Quim. Nova, Vol. 28, No.

4, 719-722, 2005

CROMATOGRAFIA DE TROCA-INICA APLICADA AO ISOLAMENTO DA FRAO CIDA DO LEO DE

Nota Tcnica
COPABA (Copaifera multijuga) E DA SACACA (Croton cajucara)

Amaro Gomes Barreto Jnior* e Evaristo Chalbaud Biscaia Junior

Coordenao dos Programas de Ps-graduao de Engenharia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitria,
CP 68502, 21945-970 Rio de Janeiro - RJ
Valdir Florncio da Veiga Junior, Angelo C. Pinto e Sergio Freire de Carvalhaes
Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitria, 21945-970 Rio de Janeiro - RJ
Maria Aparecida M. Maciel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Qumica, Campus Universitrio, 59078-970 Natal - RN

Recebido em 30/8/04; aceito em 19/11/04; publicado na web em 13/4/05

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY APPLIED TO THE FRACTIONATION OF THE COPABA OIL (Copaifera multijuga)
AND SACACA (Croton cajucara) EXTRACTS. Plant extracts are usually complex mixtures which contain several molecules of
different sizes with varied functional groups. Such extracts are a challenge to the chemist of natural products. Ion exchange
chromatography in non-aqueous medium, used for separation of basic or acidic fractions from plant extracts, is an important unit
operation in preparative scale separations. Anionic macroporous resin in non-aqueous medium was used with success in this study
for separation of the acid fraction of Copaifera multijuga (Copaiba oil), rich in labdanic diterpenes and for the methanolic extract
of Croton cajucara (acetyl aleuritoric acid).

Keywords: ion exchange chromatography; Copaifera multijuga; Croton cajucara.

