figura
25).
Nestas glndulas, podem ser encontradas formas infectantes de
Trypanosoma rangeli, que so introduzidas no hospedeiro vertebrado,
durante a salivao, no incio do repasto sanguneo.
186
Figura 24: Sistema digestivo e respiratrio de triatomneo.
Figura adaptada por Teresa Cristina M. Gonalves.
Fonte: LACOMBE, D. Estudos anatmicos e histolgicos sobre a subfamlia Triatominae

(Heteroptera, Reduviidae). Parte XXI: Estudo comparado do sistema traqueal em Triatoma,
Panstrongylus e Rhodnius. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 63, p. 65 - 105, 1965.
187
6.2 SISTEMA RESPIRATRIO
A oxigenao dos tecidos dos triatomneos feita pelo sistema traqueal.
Esse inicia-se por pequenas aberturas na superfcie ventral externa
do trax e do abdmen, chamadas espirculos, que tm continuidade
na hemocele com tubos denominados traqueias. Essas, por sua vez,
ramificam-se em tubos de calibre menor, as traquolas, que envolvendo
os rgos, conduzem o oxignio at as clulas (Lacombe 1965) (Figuras
24 e 26).
6.3 SISTEMA CIRCULATRIO
O sistema circulatrio constitudo, principalmente por sangue,
tecidos e rgos que auxiliam na distribuio sangunea por todo o
corpo. Nos vertebrados, o sangue percorre somente vasos especiais
(artrias, capilares e veias) por isso, chamado de sistema fechado.
Figura 25: Sistema digestivo Figura 26: Sistema circulatrio e

de Rhodnius brethesi. respiratrio de Rhodnius brethesi.
188
Nos insetos, um sistema aberto, porque o sangue circula por um vaso
dorsal e livremente por toda cavidade do corpo, hemocele, irrigando
assim os vrios tecidos e rgos. Esse vaso dorsal um rgo especial
bombeador, situado dorsalmente no corpo do inseto, que bombeia o
sangue da poro posterior do corpo para a poro anterior, de onde
passa cavidade interna da cabea. Dessa cavidade, o sangue circula
por todo o corpo, em direo regio posterior onde novamente entra
no vaso dorsal e bombeado para frente, repetindo o ciclo.
6.3.1 SANGUE
O fluido que circula por toda cavidade do corpo do inseto
chamado hemolinfa. Ele consiste numa parte lquida, o plasma, e
numa seleo de clulas livres chamadas hemcitos.
6.3.2 VASO DORSAL

O vaso dorsal se estende por todo comprimento do corpo do
inseto, desde a regio posterior do abdmen at a cabea. o rgo
pulstil responsvel pela circulao do sangue junto aos msculos
transversais e longitudinais (Figura 26).
O vaso dorsal dividido em duas partes: uma poro posterior,
chamada corao, e uma poro anterior, chamada de aorta. Em geral,
o corao a poro pulstil e a aorta o tubo por onde o sangue
circula at ser liberado dentro da cabea, causando a circulao.
O corao mais ou menos dilatado em cada segmento para
formar cmaras segmentais; cada cmara possui um par de aberturas
laterais ou stios, por onde o sangue entra na cmara. A aorta de
forma tubular simples ocupa a regio da cabea, e tambm pulsa,
causando a circulao.
189
7. CHAVES DICOTMICAS PARA A IDENTIFICAO DAS
ESPCIES DE TRIATOMNEOS (Lent & Wygodzinsky, 1979)
A zoologia tem como objetivo conhecer o reino animal. Para

reunir os grupos de animais, so levados em considerao aspectos
estruturais, tamanhos, propores e colorao, dentre outros
dados, baseados nas semelhanas encontradas entre os seres. Tal
procedimento feito atravs da classificao, conhecida tambm
como Taxonomia ou Zoologia Sistemtica.
Dessa forma, para se classificar um animal seja em nvel de
Classe, Ordem, Famlia, Gnero ou Espcie, utiliza-se um instrumento
denominado Chave Dicotmica. Esta formada por descries de
estruturas da morfologia externa de modo a orientar o usurio a
percorr-la em busca da identificao.
Esse caminho feito seguindo uma numerao que orienta para
duas opes a seguir, recebendo por isso, a denominao dicotmica,
onde cada opo denominada premissa. O final deste percurso
ocorrer quando se chegar a um nome de gnero ou espcie,
dependendo do que se procura identificar.
comum encontrar na literatura vrias chaves dicotmicas,
entretanto, a mais recomendada a apresentada na presente apostila,
e que pode ser encontrada na publicao de Lent & Wygodzinky (1979),
intitulada: Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae), and
their significance as vectors of Chagas disease.
Embora nesta obra o nmero total de espcies descritas seja de
111, em comparao com as 141 existentes atualmente, a chave
dicotmica mais completa, principalmente, porque ilustrada. Desta
forma, recomenda-se uma consulta aos artigos originais de descrio
de novas espcies no includas, logo aps a referida chave (pgina
230).
Na presente apostila, para facilitar o manuseio da chave dicotmica,
foram selecionados e includos esquemas das morfologias externas e
ilustraes referentes s espcies da Amaznia Legal (vide morfologia
externa do triatomneo).
190
Figura 27: Chave para as Tribos, Gneros e Espcies de Triatominae.
(Lent & Wygodzinsky 1979*).
191
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228
* Lent H & Wygodzinsky P 1979. Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae), and their
significance as vectors of Chagas Disease. Bull Am Mus Nat His 163: 125-520.
229
8. RELAO DAS ESPCIES DE TRIATOMNEOS DESCRITAS OU
REVALIDADAS
Tendo como base Jurberg & Galvo (1997), Galvo et al. (2003),
Schofield & Galvo (2009), Jurberg et al. (2010), Campos et al. (2011)
e Caranhas et al. (2011).
Tribo Alberprozeniini
Alberprozenia malheiroi Serra, Atzingen & Serra, 1980
SERRA, R.G.; ATZINGEN, N.C.B.; SERRA, O.P. Nova espcie do gnero
Alberprosenia Martinez & Carcavallo, 1977, do Estado do Par, Brasil.
Anais do V Congresso Brasileiro de Parasitologia, Rio de Janeiro,
p. 126, 1980.
Tribo Bolboderini
Belminus pittieri Osuna & Ayala, 1993
OSUNA, E.; AYALA, J.M. Belminus pittieri, nueva especie de Bolboderini
(Triatominae: Reduviidae: Heteroptera). Boletn de Entomologia
Venezolana, v. 8, p. 14750, 1993.
Belminus laportei Lent, Jurberg & Carcavallo, 1995

