1.

Descrever estruturalmente hélices-α e folhas-β

Correspondem a dois tipos de estrutura secundária proteica, sendo que é o tipo de aminoácidos
que constituem a proteína que determina qual a estrutura que existe mais propensão para
assumir.

No caso da hélice alfa, os aminoácidos mais abundantes são a metionina, alanina, glutamato
(prolina, tirosina, glicina são raros). A hélice alfa caracteriza-se pela cadeia principal assumir
uma estrutura em hélice, que se enrola de tal forma que as cadeias laterais ficam voltadas para
fora. Esta estrutura é estabilizada graças à existência de pontes de H entre o O do grupo
carbonilo do resíduo i e o N da amida do resíduo i+4, o que significa que a hélice tem um
período de 5,4A ou 3,6 aa por volta. Corresponde um dipolo elétrico, pelo que se orienta
preferencialmente se for submetida a um campo elétrico. A hélice pode ter enrolamento para a
esquerda ou para a direita (do N para o C terminal), sendo este último o mais comum, dado que
os L-aminoácidos são os enantiómeros mais abundantes em meio fisiológico (o enrolamento
para a direita será aquele que melhor empacota a hélice e as suas cadeias laterais).

No que diz respeito às folhas beta, caracterizam-se pela disposição da cadeia principal num
folha pregueada, com os resíduos laterais a serem projectados para um lado e o outro do plano
da folha; existem folhas Beta paralelas, em que as cadeias estão todas na mesma orientação (do
N terminal para o C terminal) e antiparalelas, em que as cadeias têm sentidos alternados. A
estabilização da estrutura é feita graças ao estabelecimento de pontes de hidrogénio entre os
grupos carbonilo e amida das cadeias, sendo a folha beta antiparalela mais estável do que a
paralela devido à maior densidade de pontes de hidrogénio que se estabelecem.

2. Difração de raios-x: porque se usam cristais, porquê raios-x, o que é que os

difracta? Porque não se veem hidrogénios? O que é o Protein Data Bank?

Uma das aplicações da difracção de raios X é a determinação da estrutura de proteínas. Para

que tal aconteça, existem vários passos a ser cumpridos, nomeadamente – obtém-se um cristal
da proteína desejada, este é exposto a raios X, os raios X são difractados pelos eletrões dos
átomos das moléculas e os raios difractados embatem num detector, obtém-se um padrão de
difracção, resolve-se o padrão de difracção tendo em conta que cada ponto corresponde a uma
densidade electrónica diferente, fazendo-se a alocação dos átomos nos sítios corretos e assim se
obtém a estrutura da proteína. O uso de cristais justifica-se pelo facto de que se usássemos uma
única molécula para fazer a difracção, íamos obter um sinal demasiado fraco e impossível de
detectar (não existiriam aparelhos com sensibilidade suficiente para tal). Um cristal corresponde
a um conjunto de células unitárias que (moléculas) que formam uma estrutura tridimensional,
organizada microscopicamente e em que todas têm a mesma orientação segundo os 3 eixos
(x,y,z). Deste modo, num cristal da proteína, vamos ter milhares de moléculas com a mesma
orientação e disposição relativamente aos raios X, o que permite que os raios difractados
tenham a mesma fase, pelo que somamos a intensidade de todos e conseguimos obter um sinal
amplificado e detectável.

O objectivo da difracção é então a obtenção da estrutura proteica, pelo que nos interessa
conseguir distinguir dois átomos como objectos distintos. Para que isso aconteça, o
comprimento de onda da radiação usada tem de ser da mesma ordem de grandeza que a
distância interatómica, ou seja, A, que é igual a 10^-10 m  comprimento de onda dos raios X.

Tal como referido, o padrão de difracção resulta da difracção dos raios X pelos eletrões dos
átomos. Os átomos de H têm apenas um electrão, pelo que o sinal produzido é demasiado fraco
para ser detectado.
O PDB é uma base de dados que reúne toda a informação obtida até ao momento sobre as
proteínas que nela se encontram, incluindo os dados estruturais. Para além de ter ficheiros em
que vemos os modelos estruturais (que podem ser abertos com programas como o RasMol ou
PyMol, Viewer), esta base de dados tem também os dados experimentais que permitiram a
determinação dos mesmos. Cada proteína guardada é associada a um código de 4 dígitos, o que
facilita a busca. Esta base de dados é deveras importante e útil, uma vez que permite compilar a
informação sobre todas as proteínas que conhecemos num único local, facilitando a pesquisa de
informação; pode inclusivamente ser útil na determinação de novas estruturas, pois podemos
basear-nos nas condições de cristalização/experimentais usadas em alguns casos, caso as
proteínas sejam semelhantes.

