Agregatibacter 2 PDF

UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
CENTRO INTEGRADO DE SADE - FACULDADE DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CLNICA ODONTOLGICA
Lvia de Oliveira Pereira
OCORRNCIA DE AGGREGATIBACTER
ACTINOMYCETEMCOMITANS NA SALIVA TOTAL EM PACIENTES
SOB TRATAMENTO ORTODNTICO
Juiz de Fora
2015
LVIA DE OLIVEIRA PEREIRA
OCORRNCIA DE AGGREGATIBACTER
ACTINOMYCETEMCOMITANS NA SALIVA TOTAL EM PACIENTES
SOB TRATAMENTO ORTODNTICO
Dissertao apresentada ao Programa

de Ps-graduao em Clnica
Odontolgica, da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal
de Juiz de Fora, como requisito parcial
para obteno do Ttulo de Mestre em
Clnica Odontolgica, rea de
concentrao: Clnica Odontolgica
Orientador: Prof. Dr. Marcio Jos da Silva Campos
Juiz de Fora
2015
Ficha catalogrfica elaborada atravs do programa de gerao
automtica da Biblioteca Universitria da UFJF,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
de Oliveira Pereira, Lvia .

Ocorrncia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans na
saliva total em pacientes sob tratamento ortodntico / Lvia
de Oliveira Pereira. -- 2015.
61 p. : il.
Orientador: Marcio Jos da Silva Campos

Dissertao (mestrado acadmico) - Universidade Federal de
Juiz de Fora, Faculdade de Odontologia. Programa de Ps-
Graduao em Clnica Odontolgica, 2015.
1. Aggregatibacter Actinomycetemcomitans. 2. Saliva. 3.

Tratamento Ortodntico. I. Jos da Silva Campos, Marcio,
orient. II. Ttulo.
BANCA EXAMINADORA
________________________________
Prof. Dr. Marcio Jos da Silva Campos
Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________
Prof. Dr. Maria das Graas Afonso Miranda Chaves
_________________________________________
Prof. Dr Marta Fonseca Martins
Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora
Suplentes:
__________________________________________
Prof. Dr. Roberto Sotto-Maior Fortes de Oliveira
__________________________________________
Profa. Dr Cristiane Corsini Medeiros Otenio
Universidade Estcio de S - Juiz de Fora
DEDICATRIA
Dedico esta dissertao
Deus por ser sempre fiel e aos meus amados pais.

AGRADECIMENTOS
Agradeo primeiramente e sempre ao meu querido Deus porque Ele tem sido fiel para
comigo. Amo o Senhor em todo tempo e em qualquer circunstncia! Ti toda honra e toda glria!
Aos meus pais, Marclio (in memoriam) e Vicentina, por me ensinarem o caminho certo e
me amarem incondicionalmente! Pai, te amo para sempre! Me voc a melhor de todas! Obrigada
por ser meu porto seguro sempre! Te amo para sempre!
minha famlia Oliveira, em especial aos meus tios (as) que estiveram sempre me
orientando, orando e torcendo pelo meu sucesso! Amo vocs!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcio Campos, por ter me ajudado desde o incio e por ser
meu exemplo na rea acadmica.
Prof. Dra. Maria das Graas Afonso Miranda Chaves por ter me iniciado e incentivado na
pesquisa!
EMBRAPA-Juiz de Fora, especialmente Dra. Marta Martins e Dra. Isabela Fonseca por
terem feito as anlises da pesquisa e estarem sempre abertas para responder meus questionamentos.
Muito obrigada!
s amigas da especializao por terem me ajudado e estarem sempre me incentivando nos
momentos difceis que passei nesses dois anos.
s amigas do mestrado, Jssica Avelar, Lvia Salgado e Mariana Nadaes! Vocs foram um
presente de Deus na minha vida! Agradeo em especial Lvia Salgado por ter me ajudado com as
coletas da pesquisa! Sem voc no teria chegado at aqui! Obrigada!
Agradeo aos meus amigos da Congregao Metodista do bairro Borboleta, pelas oraes e
incentivo em todas as reas da minha vida! Amo vocs!
Buscai em Primeiro Lugar o Reino de Deus e a Sua Justia e todas as
coisas vos Sero Acrescentadas
Mateus 6.33
PEREIRA, L.O. Ocorrncia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans na saliva
total em pacientes sob tratamento ortodntico. Juiz de Fora (MG), 2015. 60f.
Apresentao de Dissertao (Curso de Ps-Graduao stricto sensu Mestrado
em Clnica Odontolgica) Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Juiz
de Fora (MG).
RESUMO
O tratamento ortodntico apresenta potencial para causar alteraes no

periodonto devido ao acmulo de biofilme, em funo da dificuldade de
realizao de uma adequada higiene bucal na presena de bandas e braquetes.
OBJETIVOS: avaliar a ocorrncia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans na
saliva total em indivduos antes e depois da instalao do aparelho ortodntico
fixo metlico. METODOLOGIA: Foram avaliados 15 pacientes da Clnica de
Especializao em Ortodontia da Faculdade de Odontologia UFJF e de
consultrios particulares, do sexo feminino e masculino, com idade mdia de 18
anos e 3 meses (14-18 anos); 7 homens e 8 mulheres. Amostras de saliva total
foram coletadas um ms antes (T1), imediatamente antes (T2), 15 dias antes
(T3) e 1 ms aps a instalao de aparelho fixo Edgewise Standard (Morelli
10.30.900) nos dentes superiores e inferiores, com exceo dos segundos e
terceiros molares. A coleta de saliva foi realizada com o dispositivo Salivete
Cortisol (Sarstedt Nmbrecht, Alemanha), com swab neutro de polister e
microtubo. A partir das amostras coletadas, foi realizada a extrao do DNA para
identificao da bactria (Aa) por meio do mtodo Reao em Cadeia Polimerase
em tempo real. RESULTADOS: Aps as anlises, no havia a presena da
bactria Aggregatibacter actinomycetemcomitans em nenhum dos intervalos das
amostras testadas. No houve deteriorao da condio periodontal (ndice de
placa visvel, profundidade de sondagem e sangramento sondagem) aps T4.
CONCLUSES: a) no foi possvel identificar a ocorrncia da bactria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans na saliva nem antes (um ms antes),
nem no dia da colagem, nem 15 e um ms aps a colagem do aparelho fixo; b) o
uso do aparelho fixo no contribuiu para o aumento dos ndices de placa,
profundidade de sondagem e sangramento sondagem.
PALAVRAS-CHAVE: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, aparelho

ortodntico, saliva
PEREIRA, L.O. Occurrence Aggregatibacter actinomycetemcomitans in whole
saliva in patients undergoing orthodontic treatment. Juiz de Fora (MG), 2015.
60f. Apresentao de Dissertao (Curso de Ps-Graduao stricto sensu
Mestrado em Clnica Odontolgica) Faculdade de Odontologia, Universidade
Federal de Juiz de Fora (MG).
ABSTRACT
Orthodontic treatment has potential to cause changes in periodontal due to biofilm

accumulation, due to the difficulty of conducting a proper oral hygiene in the
presence of bands and brackets. OBJECTIVES: Evaluate the occurrence of
Aggregatibacter actinomycetemcomitans in whole saliva in individuals before and
after the installation of metal orthodontic braces and assess whether there has been
deterioration of periodontal status (visible plaque index, probing depth and bleeding
on probing) after installing braces. METHODS: We evaluated 15 patients of
Specialization in Clinical Orthodontics, School of Dentistry - UFJF and private
practices, female and male, with an average age of 18 years and 3 months (14-18
years); 7 men and 8 women. Whole saliva samples were collected one month before
(T1), immediately before (T2), 15 days before (T3) and one month after the
installation of fixed Edgewise Standard unit (Morelli 10.30.900) on the upper and
lower teeth, except the second and third molars. The saliva collection was done with
the Salivete Cortisol device (Sarstedt Nmbrecht, Germany), with neutral swab
polyester and micro tube. From samples collected, extraction of DNA for bacteria
identification was carried out (Aa) by Polymerase Chain Reaction method in real
time. RESULTS: After the analysis, there was no presence of bacteria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans in any of the intervals of the samples
tested. There was no deterioration of the periodontal status (visible plaque index,
probing depth and bleeding on probing) after T3. CONCLUSIONS: a) Unable to
identify instances of Aa bacteria in saliva either before or after bonding of fixed
appliances; b) the use of braces did not contribute to increase plaque index, probing
depth and bleeding on probing.
KEYWORDS: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, orthodontic treatment, saliva
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BAPN anaerbios pigmentados de negro
CEB clulas epiteliais bucais
CPI ndice de comunidade periodontal
Cr Campylobacter rectus
CT Cycle Threshold
DNA cido desoxirribonucleico
dNTPs deoxinucleotdeos trifosfato
FRET Transferncia de Energia por Ressonncia de Fluorescncia
IL Interleucina
IP ndice de placa
MEV Microscpia Eletrnica de Varredura
mm milmetros
NiTi Nquel Titnio
nM Nanomolar
PA periodontite do adulto
PBI ndice de sangramento de papila
PCR Reao em cadeia polimerase
pH potencial de hidrognio
PIP perda da insero periodontal
PJL periodontite juvenil localizada
PPR periodontite de progresso rpida
PS profundidade de sondagem
RNA cido ribonucleico
s segundos
SS sangramento sondagem
Tn Tannerella forsythensis
TNF fator de necrose tumoral

LISTA DE SMBOLOS
+ Positivo
- Negativo
L Microlitro
C grau Celsius
SUMRIO
1 INTRODUO........................................................................................................15
2 REVISO DE LITERATURA..................................................................................17
2.1 DOENA PERIODONTAL.................................................................................17
2.1.1 Gengivite...............................................................................................19
2.1.2 Periodontite...........................................................................................20
2.1.3 Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa).................................22
2.2 ALTERAES MICROBIOLGICAS BUCAIS EM PACIENTES EM

