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Quim. Nova, Vol. 28, No.

4, 719-722, 2005

CROMATOGRAFIA DE TROCA-INICA APLICADA AO ISOLAMENTO DA FRAO CIDA DO LEO DE

Nota Tcnica
COPABA (Copaifera multijuga) E DA SACACA (Croton cajucara)

Amaro Gomes Barreto Jnior* e Evaristo Chalbaud Biscaia Junior


Coordenao dos Programas de Ps-graduao de Engenharia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitria,
CP 68502, 21945-970 Rio de Janeiro - RJ
Valdir Florncio da Veiga Junior, Angelo C. Pinto e Sergio Freire de Carvalhaes
Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitria, 21945-970 Rio de Janeiro - RJ
Maria Aparecida M. Maciel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Qumica, Campus Universitrio, 59078-970 Natal - RN

Recebido em 30/8/04; aceito em 19/11/04; publicado na web em 13/4/05

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY APPLIED TO THE FRACTIONATION OF THE COPABA OIL (Copaifera multijuga)
AND SACACA (Croton cajucara) EXTRACTS. Plant extracts are usually complex mixtures which contain several molecules of
different sizes with varied functional groups. Such extracts are a challenge to the chemist of natural products. Ion exchange
chromatography in non-aqueous medium, used for separation of basic or acidic fractions from plant extracts, is an important unit
operation in preparative scale separations. Anionic macroporous resin in non-aqueous medium was used with success in this study
for separation of the acid fraction of Copaifera multijuga (Copaiba oil), rich in labdanic diterpenes and for the methanolic extract
of Croton cajucara (acetyl aleuritoric acid).

Keywords: ion exchange chromatography; Copaifera multijuga; Croton cajucara.

