Cultura de condrócitos humanos

Os condrócitos humanos serão gentilmente cedidos pelo Dr. Mario Ferretti e Dra.
Eliane Antonioli, pesquisadores do Departamento de Ortopedia e Traumatologia do
Hospital Israelita Albert Einstein, provenientes de pacientes com osteoartrose,
submetidos à prótese total do joelho. Serão cultivados em meio DMEM, suplementado
com 10% de soro bovino fetal (SFB), 100 mg/ml penicilina/estreptomicina e 2 mM L-
glutamina e utilizadas culturas entre 3a e 5a passagens, cultivadas em placas de seis poços
(105 células/poço), em incubador a 37ºC com 5% de CO2. O meio de cultura será trocado
a cada dois dias e quando a cultura atingir 80% de confluência, as células serão
subcultivadas em placas de cultura, utilizando tripsina 0,25% e EDTA 0,05 mM.
As células serão tratadas com os diferentes peptídeos em meio DMEM, suplementado
com 1% de soro bovino fetal (SFB) na presença ou ausência de 1ng/ml interleucina
humana recombinante 1β (IL-1 β, #201-LB-005, R&D System).

Análise de viabilidade celular

A viabilidade celular será avaliada pelo ensaio MTT (Sigma, #M2128) [32] e
liberação de lactato desidrogenasse (LDH, Kit Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity
assay, Promega, #G1780) em placas de 96 poços contendo 1x104 de condrócitos. O MTT
avalia a atividade da enzima succinato-desidrogenase mitocondrial através da capacidade
de metabolizar o reagente amarelo MTT (3-[(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide]) em cristais de formazan de cor violeta. O ensaio de
liberação de LDH avalia a liberação da enzima lactato desidrogenasse (LDH) nos
sobrenadantes pelas células não viáveis) e será realizada nos sobrenadantes de acordo
com as instruções do fabricante. Após tratamento, o sobrenadante será retirado para
análise de LDH, e as células aderidas serão incubadas com 100 l de reagente MTT (0,5
mg/ml) a 37oC e 5% de CO2. Após 3 horas, o reagente será removido e 100 l de DMSO
serão adicionados para dissolver os cristais de formazan antes de realizar a leitura em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 540 nm. Os resultados serão apresentados
como porcentagem da viabilidade (média ± desvio padrão), em relação ao controle.

Avaliação do perfil inflamatório das células e efeitos das moléculas

Após tratamento com os peptídeos, os sobrenadantes serão coletados e por ELISA
será avaliada a presença de TNF-α, IL-6 e metaloproteases 2 (MMP-2, #MMP200, R&D
System), 9 (MMP-9, #DMP900, R&D System) e 13 (MMP-13, #DM1300, R&D System)
nos sobrenadantes do cultivo.

Análise estatística
Os resultados serão expressos como as médias (X)  erro padrão (ES) e analisados
utilizando o teste estatístico de análises de variância (ANOVA), seguido de teste t de
Student. Valores de p menores que 0.05 serão considerados estatisticamente
significativos.