TRATAMENTO ORTODNTICO...............................................................................26
2.3 REAO EM CADEIA POLIMERASE ............................................................30
2.4 PCR EM TEMPO REAL .................................................................................31
2.4.1. Sistema SYBR Green........................................................................33
3 PROPOSIO........................................................................................................35
4 METODOLOGIA.....................................................................................................36
4.1 MATERIAL.......................................................................................................36
4.2 MTODOS.......................................................................................................36
4.2.1 Calibrao.............................................................................................36
4.2.2 Exame clnico........................................................................................37
4.2.3 Coleta das amostras de saliva............................................................38
4.2.4 Anlise das amostras de saliva PCR...............................................39
5 RESULTADOS........................................................................................................41
6 DISCUSSO...........................................................................................................44
7 CONCLUSO.........................................................................................................46
REFERNCIAS....................................................47
ANEXOS....................................................................................................................55
ANEXO 1 ........................................................................................................55
ANEXO 2 ........................................................................................................56
APNDICE.................................................................................................................59
15
INTRODUO
A doena periodontal a maior responsvel pela perda de dentes em seres

humanos, devido sua natureza crnica, indolor e desenvolvimento de forma
gradativa e assintomtica (MACHION et al., 2000).
O tratamento ortodntico apresenta potencial para causar alteraes no
periodonto devido ao acmulo de biofilme, em funo da dificuldade de realizao
de uma adequada higiene bucal na presena de bandas e braquetes.
Consequentemente, o controle inadequado da placa bacteriana pode promover
alteraes periodontais, que podem ser agravadas pelo tratamento ortodntico
(MAIA, 2011).
Como o risco de dano periodontal existe, necessrio realizar controle
contnuo dos pacientes ortodnticos, com instrues de higiene bucal e constante
motivao durante todo o perodo da terapia (MAIA, 2011).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans um cocobacilo anaerbio
capnofilico, Gram-negativo, imvel, no formador de esporos e vem sendo foco de
estudo para pesquisadores (WILSON et al., 1995; SRIRAMAN, MOHANRAJ e
NEELAKANTAN, 2014).
Seu principal papel se destaca na etiologia da doena periodontal em suas
vrias formas, incluindo a periodontite agressiva localizada, periodontite crnica e
periodontite refratria (SLOTS et al., 1986; ZAMBON et al., 1996).
Naranjo et al. (2006) observaram que os braquetes influenciam a composio
da microbiota subgengival indiretamente, ocorrendo um aumento significante na
contagem e frequncia de Phorphyromonsa gingivalis, Tannerella forsythia,
Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum em um
curto perodo (3 meses) aps a colagem de braquetes.
As condies supragengivais relacionadas ao tratamento ortodntico so

reversveis em pacientes com bom padro de higiene bucal (Naranjo et al., 2006;
Ristic et al., 2007; Zachrisson e Zachrisson, 1972) aps a remoo dos braquetes.
Ristic et al. (2007) observaram um aumento nos parmetros clnicos (ndice de
placa, ndice gengival, sangramento sondagem e profundidade de sondagem) e
microbianos (presena ou ausncia de Prevotella intermedia, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Porphyromas gingivalis e Fuso nucleatum) em 3 meses
aps o incio do tratamento ortodntico. Porm, os resultados deste estudo
16
demonstraram claramente uma tendncia de diminuio dos parmetros clnicos e

dos achados microbianos em 6 meses de avaliao.
Ristic et al. (2007) observaram uma mudana no perfil microbiolgico aps a

instalao de aparelho ortodntico, com o aumento na contagem de bactrias
periodontopatognicas (P. intermdia, A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e F.
nucleatum). Essas bactrias so fatores etiolgicos importantes que, quando
presentes em um hospedeiro suscetvel e ambiente favorvel, podero levar
progresso da doena.
A colocao de aparelhos ortodnticos em pacientes com periodonto

saudvel leva a um aumento no acmulo de biofilme e inflamao gengival e
influencia a composio da microbiota subgengival indiretamente em um curto
perodo de tempo aps o incio do tratamento ortodntico, porm, essas condies
so reversveis em pacientes com bom padro de higiene bucal (MAIA, 2011).
As alteraes subgengivais que o Aa provoca em pacientes em tratamento

ortodntico com aparelhos fixos tem sido bastante estudada na literatura
(PAOLANTONIO et al. 1996, 1997, 1999; SALLUM et al., 2004; SPEER et al., 2004;
NARANJO et al., 2005; CHERNOCHOV et al. (2008); CHOI et al. (2009);
DEMLING et al. (2009); entretanto, no h estudos sobre a ocorrncia de Aa na
saliva desses pacientes.
Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrncia de

Aggregatibacter actinomycetemcomitans na saliva total em indivduos antes e aps
da instalao do aparelho ortodntico fixo metlico e verificar se houve deteriorao
da condio periodontal (ndice de placa visvel, profundidade de sondagem e
sangramento sondagem) aps a instalao do aparelho fixo.
17
2 REVISO DE LITERATURA
2.1 DOENA PERIODONTAL
A doena periodontal acomete um grande nmero de indivduos em todo o

mundo. Seu principal fator etiolgico o biofilme dental, o qual promove uma reao
inflamatria dos tecidos periodontais de proteo (gengiva livre e inserida) e de
suporte (cemento, osso alveolar e ligamento periodontal), devido a um processo
infecioso mediado por microrganismos (AAP, 1996).
De acordo com Kinane e Lindhe (1999) o fator etiolgico primrio da doena

periodontal, o biofilme dental, pode ter seu acmulo aumentado pela presena de
fatores locais que facilitam sua reteno.
A exposio do tecido gengival ao biofilme dental resulta na inflamao do

tecido, o qual responde manifestando sinais clnicos da gengivite, cujas
caractersticas so alteraes da cor e do contorno gengival, mudana da
temperatura intra-sulcular, aumento do exudato gengival, sangramento espontneo
ou provocado (MARIOTTI, 1999).
Bascones e Caballeros (2000), citam que entre as bactrias associadas

doena periodontal, h duas espcies claramente associadas a esta doena:
Actinobacillus actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis. O termo doena
periodontal refere-se gengivite e periodontite (KINANE, 2001).
De acordo com Lotufo, Pannuti e Saraiva (2001) apesar dos avanos

relacionados etiopatogenia das infees periodontais, o diagnstico e a
classificao dessas doenas, ainda hoje, baseiam-se, quase inteiramente, na
avaliao clnica e no exame radiogrfico.
Existem vrios fatores que favorecem o desenvolvimento da doena

periodontal como idade avanada, tabagismo, alcoolismo, baixas condies
socioeconmicas, poucos cuidados com sade bucal, dificuldade de acesso aos
servios de sade, assim como a existncia de predisposio gentica.
classificada em gengivite, quando est limitada superfcie gengival e, periodontite,
quando atinge os tecidos mais profundos. A expresso clnica dos diferentes
quadros de periodontite depender da interao entre os fatores do hospedeiro,
18
ambientais e do agente microbiolgico. A colonizao por bactrias necessria,

porm no suficiente para que exista a doena, sendo necessrio um hospedeiro
suscetvel (MARTNEZ e RUIZ, 2004).
Os micro-organismos mais frequentemente associados doena periodontal

so Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia e Treponema denticola (SPAHR et
al., 2006).
Clinicamente, a doena periodontal caracterizada pela presena de edema,

hemorragia e exsudado. Ao progredir, surge halitose e as bolsas periodontais, que
so espaos entre os dentes e as gengivas, superioriores a 3 mm. Essas bolsas so
produzidas pela perda de tecido conjuntivo e pela reabsoro ssea induzida por
infeo crnica ocorrendo a reabsoro do osso alveolar, um aumento na distncia
entre a linha amelocementria e a crista ssea alveolar (PREZ e PREZ, 2007).
De acordo com Ksic et al. (2009) a doena periodontal uma doena

crnica e degenerativa do periodonto que constitudo da gengiva, ligamento
periodontal, cemento e osso alveolar. O principal fator etiolgico para o
desenvolvimento da doena periodontal a placa dental ou biofilme oral em
associao com bactrias anaerbicas. Aggregatibacter actinomycetemcomitans
um dos mais poderosos periodontopatgenos. A capacidade de lipopolissacardeos
de Aggregatibacter actinomycetemcomitans para estimular macrfagos a liberar as
interleucinas IL-1, IL-1 e fator de necrose tumoral (TNF) de grande importncia
porque essas citocinas so capazes de estimular a reabsoro ssea. Sua
ocorrncia deve ser evitada uma vez que encontrado na placa dental e bolsas
periodontais.
Bactrias como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus e Treponema
denticola desempenham um papel importante na iniciao e progresso da doena
periodontal e tm sido freqentemente detetadas nas bolsas subgengivais de
pacientes com periodontite. Ito et al (2010) investigaram a relao entre a deteo
de bactrias periodontopatognicas e os parmetros clnicos periodontais em vinte e
seis pacientes. A deteo precoce de bactrias associadas com o desenvolvimento
da periodontite atravs do mtodo do PCR quantitativo pode fornecer informaes
importantes para o diagnstico e tratamento subseqente e o monitoramento do
19
complexo vermelho e C.rectus pode ser particularmente importante para a terapia

periodontal (ITO et al., 2010).
A doena periodontal a principal causa da perda dental na populao

adulta, representando um dos mais srios problemas scio-econmicos e de sade
pblica (GASPARETTO, ARANA-CHAVEZ E AVILA-CAMPOS, 2000).
Para Machion et al. (2000) a doena periodontal a maior responsvel pela

perda de dentes em seres humanos, devido sua natureza crnica, indolor e
desenvolvimento de forma gradativa e assintomtica.
2.1.1 Gengivite
Gengivite uma condio inflamatria dos tecidos moles que envolvem os