LENT, H.; JURBERG. J.; CARCAVALLO, R.U. Belminus laportei sp. n. da regio
Amaznica (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Memrias do Instituto
Oswaldo Cruz, v. 90, p. 33-9, 1995.
Belminus corredori Galvo & Angulo, 2006

GALVO, C.; ANGULO, V.M. Belminus corredori, a new species of Bolboderini
(Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) from Santander (Colombia).
Zootaxa, v. 1241, p. 618, 2006.
230
Belminus ferroae Sandoval, Pabn, Jurberg & Galvo, 2007
SANDOVAL, C.M.; PABN, E.; JURBERG, J.; GALVO. C. Belminus ferroae n.
sp. from the Colombia north-east, with a key to the species of the genus
(Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Zootaxa, v. 1443, p. 55-64, 2007.
Tribo Cavernicolini
Cavernicola lenti Barrett & Arias, 1985
BARRETT, T.V.; ARIAS, J.R. A new triatomine host of Trypanosoma cruzi
from the Central Amazon of Brasil: Cavernicola lenti n. sp. (Hemiptera,
Reduviidae, Triatominae). Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 80,
p. 916, 1985.
Tribo Rhodniini
Rhodnius amazonicus Almeida, Santos & Sposina, 1973
ALMEIDA, F.B.; SANTOS, E.I.; SPOSINA, G. Triatomneos da Amazonia
III. Acta Amaznica 3, 43-66, 1973.
Rhodnius stali Lent, Jurberg & Galvo, 1993

LENT, H.; JURBERG, J.; GALVO, C. Rhodnius stali n. sp., afim de
Rhodnius pictipes Stl, 1872. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v.
88, p. 60514, 1993.
Rhodnius colombiensis Mejia, Galvo & Jurberg, 1999

MEJIA, J.M.; GALVO, C.; JURBERG, J. Rhodnius colombiensis sp. n.
da Colmbia, com quadros comparativos entre estruturas flicas do
gnero Rhodnius Stl, 1859 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae).
Entomologia y Vectores, v. 6, 60117, 1999.
231
Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvo & Jurberg, 2001 in
Valente et al. (2001)
VALENTE, V.C.; VALENTE, S.A.S.; CARCAVALLO, R.U.; ROCHA, D.S.;
GALVO, C.; JURBERG, J. Consideraes sobre uma nova espcie do
gnero Rhodnius Stl, do estado do Par, Brasil (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae). Entomologia y Vectores, v. 8, p. 65-80, 2001.
Rhodnius zeledoni Jurberg, Rocha & Galvo, 2009

JURBERG, J.; ROCHA, D.S.; GALVO, C. Rhodnius zeledoni sp. nov. afim
de Rhodnius paraensis Sherlock, Guitton & Miles, 1977 (Hemiptera:
Reduviidae: Triatominae). Biota Neotropica, v. 9, p. 123-8, 2009.
Tribo Triatomini
Triatoma garciabesi Carcavallo, Cichero, Martnez, Prosen &
Ronderos, 1967. (Revalidada)
CARCAVALLO, R.U.; CICHERO, J.A.; MARTNEZ, A.; PROSEN, A.F.; RONDEROS,
R. Uma nueva especie del genero Triatoma Laporte (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae). Segundas Jornadas Entomo-epidemiolgicas Argentinas, v.
2, p. 43-8, 1967.
Triatoma brailovskyi Martnez, Carcavallo & Pelez, 1984

MARTNEZ, A.; CARCAVALLO, R.U.; PELAEZ, D. Triatoma brailovskyi, nueva
especie Triatominae de Mxico. Chagas, v. 1, p. 39-42, 1984.
Triatoma bolivari Carcavallo, Martnez & Pelez, 1987

CARCAVALLO, R.U.; MARTNEZ, A.; PELAEZ, D. Una nueva especie de
Triatoma Laporte de Mxico. Chagas, v. 4, p. 4-5, 1987.
232
Triatoma gomeznunezi Martnez, Carcavallo & Jurberg,1994
MARTNEZ, A.; CARCAVALLO, R.U.; JURBERG, J. Triatoma gomeznunezi
a new species of Triatomini from Mxico (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae). Entomologia y Vectores, v. 1, 159, 1994.
Triatoma carcavalloi Jurberg, Rocha & Lent, 1998

JURBERG, J.; ROCHA, D.S.; LOROSA, E.S.; VINHAES, M.; LENT, H. Uma
nova espcie de Triatoma do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil
(Hemiptera,Reduviidae). Entomologia y Vectores, v. 5, p. 295-310,1998.
Triatoma jurbergi Carcavallo, Galvo & Lent, 1998

CARCAVALLO, R.U.; GALVO, C. & LENT, H. Triatoma jurbergi sp. n. do norte
do estado do Mato Grosso, Brasil (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae)
com uma atualizao das sinonmias e outros txons. Memrias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 93, p. 45964, 1998.
Triatoma baratai Carcavallo & Jurberg, 2000

CARCAVALLO, R.U.; JURBERG, J. Triatoma baratai sp. n. do estado do Mato
Grosso do Sul, Brasil (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae). Entomologia y
Vectores, v. 7, 37387, 2000.
Triatoma klugi Carcavallo, Jurberg, Lent, Galvo, Steindel &

Carvalho Pinto, 2001.
CARCAVALLO, R.U.; JURBERG, J.; LENT, H.; GALVO, C.; STEINDEL, M.;
CARVALHO PINTO, C.J. Nova especie do complexo oliveirai (nova
denominao para o complexo matogrossensis) (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae) do estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Memrias do Instituto
Oswaldo Cruz, v. 96, p. 71-9, 2001.
233
Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira & Barata,
2002
PAPA, A.R.; JURBERG, J.; CARCAVALLO, R.U.; CERQUEIRA, R.L.; BARATA,
J.M.S. Triatoma sherlocki sp. n. coletada na Bahia, Brasil (Hemiptera,
Reduviidae, Triatominae). Entomologia y Vectores, v. 9, p. 13346, 2002.
Triatoma vandae Carcavallo, Jurberg, Rocha, Galvo, Noireau &

Lent, 2002
CARCAVALLO, R.U.; JURBERG, J.; ROCHA, D.S.; GALVO, C.; NOIREAU, F.;
LENT, H. Triatoma vandae sp. n. do complexo oliveirai encontrada no
Estado de Mato Grosso, Brasil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae).
Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, p. 64954, 2002.
Triatoma melanica Costa, Argolo & Felix, 2006

COSTA, J.; ARGOLO, A.M.; FELIX, M. Redescription of Triatoma melanica
Neiva and Lent, 1941 new status (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae).
Zootaxa, v. 1385, p. 4752, 2006.
Triatoma juazeirensis Costa & Felix, 2007.