INTRODUO Quando as molculas que se deseja separar so substncias


cidas ou bsicas, a utilizao de resinas de troca inica pode ser
Extratos brutos vegetais so, normalmente, misturas comple- uma excelente alternativa. Vrios inconvenientes das extraes l-
xas constitudas quase sempre por diversas classes de produtos quido-lquido e cido-base podem ser minimizados usando-se a
naturais, contendo diferentes grupos funcionais. O isolamento destas cromatografia de troca inica (CTI), como por ex.: formao de
substncias, seja para identificao ou, em maior quantidade, para emulses de difcil separao, que comprometem a eficincia do
a realizao de ensaios farmacolgicos, um processo tedioso que processo de partio; limitao no uso do solvente de extrao, j
envolve adsorventes caros e grandes quantidades de solventes. que os dois lquidos devem ser imiscveis; extrao de compostos
A obteno de grandes quantidades de substncias ou extratos no cidos solveis em gua; custo elevado e periculosidade po-
semi-purificados para ensaios farmacolgicos in vivo , atualmen- tencial para o operador em funo de manipulao de volumes ele-
te, uma das etapas essenciais para o estudo de plantas medicinais. vados de solventes, geralmente perigosos; baixa reprodutibilidade
Por isso necessrio o desenvolvimento de novas metodologias de e dificuldades de automatizao3,4.
fracionamento e isolamento de substncias obtidas a partir de ex- A cromatografia de troca inica em meio no aquoso foi apli-
tratos de plantas. cada, na dcada de 1950, para a separao de fitofrmacos, utili-
O processo de separao de produtos naturais bioativos zando resinas sulfnicas com baixo grau de ligaes cruzadas, no
corresponde a trs fases principais: extrao a partir da matria apresentando, entretanto, bom desempenho na recuperao das
vegetal, fracionamento do extrato ou leo e purificao do princ- molculas de interesse5-7. Em 1962, Kunin e colaboradores propu-
pio ativo. seram a utilizao de suportes polimricos macroporosos, com alto
A primeira etapa normalmente utiliza extratores que operam com grau de ligaes cruzadas, os quais no exibiam alterao de
solventes. As etapas seguintes, entretanto, podem ser realizadas de porosidade em meio no aquoso8. Essas novas resinas macro-
diversas maneiras. Quanto mais seletivas forem essas etapas, menor porosas trocadoras de ons apresentaram melhores desempenhos
o tempo necessrio para obteno do produto desejado. Em escala de recuperao, tendo sido utilizadas na separao de antibiti-
de laboratrio, a cromatografia de adsoro em slica a tcnica cos9, protenas10 e acares11. Estudos recentes mostram a aplica-
mais utilizada. Variaes desta tcnica tm sido apresentadas na o destas resinas tambm para alcalides12,13, inclusive queles
literatura, como a adaptao realizada por Pinto e colaboradores1 da presentes em extratos brutos vegetais4,14.
metodologia originalmente desenvolvida por McCarthy e Duthie2, Alcalides foram separados do extrato etanlico de Peschiera
utilizando cromatografia flash, com slica impregnada em KOH, affinis com alto nvel de recuperao (85-96%), utilizando-se resi-
para a separao de hidrocarbonetos e lcoois sesquiterpnicos dos na macroporosa funcionalizada com grupamentos sulfnicos de alta
cidos diterpnicos do leo de copaba (Copaifera sp.). capacidade de troca inica (1,66 meq/g resina)14. Para a concentra-
Industrialmente, o fracionamento de extratos vegetais desen- o dos alcalides presentes no extrato etanlico de Catharantus
volvido por partio, utilizando solventes orgnicos imiscveis (ex- roseus a utilizao de resina de troca inica mostrou maior eficin-
trao lquido/lquido), e por extrao cido-base. cia de separao que os mtodos clssicos4.
Para a separao de cidos a partir de extratos de origem natural,
*e-mail: abarreto@peqmail.peq.coppe.ufrj.br a utilizao da resina aninica macroporosa em meio no aquoso
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apresenta uma srie de vantagens em relao ao processo clssico de As amostras esterificadas com diazometano, provenientes do
cromatografia em coluna de slica. Estas vantagens, listadas na Ta- fracionamento do extrato metanlico de Croton cajucara, foram
bela 1, motivaram a utilizao de resinas de troca inica na separa- analisadas por cromatografia em fase gasosa acoplada ao espec-
o de princpios ativos ou extratos contendo substncias ionizveis. trmetro de massas (equipamento Hewlett Packard - modelo 6890
MSD), coluna DB5 com 60 m de comprimento, 0,249 mm de di-
Tabela 1. Vantagens da cromatografia de troca inica em relao metro, 0,25 m de espessura de fase, nas seguintes condies: gs
s colunas de slica de arraste Hlio, com vazo de 1,6 ml/min, sem diviso de fluxo
(splitless). A temperatura inicial foi ajustada em 55 oC e mantida
pode ser utilizada em escala de laboratrio e ser facilmente
constante por 2 min, seguindo uma taxa de aquecimento de 4 oC/
ampliada (Scale-Up) para quantidades maiores, em escala in-
min at atingir a temperatura final de 320o C, a qual foi mantida
dustrial;
constante por 10 min.
a matriz polimrica tem menor capacidade de adsoro fsica
que o gel de slica, minimizando a adsoro de substncias no
Reagentes
cidas em sua superfcie, diminuindo a presena de contami-
nantes;
Todos os reagentes utilizados foram de grau para anlise e os
as resinas polimricas com grupamentos funcionais ligados
solventes foram destilados antes de serem utilizados .
covalentemente podem atuar em diferentes faixas de pH,
viabilizando a separao de fraes de cidos ou de bases (no
Purificao e ativao da resina
caso de resina catinica) com diferentes valores de pKa;
o uso de resinas aninicas implica em um nmero menor de etapas
Aproximadamente 500 g de resina aninica macroporosa de
e de fraes, conseqentemente, menor gasto de tempo e de
copolmero de estireno-co-divinilbenzeno funcionalizada sob as
material e
formas de amina terciria e sal de amnio quaternrio (Lewatit MP
as resinas polimricas podem ser facilmente recuperadas e re-
64, de fabricao Bayer), foram purificadas/ativadas de acordo com
utilizadas, sem perda de capacidade de adsoro.
o seguinte procedimento, desenvolvido por Green e colaborado-
res17:
O objetivo deste trabalho mostrar a utilizao de resina (a) eluio com 8 L de HCl 1,7 M, a uma vazo de 3 ml/min;
aninica macroporosa (poliestireno-divinilbenzeno funcionalizada (b) lavagens sucessivas com 1,3 L de gua, 8 L de NaOH 1,7 M,
sob a forma de hidrxido de sal de amnio quaternrio e de amina 4 L de gua, 8 L de uma mistura 1:1 de n-propanol:gua e 8 L
terciria) em meio no aquoso, para a obteno de uma frao de de n-propanol, na mesma vazo descrita no tem 1 e
cidos do leo de copaba, obtido de Copaifera multijuga, e do (c) extrao em Soxhlet durante 24 h com ter etlico e 24 h com
extrato metanlico de Croton cajucara (Sacaca), duas espcies ter de petrleo.
muito usadas na medicina popular15.
Adsoro e dessoro da frao cida em resina trocadora de
PARTE EXPERIMENTAL ons