dentes e representa uma resposta inflamatria em decorrncia da presena de
biofilme aderido s superfcies dentrias, podendo ser modificada por fatores como
fumo, certas drogas e mudanas hormonais que ocorrem na puberdade e gravidez
(KINANE, 2001).
A gengivite uma inflamao superficial da gengiva, na qual, apesar das

alteraes patolgicas, o epitlio de unio mantm-se unido ao dente, no
ocorrendo a perda de insero. uma situao reversvel, caso sejam removidos os
fatores etiolgicos. Contudo, tem um papel precursor na perda de insero dos
dentes quando estes fatores no so eliminados (ALMEIDA et al., 2006).
A localizao da placa bacteriana associada gengivite na poro gengival

do dente desempenha um papel fundamental em sua formao. Contudo, fatores
locais e outros fatores tambm podem influenciar a resposta do hospedeiro.
Basicamente podem ser divididos em (LIBANA, CASTILLO e LVARES, 2004):
a) Gengivite sem fatores que favorecem o seu aparecimento,

etiologicamente relacionada com a placa e o clculo resultante da ausncia de
adequada higiene bucal e geralmente afeta toda a populao em algum momento
durante a sua vida;
b) Gengivite com fatores locais que promovem seu aparecimento, na qual
alm de placa e clculo, alteraes anatmicas dentais esto presentes, como
20
apinhamento dentrio ou iatrogenias, devido a obturao e restauraes defeituosas

ou aparelhos ortodnticos, que favorecem o acmulo de placa bacteriana e
dificultam a sua eliminao;
c) Doenas gengivais associada placa que modificam a resposta do
hospedeiro. Nestes casos, outras diferentes fatores sistmicos esto presentes,
alm do fator microbiano e geralmente so acompanhadas de alargamentos
gengivais. Tal o caso dos fenmenos endcrinos fisiolgicos (puberdade, ciclo
menstrual, gravidez), fatores endcrinos patolgicos (diabetes mellitus), nutricionais
(falta de vitamina C), discrasias sangneas (certos tipos de leucemias) e certos
medicamentos (contracetivos orais, algumas drogas anti-epilticas,
imunossupressores e os certos antagonistas do clcio) e doenas gengivais
relacionadas com placas com fatores desconhecidos, sendo classificadas como
idiopticas.
De acordo com Touyz (2008) geralmente ocorrem gengivorragias e bolsas de

at 3 mm na gengivite. Ela sempre precede a periodontite, na qual ocorrem bolsas
periodontais superiores a 3 mm e perda da insero gengival, mas apenas 30% dos
casos de gengivite progridem para alguma forma de periodontite. A doena
periodontal tem incio insidioso e os indivduos afetados raramente detetam
quaisquer sintomas nas etapas iniciais do desenvolvimento da doena. Logo, as
infees crnicas provocadas pela periodontite progridem muitas vezes sem
sintomas durante muitos anos, antes do diagnstico inicial ou antes do aparecimento
de manifestaes clnicas.
A gengivite quando no tratada pode evoluir para periodontite crnica, cujas

caractersticas clnicas so inflamao gengival, sangramento sondagem, aumento
na profundidade de sondagem, perda de insero clnica e consequente perda
ssea alveolar (KINANE e LINDHE, 1999).
2.1.2 Periodontite
A periodontite definida como uma doena inflamatria dos tecidos de

suporte dos dentes, causada por microrganismos especficos, resultando em uma
destruio progressiva do ligamento periodontal e do osso alveolar (NOVAK, 2004).
21
A periodontite corresponde a uma situao de inflamao com destruio do

periodonto e ocorre quando as alteraes patolgicas verificadas na gengivite
progridem at haver destruio do ligamento periodontal e migrao apical do
epitlio de unio. H acmulo de placa bacteriana ao nvel dos tecidos mais
profundos, o que provoca uma perda de insero por destruio do tecido conjuntivo
e por reabsoro do osso alveolar (ALMEIDA et al., 2006).
Nagy e Novak (2004) afirmaram que a perda ssea vertical ocorre quando a
perda de insero e osso em superfcie dental so maiores do que acontece na
superfcie adjacente. J a horizontal, ocorre quando a perda de insero e osso
progridem a uma taxa uniforme na maioria das superfcies dentais. Normalmente, a
perda ssea vertical est associada a defeitos sseos angulares e formao de
bolsas intrasseas. Ao passo que a horizontal est associada normalmente com
bolsas supra-sseas.
Dzink, Socransky e Haffajee (1988) afirmaram que a periodontite precedida

pela gengivite e isto implica que a preveno desta tambm uma medida de
preveno daquela. Devido a limitaes do tratamento mecnico no sentido de
diminuir ou suprimir microrganismos subgengivais, tem sido sugerido a utilizao de
antimicrobianos locais ou sistmicos para a complementao do tratamento
mecnico.
A patogenia da periodontite mais complexa. Os micro-organismos que

compem a placa subgengival so capazes de agir diretamente sobre os tecidos
periodontais ou modificar a resposta do hospedeiro, enquanto que a participao da
placa em si (normal, reduzida ou aumentada) to decisiva como a ao das
prprias bactrias no aparecimento da doena. A periodontite, em geral, representa
a origem de complicaes como a crie de raiz, processos endoperiodontais e
abscessos periodontais. As diversas modalidades de PCR so particularmente
importantes no diagnstico microbiolgico da periodontite, embora deva ser
salientado que estudos de sensibilidade in vitro no podem ser realizados utilizando
esta tcnica (MARTNEZ e RUIZ, 2004).
Silva (2006) avaliou a prevalncia de diferentes bactrias da microbiota

subgengival em trs grupos de doenas atravs de cultivos anaerbicos. Amostras
de fluido subgengival foram coletadas das bolsas subgengivais com dois cones de
papel estreis foram inseridos at o fundo da bolsa periodontal e deixados no local
22
por 20s, sendo ento transferidos para um pequeno frasco contendo fluido de
transporte reduzido acrescido de 20% de glicose. As amostras foram cultivadas sob
atmosfera anaerbica e microaerfila usando meios de cultura seletivos e no
seletivos. Os isolados foram caracterizados ao nvel de espcie atravs de testes
bioqumicos convencionais e tambm pelo uso de um sistema comercial rpido de
identificao bacteriana.
Os resultados indicaram que os bacilos anaerbios Gram negativos e

microaerfilos foram as bactrias mais frequentemente detetadas nas amostras de
todos os grupos.
A periodontite a principal causa da perda dentria na populao adulta e

resulta da substituio de uma microbiota bacteriana normal (constituda por
bactrias Gram positivas) por uma microbiota constituda por Gram negativos
anaerbios. Seu tratamento realizado removendo, primeiramente, a fonte de
infeo, a placa dental e o clculo aderidos coroa do dente e superfcie da raiz.
Para isso necessrio fazer uma terapia mecnica com alisamento radicular
fechado ou aberto (procedimento cirrgico) ou cirurgia para a remoo da bolsa
periodontal. s vezes, a agressividade da doena pode exigir o uso de antibiticos
locais ou sistmicos (PREZ e PREZ, 2007).
2.1.3 Actinobacillus actinomycetemcomitans/ Aggregatibacter

actinomycetemcomitans (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (antes de 2006, Actinobacillus

actinomycetemcomitans) um cocobacilo anaerbio capnofilico, Gram-negativo,
imvel, no formador de esporos e vem sendo foco de estudo para pesquisadores
(WILSON et al., 1995; SRIRAMAN, MOHANRAJ e NEELAKANTAN, 2014).
Est associado vrias doenas infeciosas, tais como endocardite,

meningite, abscessos, septicemia, e osteomielite (MUHLE et al., 1979; PAGE; KING,
1966). No entanto, seu principal papel se destaca na etiologia da doena periodontal
23
em suas vrias formas, incluindo a periodontite agressiva localizada, periodontite

crnica e periodontite refratria (SLOTS et al., 1986; ZAMBON et al., 1996).
Entretanto, estudos tambm tm mostrado a presena desta bactria como

microbiota residente da cavidade bucal, em pacientes com sade periodontal (TAN,
SONG, ONG, 2002).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans possui inmeros fatores de

virulncia que aumentam sua sobrevivncia na cavidade oral e o tornam capaz de
driblar as estratgias protetoras do hospedeiro (FIVES-TAYLOR, 1999).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans tem a habilidade de se aderir s

clulas epiteliais da mucosa oral e s superfcies dentais, assim como realiza a
coagregao com outras bactrias, sendo tambm capaz de invadir clulas orais,
caracte rsticas consideradas essenciais para a patognese das doenas
periodontais. Estes mecanismos de adeso e invaso s clulas epiteliais,
certamente envolvem interaes especficas e no especficas, com a participao
de outros reguladores deste processo (MEYER; FIVES-TAYLOR, 1994).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans tem a capacidade de colonizar

superfcies dentais formando populaes agrupadas em biofilme, caracterstica de
bactrias periodontopatognicas. Sabe-se que colnias rugosas apresentam maior
capacidade na formao de biofilme assim como maior resistncia s mudanas de
salinidade e pH. Tal capacidade favorecida pela presena de fmbrias, que embora
no sejam consideradas essenciais para o processo adesivo em algumas
superfcies, aumentam as interaes entre microrganismos e superfcies,
colaborando desta maneira para a estabilizao do biofilme (INOUE et al., 2003).
A doena periodontal destrutiva freqentemente associada este patgeno

e considerada a principal causa de periodontite de incio precoce. Na periodontite
pr-puberal, a prevalncia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans de 40-
100%. A Periodontite juvenil localizada a doena que est mais associada com a
bactria, sendo que encontrada em 75-100% das leses. Acredita-se que os
principais patgenos periodontais de Aggregatibacter actinomycetemcomitans
tenham uma origem exgena porque eles raramente so encontrados em indivduos
periodontalmente saudveis. No entanto, alguns autores argumentam que as
infees periodontais so causadas pela microbiota saprfita bucal e,
24
consequentemente, tm uma origem endgena (BASCONES e CABALLEROS,