COSTA, J.; FELIX, M. Triatoma juazeirensis sp. nov. from the state of Bahia
Northeastern Brazil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Memrias do
Triatoma boliviana Martinez, Chavez, Sossa, Aranda, Vargas &

Vidaurre, 2007
MARTINEZ, E.; CHAVEZ, T.; SOSSA, D.; ARANDA, R.; VARGAS, B.; VIDAURRE,
P. Triatoma boliviana sp.n. de los valles subandinos de La Paz, Bolivia
(Hemiptera: Reduviidae:Triatominae), similar a Triatoma nigromaculata
Stl 1859. Boletn del Instituto de Investigacin en Salud y Desarrollo, v.
3, p.111, 2007.
234
Panstrongylus mitarakaensis Brenger & Blanchet, 2007
BRENGER, J.M.; BLANCHET, D. A new species of the genus Panstrongylus
from French Guiana (Heteroptera; Reduviidae; Triatominae). Memrias do
Linshcosteus karupus Galvo, Patterson Rocha & Jurberg, 2002

Galvo, C.; Patterson, J.S.; Rocha, D.S.; Jurberg,J.; Carcavallo, R.U.; Rajen, K.;
Ambrose, D.P.; Miles, M.A. A new species of triatomine from Tamil Nabul,
India. Medical of Veterinary Entomology, v. 16, p. 7582, 2002.
Hermanlentia matsunoi (Fernndez-Loayza, 1989)

JURBERG, J.; GALVO, C. Hermanlentia n.gen. da tribo Triatomini, com um
rol de espcies de Triatominae (Hemiptera, Reduviidae). Memrias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 92, p.181- 5, 1997.
*Meccus bassolsae (Aguilar, Torres, Jimnez, Jurberg, Galvo &

Carcavallo, 1999)
AGUILAR, R.A., TORRES, B.N., JIMENEZ, M.C., JURBERG, J., GALVO, C. &
CARCAVALLO, R. Triatoma bassolsae sp.n. do Mxico, com uma chave
para as espcies do complexo phyllosoma(Hemiptera, Reduviidae).
Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 94, p. 353-9, 1999.
*Nesotriatoma bruneri Usinger, 1944

USINGER, R.L.The Triatominae of North and Central Amrica and the West
Indeis and their public health significance. US Public Health Bulletin, v.
288, p. 1-83.
*Mepraia spinolai (Porter, 1934)
PORTER, C.E. Una Triatoma nueva chilena. Revista Chilena de Historia

Natural, v. 37, p. 192-3, 1934.
235
*Mepraia gajardoi Frias, Henry & Gonzalez, 1998
FRIAS, D.A.; HENRY, A.A.; GONZALEZ, C.R. Mepraia gajardoi: a new
species of Triatominae (Hemiptera: Reduviidae) from Chile and its
comparison with Mepraia spinolai. Revista Chilena de Historia Natural,
v.71, p.177-88, 1998.
* Schofield & Galvo (2009) baseados em estudos genticos no consideram os

gneros Meccus e Nesotriatoma, e excluem Mepraia at que novos estudos possam
confirmar o seu status. Desta forma, sugerem que as espcies destes gneros
pertenam ao grupo ou complexo de espcies de Triatoma. Assim, em 2009, Jurberg
et al., foram validados 15 gneros e 141 espcies. Em 2011, Campos et al., com
base em estudos de morfometria geomtrica das asas, continuam reconhecendo o
gnero Mepraia composto por duas espcies: M. spinolai e M. gajardoi. Entretanto,
recentemente, Caranhas et al. (2011) mantendo o nmero de 141 espcies citam a
existncia de 18 gneros, sugerindo desta forma, a reconsiderao dos trs gneros
(Meccus, Nesotriatoma e Mepraia) excludos da proposta de Schofield & Galvo (2009).
BIBLIOGRAFIA
CAMPOS, R.; BOTTO-MAHAN, C.; CORONADO XIMENA; JARAMILLO, N.; PANZERA, F.; SOLARI, A.
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Evolution, v. 11, p. 32933, 2011.
CARANHAS, L.; GURGEL-GONALVES, R.; RAMALHO, R.D.; GALVO, C. New records and geographic
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Triatominae). Check List, v. 4, p. 508-9, 2011.
GALVO C.; CARCAVALLO R.; ROCHA D.S.; JURBERG, J. A checklist of the current valid species
of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera, Reduviidae) and their geographical
distribution, with nomenclatural and taxonomic. Zootaxa, v. 202, p. 1-36, 2003.
JURBERG, J.; GALVO, C. Hermanlentia n.gen. da tribo Triatomini, com um rol de espcies de
Triatominae (Hemiptera, Reduviidae). Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 92, p.181-5, 1997.
JURBERG, J.; ROCHA, D.S.; GALVO, C. Rhodnius zeledoni sp. nov. afim de Rhodnius paraensis
Sherlock, Guitton & Miles, 1977 (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Biota Neotropica, v. 9, p.
123-8, 2009.
LENT, H.; WYGODZINSKY, P. Revision of the Triatominae (Hemiptera: Reduviidae), and their
significance as vectors of Chagas disease. Bulletin American Museum Natural History, v. 163, p.
125-520, 1979.
SCHOFIELD, C.J.; GALVO, C. Classification, evolution, and species groups within the Triatominae.
Acta Tropica, v. 110, p. 88-100, 2009.
236
9. MORFOLOGIA EXTERNA DO TRIATOMNEO
9.1 ASPECTOS MORFOLGICOS EXTERNOS E

NOMENCLATURA DAS ESTRUTURAS
Figura 66: Morfologia externa, vista dorsal do triatomneo: A) Aspecto geral;