3. Técnicas biofísicas para a caracterização de agregados amiloidogénicos.

Os agregados amiloidoénicos resultam da deposição de proteínas extracelulares anormais, que

formam fibras amilóides, as quais se depositam nos tecidos causando danos. Estas proteínas
misfolded formam as fibras, estruturas lineares, rígidas, insolúveis e com um comprimento entre
7,5-10 nm. Em muitos casos, o misfolded passa por existir folhas beta em vez de hélices alfa. O
misfolding pode resultar de mutações pontuais, fricção entre proteínas ou ambiente externo
agressivo. A deposição pode ser localizada ou sistémica. Relativamente a técnicas usadas para
caracterizar estes agregados:

 Vermelho do congo – corante que se liga aos agregados e permite distingui-los aquando
da observação com luz polarizada, dado que estes surgem num tom verde-garrafa
 Tioflavina – corante formado por um anel, seguido de um ângulo de rotação e depois
outro anel; a molécula consegue absorver energia num dado comprimento de onda,
sendo que se estiver no estado livre, liberta a energia rodando o anel; porém, quando
ligada a fibras amilóides não consegue rodar, pelo que armazena a energia e liberta sob
a forma de fluorescência; quanto maior o número de folhas beta, maior a intensidade de
fluorescência
 ATM e microscopia electrónica – técnicas de microscopia que permitem inclusivamente
observar a evolução das fibrilas, desde o estado de proteína solúvel, passando por
oligómeros, protofibrilas e fibras maduras
 Anticorpos contra agregados amilóides – permitem detectar a formação de agregados
amilóides numa fase precoce, dado que os anticorpos são contra oligómeros, ou seja, a
fase inicial da formação de fibras amilóides (mas é uma técnica cara e os anticorpos são
difíceis de arranjar)
 Dicroísmo circular – esta técnica permite obter diferentes espectros de absorvância
consoante o tipo de estrutura presente, possibilitando a distinção entre alfa-hélices e
folhas beta (logo pode ser usada para ver se existe um enriquecimento em folhas beta)
 Difracção de fibras – exige uma preparação prévia das fibras, que passa pela deposição
de uma gota em duas fibras, que evapora e se torna viscosa, permitindo o estiramento
mecânico das fibras. Após isto, as fibras são expostas a raios X e obtém-se um padrão
de difracção do tipo cross Beta pattern, se forem fibras amilóides (caracteriza-se por
uma distância entre folhas beta de 10 A e 4,5 entre cadeias)
 NMR, cristalografia de proteínas, microscopia electrónica – por vezes só se conseguem
estudar fragmento das proteínas

4. Estrutura do péptido RADA16 num gel e uma aplicação do gel

O péptido RADA16 consiste num exemplo de estrutura proteica em folha beta e caracteriza-se
por um motivo repetitivo de 4 aminoácidos – arginina, alanina, ácido aspártico e alanina. A
cadeia principal forma então a típica folha pregueada característica das folhas beta num só plano
e para um lado do plano temos os resíduos hidrófobos das alaninas, enquanto para o outro temos
os resíduos laterais positivos e negativos da arginina e do ácido aspártico, respectivamente, que
interagem em folhas consecutivas, permitindo a formação de camadas estáveis. Deste modo
obtemos um gel muito poroso capaz de albergar grandes quantidades de água e muito adequado
para o armazenamento e delivery de proteínas como a BSA ou a albumina. Podemos regular a
densidade do gel de maneira a controlar a velocidade de libertação da proteína – quanto mais
denso, mais lentamente se liberta.

5. Descrever as interações que conferem estabilidade estrutural às proteínas

Interacções electrostáticas entre aminoácidos carregados; pontes de H entre os grupos carbonilo

e amida; ligações hidrofóbicas (forças de van der Waals); ligações covalentes – pontes de
dissulfureto entre os grupos SH das cisteínas (fundamentais para manter a estrutura terciária,
quanto as pontes de H são essenciais na manutenção de estrutura secundária).