INTRODUO Quando as molculas que se deseja separar so substncias

Extratos brutos vegetais so, normalmente, misturas comple-
xas constitudas quase sempre por diversas classes de produtos
naturais, contendo diferentes grupos funcionais. O isolamento destas
substncias, seja para identificao ou, em maior quantidade, para
a realizao de ensaios farmacolgicos, um processo tedioso que
envolve adsorventes caros e grandes quantidades de solventes.
A obteno de grandes quantidades de substncias ou extratos
semi-purificados para ensaios farmacolgicos in vivo , atualmen-
te, uma das etapas essenciais para o estudo de plantas medicinais.
Por isso necessrio o desenvolvimento de novas metodologias de
fracionamento e isolamento de substncias obtidas a partir de ex-
tratos de plantas.
O processo de separao de produtos naturais bioativos
corresponde a trs fases principais: extrao a partir da matria
vegetal, fracionamento do extrato ou leo e purificao do princ-
pio ativo.
A primeira etapa normalmente utiliza extratores que operam com
solventes. As etapas seguintes, entretanto, podem ser realizadas de
diversas maneiras. Quanto mais seletivas forem essas etapas, menor
o tempo necessrio para obteno do produto desejado. Em escala
de laboratrio, a cromatografia de adsoro em slica a tcnica
mais utilizada. Variaes desta tcnica tm sido apresentadas na
literatura, como a adaptao realizada por Pinto e colaboradores1 da
metodologia originalmente desenvolvida por McCarthy e Duthie2,
utilizando cromatografia flash, com slica impregnada em KOH,
para a separao de hidrocarbonetos e lcoois sesquiterpnicos dos
cidos diterpnicos do leo de copaba (Copaifera sp.).
Industrialmente, o fracionamento de extratos vegetais desen-
volvido por partio, utilizando solventes orgnicos imiscveis (ex-
trao lquido/lquido), e por extrao cido-base.
*e-mail: abarreto@peqmail.peq.coppe.ufrj.br
cidas ou bsicas, a utilizao de resinas de troca inica pode ser
uma excelente alternativa. Vrios inconvenientes das extraes l-
quido-lquido e cido-base podem ser minimizados usando-se a
cromatografia de troca inica (CTI), como por ex.: formao de
emulses de difcil separao, que comprometem a eficincia do
processo de partio; limitao no uso do solvente de extrao, j
que os dois lquidos devem ser imiscveis; extrao de compostos
no cidos solveis em gua; custo elevado e periculosidade po-
tencial para o operador em funo de manipulao de volumes ele-
vados de solventes, geralmente perigosos; baixa reprodutibilidade
e dificuldades de automatizao3,4.
A cromatografia de troca inica em meio no aquoso foi apli-
cada, na dcada de 1950, para a separao de fitofrmacos, utili-
zando resinas sulfnicas com baixo grau de ligaes cruzadas, no
apresentando, entretanto, bom desempenho na recuperao das
molculas de interesse5-7. Em 1962, Kunin e colaboradores propu-
seram a utilizao de suportes polimricos macroporosos, com alto
grau de ligaes cruzadas, os quais no exibiam alterao de
porosidade em meio no aquoso8. Essas novas resinas macro-
porosas trocadoras de ons apresentaram melhores desempenhos
de recuperao, tendo sido utilizadas na separao de antibiti-
cos9, protenas10 e acares11. Estudos recentes mostram a aplica-
o destas resinas tambm para alcalides12,13, inclusive queles
presentes em extratos brutos vegetais4,14.
Alcalides foram separados do extrato etanlico de Peschiera
affinis com alto nvel de recuperao (85-96%), utilizando-se resi-
na macroporosa funcionalizada com grupamentos sulfnicos de alta
capacidade de troca inica (1,66 meq/g resina)14. Para a concentra-
o dos alcalides presentes no extrato etanlico de Catharantus
roseus a utilizao de resina de troca inica mostrou maior eficin-
cia de separao que os mtodos clssicos4.
Para a separao de cidos a partir de extratos de origem natural,
a utilizao da resina aninica macroporosa em meio no aquoso
720 Barreto Jr. et al.
apresenta uma srie de vantagens em relao ao processo clssico de
cromatografia em coluna de slica. Estas vantagens, listadas na Ta-
bela 1, motivaram a utilizao de resinas de troca inica na separa-
o de princpios ativos ou extratos contendo substncias ionizveis.
Tabela 1. Vantagens da cromatografia de troca inica em relao
s colunas de slica
pode ser utilizada em escala de laboratrio e ser facilmente
ampliada (Scale-Up) para quantidades maiores, em escala in-
dustrial;
a matriz polimrica tem menor capacidade de adsoro fsica
que o gel de slica, minimizando a adsoro de substncias no
cidas em sua superfcie, diminuindo a presena de contami-
nantes;
as resinas polimricas com grupamentos funcionais ligados
covalentemente podem atuar em diferentes faixas de pH,
viabilizando a separao de fraes de cidos ou de bases (no
caso de resina catinica) com diferentes valores de pKa;
o uso de resinas aninicas implica em um nmero menor de etapas
e de fraes, conseqentemente, menor gasto de tempo e de
material e
as resinas polimricas podem ser facilmente recuperadas e re-
utilizadas, sem perda de capacidade de adsoro.