2000).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans um dos primeiros colonizadores da

placa das superfcies dos dentes, o que sugere que ele possa colonizar a superfcie
limpa e saudvel. Em relao idade, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
geralmente ocorre em pacientes jovens e sua presena diminui com a idade. O
habitat natural do Aggregatibacter actinomycetemcomitans a rea subgengival,
pois eles necessitam para o seu desenvolvimento um ambiente anaerbio como os
proporcionados pelas bolsas periodontais, mas tambm so encontrados na rea
subgengival numa proporo elevada (BASCONES e CABALLEROS, 2000).
Em um periodonto saudvel, Aggregatibacter actinomycetemcomitans pode

estar presente em baixas propores e com crescimento controlado, porm
aumentando o nmero desses patgenos, a homeostase do ecossistema alterada,
levando ao aparecimento da doena periodontal. Uma vez que o nicho ecolgico
desta bactria a rea subgengival, provvel que bactrias presentes na saliva
venham da bolsa periodontal, de modo que quanto maior a quantidade de saliva,
maior o risco de recolonizao. Com o tratamento periodontal pode-se eliminar ou
reduzir significativamente a presena dessas bactrias na saliva, por pelo menos
seis meses. No entanto, no parece possvel a remoo destas bactrias das
membranas mucosas (BASCONES e CABALLEROS, 2000).
Quando Aggregatibacter actinomycetemcomitans est presente em um

paciente periodontalmente no tratado, ele pode persistir por um longo tempo,
indicando que os mecanismos de defesa do hospedeiro no conseguem remov-lo.
O tratamento de raspagem e alisamento radicular parece ser insuficiente para
erradicar o micro-organismo, pois ele tem a capacidade de invadir os tecidos
gengivais, sendo necessria antibioticoterapia sistmica (BASCONES e
CABALLEROS, 2000).
Paolantonio et al. (2000), objetivaram relatar sobre a prevalncia de

Aggregatibacter actinomycetemcomitans em 780 crianas e adolescentes saudveis
de uma rea rural da Itlia Central e compar-la com indivduos de uma rea urbana
da mesma regio, investigando tambm a relao entre a presena desta bactria e
as condies clnicas periodontais. No grupo urbano, ambos indivduos PIP+
abrigavam a bactria, enquanto entre as crianas das reas rurais, 3 com
25
periodontite juvenil e 13 com periodontite precoce abrigavam o patgenos. O risco

relativo para stios com PIP+ foi significativamente maior (2,42) nos indivduos rurais
que abrigavam a bactria. Sua presena foi relacionada a um risco maior que 50%
de stios com SS+.
Segundo Cortelli, Cortelli e Jorge (2001), Aggregatibacter

actinomycetemcomitans um bastonete Gram-negativo, pequeno, no formador de
esporo, imvel, anaerbio facultativo e que se desenvolve melhor em ambientes de
anaerobiose. Segundo eles, a bactria pode ser encontrada em maiores propores
em indivduos com as formas de periodontite. J nos indivduos com sade
periodontal ou com gengivite, encontrada em pequenas quantidades.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans est associada com a doena

periodontal, especialmente periodontite agressiva localizada e produz uma
leucotoxina potente. Sriraman, Mohanraj e Neelakantan (2014)
Vieira et al (2009) utilizaram a cultura e PCR e avaliaram a ocorrncia desse

micro-organismo e a distribuio de cepas leucotoxina isolado de 48 ndios
brasileiros com gengivite e 38 com periodontite crnica. Amostras supragengivais,
subgengivais e saliva de cada paciente foram coletadas. A saliva foi coletada
atravs de Salivettes. Os resultados mostraram que o Aggregatibacter
actinomycetemcomitans foi isolado a partir de 8,33% de amostras de saliva,
supragengival e subgengival de pacientes com gengivite e de 18,42% de saliva e
biofilme supragengival, e 26,32% de biofilme subgengival de pacientes com
periodontite crnica.
Por PCR, o DNA bacteriano foi detetado em 8,33% de saliva, biofilme

supragengival e subgengival de pacientes com gengivite e de 23,68% de saliva,
28,95% do biofilme supragengival e 34,21% de biofilme subgengival de pacientes
com periodontite. Os resultados sugeriram que Aggregatibacter
actinomycetemcomitans pode estar relacionado com a perda de insero na
populao (VIEIRA et al., 2009).
Aggregatibacter actinomycetemcomitans frequentemente isolado de stios

periodontais e periimplantares, entretanto os fatores que modulam a colonizao da
mucosa bucal e o papel deste microrganismo na doena so controversos. O
objetivo deste estudo foi comparar a presena da bactria em amostras de fluido
26
gengival periimplantar e saliva de 14 pacientes parcialmente edntulos e 8

totalmente edntulos. A bactria tambm foi pesquisada na saliva. Os resultados
obtidos sugerem que a colonizao do sulco periimplantar e cavidade bucal e o
nmero de Aggregatibacter actinomycetemcomitans nesses stios no so
modulados pela presena ou no de dentes naturais (MANSUR, 2008).
Este estudo teve por objetivo avaliar a ocorrncia de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans na saliva e nos biofilmes supra e subgengival de crianas e
adolescentes com Sndrome de Down e analisar a influncia da dieta, fatores
socioeconmicos e culturais e de condio periodontal. Aps avaliao das
condies scio-econmicas coletaram-se os espcimes clnicos, os quais foram
transportados para o laboratrio de Microbiologia e Imunologia da FOA-UNESP para
deteo do microrganismo por mtodo molecular. A saliva foi coletada com pipetas
Pasteur plsticas, esterilizadas. A anlise dos dados desse estudo permitiu verificar
que a ocorrncia variou de 0,0% a 25,0%, tanto no grupo de pacientes portadores de
sndrome, quanto para os indivduos do grupo controle (MESSIAS et al. 2013).
2.2 ALTERAES MICROBIOLGICAS BUCAIS EM PACIENTES EM

TRATAMENTO ORTODNTICO
Paolantonio et al. (1996) pesquisaram a ocorrncia de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans na placa subgengival de 20 indivduos jovens de 12 a 20
anos submetidos ao tratamento ortodntico com aparelhos fixos por pelo menos 6
meses. Foi identificada diferena significativa para o ndice de sangramento gengival
(ISG) entre o grupo teste (57,5%) e grupo controle (25%). A bactria foi detetada
em pelo menos um stio em 85% dos indivduos teste e 15% dos indivduos controle
(p<0,001). 41% abrigou a bactria em concentrao entre 0,1% e 1,0%, enquanto
outros 40% resultaram concentrao a 1,0%. Houve uma correlao positiva entre a
porcentagem dos stios positivos para o patgeno e a porcentagem daqueles que
exibiram um ISG + (p <0,005). A durao da terapia ortodntica no foi relacionada
com os parmetros clnicos ou microbiolgicos.
Em 1997, Paolantonio et al., objetivaram relatar sobre a colonizao

subgengival de Aggregatibacter actinomycetemcomitans e modificaes periodontais
em pacientes ortodnticos atravs de um estudo prospectivo longitudinal de 3 anos.
27
A porcentagem de indivduos ortodnticos infectados com a bactria no incio e aps

3 anos foram 86% e 80%, respectivamente, enquanto os valores correspondentes
para indivduos controle foram 16,6% e 26,6%. A distribuio de freqncia do
patgenona microbiota subgengival entre os indivduos controle permaneceu
relativamente estvel, enquanto que a proporo de indivduos ortodnticos com sua
presena em concentrao maior ou igual a 1,0% caiu significativamente de 32% no
incio do estudo para 19% em 3 anos.
Os indivduos ortodnticos positivos para Aggregatibacter

actinomycetemcomitans tinham risco relativo de piores condies periodontais em
comparao com pacientes ortodnticos, nos quais o patgeno no foi detetado no
incio. Em contraste, indivduos controle infectados inicialmente com a bactria
apresentaram risco de aumento do ndice de sangramento gengival 6,6 vezes maior
do que para indivduos sem a bactria. Os autores concluram que indivduos jovens
com um periodonto ntegro usando aparelho ortodntico fixo abrigam
Aggregatibacter actinomycetemcomitans com uma frequncia significativamente
maior do que aqueles que no usam aparelho.
Paolantonio et al (1999) avaliaram a relao direta entre o uso de aparelho

ortodntico e a colonizao subgengival por Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. O estudo foi composto por vinte e quatro indivduos, Os
resultados mostraram que, durante o perodo com os aparelhos ortodnticos, a
presena dos escores de placa e sangramento gengival sondagem foram
aumentados significativamente e que a bactria, inicialmente ausente em todos, foi
isolada em 19 e 20 indivduos, aps 4 e 8 semanas, respectivamente. Esta mudana
microbiana especificamente restrita placa bacteriana subgengival de dentes com
aparelhos ortodnticos. A presena de bandas e braquetes ortodnticos, no afetou
o estado microbiolgico de toda a boca (PAOLANTONIO et al., 1999).
Sallum et al. (2004) avaliaram as alteraes clnicas e microbiolgicas que

acompanham o processo inflamatrio dos tecidos periodontais em torno dos
aparelhos ortodnticos e o impacto destas mudanas aps a remoo dos aparelhos
em dez indivduos com idade entre 16-18 anos. Houve uma reduo de
aproximadamente 50% dos nveis de Aggregatibacter actinomycetemcomitans
encontrada aps a remoo do aparelho ortodntico, profilaxia e instruo de
higiene bucal. Concluram que a inflamao gengival foi associada com a presena
28
de periodontopatgenos, tanto supragengivalmente quanto subgengivalmente; a