B) Trax, vista dorsal; C) Cabea, vista dorsal; D) Cabea, vista lateral.
(*Lent & Wygodzinsky 1979)
Adaptado por Teresa Cristina M. Gonalves.
237
Figura 67: Morfologia externa (vista ventral e lateral): A) trax, vista ventral;
B) trax, vista lateral; C) patas; D) asa anterior ou hemlitro;
E) asa posterior; F) abdmen do macho, vista dorsal; G) idem, vista ventral;
H) abdmen da fmea, vista dorsal; I) ltimo segmento abdominal ventral
do macho com genitlia; J) parmero; K) abdmen da fmea, vista lateral; L)
ltimos segmentos abdominais ventrais da fmea. (*Lent & Wygodzinsky 1979)
Adaptado por Teresa Cristina M. Gonalves..
238
Figura 68: Triatoma rubrofasciata, genitlia do macho: (A) falo, semi-evertido,
vista lateral; B) idem, vista dorsal; C) aparelho articular; D) pigforo, vista lateral;
E) processo mediano do pigforo, vista dorsal. (*Lent & Wygodzinsky 1979).
239
Figura 69: Hempteros e os diferentes tipos de aparelhos
bucais (vista ventral): A) fitfago; B) predador; C) hematfago.
240
Figura 70: Distino do limite do clpeo
e do anteclpeo; ocelo elevado
situado em ntida salincia.
Figura 71: Calosidade ps-ocular

presente em todas as espcies
da Tribo Rhodniini.
Figura 72: Aspectos do pronoto:

A) P. megistus;
B) T. sordida;
C) R. brethesi.
241
Figura 73: Processo apical do escutelo alongado, sub-cilndrico, afilando
para a ponta: A) vista dorsal; B) vista lateral. Processo apical do escutelo
arredondado, cnico ou truncado na ponta: C) vista dorsal; D) vista lateral.
242
9.2 IlustraES DAS CHAVES DICOTMICAS
A seguir esto ilustradas as principais estruturas morfolgicas
empregadas na identificao das diferentes espcies de triatomneos.
Essas ilustraes esto no livro de Lent & Wygodzinsky, 1979, e foram
adaptadas por Teresa Cristina M. Gonalves.
Figura 74 (correspondente a Fig. 264 na chave dicotmica):

Rhodnius neglectus: A) cabea e pronoto; B) cabea, vista lateral;
C) colar; D) processo mediano do pigforo.

Rhodnius pictipes: A) cabea, vista dorsal; B) cabea, vista lateral;
C) antena com padro de pigmentos, primeiro segmento ausente;
D) processo mediano do pigforo.
243
Rhodnius prolixus: A) cabea, vista dorsal; B) cabea, vista lateral; C) colar;
D) processo mediano do pigforo; E) suporte do falosoma.

Rhodnius robustus: A) cabea, vista lateral; B) colar; C) cabea, vista dorsal;
D) escutelo; E) suporte do falosoma; F) processo mediano do pigforo.
244
Cavernicola pilosa: A) poro lateral da rea ventral; B) cabea, vista dorsal;
C) cabea, vista lateral; D) processo mediano do pigforo; E) trax, vista lateral;
F) venao da asa posterior; G) venao do hemlitro; H,I) fmur posterior, com
tricobtria; J-N) interior da clula da membrana, com nervura transversal hipottica.

Eratyrus mucronatus: A) cabea e trax, vista lateral, espcime da Guiana;
B-D) poro da regio anterior do hemlitro: B) espcime de Urcupata, Peru;
C) Manaus, Amazonas, Brasil; D) San Juan de Lagunillas, Mrida, Venezuela;
E-G) pronoto, vista lateral: E) San Juan de Lagunillas, Mrida, Venezuela; F) Aragua,
Lara, Venezuela; G) Borbur, Boyac, Colmbia; H-N) pronoto, bordo posterior,
ngulo humeral: H) Urcupata, Peru; I) Vila Vera, Mato Grosso, Brasil; J) Trinidad;
K) Hacienda Bonaire, Lara, Venezuela; L) Aragua, Lara, Venezuela;
M) Ejido, Mrida, Venezuela; N) Colnia de laboratrio, Venezuela.
245
Panstrongylus diasi: A) cabea, vista dorsal; B) fmur anterior;
C) cabea, vista lateral; D) pronoto.
Figura 81 (correspondente a Fig. 221na chave dicotmica):

Panstrongylus geniculatus: A) cabea, vista dorsal; B) cabea, vista lateral; C) regio
anteocular da cabea; D) padro cromtico do conexivo ventral, com metade lateral
do uroesternito, espcime de Barro Colorado, Panam; E) padro cromtico de
espcime de Barro Colorado; F) padro pigmentar do conexivo ventral, com metade
lateral do uroesternito, espcime de Trinidad; G) idem, espcime diferente de
Trinidad; H) fmur anterior; I-L) padro do conexivo ventral, com metade lateral do
uroesternito: I) espcime de Satipo, Peru; J) Chavantina, Mato Grosso, Brasil;
K) Rio Maraon, Peru; L) Venezuela.
246
Panstrongylus lignarius: A) cabea, vista dorsal; B) padro cromtico da pata
anterior; C) pronoto esquemtico; D) processo apical do escutelo;
E) cabea e poro anterior do protrax, vista lateral.
247
10. TCNICAS
10.1 CAPTURA DE TRIATOMNEOS

As tcnicas de captura de triatomneos podem ser realizadas
atravs de dois mtodos: busca passiva e busca ativa.
10.1.1 BUSCA ATIVA

Esse mtodo consiste na busca homem a homem que pode
ser realizada no domiclio, no peridomiclio e no ambiente silvestre.
Marcas de fezes nas paredes exuvias e ovos eclodidos so sinais
importantes que indicam a presena de triatomneos no local de
coleta (Figura 83).
Figura 83: Vestgios da presena de triatomneos: A) marcas de fezes na

parede; B) exvia de 5 estdio; C) ovos e casca de ovos;
D) casca de ovos aderidos palha da piaaba.
Fotos: Anthony Guimares (A), Teresa Cristina M. Gonalves (B e D), Catarina Macedo (C).
248
A) DOMICLIO
No domiclio a pesquisa feita em estrados de cama, objetos
guardados, caixas, paredes, calendrios e fotos presas em paredes,
roupas e teto com folhas de palmeira (Figura 84).
Figura 84: Pesquisa no domiclio: A) sob colcho; B) atrs de calendrios,