6. Parâmetros que influenciam a cristalização de proteínas e que são variados

quando se faz o screening de condições

A cristalização proteica é um processo moroso, uma vez que está dependente de um grande
número de condições, as quais têm de ser optimizadas para cada proteína. Esse processo de
definição das condições ideais de cristalização pode ser muito complicado, pois para as definir
tínhamos de conhecer a estrutura da proteína, que é precisamente aquilo que desejamos
determinar. Atualmente, existem ferramentas tecnológicas que permitem fazer um screening da
estrutura e prever aproximadamente as melhores condições. Os parâmetros que influenciam a
cristalização são então os seguintes:

 Concentração – a concentração de proteína usada em solução pode determinar uma

cristalização mais rápida ou mais lenta
 Tampão e pH – idealmente as proteínas devem encontrar-se a um pH que permite a
proximidade ao ponto isoeléctrico, isto é, o pH ao qual se encontram sob uma forma
neutra. Se as proteínas estiverem muito longe de PI e ionizadas, verifica-se um aumento
do limite de solubilidade e uma maior repulsão entre as moléculas, uma vez que estão
carregadas, dois aspectos que vão dificultar o processo de cristalização. Por outro lado,
se estiver mesmo no PI, o processo de cristalização pode acontecer demasiado rápido,
dando origem a um cristal menos organizada e pior definido.
 Força iónica e espécies iónicas em solução – são importantes dado que permitem a
estabilização da proteína
 Agentes precipitantes (tipo e concentração) – o mais comummente usado é o NaCl e o
agente tem de estar sempre mais concentrado na solução do poço do que na gota que
contém a proteína, de maneira a que a água evapore, aumentando a concentração da
proteína na gota e leva à formação de cristais da mesma, quando o limite de
solubilidade é atingido.
 Aditivos (iões divalentes, crioprotetores) – os raios X usados para fazer a difracção são
muito intensos e perfurariam a proteína se o processo fosse executado à temperatura
ambiente; para evitar essa situação, a difracção é feita a 100K (-173,15 ºC). Como o
cristal da proteína é 50% água, se não usássemos criprotetores poderiam formar-se
cristais de gelo, que podiam danificar os cristais proteicos e/ou causar artefactos no
padrão de difracção
 Detergentes – particularmente importantes quando estamos a tentar determinar a
estrutura de proteínas de membrana, dado que estas costumam estar num ambiente
hidrofóbico e em solução têm tendência a agregar-se e desnaturar, sendo necessários
detergentes para as manter estáveis
 Temperatura – está relacionada com o diagrama de fases de cada proteína, que varia e
determina a temperatura à qual acontece preferencialmente a formação de
cristais/precipitação
 Impurezas – normalmente, pretende-se uma amostra de proteína o mais pura possível;
todavia, existem kits que contém propositadamente impurezas, como pêlos de gato ou
de cavalo, dado que estes funcionam como núcleos de cristalização, ou seja, pontos
onde se inicia a formação de cristais, que depois crescem em redor destas impurezas
(pelo que assim conseguimos controlar a localização e número dos núcleos de
cristalização).

7. Em relação aos agregados amiloidogénicos, qual é a forma tóxica: a proteína

solúvel, os oligómeros ou a fibra madura? Porquê?

Os agregados amiloidoénicos resultam da deposição de proteínas extracelulares anormais,

que formam fibras amilóides, as quais se depositam nos tecidos causando danos. Estas
proteínas misfolded formam as fibras, estruturas lineares, rígidas, insolúveis e com um
comprimento entre 7,5-10 nm. Em muitos casos, o misfolded passa por existir folhas beta
em vez de hélices alfa. O misfolding pode resultar de mutações pontuais, fricção entre
proteínas ou ambiente externo agressivo. A deposição pode ser localizada ou sistémica. A
proteína solúvel corresponde à forma normal e well folded da proteína, logo não é tóxica; os
oligómeros correspondem à primeira etapa na formação dos agregados, seguindo-se as
protofibrilas, que têm a capacidade de destablizar membranas, sendo a forma mais tóxica e,
por fim, as fibras maduras. As fibras maduras são inertes, não apresentando toxicidade (o
que não significa que não causem danos, dado que a sua deposição pode causar, por
exemplo, a perda de sensibilidade, como acontece na doença dos pezinhos). Assim, sendo a
forma mais tóxica das enunciadas corresponde aos oligómeros, que podem crescer para
formar as protofibrilas ainda mais tóxicas ou eles mesmos desencadearem alguma
toxicidade. No passado, pensava-se que a estratégia adequada para resolver o problema dos
agregados amiloidogénicos passava por promover a suadesintegração; porém, esta solução
revelou-se incorrecta, porque o que acontecia era a produção dos oligómeros tóxicos; assim,
actualmente, o que se faz é procurar desenvolver estratégias que promovam a estabilidade
das fibras amilóides.