Obteno e anlise do material vegetal Uma coluna de vidro de 50 cm de comprimento e 0,9 cm de


dimetro foi empacotada com 20 g da resina (purificada/ativada) em
O leo de copaba analisado foi obtido de um espcime de suspenso com a soluo usada para a eluio da coluna:
Copaifera multijuga Hayne, localizado na Reserva Ducke do Insti- tolueno:etanol (1:1). A coluna foi conectada a uma bomba Milton
tuto Nacional de Pesquisas da Amaznia, em Manaus - AM. Roy por meio de tubos e conexes de teflon de 1/8" e condicionada
As cascas da Sacaca (Croton cajucara Benth) foram obtidas de com 250 mL da mesma soluo, sob vazo de 1,5 mL/min. A amos-
um espcime localizado em Belm - PA. As cascas, secas a 40 C e tra (1 g), diluda em 250 mL da soluo de eluio, foi injetada na
modas em triturador de facas horizontal, foram primeiramente coluna. A frao no cida foi eluda com 250 mL da soluo de
extradas em Soxhlet com hexano durante 48 h, e, em seguida, eluio mesma vazo da usada no condicionamento da coluna. A
extradas em metanol durante 48 h, para a obteno do extrato dessoro dos cidos carboxlicos adsorvidos na resina aninica foi
metanlico, como descrito por Maciel16. realizada por extrao em Soxhlet (250 mL de tolueno e 6 mL de
As fraes obtidas atravs da cromatografia de troca inica cido frmico) por 4 h (Figura 1). Todos os solventes foram recupe-
(adsorvidas e dessorvidas) foram esterificadas com diazometano e rados em evaporador rotatrio (presso de 1 mm de Hg), a 40 C.
analisadas atravs de cromatografia em fase gasosa de alta resolu- A dessoro dos cidos presentes na coluna foi desenvolvida
o utilizando deteco em ionizao de chama (CGAR-DIC) e em soxhlet, para alcanar a maior quantidade possvel de cidos
espectrometria de massas (CGAR-EM). A identificao dos consti- dessorvidos.
tuintes qumicos foi realizada atravs de comparao dos espectros O rendimento de recuperao (de dessoro) com soluo de
obtidos com os armazenados na Espectroteca Wiley e com dados de cido frmico na prpria coluna depende da vazo, da concentra-
substncias isoladas e purificadas em trabalhos anteriores. o de cido frmico e do tempo de dessoro. Por essas razes,
As anlises cromatogrficas das fraes do leo de copaba foi utilizado soxhlet com soluo de cido frmico 0,4% em tolueno
foram realizadas em cromatgrafo a gs (Hewlett Packard - mode- e etanol (1:1). Esta concentrao de cido frmico suficiente
lo 5890), coluna SE-54 com 20 m de comprimento, 0,25 mm de para garantir 100% de rendimento de recuperao, na temperatura
dimetro interno e 0,25 m de espessura de fase, nas seguintes de vaporizao da mistura tolueno-cido frmico, pois estes for-
condies: gs de arraste Hidrognio, com vazo de 2 ml/min e mam azetropo presso ambiente.
diviso de fluxo (split) de 1:20. A temperatura inicial foi ajusta-
da em 120 oC, com de taxa de aquecimento de 2 oC/min at 160 oC, RESULTADOS E DISCUSSO
quando a taxa de aquecimento passou a ser igual a 10 oC /min at a
temperatura final de 270 oC, mantida constante por 5 min. O leo de copaba extrado de vrias espcies do gnero
Vol. 28, No. 4 Cromatografia de Troca-Inica Aplicada ao Isolamento da Frao cida 721

reteno relativa22, os seguintes cidos carboxlicos diterpnicos:


coplico, colavnico, 3-hidrxi-coplico, agtico e 3-acetxi-
coplico (Figuras 4 e 5). Convm observar que no ocorreu qual-
quer discriminao na adsoro qumica destes cidos diterpnicos,
uma vez que o perfil cromatogrfico desta frao idntico ao dos
cidos carboxlicos obtidos desta mesma amostra por eluio em
gel de slica impregnada com KOH1,22.