quadros e objetos pendurados na parede.
B) PERIDOMICLIO
No peridomiclio, a investigao mais abrangente, por ser uma
rea onde existem muitos locais que podem servir de abrigo para os
triatomneos. Sendo assim, um trabalho mais demorado que requer
muita ateno. Geralmente no peridomiclio, existem amontoados
de telhas, lenhas e tijolos, cerca de curral, galinheiros e pocilgas,
paiis, fornos, etc (Figura 85). As lenhas e cercas normalmente tm
suas cascas soltas e sob elas que os triatomneos ficam escondidos.
Sendo assim, as cascas devem ser removidas com cuidado para a
observao da presena de todas as formas do desenvolvimento dos
triatomneos, isto , de sua evoluo de ovo fase adulta.
249
Figura 85: Locais de investigao no peridomiclio: A) amontoado de tijolos;
B) galinheiro; C) amontoado de telhas; D) amontoado de lenha.
Fotos: Teresa Cristina M. Gonalves (A,B e C) e Catarina Macedo (D).
C) SILVESTRE
No ambiente silvestre as buscas so realizadas em locais que
podem abrigar os possveis hospedeiros. Esses ambientes incluem
pedras, ninhos de aves, sob a casca de troncos de rvores ou arbustos,
troncos de rvore, tocas de animais, bromlias, palmeiras e outros que
variam de acordo com a regio que est sendo trabalhada.
Para as buscas em rea de pedras, essas devem ser levantadas e,
aps a observao, devem retornar para a mesma posio, de modo
a no alterar o ambiente (Figura 86A).
No caso das palmeiras, possvel trabalhar com o uso de
armadilha com isca animal ou com a derrubada da palmeira. Nesse
caso, preciso de uma autorizao para a sua derrubada. O trabalho
realizado atravs da retirada das folhas uma a uma at chegar parte
central (Figura 86B).
250
Figura 86: Investigao no ambiente silvestre: A) sob pedras; B) palmeira.
Fotos: Catarina Macedo (A) e Angela C. V. Junqueira (B).
No caso dos ninhos (Figura 87) e cascas de rvores (Figura 88), esses
devem ser removidos com cuidado e colocados sobre um pano branco
para que se proceda a disseco em busca do triatomneo.
Na regio amaznica, encontrada uma diversidade de palmeiras,
habitat onde observa-se com frequncia, espcies do gnero Rhodnius,
(Ricardo - Silva, 2010).
Figura 87: Investigao de ninhos de aves no ambiente silvestre (A, B).

251
Figura 88: A) investigao em bromlia; B) investigao sob casca de rvore.
Fotos: Catarina Macedo (A) e Anthony Guimares (B).
Na palmeira Leopoldina piassaba, de onde se retira a piassaba,

so encontrados com frequncia, espcimes de Rhodnius brethesi.
Esses tm demonstrado um comportamento agressivo para com os
colhetores da piassaba que vivem, durante alguns meses, nos piaabais
para o trabalho de extrativismo da fibra da palmeira.
O transporte e o armazenamento desse material devem ser
feitos com cuidado para evitar a disperso dessa espcie atravs do
transporte passivo (Figura 89).
252
Figura 89: A) Leopoldina piassaba; B) detalhe da palha da piaaba; C) piaaba aps
descarregamento; D) preparo do material; E) piaaba pronta para o transporte.
253
O trabalho de disseco das palmeiras feito a partir da retirada
das folhas mais externas at chegar ao centro da palmeira, regio
denominada olho.
Todas as espcies da tribo Rhodniini e algumas do gnero Triatoma
depositam seus ovos colados ao substrato. Esse comportamento
possibilita que os ovos sejam transportados de um lugar para outro,
atravs da disperso passiva. As espcies da tribo Rhodniini so, em
sua maioria, parasitas de aves e essas podem levar os ovos presos em
suas penas (Figura 90A). Da mesma forma, as palmeiras so habitats
comuns s espcies do gnero Rhodnius, que podem fixar os seus
ovos nas folhas e/ou no fruto (Figura 90B-C). Alis, este foi o motivo
que levou domiciliao de Rhodnius prolixus em alguns pases da
Amrica Latina: o homem ter usado a palha da palmeira para cobrir
suas casas.
Figura 90: A) ovo fixado na pena de ave; B) inflorescncia do babau;

C) ovo fixado na inflorescncia.
254
D) MATERIAL UTILIZADO NA BUSCA ATIVA:
pina entomolgica;
lanterna e pilhas;
frascos com papel sanfonado para armazenar os insetos
coletados;
caneta pilot para escrever nos potes;
GPS para o georeferenciamento;
luvas.
10.1.2 BUSCA PASSIVA

Nesse mtodo, a captura feita com armadilhas que atraem os
insetos, portanto no h uma participao direta do homem. Essas
armadilhas podem ser de dois tipos: armadilha luminosa e armadilha
com isca animal.
A armadilha luminosa do tipo Malaise formada por um tecido
branco que mede cerca de 1,5m x 1,5m e por uma fonte luminosa, a
qual ser responsvel pela atrao dos insetos (Figura 91). O tecido deve
ser amarrado nas quatro extremidades de modo que fique esticado
e a luz possa refletir na sua superfcie. Essa armadilha montada no
perodo noturno, durante aproximadamente quatro horas, para que
haja o efeito da luz sobre os insetos. Durante a exposio, necessria
a permanncia do homem em local prximo armadilha, para que,
caso um triatomneo seja atrado, o mesmo possa ser coletado.
Existe outro tipo de armadilha luminosa, com base no uso de
lmpada, que fica disposta a certa altura do solo, de modo que o raio
de luz tenha um maior alcance. Essa armadilha fica acesa durante
todo o perodo noturno e pela manh feita a pesquisa do material
que foi coletado. A referida lmpada pode ser ligada em luz eltrica
ou em um gerador (Figura 92).
255
Figura 91: Captura noturna com armadilha luminosa do tipo Malaise.
Foto: Teresa Cristina M. Gonalves.
Figura 92: Armadilha luminosa utilizada na captura noturna.