O objetivo deste trabalho mostrar a utilizao de resina
aninica macroporosa (poliestireno-divinilbenzeno funcionalizada
sob a forma de hidrxido de sal de amnio quaternrio e de amina
terciria) em meio no aquoso, para a obteno de uma frao de
cidos do leo de copaba, obtido de Copaifera multijuga, e do
extrato metanlico de Croton cajucara (Sacaca), duas espcies
muito usadas na medicina popular15.
PARTE EXPERIMENTAL
Obteno e anlise do material vegetal
O leo de copaba analisado foi obtido de um espcime de
Copaifera multijuga Hayne, localizado na Reserva Ducke do Insti-
tuto Nacional de Pesquisas da Amaznia, em Manaus - AM.
As cascas da Sacaca (Croton cajucara Benth) foram obtidas de
um espcime localizado em Belm - PA. As cascas, secas a 40 C e
modas em triturador de facas horizontal, foram primeiramente
extradas em Soxhlet com hexano durante 48 h, e, em seguida,
extradas em metanol durante 48 h, para a obteno do extrato
metanlico, como descrito por Maciel16.
As fraes obtidas atravs da cromatografia de troca inica
(adsorvidas e dessorvidas) foram esterificadas com diazometano e
analisadas atravs de cromatografia em fase gasosa de alta resolu-
o utilizando deteco em ionizao de chama (CGAR-DIC) e
espectrometria de massas (CGAR-EM). A identificao dos consti-
tuintes qumicos foi realizada atravs de comparao dos espectros
obtidos com os armazenados na Espectroteca Wiley e com dados de
substncias isoladas e purificadas em trabalhos anteriores.
As anlises cromatogrficas das fraes do leo de copaba
foram realizadas em cromatgrafo a gs (Hewlett Packard - mode-
lo 5890), coluna SE-54 com 20 m de comprimento, 0,25 mm de
dimetro interno e 0,25 m de espessura de fase, nas seguintes
condies: gs de arraste Hidrognio, com vazo de 2 ml/min e
diviso de fluxo (split) de 1:20. A temperatura inicial foi ajusta-
da em 120 oC, com de taxa de aquecimento de 2 oC/min at 160 oC,
quando a taxa de aquecimento passou a ser igual a 10 oC /min at a
temperatura final de 270 oC, mantida constante por 5 min.
Quim. Nova
As amostras esterificadas com diazometano, provenientes do
fracionamento do extrato metanlico de Croton cajucara, foram
analisadas por cromatografia em fase gasosa acoplada ao espec-
trmetro de massas (equipamento Hewlett Packard - modelo 6890
MSD), coluna DB5 com 60 m de comprimento, 0,249 mm de di-
metro, 0,25 m de espessura de fase, nas seguintes condies: gs
de arraste Hlio, com vazo de 1,6 ml/min, sem diviso de fluxo
(splitless). A temperatura inicial foi ajustada em 55 oC e mantida
constante por 2 min, seguindo uma taxa de aquecimento de 4 oC/
min at atingir a temperatura final de 320o C, a qual foi mantida
constante por 10 min.
Reagentes
Todos os reagentes utilizados foram de grau para anlise e os
solventes foram destilados antes de serem utilizados .
Purificao e ativao da resina
Aproximadamente 500 g de resina aninica macroporosa de
copolmero de estireno-co-divinilbenzeno funcionalizada sob as
formas de amina terciria e sal de amnio quaternrio (Lewatit MP
64, de fabricao Bayer), foram purificadas/ativadas de acordo com
o seguinte procedimento, desenvolvido por Green e colaborado-
res17:
(a) eluio com 8 L de HCl 1,7 M, a uma vazo de 3 ml/min;
(b) lavagens sucessivas com 1,3 L de gua, 8 L de NaOH 1,7 M,
4 L de gua, 8 L de uma mistura 1:1 de n-propanol:gua e 8 L
de n-propanol, na mesma vazo descrita no tem 1 e
(c) extrao em Soxhlet durante 24 h com ter etlico e 24 h com
ter de petrleo.
Adsoro e dessoro da frao cida em resina trocadora de
ons
Uma coluna de vidro de 50 cm de comprimento e 0,9 cm de
dimetro foi empacotada com 20 g da resina (purificada/ativada) em
suspenso com a soluo usada para a eluio da coluna:
tolueno:etanol (1:1). A coluna foi conectada a uma bomba Milton
Roy por meio de tubos e conexes de teflon de 1/8" e condicionada
com 250 mL da mesma soluo, sob vazo de 1,5 mL/min. A amos-
tra (1 g), diluda em 250 mL da soluo de eluio, foi injetada na
coluna. A frao no cida foi eluda com 250 mL da soluo de
eluio mesma vazo da usada no condicionamento da coluna. A
dessoro dos cidos carboxlicos adsorvidos na resina aninica foi
realizada por extrao em Soxhlet (250 mL de tolueno e 6 mL de
cido frmico) por 4 h (Figura 1). Todos os solventes foram recupe-
rados em evaporador rotatrio (presso de 1 mm de Hg), a 40 C.
A dessoro dos cidos presentes na coluna foi desenvolvida
em soxhlet, para alcanar a maior quantidade possvel de cidos
dessorvidos.
O rendimento de recuperao (de dessoro) com soluo de
cido frmico na prpria coluna depende da vazo, da concentra-
o de cido frmico e do tempo de dessoro. Por essas razes,
foi utilizado soxhlet com soluo de cido frmico 0,4% em tolueno
e etanol (1:1). Esta concentrao de cido frmico suficiente
para garantir 100% de rendimento de recuperao, na temperatura
de vaporizao da mistura tolueno-cido frmico, pois estes for-
mam azetropo presso ambiente.
RESULTADOS E DISCUSSO
O leo de copaba extrado de vrias espcies do gnero
Vol. 28, No. 4 Cromatografia de Troca-Inica Aplicada ao Isolamento da Frao cida 721