remoo dos aparelhos ortodnticos, juntamente com uma profilaxia profissional e
instruo adequada de higienizao oral, resultou em redues significativas da
bactria.
Em estudo realizado em 2004, Speer et al., avaliaram se a terapia ortodntica

na dentio adulta periodontalmente comprometida pode causar uma mudana na
microbiota periodontopatognica. Durante a terapia com aparelhos fixos, reduo
acentuada foi observada na contagem total de bactrias das bolsas subgengivais
apesar de os parmetros clnicos periodontais terem se mantidos praticamente
inalterados. Contudo, a contagem total de algumas bactrias altamente patognicas
aumentou novamente aps o fim do tratamento. Em nenhum dos pacientes
deteriorao do estado periodontal foi observada durante e aps o tratamento
ortodntico (SPEER et al., 2004).
Vrios fatores so capazes de afetar a colonizao microbiana, incluindo

restauraes e braquetes ortodnticos. Assim, o controle inadequado da placa e a
no deteo da inflamao gengival promovem a destruio periodontal que pode
ser agravada pelo tratamento ortodntico. Os autores compararam as mudanas na
microbiota subgengival e os parmetros periodontal antes e depois da colocao de
braquetes ortodnticos. Em 30 indivduos avaliados antes e trs meses aps a
colocao dos braquetes e comparados com 30 indivduos controle. PS e NIC
mantiveram-se constantes em ambos os grupos, enquanto o SS, IP, e IG
aumentaram nos pacientes ortodnticos trs meses aps a colocao do braquete
(p<0,05) (NARANJO et al. 2006).
O objetivo de Ristic et al. (2007) foi investigar a influncia de aparelhos

ortodnticos fixos sobre as mudanas quantitativas e qualitativas da microbiota
subgengival e dos tecidos periodontais. Participaram 32 pacientes, com idade entre
12 e 18 anos, que receberam instrues de higiene oral. Trs semanas antes de
iniciar o tratamento. Os indivduos foram avaliados clinicamente antes da fixao
(T0) e 1 (T1), 3 (T2) e 6 (T3) meses aps o incio da terapia ortodntica. A
investigao microbiolgica foi realizada para avaliar a presena ou ausncia de
anaerbios periodontopatognicos: Pi, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e o
grupo de outros anaerbios pigmentados de negro (BAPN), como Porphyromonas
gingivalis e Fn.
29
Os resultados positivos de Aggregatibacter actinomycetemcomitans foram

observadas nos incisivos em T1 e T2. Os autores concluram que, em adolescentes,
o tratamento com aparelhos fixos aumenta os valores dos ndices periodontais e
tambm o crescimento de bactrias patognicas e anaerbias. Estas alteraes
clnicas e microbiolgicas especficas so estritamente limitadas aos dentes com
braquetes e elas no tm um efeito destrutivo sobre os tecidos periodontais devido
sua transio e limitao durante o tempo (RISTIC et al., 2007).
O aparelho ortodntico cria superfcies de reteno adicionais e espaos para

a adeso de microrganismos e de crescimento do biofilme. Estes pacientes tendem
a apresentar sinais da gengivite e da ampliao gengival com bolsas falsas.
Chernochov et al. (2008) avaliaram a ocorrncia de patgenos periodontais em 32
pacientes com quadro clnico de gengivite associada placa bacteriana tratados
com aparelhos ortodnticos fixos. A ocorrncia simultnea de Aggregatibacter
actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis foi registrada em 9,37% dos
pacientes. Os autores concluram que os patgenos periodontais representam um
risco significativo para a doena periodontal e para a sade geral do paciente
(ERNOCHOV et al., 2008).
O objetivo de Choi et al. (2009) foi avaliar as mudanas que ocorrem na

microbiota subgengival aps a remoo dos aparelhos ortodnticos atravs da PCR.
A frequncia para as espcies de Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Pi, Pn e Treponema denticola foi
ligeiramente reduzida entre T1 e T2 e no foram observadas diferenas
significativas. Os autores concluram que os periodontopatgenos presentes durante
o tratamento ortodntico foram significativamente reduzidos dentro de trs meses da
remoo do aparelho; a avaliao de mdio prazo (trs meses aps a retirada do
aparelho) mostrou que a frequncia dos stios positivos tendeu a voltar aos nveis
encontrados em indivduos com sade gengival.
Fernandes et al. (2010) avaliaram a prevalncia dos patgeneos periodontais

- Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis e Pi em
diferentes grupos populacionais, na condio de ausncia ou presena de elemento
dentrio. O grupo de recm-nascidos apresentou somente a bactria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (2,56%); as crianas apresentaram
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (10,00%) e Pi (92,50%); os adultos/idosos
30
dentados apresentaram a bactria Porphyromonas gingivalis (46,67%) e os

desdentados numa frequncia de 3,33%. Concluram que a microbiota periodontal
se faz presente independentemente de alguns fatores de risco para a doena
periodontal como a idade do indivduo, a presena e o nmero de dentes.
(PEJDA et al., 2013) avaliaram as alteraes na microbiota subgengival antes

e durante o nivelamento e fase alinhamento ortodntico usando o mtodo de PCR.
Patgenos periodontais de microflora subgengival foram detectados em T3 usando
uma PCR que continha sondas para Aggregatibacter actinomycetemcomitans ,
Porphyromonas gingivalis , Prevotella intermedia , Tannerella forsythia e Treponema
denticola. Houve uma significativa maior prevalncia de Aggregatibacter
actinomycetemcomitans em pacientes com braquetes convencionais do que em
pacientes com braquetes autoligveis , mas no houve diferena estatisticamente
significante para outros patgenos periodontais.
YANEZ-VICO et al. (2015) avaliaram e compararam os parmetros

microbiolgicos e clnicos de pacientes que usavam aparelho ortodntico fixo 10 dias
aps ele ter sido removido aps o tratamento. Parmetros clnicos apresentaram
diferena estatstica (p <0,05 ) entre T1 -T2 , T1 e T2 -CT -CT . Em T2 , foi
encontrada uma correlao positiva entre a SS e A. actinomycetemcomitans (p <
0,01) e entre parmetros clnicos e PI . Concluram que fatores locais associados
com o uso de aparelho fixo influenciam mudanas na placa subgengival e que leva a
mais inflamao e sangramento .
2.3 REAO EM CADEIA POLIMERASE
A tcnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis (NOVAIS e
PIRES-ALVES, 2004).
A biologia molecular est sendo cada vez mais usada e a PCR o mtodo
mais empregado como ferramenta diagnstica. Porm, com a evoluo para a PCR
em tempo real, este vem sendo substitudo (Vernet, 2004).
A PCR possibilita a sntese de DNA, usando a enzima DNA-polimerase. Esta

enzima sintetiza uma sequncia complementar de DNA, desde que um pequeno
fragmento (primer, em ingls) j esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto
escolhido para o incio da sntese. Os iniciadores definem a sequncia a ser
31
replicada e o resultado obtido a amplificao de uma determinada sequncia DNA

com bilhes de cpias (MULLIS, 1990).
A PCR consiste na sntese bidirecional e repetitiva de DNA atravs da

extenso de uma regio do cido nuclico com a utilizao de primers ou
iniciadores (SOUZA, 2007).
A amplificao de uma amostra pela tcnica de PCR requer um par de

iniciadores, os quatro deoxinucleotdeos trifosfato (dNTPs), ons de magnsio
(MgCl2), que devem estar em maior concentrao que os dNTPs e uma DNA
polimerase termoestvel para sintetizar o DNA. As concentraes de iniciador, dNTP
e magnsio so variveis de acordo com a reao (SOUZA, 2007).
O princpio da tcnica baseado na replicao natural de DNA. O processo

pode ser dividido em trs etapas: (desnaturao - quebra das pontes de hidrognio
que ligam as fitas do DNA, hibridizao - anelamento dos primers na regio
complementar da fita de DNA e extenso - promovida pela enzima termo estvel,
DNA polimerase) que se repetem um nmero especfico de vezes (SOUZA, 2007):
Figura 1: Etapas da PCR.

FONTE: http://e-escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp?hid=339
2.4 PCR EM TEMPO REAL
Uma inovao tecnolgica resultante da PCR, denominada de PCR em

Tempo Real, vem ganhando espao nos diagnsticos clnicos e nos laboratrios de
pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa
tcnica permite o acompanhamento da reao e a apresentao dos resultados de
32
forma mais precisa e rpida, em relao PCR que apresenta somente resultados
semi-qualitativos (NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
Nos ltimos anos foram desenvolvidos ensaios PCR em Tempo Real a fim de
aperfeioar o diagnstico. A tcnica de PCR em Tempo Real quantitativo uma
metodologia confivel, capaz de quantificar a concentrao do produto de PCR
gerado durante cada ciclo da reao. Para tanto, necessrio ter um mtodo de
deteo do acmulo do produto de PCR e um termociclador que seja adaptado para
gravar os resultados a cada novo ciclo da reao (SOUZA, 2007).
A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real revolucionou o processo

de quantificao de fragmentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a
quantificao destes cidos nuclicos de maneira precisa e com maior
reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reao
(NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
O ponto que detecta o ciclo na qual a reao atinge o limiar da fase

exponencial denominado de Cycle Threshold (CT). Este ponto permite a
quantificao exata e reprodutvel baseado na fluorescncia (NOVAIS e PIRES-
ALVES, 2004).
A emisso dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na

proporo direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valores da
fluorescncia so gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de
produto amplificado.
Os fluorforos so molculas que absorvem e emitem luz em um

comprimento de onda especfico. Os sistemas de deteo da PCR em Tempo Real
utilizam estas molculas que proporcionam o acompanhamento da reao ao longo
dos ciclos (NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
33
Figura 2: Curva de amplificao do PCR em Tempo Real. CT Cycle Threshold.