Foto: Teresa Cristina M. Gonalves.
256
A armadilha com isca animal ou armadilha de Noireau, comumente
utilizada para as capturas no ambiente silvestre, baseia-se na utilizao
de um pote plstico, cuja tampa deve ser telada, na parte central.
Na parte superior, envolta por uma fita adesiva de dupla face. No
interior, colocado um animal (pinto ou camundongo) para que sirva
de isca para o triatomneo (Figuras 93 e 94).
Ao redor do bordo inferior, colocada uma fita adesiva para que
seja anotada a numerao da armadilha, a qual seguida at o final do
estudo. Esse tipo de armadilha usado em copa de palmeiras, buracos
de pedra, toca de animais, ocos de rvores, etc. (Figura 95) e dispensa
a presena do homem. O perodo de permanncia das armadilhas no
local pode variar de acordo com as condies do trabalho.
10.2 TRANSPORTE DOS INSETOS COLETADOS

Os insetos coletados devero ser acondicionados em recipientes,
devidamente identificados quanto ao local de captura, nome do coletor
e data (Figura 96). Estes dados so de extrema importncia porque,
havendo a necessidade de retornar ao local de coleta para capturar
mais espcimes, as referidas informaes possibilitaro a repetio do
procedimento.
O recipiente para o transporte do inseto vivo dever conter em
seu interior papel dobrado em sanfona, para aumentar a superfcie
de contato. Pequenos orifcios devem ser feitos na tampa, entretanto,
com o cuidado de no serem muito grandes para que os ovos e ninfas
de 1 estdio no passem (Figura 97).
No caso de insetos mortos, os mesmos devem ser contidos no
recipiente com um papel fino (papel higinico ou leno de papel),
para evitar que se desloquem dentro do recipiente, deslocamento
esse que poderia danificar as estruturas delicadas, como antenas,
tarsos e cerdas, dificultando sua identificao (Figura 98). Os potes
para transporte devem ser de plstico com aproximadamente 5 mm
de dimetro e 4 mm de altura, medidas adotadas pelas Secretarias de
Sade.
257
Figura 93: Sequncia da montagem da armadilha de Noireau:
A) material utilizado; B) colocao da isca animal no interior do pote;
C) fechamento do pote, evidenciando a tampa telada e a
colocao da fita dupla face; D) armadilha montada.
Fotos: Anthony Guimares.
258
Figura 94: Armadilha de Noireau positiva para barbeiro: A) armadilha com
triatomneos aderidos a fita dupla face e a fita adesiva na base, com a
numerao; B) detalhe da fita dupla face com triatomneos aderidos.
Figura 95: Tipos de ambientes onde podem ser colocadas armadilhas

de Noireau: A e B) pedras; C) imbricamento das folhas de palmeiras.
259
muito importante manter o inseto ntegro para no prejudicar
a identificao da espcie nem o exame para a investigao da
presena de infeco pelo parasito T. cruzi. Evitar que o espcime
entre em contato com algodo, caso venha a ser utilizado o mesmo
dentro do frasco.
Figura 96: Etiqueta com informaes bsicas sobre o inseto coletado.

A) ambiente de domiclio e peridomicilo; B) ambiente silvestre.
Figura 97: A) recipientes para transporte dos triatomneos contendo papel

de filtro no interior, dobrado em sanfona, para aumentar a
superfcie de contato; B) furos na tampa para a entrada de ar.
260
Figura 98: Modo de acondicionamento do inseto morto:
A) pote; B) pote com papel para conter o inseto para evitar
que o inseto se danifique; C) pote com o inseto acondicionado.
10.3 MONTAGEM DOS TRIATOMNEOS COLETADOS

A montagem dos insetos tem sua importncia, uma vez que
ao ser incorporada a uma coleo, far parte de um acervo e estar
disponvel para estudiosos da rea. Para isso, foi estabelecida uma
padronizao na montagem que varia entre as diferentes ordens de
insetos (Figura 99).
A simetria bilateral, isto , a semelhana entre os lados direito
e esquerdo do triatomneo, ratifica a importncia da preservao de
um dos lados, preservao que tornar possvel a observao de todas
as estruturas do inseto.
No caso dos percevejos, o inseto deve ser alfinetado, de preferncia
com alfinete entomolgico (Figura 100A), no lado direito do pronoto
(Figura 100B), nunca no meio, deixando, na parte superior do alfinete,
um espao suficiente para seu manuseio com a ponta dos dedos.
O inseto deve ficar perpendicular ao alfinete, para ser observado
ao microscpio estereoscpio (Figura 100C).
261
Figura 99: Ponto de insero do alfinete entomolgico,
em destaque um inseto da ordem Hemiptera.
Figura 100: A) alfinete entomolgico; B) local de insero do alfinete, lado direito

do pronoto; C) inseto alfinetado em posio perpendicular com as etiquetas.
262
A identificao do espcime alfinetado, bem como o local de coleta
e o nome de quem o classificou tambm so dados importantes. Sendo
assim, depois que o inseto alfinetado, juntam-se a ele trs etiquetas:
a primeira, com as informaes do pas, Estado, municpio, local de
coleta, data e nome do coletor; a segunda, com o nome da espcie,
do determinador e a data; e a terceira, opcional, com informaes
sobre o substrato de coleta (Figura 101), caso o ponto de coleta tenha
sido georreferenciado (GPS), informar na 2 etiqueta.
Figura 101: Modelo das etiquetas: A) identificao do local de coleta, da data e

do coletor. Nesse caso, costuma-se colocar o sobrenome do coletor, seguido
das iniciais do seu nome; B) identificao da espcie, da data e do coletor;
C) outras informaes (opcional).
Se o espcime analisado fizer parte de uma coleo, dever ser