reteno relativa22, os seguintes cidos carboxlicos diterpnicos:

coplico, colavnico, 3-hidrxi-coplico, agtico e 3-acetxi-
coplico (Figuras 4 e 5). Convm observar que no ocorreu qual-
quer discriminao na adsoro qumica destes cidos diterpnicos,
uma vez que o perfil cromatogrfico desta frao idntico ao dos
cidos carboxlicos obtidos desta mesma amostra por eluio em
gel de slica impregnada com KOH1,22.

Figura 1. Fluxograma das etapas do processo

Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae). Amplamente utiliza-

do na medicina popular como anti-inflamatrio e cicatrizante, este
leo encontrado em grande parte das feiras livres, mercados po-
pulares, ervanrios e farmcias de produtos naturais de todo o pas. Figura 2. Cromatograma do leo de copaba (esterificado com diazometano)
Os leos de copaba so constitudos por misturas de sesquiterpenos,
predominantes na maioria deles, e de diterpenos18. A indstria de
perfumes e cosmticos tem mostrado grande interesse na frao de
sesquiterpenos, responsvel pelo aroma do leo de copaba. O va-
lor de concentrados de sesquiterpenos de Copaifera chega a ser
600 vezes maior que o do leo bruto19. Quanto aos diterpenos, h
registros na literatura de 28 diterpenos diferentes com os esquele-
tos caurano, labdano e clerodano. Entretanto, apenas o cido
coplico est presente em todas as espcies estudadas por Veiga Jr
e colaboradores19.
Do ponto de vista farmacolgico, a aplicao do leo e de suas
fraes objeto de vrios estudos. H registros de atividade anti-
Figura 3. Cromatograma da frao no adsorvida
inflamatria na frao de hidrocarbonetos sesquiterpnicos20, as-
sim como de atividade antitumoral entre os constituintes da frao
de diterpenos21. Artigo recente de reviso lista as atividades farma-
colgicas e os constituintes qumicos dos leos de copaba19.
Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) popularmente co-
nhecida como sacaca, sendo muito utilizada na medicina popular
na regio Amaznica. O uso desta planta vem se difundindo por
todo o pas16. Apesar disto, os estudos farmacolgicos sobre esta
planta so recentes. A partir de 1996, foram demonstradas as ativi-
dades anti-inflamatria, antitumoral e antiestrognica da trans-
desidrocrotonina, um 19-nor-diterpeno neutro majoritrio nas cas-
cas de rvores adultas (idade acima de 3 anos)16. Foram observadas
tambm atividades antiespasmdica, anti-inflamatria e antinoci-
Figura 4. Cromatograma da frao adsorvida (esterificada com diazometano)
ceptiva do triterpeno cido acetil aleuritlico, um cido majorit-
rio nas cascas de rvores jovens (idade at 2 anos)16.