A amplificao mostra 3 fases distintas (1) linha basal: no houve produtos da PCR
suficiente para detetar a fluorescncia; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra
a cada ciclo e (3) fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
Fonte: NOVAIS, C.M. PIRES-ALVES, M. PCR em tempo real: uma inovao
tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Biotecnologia Cincia e
Desenvolvimento Ed 33, p. 10-13. 2004.
2.4.1. Sistema SYBR Green
O SYBR Green se liga entre a fita dupla de DNA (Figura 7) e com a

excitao da luz emitida pelo sistema tico do termociclador, emite uma
fluorescncia verde. O SYBR Green no ligado ao DNA exibe uma fluorescncia
muito pequena. Entretanto, a fluorescncia realada quando ligado na fita dupla do
DNA. (NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
Figura 3: Molcula de SYBR Green entre a fita dupla de DNA.

Fonte: NOVAIS, C.M. PIRES-ALVES, M. PCR em tempo real: uma inovao
tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Biotecnologia Cincia e
Desenvolvimento Ed 33, p. 10-13. 2004.
34
No comeo da amplificao, a mistura da reao contm o DNA desnaturado,

os iniciadores e o SYBR Green. As molculas no-ligadas do SYBR Green
apresentam fluorescncia fraca produzindo um sinal mnimo sendo este subtrado
durante a anlise de computador. Aps o reconhecimento dos iniciadores, algumas
molculas do SYBR Green podem ligar-se na fita dupla previamente formada.
Durante a polimerizao catalisada pela enzima Taq DNA polimerase, as molculas
do SYBR Green vo se ligando ao DNA recentemente sintetizado. Assim, a reao
monitorada continuamente e um aumento da fluorescncia observado em tempo
real. (VITZTHUM et al., 1999).
No ciclo seguinte, na etapa de desnaturao do DNA, as molculas do

SYBR Green so liberadas e h queda no sinal da fluorescncia. A deteo da
fluorescncia no fim da etapa de extenso de cada ciclo da PCR permite monitorar a
quantidade crescente de DNA amplificado (VITZTHUM et al., 1999).
O resultado da PCR em Tempo Real gerado em um grfico, onde

representado o acmulo de fluorescncia pelo tempo ou nmero de ciclos da
reao. Este CT onde a fluorescncia detetada de uma determinada amostra
intercepta a linha de threshold acima do background de fluorescncia (MACKAY et
al., 2002), ou seja, inicia a fase exponencial, permitindo uma quantificao exata e
reprodutvel do nmero inicial de cidos nuclicos presentes na amostra (do material
amplificado) (LEE et al, 1993; LIVAK et al 1995).
Os dados brutos gerados em uma reao de PCR em tempo Real devem ser
exportados em formatos compatveis, para anlises em programas-padro como, por
exemplo, o Excel, o que oferece, assim, uma gama maior de possibilidades na
anlise dos resultados. A padronizao das anlises garante um resultado mais
preciso e real, confirmando a credibilidade desta tecnologia, e consolidando-a no
cenrio de tcnicas de diagnstico molecular (DIAS, 2011).
35
3 PROPOSIO
Avaliar a condio periodontal e a ocorrncia de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans na saliva total em indivduos antes e aps a instalao do
aparelho ortodntico fixo metlico.
36
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAL
Foram selecionados 15 pacientes da Clnica do Curso de Especializao em

Ortodontia da Faculdade de Odontologia da UFJF e de consultrios particulares, 7
homens e 8 mulheres, com idade mdia de 18 anos e 3 meses (14-18 anos). Todos
os indivduos apresentavam dentio permanente completa, com exceo dos
terceiros molares, no fumantes, sem histrico de doena periodontal, sem doena
sistmica, que no tivessem utilizando medicao sistmica nos ltimos seis meses,
que no estivessem grvidas, sem histrico de doena periodontal e que
necessitassem de tratamento com aparelho fixo.
Para incluso na amostra os pacientes foram selecionados atravs de exame

clnico da condio periodontal, onde deveriam apresentar ndice de placa com grau
1 (sem presena de placa na rea gengival da superfcie dental quando se passa
uma sonda), sangramento gengival negativo em at 15 segundos e profundidade de
sondagem 3mm.
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em Pesquisa da

Universidade Federal de Juiz de Fora, sob o Parecer nmero 0217.0.180.000-09.
Todos os indivduos foram orientados dos procedimentos, aceitaram participar da
pesquisa e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.
4.2 MTODOS
4.2.1 Calibrao
Previamente aos exames clnicos de seleo e avaliao dos pacientes da

amostra, a examinadora foi submetida ao processo de calibrao, que consistiu da
avaliao clnica de 10 voluntrios (com as mesmas caractersticas dos indivduos
da amostra), treinamento terico e prtico, coleta de dados e clculo da
concordncia.
O treinamento terico consistiu da exposio terica e discusso junto com

equipe de exame (Periodontista, examinadora da pesquisa e anotadores), dos
37
ndices, cdigos e critrios (OMS, 1997) a serem utilizados, com durao de quatro
horas.
O treinamento prtico consistiu de calibrao inter e intra-examinadores. Para

calibrao inter-examinador, a examinadora e o Periodontista realizaram exames
clnicos nos 10 voluntrios e determinaram o ndice de placa, o sangramento
gengival e a profundidade de sondagem. Estes exames foram repetidos 15 dias
aps nos mesmos pacientes para determinar a concordncia intra-examinador.
4.2.2 Exame clnico
Os exames clnicos realizados nas fases de calibrao, seleo e avaliao

dos pacientes consistiram de determinao do ndice de placa bacteriana, ndice de
sangramento gengival e profundidade de sondagem.
Os exames foram realizados com os pacientes sentados e sob a luz artificial

do refletor da cadeira odontolgica. Em cada paciente foram avaliados seis dentes-
ndices: primeiro molar superior direito; primeiro molar superior esquerdo, primeiro
molar inferior direito, primeiro molar inferior esquerdo, incisivo central superior direito
e incisivo central inferior esquerdo.
O ndice de placa bacteriana foi determinado por inspeo visual com auxlio
de espelho clnico (n 5, Golgram, So Caetano do Sul, Brasil) e sonda clnica
(sonda exploradora, Golgram, So Caetano do Sul, Brasil), onde foi avaliada a
quantidade de placa bacteriana nas faces vestibular e lingual dos dentes-ndices,
classificando os mesmos com os seguintes critrios:
Grau 1: no h placa na rea gengival da superfcie dental quando se passa

uma sonda;
Grau 2: h um filme de placa aderido margem gengival livre e rea

adjacente ao dente. A placa somente pode ser reconhecida passando-se uma sonda
sobre a superfcie do dente, no sendo visvel a olho nu;
Grau 3: h um moderado acmulo de depsitos moles dentro do sulco

gengival e/ou superfcie dental adjacente, visvel a olho nu;
Grau 4: h abundante acmulo de depsitos moles dentro do sulco gengival,

na margem gengival e/ou na superfcie dental.
38
O ndice de sangramento gengival foi determinado pela insero suave de

uma sonda periodontal (OMS, Golgram, So Caetano do Sul, Brasil) no sulco
gengival das superfcies vestibular e lingual dos dentes-ndices. Se houvesse
sangramento em at 15 segundos o ndice era marcado como positivo, caso
contrrio era marcado como negativo.
A profundidade de sondagem foi determinada pela insero suave de uma

sonda periodontal (OMS, Golgram, So Caetano do Sul, Brasil) no sulco gengival
nas regies mesio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, lingual e
disto-lingual dos dentes-ndices. Foram determinadas a profundidade de sondagem
mdia de cada regio e a profundidade mdia de cada indivduo, como descrito por
Medeiros (2010).
O exame clnico dos pacientes da amostra foi realizado um ms antes (T1) e

1 ms aps (T4) a instalao de aparelho fixo Edgewise Standard (10.30.900
Morelli, Sorocaba, Brasil) nos dentes superiores, com exceo dos segundos e
terceiros molares. Para colagem do aparelho foi feito ataque cido nos dentes com
condicionador cido fosfrico 37% (FGM Produtos Odontolgicos, Joinville, Brasil).
Aps lavar e secar os dentes, os braquetes foram colados com Adesivo Ortodntico
Orthocem (FGM Produtos Odontolgicos, Joinville, Brasil) e cada um
fotopolimerizados ao final (40 segundos). Aps a colagem foi inserido arco de NiTi
0,012 (Morelli, Sorocaba, Brasil).
Os pacientes receberam um kit contendo uma escova e pasta dental

(Professional - Colgate/Palmolive Industria e Comrcio, So Paulo, Brasil) e foram
instrudos a utilizarem a tcnica de escovao de Bass.
4.2.3 Coleta das amostras de saliva
Foram coletadas amostras de saliva total de todos os indivduos um ms

antes (T1), imediatamente antes (T2), 15 dias aps (T3) e 1 ms aps (T4) a
instalao do aparelho ortodntico fixo.
A coleta de saliva foi realizada com o dispositivo Salivette Cortisol (Sarstedt

Nmbrecht, Alemanha), com swab neutro de polister e microtubo. Os indivduos
removeram o swab do Salivette e o mantiveram debaixo da lngua por 120
segundos, recolocando-o de volta no recipiente e fechando o Salivette.
39
Para coleta com microtubo, os pacientes foram instrudos a se posicionarem

em uma cadeira com a cabea inclinada para frente e deixarem a saliva acumular na
boca. Com uma pipeta Pasteur descartvel estril (3ml, Prolab, So Paulo, Brasil) a
saliva foi coletada e transferida da boca para um microtubo de 5mL. Todas as
coletas foram realizadas no perodo da manh.
De acordo com projeto piloto realizado (Apndice 1), no houve diferena

entre a identificao de Aggregatibacter actinomycetemcomitans atravs de PCR
com o uso de microtubos e salivete.
Aps a coleta, os recipientes contendo as amostras foram mantidos em

caixas trmicas com gelo por at 3 h e estocado em freezer a -80C at o momento
da anlise, que ocorreu 64 dias aps a ltima coleta.
4.2.4 Anlise das amostras de saliva - PCR
A partir das amostras de saliva coletadas, foi realizado na Embrapa Gado de