Figura 1. Fluxograma das etapas do processo

Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae). Amplamente utiliza-


do na medicina popular como anti-inflamatrio e cicatrizante, este
leo encontrado em grande parte das feiras livres, mercados po-
pulares, ervanrios e farmcias de produtos naturais de todo o pas. Figura 2. Cromatograma do leo de copaba (esterificado com diazometano)
Os leos de copaba so constitudos por misturas de sesquiterpenos,
predominantes na maioria deles, e de diterpenos18. A indstria de
perfumes e cosmticos tem mostrado grande interesse na frao de
sesquiterpenos, responsvel pelo aroma do leo de copaba. O va-
lor de concentrados de sesquiterpenos de Copaifera chega a ser
600 vezes maior que o do leo bruto19. Quanto aos diterpenos, h
registros na literatura de 28 diterpenos diferentes com os esquele-
tos caurano, labdano e clerodano. Entretanto, apenas o cido
coplico est presente em todas as espcies estudadas por Veiga Jr
e colaboradores19.
Do ponto de vista farmacolgico, a aplicao do leo e de suas
fraes objeto de vrios estudos. H registros de atividade anti-
Figura 3. Cromatograma da frao no adsorvida
inflamatria na frao de hidrocarbonetos sesquiterpnicos20, as-
sim como de atividade antitumoral entre os constituintes da frao
de diterpenos21. Artigo recente de reviso lista as atividades farma-
colgicas e os constituintes qumicos dos leos de copaba19.
Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) popularmente co-
nhecida como sacaca, sendo muito utilizada na medicina popular
na regio Amaznica. O uso desta planta vem se difundindo por
todo o pas16. Apesar disto, os estudos farmacolgicos sobre esta
planta so recentes. A partir de 1996, foram demonstradas as ativi-
dades anti-inflamatria, antitumoral e antiestrognica da trans-
desidrocrotonina, um 19-nor-diterpeno neutro majoritrio nas cas-
cas de rvores adultas (idade acima de 3 anos)16. Foram observadas
tambm atividades antiespasmdica, anti-inflamatria e antinoci-
Figura 4. Cromatograma da frao adsorvida (esterificada com diazometano)
ceptiva do triterpeno cido acetil aleuritlico, um cido majorit-
rio nas cascas de rvores jovens (idade at 2 anos)16.

Fracionamento do leo de copaba

O perfil cromatogrfico do leo de Copaifera multijuga (Figu-


ra 2) apresenta dois grupos de substncias em regies bem distin-
tas: hidrocarbonetos e lcoois sesquiterpnicos e cidos
diterpnicos18. Aps adsoro em resina aninica macroporosa
possvel observar a separao bem definida destas duas fraes.
Na frao no adsorvida no se observa a presena de cidos
carboxilcos diterpnicos, assim como na frao destes cidos no
foi detectada a presena de compostos neutros (hidrocarbonetos e
lcoois sesquiterpnicos), como pode ser observado nas Figuras 3
e 4.
Na frao cida (frao adsorvida) foram identificados atravs Figura 5. Principais diterpenos cidos extrados por cromatografia de troca
dos espectros de massas, em conjunto com os dados de tempo de inica do leo de Copaifera multijuga
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Fracionamento do extrato metanlico de Croton cajucara REFERNCIAS