8. Que vias de agregação/desagregação de fibras amiloides existem?

Os agregados amiloidoénicos resultam da deposição de proteínas extracelulares anormais,

que formam fibras amilóides, as quais se depositam nos tecidos causando danos. Estas
proteínas misfolded formam as fibras, estruturas lineares, rígidas, insolúveis e com um
comprimento entre 7,5-10 nm. Em muitos casos, o misfolded passa por existir folhas beta
em vez de hélices alfa. O misfolding pode resultar de mutações pontuais, fricção entre
proteínas ou ambiente externo agressivo. A deposição pode ser localizada ou sistémica. A
formação de uma fibra amilóide começa com a formação de uma estrutura micelar por parte
de uma proteína misfolded, que depois evolui para um agregado – corresponde à primeira
etapa, a nucleação, onde se formam os pontos a partir dos quais vão crescer as fibras. O que
se verifica de seguida é o sequestro de oligómeros em solução, possibilitando o crescimento
da fibra – fase de elongamento. O processo de agregação das fibras pode ser descrito por
uma curva sigmoidal, em que temos uma lag phase inicial correspondente ao processo de
nucleação que é mais lento, seguida de uma fase de rápido crescimento da fibra (fase de
elongamento). Em alguns casos, o que se faz é um seeding, ou seja, coloca-se agregados já
formados juntamente com proteína em solução, eliminando a fase de nucleação e,
consequentemente, tornando o processo de formação de fibras amilóides muito mais rápido.

9. Diga o que é estruturalmente o coiled coil e porque pode ser usado para transporte
e entrega de fármacos.

O coiled coil é um tipo específico de hélice-alfa, que se caracteriza por uma unidade
repetitiva de 7 aminoácidos (abcdefg), sendo que a e d são hidrofóbicos e os restantes
 polares, com e e g carregados positiva e negativamente, respectivamente. Esta disposição
dos aminoácidos leva à criação de um núcleo hidrofóbico ao centro, com dois canais,
enquanto no exterior ficamos com uma interface hidrofílica. Deste modo, este tipo de
estrutura pode ser usado para transportar fármacos hidrofóbicos no seu interior. Para haver a
libertação do fármaco podemos criar um material termoresponsivo ou que altere com o pH.

10. Processos que afetam a propagação de US no corpo. Dizer qual ou quais têm
importância clínica.

Os ultrassons correspondem a uma onda do tipo mecânico, não ionizante, que precisa de um
meio para se propagar (propaga-se desencadeando sucessivamente a compressão e expansão
do meio em questão), longitudinal (ou seja, a vibração do meio ocorre na mesma direcção
que a propagação da onda), que viajam nos tecidos corporais à mesma velocidade que o
som, ou seja, 1540 m/s. O uso de US para observar tecidos é uma técnica barata, rápida
segura e fácil, mas que não permite uma grande resolução ou capacidade de penetração. Os
ultrassons são produzidos recorrendo a um cristal piezoelétrico e vão se propagar nos
tecidos, perdendo intensidade à medida que a distância percorrida aumenta, podendo ocorrer
3 processos/fenómenos distintos:

 Refracção - a onda muda de direcção, mantendo a sua velocidade e frequência, mas

mudando o comprimento de onda; causa distorção das imagens
 Absorção/atenuação – absorção da onda pelo tecido, diminuindo a intensidade
 Reflexão – a onda é reflectida, produzindo um eco que pode ser captado por um
detector – transdutor – e convertido num sinal elétrico. Como sabemos o instante em
cada onda foi emitida e a velocidade a que se propaga, registando o tempo que demora
o eco a voltar podemos determinar a profundidade a que se encontra o tecido. Este
terceiro processo é o único que tem importância em termos de imagiologia clínica.