Leite - Juiz de Fora/MG a extrao do DNA para identificao da bactria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans por meio do mtodo Reao em Cadeia
Polimerase em tempo real, utilizando um par de primers especficos (SAKAI et al.,
2007; PRESTES, 2007).
Protocolo para o PCR em tempo real:
O equipamento 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster

City, EUA) foi utilizado para anlise.
Como controle positivo, DNA da bactria Aggregatibacter

actinomycetemcomitans: cepas JP2 e Y4 doadas pela professora Marcia Mayer do
Instituto de Cincias Biolgicas USP. O controle positivo garante a padronizao
da PCR, pois contm DNA conhecido, cujo resultado idntico ao final do exame
garante a preciso daquele processamento especfico.
Cada reao continha 10 L DNA, 100nM de cada primer para a bactria

Aggregatibacter actinomycetemcomitans e 12,5L 2X SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Foster City, EUA) em um volume final de 25 L. Cada amostra
foi feita em duplicata em placas ticas de reao de 96 poos, seladas com filme
adesivo tico e amplificadas no 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,
40
Foster City, EUA), sendo cada amostra amplificada separadamente. As condies

de amplificao foram 2 minutos a 50C, 10 minutos a 95C, seguido de 40 ciclos de
15 segundos a 95C, 1 minuto a 60C. Ao final de cada reao foi feita a curva de
dissociao (melting point) para assegurar que cada reao produziu um nico
fragmento.
Foi utilizado o teste de Wilcoxon para comparar os parmetros clnicos de

profundidade de sondagem entre os tempos T1 e T4.
41
5 RESULTADOS
Valores de concordncia intra e inter-examinador obtidos (Kappa 0,80 e

Kappa 0,81) na primeira etapa. Kappa 0,80 e 0,85 (placa visvel) e Kappa 0,80 e
0,88 para profundidade de sondagem.
A Tabela 1 mostra mdia e desvio padro da profundidade de sondagem nas

regies avaliadas nos tempos T1 e T4. No houve diferena significativa entre os
tempos para os valores de profundidade de sondagem nas regies avaliadas.
Tabela 1: mdia e desvio-padro da profundidade de sondagem nas regies avaliadas um

ms antes T1 e um ms aps (T4) a instalao do aparelho fixo.
Tempo 1 Tempo 4
Regies Desvio- Desvio- p-valor*
Mdia Mdia
padro padro
Vestibular 1,173 0,2086 1,173 0,2086 1,000
Mesio-vestibular 1,167 0,1877 1,160 0,1805 0,317
Disto-vestibular 1,180 0,2178 1,173 0,2187 0,317
Lingual 1,160 0,2230 1,160 0,2230 1,000
Mesio-lingual 1,167 0,2193 1,166 0,2193 1,000
Disto-lingual 1,166 0,2193 1,166 0,2193 1,000
Mdia 1,169 0,2095 1,167 0,2082 0,180
*p-valor segundo teste de Wilcoxon
Todos os indivduos, nos tempos T1 e T4, apresentaram sangramento

sondagem negativo para todos os dentes e se enquadrava no grau 1 de ndice de
placa, no havendo diferena entre os tempos.
Aps as anlises laboratoriais, somente o controle positivo amplificou, ou seja, a

reao estava funcionando: na presena do DNA alvo haveria amplificao das
amostras.
Na anlise foi estabelecido que o baseline (ciclos iniciais da PCR nos quais h
uma pequena alterao no sinal de fluorescncia) iria de 3 a 15. Pelas figuras 6, 7, 8
e 8 nota-se que a emisso est abaixo do nvel de deteco do equipamento.
42
Figura 6: Escala linear da amplificao de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans em T1. considerada amostra positiva aquela que cruza a linha
verde que est na vertical.

43


Nas duas placas de reao, onde as amostras foram colocadas, somente o

controle positivo ultrapassou este limiar, ou seja, no foi possvel identificar bactria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans nas amostras testadas, no perodo
descrito.
44
6 DISCUSSO
As alteraes subgengivais que o Aggregatibacter actinomycetemcomitans

provoca no fluido gengival em pacientes em tratamento ortodntico com aparelhos
fixos tem sido bastante estudada na literatura (PAOLANTONIO et al. 1996, 1997,
1999; SALLUM et al., 2004; SPEER et al., 2004; NARANJO et al., 2005;
CHERNOCHOV et al., 2008; CHOI et al., 2009; DEMLING et al., 2009); entretanto,
no h estudos sobre a ocorrncia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans na
saliva desses pacientes.
A presena dessa bactria mais frequente em indivduos que apresentam

bolsas periodontais profundas e inflamao gengival (CORTELLI et al. 2004; Van
HOOGMOED et al, 2008). Por isso, no presente estudo, no foram selecionados
indivduos com sangramento gengival positivo e ndices de placa graus 2, 3 e 4.
No presente estudo, no foi observada presena de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans na saliva total coletada antes e aps a instalao do
aparelho ortodntico fixo. Este resultado est de acordo com o relato de Messias et
al. (2013), que verificou a ocorrncia da bactria entre 0,0% e 25% na saliva de
pacientes com Sndrome de Down e de indivduos do grupo controle pelo mtodo de
PCR. Vieira et al (2009) detectaram Aggregatibacter actinomycetemcomitans em
8,33% de amostras de saliva de indgenas atravs do mtodo de PCR.
O fato de no ter sido detectado Aggregatibacter actinomycetemcomitans na

saliva dos pacientes aps a instalao do aparelho ortodntico pode estar
relacionado manuteno dos parmetros clnicos de avaliao periodontal (ndice
de placa visvel, sangramento sondagem e profundidade de sondagem) entre os
tempos T1 e T4.
Alguns estudos no identificaram deteriorao do estado periodontal (SPEER et

al., 2004) ou alterao significativa da profundidade de sondagem (NARANJO et al.
2006) em pacientes ortodnticos durante e aps o tratamento. Tais resultados
confirmam os achados do o presente estudo, que no encontrou alterao
significativa dos ndices utilizados para a avaliao da condio periodontal aps a
instalao do aparelho ortodontico fixo.
45
Em contrapartida, alguns autores descreveram alteraes significativas na

condio periodontal de pacientes durante o tratamento ortodntico. Naranjo et al.
(2006) relataram um aumento significativos dos ndices de placa e sangramento
sondagem em pacientes aps o uso de aparelho fixo. Ristic et al. (2007) afirmaram
que o tratamento com aparelhos fixos aumenta os valores dos ndices periodontais e
tambm o crescimento de bactrias patognicas e anaerbias. Yanez-vico et al.
(2015) afirmaram que fatores locais associados com o uso de aparelho fixo
influenciam mudanas na placa subgengival e que leva a mais inflamao e
sangramento.
46
7. CONCLUSO
No foi possvel identificar ocorrncia da bactria Aggregatibacter

actinomycetencomitans na saliva em nenhum dos tempos avaliados.
No houve alterao significativa das condies periodontais (ndice de placa,

profundidade de sondagem e sangramento periodontal) entre os perodos de um
ms antes e um ms aps a instalao do aparelho fixo.
47
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55
ANEXOS
Anexo1: Aprovao do projeto

56
Anexo 2: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
COMIT DE TICA EM PESQUISA UFJF
PESQUISADOR(A) RESPONSVEL Prof Dr Maria das Graas Afonso Miranda Chaves
Endereo: Universidade Federal de Juiz de Fora, Faculdade de Odontologia, CLO.
CEP: 36100-000 Juiz de Fora MG
Fone: (32) 3229-3881
E-mail: duque05@gmail.com
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
O Sr. (a) est sendo convidado (a) como voluntrio (a) a participar da
pesquisa Influencia do dispositivo de coleta de saliva na contagem de
Aggregatibacter actinomycetemcomitans Neste estudo pretendemos verificar se
possvel identificar a bactria Aggregatibacter actinomycetemcomitans atravs da
coleta de saliva pelo mtodo do Salivette e posterior anlise de seu DNA atravs do
mtodo PCR em tempo real (feito em laboratrio).
O motivo que nos leva a este estudo que este mtodo citado acima, ainda
no tem relatos em pesquisas anteriores. Desta forma, este estudo torna-se
necessrio para verificar se a identificao deste micro-organismo por estes
mtodos possvel.
Para este estudo adotaremos os seguintes procedimentos: voc permanecer
sentado de maneira confortvel em cadeira comum (no odontolgica), com a
cabea levemente inclinada para baixo, sem movimentar lbios e lngua, sem
57
deglutir e deixando acumular a saliva na boca. Depois de acumulada, voc ir cuspir

em um frasco de plstico, e esta saliva ser avaliada em laboratrio.
A saliva tambm ser coletada com dispositivo salivete. Voc ir remover o
swab do Salivete e o deixar debaixo da lngua por 120 segundos, recolocando-o de
volta no recipiente e fechando o Salivete.
Este estudo apresenta risco mnimo, isto , o mesmo risco existente em