O fracionamento do extrato de metanlico de Croton cajucara 1. Pinto, A. C.; Braga, W. F.; Rezende, C. M.; Garrido, F. M. S.; Veiga Jr, V.
com resina aninica, desenvolvido de acordo com a metodologia F.; Bergter, L.; Patitucci, M. L.; Antunes, O. A. C.; J. Braz. Chem. Soc.
2000, 11, 355.
representada na Figura 1, permitiu a separao de cidos carbo- 2. McCarthy, R. D.; Duthie, A. H.; J. Lip. Res. 1962, 3, 117.
xlicos lineares de 15 a 28 tomos de carbono e do triterpeno cido 3. Zief, M.; Kiser, R.; Am. Lab. 1990, 70.
acetil aleuritlico (Figura 6). A identificao destas substncias 4. Carvalhaes, S. F.; Costa, D. L.; Mazzei, J. L.; dAvila, L. A.; Taddei, L. E.
foi feita com base na interpretao dos seus dados de massas e por M.; Rev. Bras. Farmacog. 2002, 12, 83.
5. Berggren, A.; Bjorling, C. O.; Willmanjohnson, B.; Acta Chem. Scand.
comparao destes dados com os perfis de padres disponveis na
1958, 12, 1521.
Espectroteca Wiley, e com os dados de substncias padro16. 6. Mcguire, T. A.; Vanetten, C. H.; Earle, F. R.; J. Am. Pharm. Assoc. 1957,
46, 247.
7. Mehltretter, C. L.; Weakley, F. B.; J. Am. Pharm Assoc. 1956, 46, 193.
8. Kunin, R.; Meitzner, E.; Bortnick, N.; J. Am. Chem. Soc. 1962, 84, 305.
9. Gzeltun, E. E.; lgen, K. .; J. Chromatogr., A 2001, 914, 67.
10. Avramescu, M. E.; Borneman, Z.; Wessling, M.; J. Chromatogr., A 2003,
1006, 171.
11. Matijaevic, Lj.; Vasic-Racki, D.; Biochem. Eng. J. 2000, 4,101.
12. Barreto, A. S.; Siani, A. C.; Amaral, A. C. F.; Nunes, D. S. S. G.; Veiga
Jr., V. F.; Pinto, A. C.; Soares, K. C. C.; Taddei, L. E. M.; Carvalhaes, S.
F.; Resumos do II Simpsio Brasileiro de Farmacognosia, Curitiba, Brasil,
Figura 6. cido acetil aleuritrico, extrado por cromatografia de troca inica
2001.
do extrato metanlico de Croton cajucara 13. Albuquerque, M. E. L. R.; Viana, L. C. C.; Andrade, J. F. F.; WO pat 95/
01984 1995.
CONCLUSES 14. Soares K.; Carvalhaes S. F.; Taddei L. E. M.; Resumos da 23 Reunio
Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Poos de Caldas, Brasil, 2000.
15. Maciel, M. A. M.; Pinto, A. C.; Veiga Jr, V. F.; Grynberg, N. F.; Echevarria,
A tcnica de cromatografia de troca inica em meio no aquo- A.; Quim. Nova 2002, 25, 429.
so foi aplicada com sucesso na separao dos cidos diterpnicos 16. Maciel, M. A. M.; Pinto, A. C.; Arruda, A. C.; Pamplona, S. G. S. R.;
do leo de Copaifera multijuga e de cidos lineares e do cido Vanderlinde, F. A.; Lapa, A. J.; Clus, I. M. S.; Echevarria, A.; Grynberg,
N. F.; Farias, R. A. F.; Luna- Costa, A. M.; Rao, V. S. N.; J.
triterpnico acetil aleuritlico de Croton cajucara. A seletividade
Ethnopharmacol. 2000, 70, 41.
da separao de fraes cidas alta, pois no h substncias no 17. Green, J. B.; Hoff, R. J.; Woodward, P. W.; Stevens, L. L.; Fuel 1984, 63,
cidas na frao adsorvida e no h substncias cidas na frao 1290.
eluda. 18. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Patitucci, M. L.; Quim. Nova 1997, 20, 612.
O presente trabalho abre perspectivas para a utilizao desta 19. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Quim. Nova 2002, 25, 273.
20. Veiga Jr, V. F.; Pinto, A. C.; Calixto, J. B.; Zunino, L.; Patitucci, M. L.;
tcnica, no s para a concentrao de fraes cidas presentes em Phytother. Res. 2001, 15, 476.
pequenas quantidades em extratos bioativos como, tambm, pode 21. Ohsaki, A.; Yan, L. T.; Ito, S.; Edatsugi, H.; Iwata, D.; Komoda, Y.; Bio-
ser aplicada para a concentrao de substncias cidas de extratos org. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 2889.
e leos em escala preparativa. 22. Veiga Jr, V. F.; Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Brasil, 2004.
AGRADECIMENTOS

CAPES e FAPERJ.