numerado.
O inseto dever ser mantido, de preferncia, em gaveta com
naftalina, fixada no canto da gaveta, em ambiente seco, livre de
iluminao, uma vez que sua emisso descora o inseto (Figura 102).
A naftalina deve ser reposta periodicamente.
263
Figura 102: Armrio e gavetas da coleo entomolgica do Instituto Oswaldo Cruz/
FIOCRUZ: A) gaveta; B) detalhe do interior da gaveta.
264
10.4 INVESTIGAO ENTOMOLGICA
Esse procedimento consiste na realizao de uma pesquisa no
ambiente intradomiciliar e peridomiciliar, em uma rea de incidncia
de triatomneo ou uma rea onde o mesmo foi encontrado.
A investigao da presena de triatomneos deve ser feita em
reas previamente demarcadas de modo que, em caso de necessidade,
outro agente de sade, que desconhea a rea, possa identific-la e
dar continuidade ao trabalho.
Para isso, a Secretaria de Sade de cada municpio dispe de
um mapa dividido em microrregies, havendo para cada, um nmero
pr-determinado de agentes de sade responsvel pelo inqurito
entomolgico.
Todas as coletas realizadas no intradomiclio e/ou peridomiclio
devero ser georeferenciadas e notificadas atravs do preenchimento
de uma ficha denominada SIOChagas 1 (Sistema de Operao de
Campo Doena de Chagas), conforme modelo sugerido (Anexo 2).
Nessa ficha, devero constar todas as informaes referentes
Unidade Domiciliar tais como: localizao, nmero de moradores,
condies da moradia, tipos de anexos e dados da pesquisa e
borrifao referentes ao tipo de parede, de teto, de piso e distncia
da rea silvestre, bem como o resultado da pesquisa entomolgica no
intradomiclio e no peridomiclio, com o registro da captura do inseto
e da presena de vestgios.
O material coletado levado ao laboratrio, onde ser identificado
quanto espcie, local de captura, fase de desenvolvimento e
presena de infeco por tripanosomatdeo. O resultado desse trabalho
relatado, no modelo de ficha SIOChagas 2 (Anexo 2).
Visando uma abrangncia de notificao que inclua no s as
coletas do intradomiclio e peridomiclio, mas tambm do ambiente
silvestre, foi adaptado um terceiro modelo de ficha SIOChagas
(Junqueira ACV, Moreira CJC & Gonalves TCM) (Anexo 3). Nessa ficha,
265
considerada a distncia do local de coleta em relao s edificaes,
o local de coleta, a fase de desenvolvimento do inseto coletado e
o resultado da investigao para o parasito. Nesse caso, a pequisa
realizada nas fezes, no tubo digestivo, na glndula salivar e na
hemolinfa.
No Anexo 4 so apresentados os indicadores entomolgicos de
uso corrente para uma avaliao da pesquisa realizada.
10.5 DISSECO DO INSETO

10.5.1 TRATO INTESTINAL
Retirar as asas e, com o auxlio de uma tesoura, cortar as laterais
do abdmen, na altura do conexivo, no sentido pstero-anterior e por
ltimo transversalmente, para a remoo da regio dorsal (Figura 103).
As regies do tubo digestivo que ficaro expostas sero o mesntero
e o proctodeo, que devero ser pinadas em ambas as extremidades
e transferidas para a placa de Petri, onde sero maceradas com salina.
Deve-se tomar muito cuidado nessa etapa, principalmente se o inseto
estiver ingurgitado, para no romper o tubo digestivo. Macerar bem o
material e observar entre lmina e lamnula ao microscpio.
10.5.2 GLNDULA SALIVAR:
Conforme foi feito no abdmen, continuar o corte lateral no trax
e por ltimo transversalmente, para remover a regio torcica dorsal.
Pelo fato de as glndulas serem transparentes (exceto no gnero
Rhodnius que so vermelhas) e esta regio ser muito musculosa,
preciso muito cuidado na sua extrao (Figura 104A). Uma maneira
de se extrair as glndulas puxando a cabea. As glndulas saem
presas ao esfago, intestino anterior (Figura 104B).
As formas infectantes do parasito Trypanosoma rangeli so
encontradas nas glndulas salivares, principalmente das espcies
do gnero Rhodnius. Para investigar a presena desses parasitos,
necessrio observ-los ao microscpio tico, entre lmina e lamnula,
com um pouco de salina.
266
Figura 103: Tcnica de disseco para a retirada dos tergitos abdominais: A) corte lateral
nos conexivos de ambos os lados; B) corte transversal no tergito prximo ao trax; C)
retirada dos tergitos; D) visualizao das estruturas internas e da hemolinfa (brilho).
Figura 104: A) visualizao das glndulas salivares no trax;

B) retirada das glndulas salivares, puxando pela cabea.
267
10.5.3 RETIRADA DE HEMOLINFA:
Quando se retira a asa ou a pata do inseto, comum observar o
extravasamento de um lquido transparente no seu ponto de insero,
que o sangue do inseto, tambm denominado de hemolinfa (Figura
105).
A quantidade de hemolinfa est diretamente relacionada com o
estado nutricional do inseto. Assim, caso o inseto tenha se alimentado
recentemente, haver uma quantidade maior de hemolinfa.
O parasito Trypanosoma rangeli, para chegar at a glndula salivar
atravessa a parede do tubo digestivo e cai na cavidade do corpo,
aonde na hemolinfa, vai para as glndulas salivares.
Outra maneira de investigar a presena daquele parasito atravs
da observao da hemolinfa entre lmina e lamnula.
Figura 105: Visualizao da hemolinfa aps a retirada do hemlitro.

268
10.6 IDENTIFICAO DA FONTE ALIMENTAR
Existem tcnicas laboratoriais de princpios distintos que permitem
avaliar a fonte alimentar de insetos hematfagos. Dentre estas
destacamos as seguintes:
10.6.1 TCNICA DE PRECIPITINA
A tcnica de precipitina adaptada por Bull e King (1923) para
identificao de fontes alimentares de insetos hematfagos, teve
poucas mudanas no sentido do seu aprimoramento. Marass et al.
(2004) ressaltam que apesar do seu largo emprego, a sensibilidade e
a especificidade so baixas, alm de requerer grande quantidade de
sangue. Essas dificuldades possibilitaram a necessidade do estudo de
outros mtodos para identificao.
Esta tcnica consiste na identificao das provveis fontes
alimentares de insetos hematfagos utilizando diferentes metodologias:
papel de filtro impregnado com fezes, fezes obtidas por compresso
abdominal do inseto ou a anlise do contedo intestinal total do inseto
(Siqueira 1960). Neste caso, o inseto deve ser dissecado conforme
descrito no tem 1. O intestino depois de retirado espalhado em um
papel de filtro em forma de disco, dividido em setores numerados
(Figura 106). Para cada amostra feito um esfregao do contedo
intestinal, a qual devidamente identificada e protocolada, de acordo
com a numerao. Aps seco, o papel de filtro deve ser guardado na
geladeira, em envelope, para posterior envio ao laboratrio que far
a anlise.
10.6.2 ENSAIO IMUNOENZIMTICO (ELISA)
Na dcada de 80, os pesquisadores comearam a utilizar a tcnica
imunoenzimtica para a identificao das fontes alimentares (Burkot
et al, 1981). Apesar de ser um ensaio muito sensvel e permitir
automatizao, sua especificidade pode ser comprometida entre
outros fatores pela qualidade e quantidade do anti-soro empregado
no ensaio (Duarte, 1997; Farfn, 2007).
269
Figura 106: Disco de papel de filtro para a impregnao
do contedo intestinal do triatomneo.
Desenho: Teresa Cristina M. Gonalves.
Nesta tcnica as fezes so colhidas por compresso abdominal,

diludas em 50 microlitros de PBS (pH 7,2 a 0,01M) e mantidas em
tubos Eppendorf. Os papis de filtro que forram os frascos de transporte
dos triatomneos, e que ficam impregnados de fezes, tambm podem
ser utilizados. Estes so eludos em 50 microlitros de PBS durante 12
horas, e centrifugados obtendo-se assim os extratos. Ambos devero
ser mantidos em freezer -20C at o teste com os anti-soros (Siqueira,
1960).
Procedimento Bsico: Vide dissertao mestrado de Duarte (1997).
10.6.3 MARCADORES MOLECULARES