atividades rotineiras como conversar, tomar banho, ler, etc. Apesar disso, voc tem
assegurado o direito a ressarcimento ou indenizao no caso de quaisquer danos
eventualmente produzidos pela pesquisa.
Para participar deste estudo voc no ter nenhum custo, nem receber
qualquer vantagem financeira. Voc ser esclarecido (a) sobre o estudo em
qualquer aspeto que desejar e estar livre para participar ou recusar-se a participar.
Poder retirar seu consentimento ou interromper a participao a qualquer
momento. A sua participao voluntria e a recusa em participar no acarretar
qualquer penalidade ou modificao na forma em que atendido pelo pesquisador.
O pesquisador ir tratar a sua identidade com padres profissionais de sigilo.
Os resultados da pesquisa estaro sua disposio quando finalizada. Seu
nome ou o material que indique sua participao no ser liberado sem a sua
permisso.
O (A) Sr (a) no ser identificado em nenhuma publicao que possa resultar
deste estudo.
Este termo de consentimento est de acordo com a Res. 196/96 CNS e
encontra-se impresso em duas vias, sendo que uma cpia ser arquivada pelo
pesquisador responsvel, e a outra ser fornecida a voc.
Caso haja danos decorrentes dos riscos previstos, o pesquisador assumir a

responsabilidade pelos mesmos.
Eu, ____________________________________________, portador do documento

de Identidade ____________________ fui informado (a) dos objetivos do estudo
Influencia do dispositivo de coleta de saliva na contagem de Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dvidas.
Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informaes e modificar minha
deciso de participar se assim o desejar.
58
Declaro que concordo em participar desse estudo. Recebi uma cpia deste termo de
consentimento livre e esclarecido e me foi dada oportunidade de ler e esclarecer
as minhas dvidas.
Juiz de Fora, _________ de __________________________ de 2011.
___________________________ ________________________________
Nome Assinatura participante Data
___________________________ ________________________________
Nome Assinatura pesquisador Data
___________________________ ________________________________
Nome Assinatura testemunha Data
Em caso de dvidas com respeito aos aspetos ticos deste estudo, voc poder
consultar o:
CEP- COMIT DE TICA EM PESQUISA - UFJF
PR-REITORIA DE PESQUISA / CAMPUS UNIVERSITRIO DA UFJF

JUIZ DE FORA (MG) - CEP: 36036-900
FONE: (32) 2102-3788 / E-MAIL: cep.propesq@ufjf.edu.br
59
APNDICE
Apndice 1: PROJETO PILOTO
Amostra:
Participaram do estudo, 15 pacientes da Clnica do Curso de Especializao em

Ortodontia da Faculdade de Odontologia da UFJF e de consultrios particulares, 7
homens e 8 mulheres, com idade mdia de 18 anos e 3 meses (14-18 anos).
Foram selecionados indivduos com dentio permanente completa, com

exceo dos terceiros molares, no fumantes, sem histrico de doena periodontal,
sem doena sistmica, que no tivessem utilizando medicao sistmica nos ltimos
seis meses, que no estivessem grvidas, sem histrico de doena periodontal e
que necessitassem de tratamento com aparelho fixo.
Metodologia
Foram coletadas amostras de saliva total de todos os indivduos um ms antes

(T1) e 1 ms aps (T2) a instalao de aparelho fixo Edgewise Standard (10.30.900
Morelli, Sorocaba, Brasil) nos dentes superiores, com exceo dos segundos e
terceiros molares. Para colagem do aparelho foi feito ataque cido nos dentes com
condicionador cido fosfrico 37% (FGM Produtos Odontolgicos, Joinville, Brasil).
Aps lavar e secar os dentes, os braquetes foram colados com Adesivo Ortodntico
Orthocem (FGM Produtos Odontolgicos, Joinville, Brasil) e cada um
fotopolimerizados ao final (40 segundos) Aps a colagem foi inserido arco de NiTi
0,012 (Morelli, Sorocaba, Brasil).
Os pacientes receberam um kit contendo uma escova e pasta dental

(Professional - Colgate/Palmolive Industria e Comrcio, So Paulo, Brasil) e foram
instrudos a utilizarem a tcnica de escovao de Bass.
A coleta de saliva foi realizada com o dispositivo Salivette Cortisol (Sarstedt

Nmbrecht, Alemanha), com swab neutro de polister e microtubo. Os indivduos
removeram o swab do Salivette e o mantiveram debaixo da lngua por 120
segundos, recolocando-o de volta no recipiente e fechando o Salivette.
60
Para coleta com microtubo, os pacientes foram instrudos a se posicionarem em

uma cadeira com a cabea inclinada para frente e deixarem a saliva acumular na
boca. Com uma pipeta Pasteur descartvel estril (3ml, Prolab, So Paulo, Brasil) a
saliva foi coletada e transferida da boca para um microtubo de 5mL. Todas as
coletas foram realizadas no perodo da manh.
Aps a coleta, os recipientes contendo as amostras foram mantidos em caixas

trmicas com gelo por at 3 h e estocado em freezer a -80C at o momento da
anlise, que ocorreu um ms aps a coleta.
A partir das amostras de saliva coletadas, foi realizado na Embrapa Gado de

Leite - Juiz de Fora/MG a extrao do DNA para identificao da bactria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans por meio do mtodo Reao em Cadeia
Polimerase em tempo real, utilizando um par de primers especficos (SAKAI et al.,
2007; PRESTES, 2007).
Protocolo para o PCR em tempo real:
O equipamento 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City,

EUA) foi utilizado para anlise.
Como controle positivo, DNA da bactria Aggregatibacter

actinomycetemcomitans: cepas JP2 e Y4 doadas pela professora Marcia Mayer do
Instituto de Cincias Biolgicas USP. O controle positivo (DNA sabidamente com a
sequncia alvo) garante a padronizao da PCR, pois contm DNA conhecido, cujo
resultado idntico ao final do exame garante a preciso daquele processamento
especfico.
Cada reao continha 10 L DNA, 100nM de cada primer para a bactria

Aggregatibacter actinomycetemcomitans e 12,5L 2X SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Foster City, EUA) em um volume final de 25 L. Cada amostra
foi feita em duplicata em placas ticas de reao de 96 poos, seladas com filme
adesivo tico e amplificadas no 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,
Foster City, EUA), sendo cada amostra amplificada separadamente. As condies
de amplificao foram 2 minutos a 50C, 10 minutos a 95C, seguido de 40 ciclos de
15 segundos a 95C, 1 minuto a 60C.
Ao final de cada reao foi feita a curva de dissociao (melting point) para
assegurar que cada reao produziu um nico fragmento.
61
Resultados
Figura 10: Resultados para microtubo.
Figura 11 Resultados para salivete.
De acordo com as figuras acima, observou-se que no foi possvel identificar

a bactria Aggregatibacter actinomycetemcomitans em nenhum dos pacientes com
nenhum dos mtodos testados.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

CENTRO INTEGRADO DE SADE - FACULDADE DE ODONTOLOGIA

Lvia de Oliveira Pereira

Dissertao apresentada ao Programa

Orientador: Prof. Dr. Marcio Jos da Silva Campos

de Oliveira Pereira, Lvia .

Orientador: Marcio Jos da Silva Campos

1. Aggregatibacter Actinomycetemcomitans. 2. Saliva. 3.

Dedico esta dissertao

Deus por ser sempre fiel e aos meus amados pais.

coisas vos Sero Acrescentadas

O tratamento ortodntico apresenta potencial para causar alteraes no

PALAVRAS-CHAVE: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, aparelho

Orthodontic treatment has potential to cause changes in periodontal due to biofilm

BAPN anaerbios pigmentados de negro

CEB clulas epiteliais bucais

CPI ndice de comunidade periodontal

DNA cido desoxirribonucleico

dNTPs deoxinucleotdeos trifosfato

FRET Transferncia de Energia por Ressonncia de Fluorescncia

MEV Microscpia Eletrnica de Varredura

NiTi Nquel Titnio

PBI ndice de sangramento de papila

PCR Reao em cadeia polimerase

PIP perda da insero periodontal

PJL periodontite juvenil localizada

PPR periodontite de progresso rpida

RNA cido ribonucleico

TNF fator de necrose tumoral

2.1 DOENA PERIODONTAL.................................................................................17

2.1.3 Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa).................................22

2.2 ALTERAES MICROBIOLGICAS BUCAIS EM PACIENTES EM

2.3 REAO EM CADEIA POLIMERASE ............................................................30

2.4 PCR EM TEMPO REAL .................................................................................31

2.4.1. Sistema SYBR Green........................................................................33

4.2.2 Exame clnico........................................................................................37

4.2.3 Coleta das amostras de saliva............................................................38

4.2.4 Anlise das amostras de saliva PCR...............................................39

A doena periodontal a maior responsvel pela perda de dentes em seres

As condies supragengivais relacionadas ao tratamento ortodntico so

demonstraram claramente uma tendncia de diminuio dos parmetros clnicos e

Ristic et al. (2007) observaram uma mudana no perfil microbiolgico aps a

A colocao de aparelhos ortodnticos em pacientes com periodonto

As alteraes subgengivais que o Aa provoca em pacientes em tratamento

Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrncia de

2.1 DOENA PERIODONTAL

A doena periodontal acomete um grande nmero de indivduos em todo o

De acordo com Kinane e Lindhe (1999) o fator etiolgico primrio da doena

A exposio do tecido gengival ao biofilme dental resulta na inflamao do

Bascones e Caballeros (2000), citam que entre as bactrias associadas

De acordo com Lotufo, Pannuti e Saraiva (2001) apesar dos avanos

Existem vrios fatores que favorecem o desenvolvimento da doena

ambientais e do agente microbiolgico. A colonizao por bactrias necessria,

Os micro-organismos mais frequentemente associados doena periodontal

Clinicamente, a doena periodontal caracterizada pela presena de edema,

De acordo com Ksic et al. (2009) a doena periodontal uma doena

Bactrias como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter

complexo vermelho e C.rectus pode ser particularmente importante para a terapia

A doena periodontal a principal causa da perda dental na populao

Para Machion et al. (2000) a doena periodontal a maior responsvel pela

Gengivite uma condio inflamatria dos tecidos moles que envolvem os

A gengivite uma inflamao superficial da gengiva, na qual, apesar das

A localizao da placa bacteriana associada gengivite na poro gengival