Fracionamento do leo de copaba

O perfil cromatogrfico do leo de Copaifera multijuga (Figu-

ra 2) apresenta dois grupos de substncias em regies bem distin-
tas: hidrocarbonetos e lcoois sesquiterpnicos e cidos
diterpnicos18. Aps adsoro em resina aninica macroporosa
possvel observar a separao bem definida destas duas fraes.
Na frao no adsorvida no se observa a presena de cidos
carboxilcos diterpnicos, assim como na frao destes cidos no
foi detectada a presena de compostos neutros (hidrocarbonetos e
lcoois sesquiterpnicos), como pode ser observado nas Figuras 3
e 4.
Na frao cida (frao adsorvida) foram identificados atravs Figura 5. Principais diterpenos cidos extrados por cromatografia de troca
dos espectros de massas, em conjunto com os dados de tempo de inica do leo de Copaifera multijuga
722
Fracionamento do extrato metanlico de Croton cajucara
O fracionamento do extrato de metanlico de Croton cajucara
com resina aninica, desenvolvido de acordo com a metodologia
representada na Figura 1, permitiu a separao de cidos carbo-
xlicos lineares de 15 a 28 tomos de carbono e do triterpeno cido
acetil aleuritlico (Figura 6). A identificao destas substncias
foi feita com base na interpretao dos seus dados de massas e por
comparao destes dados com os perfis de padres disponveis na
Espectroteca Wiley, e com os dados de substncias padro16.
Figura 6. cido acetil aleuritrico, extrado por cromatografia de troca inica
do extrato metanlico de Croton cajucara
CONCLUSES
A tcnica de cromatografia de troca inica em meio no aquo-
so foi aplicada com sucesso na separao dos cidos diterpnicos
do leo de Copaifera multijuga e de cidos lineares e do cido
triterpnico acetil aleuritlico de Croton cajucara. A seletividade
da separao de fraes cidas alta, pois no h substncias no
cidas na frao adsorvida e no h substncias cidas na frao
eluda.
O presente trabalho abre perspectivas para a utilizao desta
tcnica, no s para a concentrao de fraes cidas presentes em
pequenas quantidades em extratos bioativos como, tambm, pode
ser aplicada para a concentrao de substncias cidas de extratos
e leos em escala preparativa.
AGRADECIMENTOS
CAPES e FAPERJ.
Barreto Jr. et al. Quim. Nova
REFERNCIAS
1. Pinto, A. C.; Braga, W. F.; Rezende, C. M.; Garrido, F. M. S.; Veiga Jr, V.
F.; Bergter, L.; Patitucci, M. L.; Antunes, O. A. C.; J. Braz. Chem. Soc.
2000, 11, 355.
2. McCarthy, R. D.; Duthie, A. H.; J. Lip. Res. 1962, 3, 117.
3. Zief, M.; Kiser, R.; Am. Lab. 1990, 70.
4. Carvalhaes, S. F.; Costa, D. L.; Mazzei, J. L.; dAvila, L. A.; Taddei, L. E.
M.; Rev. Bras. Farmacog. 2002, 12, 83.
5. Berggren, A.; Bjorling, C. O.; Willmanjohnson, B.; Acta Chem. Scand.
1958, 12, 1521.
6. Mcguire, T. A.; Vanetten, C. H.; Earle, F. R.; J. Am. Pharm. Assoc. 1957,
46, 247.
7. Mehltretter, C. L.; Weakley, F. B.; J. Am. Pharm Assoc. 1956, 46, 193.
8. Kunin, R.; Meitzner, E.; Bortnick, N.; J. Am. Chem. Soc. 1962, 84, 305.
9. Gzeltun, E. E.; lgen, K. .; J. Chromatogr., A 2001, 914, 67.
10. Avramescu, M. E.; Borneman, Z.; Wessling, M.; J. Chromatogr., A 2003,
1006, 171.
11. Matijaevic, Lj.; Vasic-Racki, D.; Biochem. Eng. J. 2000, 4,101.
12. Barreto, A. S.; Siani, A. C.; Amaral, A. C. F.; Nunes, D. S. S. G.; Veiga
Jr., V. F.; Pinto, A. C.; Soares, K. C. C.; Taddei, L. E. M.; Carvalhaes, S.
F.; Resumos do II Simpsio Brasileiro de Farmacognosia, Curitiba, Brasil,
2001.
13. Albuquerque, M. E. L. R.; Viana, L. C. C.; Andrade, J. F. F.; WO pat 95/
01984 1995.
14. Soares K.; Carvalhaes S. F.; Taddei L. E. M.; Resumos da 23 Reunio
Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Poos de Caldas, Brasil, 2000.
15. Maciel, M. A. M.; Pinto, A. C.; Veiga Jr, V. F.; Grynberg, N. F.; Echevarria,
A.; Quim. Nova 2002, 25, 429.
16. Maciel, M. A. M.; Pinto, A. C.; Arruda, A. C.; Pamplona, S. G. S. R.;
Vanderlinde, F. A.; Lapa, A. J.; Clus, I. M. S.; Echevarria, A.; Grynberg,
N. F.; Farias, R. A. F.; Luna- Costa, A. M.; Rao, V. S. N.; J.
Ethnopharmacol. 2000, 70, 41.
17. Green, J. B.; Hoff, R. J.; Woodward, P. W.; Stevens, L. L.; Fuel 1984, 63,
1290.
18. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Patitucci, M. L.; Quim. Nova 1997, 20, 612.
19. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Quim. Nova 2002, 25, 273.
20. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Calixto, J. B.; Zunino, L.; Patitucci, M. L.;
Phytother. Res. 2001, 15, 476.
21. Ohsaki, A.; Yan, L. T.; Ito, S.; Edatsugi, H.; Iwata, D.; Komoda, Y.; Bio-
org. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 2889.
22. Veiga Jr, V. F.; Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Brasil, 2004.