O emprego da tcnica de marcadores moleculares tem mostrado
resultados promissores na identificao das fontes alimentares.
As metodologias mais utilizadas so os iniciadores especficos da
sequncia do DNA mitocondrial de unidades conhecidas como
citocromos (citocromo B e citocromo oxidase) para identificao de
fontes alimentares de artrpodes hematfagos vetores. Os ensaios com
esses iniciadores na PCR apresentam alta sensibilidade e especificidade
em relao aos procedimentos anteriormente relatados (Mukabana et
270
al., 2002; Chow-Shaffer et al., 2000; Steuber et al., 2005; Kirstein &
Gray 1996; Townzen et al; 2008; Mota et al., 2007).
Procedimento Bsico: Vide artigos de Pizarro & Stevens(2008) e Abbasi
et al (2009).
10.7 MATERIAL UTILIZADO PARA A DISSECO:
placa de Petri com parafina;

alfinete;
lminas e lamnulas bem limpas em lcool 70%;
2 pinas ponta fina;
1 tesoura pequena (tipo de unha);
soluo salina;
luva cirrgica;
mscara protetora.
271
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277
ANEXO 1
279
ANEXO 2
280
ANEXO 3
281
ANEXO 4
282
ANEXO 5 - PRANCHA VISANDO O RECONHECIMENTO DE
TRIATOMNEOS
Figura 13: Fotografia demonstrativa dos 3 principais gneros de triatomneos

descritos nas Amricas. Foto semelhante tem sido empregada nos inquritos
soroepidemiolgicos realizados na Microrregio do Rio Negro, AM, Brasil.
Foto: Rodrigo Mexas. Esquema: Amanda C. Souza e Marcello Pelliccione.
283
ANOTAES
284

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MANUAL DE CAPACITAO

Laboratrio de Doenas Parasitrias

Inclui CD com o contedo do Manual em formato PDF e material

Todos os direitos reservados. permitida a reproduo total ou

Teresa Cristina Monte Gonalves

Carlos Jos de Carvalho Moreira

Bernardino Cludio de Albuquerque

Jacenir Reis dos Santos Mallet

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Preparao do material didtico para as aulas prticas do Mdulo III.

Preparao das cpias reprogrficas.

Armando Carlos Lopes e Soraya Batoreu de Azevedo

Elizabeth Luz Snchez Roman

Jane Margaret Costa von Sydaw

Jos Borges Pereira

Jlio Cesar Miguel

Mariangela Ziccardi de Camargo Salles

Matheus de Oliveira Rachid

Mirko Rojas Cortez

Sergio Luiz Bessa Luz

Sonia Gumes Andrade

Mdulo II (Terico e prtico)

Mdulo III (Terico e prtico)

Os Mdulos I e II so ministrados em conjunto, na parte da

Rio de Janeiro, outubro de 2011.

Prof. Dr. Jos Rodrigues Coura

Intervalo 15:00 s 15:15

Subfamlia Triatomiae: morfologia externa, morfologia interna e fisiologia. 15:15 s 16:15

Intervalo 16:15 s 16:30

Intervalo 15:00 s 15:15

Intervalo 16:15 s 16:30

Intervalo 15:00 s 15:15

Intervalo 16:45 s 17:00

Intervalo 15:00 s 15:15

Intervalo 16:15 s 16:30

Outros mtodos de identificao de triatomneos: moleculares e bioqumicos. 16:30 s 18:30

Intervalo 15:00 s 15:15

Avaliao prtica: identificao das principais espcies de triatomneos. 15:15 s 16:15

Correo das duas avaliaes junto com os alunos. 16:30 s 18:30

ANEXOS DOS MDULOS I E II

O risco da doena de Chagas se tornar endmica na Regio

Casos crnicos da doena com cardiopatia grave tm sido

Figura 2: Habitat de triatomneos silvestres e de Didelphis

ALBAJAR, P.V.; LAREDO, S.V.; TERRAZAS, M.B.; COURA, J.R. Miocardiopatia

Brener, Z.; Andrade, Z.A.; Barral-Netto, M. Trypanosoma cruzi

Coura, J.R. Chagas disease: what is known and what is needed A

Coura, J.R.; Junqueira, A.C.V., Carvalho-Moreira, C.J.; Borges-

DIAS, J.C.P.; COURA, J.R. Clnica e Teraputica da Doena de Chagas.

Dias, J.C.P.; Macedo, V.O. Doena de Chagas. In: JR Coura, Dinmica

E. CHOW-SHAFFER, E.; SINA, B.; HAWLEY, W.A.; DE BENEDICTIS,

Junqueira, A.C.V.; Albajar, P.V.; Coura, J.R. Doena de Chagas na

MOTA, J.; CHACON, J.C.; GUTIERREZ-CABRERA, A.E.; SANCHEZ-

MUKABANA, W.R.; TAKKEN, W.; KNOLS, B.G. Analysis of arthropod

PIZARRO, J.C.; STEVENS, L. A new method for forensic DNA analysis of

STEUBER, S.; ABDEL-RADY, A.; CLAUSEN, P.H. PCR-RFLP analysis: a

TOWNZEN, J. S.; BROWER, A. V.; JUDD, D. D. Identification of mosquito

O Trypanosoma cruzi (Chagas 1909), um protozorio

Tabela 1: Exemplos de subgneros e espcies de tripanossomas,

Figura 3: Origem geogrfica de 4 diferentes grupos de T. rangeli

1.1 DIFERENTES ESTDIOS EVOLUTIVOS DO T. cruzi

O T. cruzi apresenta formas evolutivas com aspectos morfolgicos

Figura 4: Forma amastigota de T. cruzi: B) amastigota em um macrfago;

Figura 5: Forma epimastigota de T. cruzi: A) desenho;