A reflexão vai depender da diferença de impedância acústica entre os dois meios, porque a
reflexão ocorre na interface entre meios com diferentes impedâncias acústicas; a impedância
corresponde à tendência que o material tem para reflectir a US, opondo-se à sua passagem;
quanto mais denso o material, maior a impedância acústica. A diferença de impedância acústica
é máxima entre ar e sólido, por isso mesmo quando se fazem os ultrassons se usa o gel, caso
contrário a onda seria logo reflectida pela pele. (não se usa US para analisar pulmões, porque a
impedância do ar é muito inferior à dos tecidos).

Maior frequência de US, menor penetração, mas maior resolução (12MHz); menor frequência
de US, maior penetração, mas menor resolução (3MHz).

(Produção – cristal piezoelétrico consegue transformar um sinal elétrico em mecânico e vice

versa; o que faz é fornecer corrente eléctrica, que leva à contracção e expansão do cristal,
resultando na produção de ultrassons, direccionados para o tecido que queremos analisar; os US
são reflectidos e o eco detetacto pelo cristal, que transforma num sinal elétrico)

11. Que veículos estão a ser desenvolvidos para o transporte de NO?

O NO é um exemplo de um gás produzido endogenamente em pequenas quantidades, dado que

é bastante tóxico. Porém, desempenha funções muito importantes, nomeadamente, porque
promove a vasodilatação (principal) e impede a formação de agregados de plaquetas e
trômbulos, ajudando ainda na reparação de tendões e fraturas, bem como na remodelação óssea.
Ainda não existem veículos totalmente eficientes para o seu transporte. No passado, recorria-se
a nitrosilos de metais, que são capazes de transportar o NO e liberta-lo enzimática ou não
enzimaticamente, desde que haja a presença de tecido vascular, agentes redutores ou a
irradiação de luz; porém, esta estratégia não é uma boa solução, porque implica a libertação de
cianida, que é bastante tóxica. Atualmente, os tipos de veículos usados podem dividir-se em
dois grandes grupos – poliméricos e MOFs. Nos poliméricos, temos a fixação de duas
moléculas de NO em polímeros como os diazeniodiolatos, ocorrendo a libertação de NO quando
a água compete com o mesmo para a ligação do polímero. No caso dos MOFs (metal organic
frameworks, que resultam do estabelecimento de ligações de coordenação entre metais e um
ligando orgânico), os metais têm frequentemente locais de coordenação livres que podem
coordenar os NO, ocorrendo a libertação também quando há contacto com a água. Neste tipo de
veículos existe a possibilidade de o NO se ligar não aos metais, mas ao próprio ligando
orgânico, o que permitiria uma libertação mais lenta, dado que a água teria mais dificuldade em
chegar ao interior do MOF onde se encontraria nesta hipótese o NO. Para haver a incorporação
de NO no MOF, este é colocado numa atmosfera saturada em NO, sendo depois removido para
uma atmosfera normal e pobre em NO, mas o NO fica retido no MOF na mesma, porque existe
histerese, que garante o armazenamento e a libertação só quando a água adsorve.

12. O que são agentes de contraste paramagnéticos? São tóxicos? Como podem ser
intravenosamente administrados?

Os agentes de contraste são usados em técnicas como a angiografia ou RMN e permitem

diminuir o tempo de relaxação T1 dos tecidos onde ficam retidos, o que permite obter imagens
dos tecidos por contraste T1 (TR e TE curtos). Agentes paramagnéticos correspondem a
compostos que não podem ser magnetizados e só podem ser detectados se recorrermos a
instrumentos sensíveis ou a campos magnéticos intensos; não fazem histerese, por isso quando
paramos de aplicar o campo magnético, perdem a magnetização e não agregam, antes voltam ao
estado de energia inicial, o que pode ser detetado. Estes agentes têm eletrões desemparelhados,
o que é fundamental para a interacção com os protões dos átomos de água, cujos núcleos são
analisados nas técnicas de imagiologia acima descritas, permitindo assim a redução do tempo de
relaxamento T1 (e T2). Os lantanídeos (como o Gd) são dos elementos mais usados, mas têm
um problema porque são tóxicos na sua forma iónica. A solução passa por usar agentes
quelantes, que permitem a rápida eliminação dos mesmos na urina, minimizando os danos
tóxicos para o organismo (exs de agentes quelantes: OMNISCAM, MAGNEVIST, ProHance).
Outros agentes não tóxicos podem ser usados, como é o caso do Fe, que aparece naturalmente e
pode ser acoplado em MOFs para ser usado MRI.