HANSSON, A.

, Structural Determination of Drug Metabolites from Doping Classed

Compounds Using Mass Spectrometry Digital Comprehensive Summaries of
Uppsala Dissertations from the Faculty of Pharmacy 251. 58 pp. Uppsala: Acta
Universitatis Upsaliensis. ISBN 978-91-513-0276-8

O controle de dopagem no esporte equino é importante para uma competição justa, mas
também para garantir a integridade do sistema de apostas, bem como por razões de
bem-estar dos animais. Detectar o uso de drogas ilícitas, a triagem através do composto
original é comum. No entanto, ao utilizar um metabolito como o alvo analítico é possivel
prolongar o tempo de detecção da substância original. Para alguns compostos, o uso
de um metabolito é uma necessidade, uma vez que o medicamento original pode não
ser detectado. No presente trabalho, os metabolitos dos moduladores seletivos do
receptor de andrógeno (SARM) S1, S4 e S22 foram investigados em urina e plasma de
cavalo. Os compostos parentais inalterados apresentaram os maiores tempo de
detecção no plasma, mas não foram detectados na urina. Em vez disso, o maior tempo
de detecção foi medido para os metabólitos 2-amino-5-nitro-4- (trifluorometil) fenil
hidrogênio sulfato (SARMs S1 e S4) e hidrogenossulfato de 2-amino-5-ciano-4-
(trifluorometil) fenil (SARM S22). Esses metabólitos foram sugeridos como alvos
analíticos para o controle de dopagem em urina enquanto os compostos originais foram
sugeridos para amostras de plasma. 2-amino-5-nitro-4-(trifluorometil) fenil
hidrogenossulfato também pode ser observado em grandes quantidades no fungo
Cunninghamella elegans para ser potencialmente usado como composto de referência.
Os metabólitos de cavalo do SARM LGD-4033 também foram estudados na urina e no
plasma.
O aducto de formato de LGD-4033 teve o maior tempo de detecção no plasma e na
urina após hidrólise com β-glucuronidase. Na urina não hidrolisada, o LGD-4033
glucuronidado foi detectado em seu lugar.
Diferentes modelos in vitro foram utilizados para prever metabólitos in vivo do
roxadustato, um estabilizador de fator induzível por hipóxia. Cunninghamella elegans
conseguiu produzir mais metabolitos em comparação com microssomas de fígado
humano e equino e hepatócitos humanos.
A detecção e identificação de metabólitos em todas as experiências foram realizadas
usando um Instrumento UHPLC-Q-TOF MS, onde os dados de alta resolução foram
vitais para determinar quais metabolitos foram formados.
A tese mostra os benefícios de investigar os metabólitos de substâncias dopantes para
a elaboração de um método de controle antidoping bem-sucedido na urina e plasma de
cavalos, prolongando o tempo de detecção. Destaca também a utilidade de
Cunninghamella elegans como alternativa aos mais modelos in vitro comumente usados
para prever e produzir metabólitos.

Introdução
O doping é descrito como uma maneira de melhorar ilicitamente o desempenho
dos atletas pelo uso de uma técnica ou administração de compostos com efeito
farmacológico. Já em 1666, um regulamento proibia a administração de substâncias
estimulantes nas corridas de cavalos em Worksop. Mas mesmo assim, a prática de
cavalos dopantes e humanos já existem há mais tempo. No início do século 20, o doping
de cavalos estava se tornando um questão importante que ameaçava a fé no sistema
de apostas e para combater isso, o controle antidoping dos animais foi iniciado. Um dos
primeiros métodos de controle antidoping envolveu a amostragem de saliva de cavalo.
Tanto a amostragem quanto o método em si era muito complicado, mas conseguiu
reduzir o uso estimulantes em cavalos. Tão historicamente, foi o controle de doping em
animais, e cavalos em particular, que levaram ao desenvolvimento de métodos
antidoping para avançar.
Atualmente, o foco na mídia mudou para o controle de dopagem humano e a
dopagem nos esportes ganhou muito mais publicidade, especialmente depois que o
doping sistemático de atletas na Rússia foi exposto. Agora, perguntas foram levantadas
se as competições eram justas.
Todos os anos, a Agência Mundial Antidopagem (WADA) emite uma lista de
métodos e compostos proibidos, incluindo análogos, proibidos em esportes. [3]
O número de compostos a serem testados no controle de doping de cavalos e
humanos aumenta a cada ano devido ao desenvolvimento contínuo de novos
medicamentos. Embora os medicamentos sejam desenvolvidos principalmente para
tratar doenças, alguns deles podem ter efeitos de melhoria de desempenho em pessoas
saudáveis. Isso os torna interessantes do ponto de vista do controle de dopagem.
Muitos desses compostos estão disponíveis para compra na internet muito
tempo antes de serem aprovados como medicamento pelas autoridades reguladoras,
como a Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e Food and Drug Administration
(FDA), ou mesmo após o cancelamento do desenvolvimento. Eles podem assim, ser
obtidos e usados por atletas que desejam obter uma vantagem sobre seus concorrentes.
Devido ao crescente número de novos medicamentos disponíveis, os métodos
analíticos dos laboratórios de doping precisam ser desenvolvidos e aprimorados
constantemente.
No controle de doping, a detecção de uma substância não envolve apenas o
próprio composto parental, mas também pode incluir seus metabólitos. Ao utilizar
metabólitos como alvos analíticos é possível reduzir o risco de contaminação externa
das amostras. Além disso, é possível prolongar potencialmente o tempo de detecção.
Um exemplo é de 2012, quando as amostras de atletas que competira nos Jogos
Olímpicos de Atenas em 2004 foram reanalisadas. Os métodos de análise haviam
melhorado ao longo do tempo, e um novo metabolito a longo prazo do esteróide
anabólico androgênico oxandrolona havia sido caracterizado. Esse metabolito foi
detectado nas amostras de dois medalhistas, sendo estes desqualificados da
competição, o que significa que eles também perderam suas medalhas. [7,8] Mas, para
observar os metabólitos, você primeiro precisa saber o que procurar.

Metabolismo de xenobióticos
Quando um medicamento é introduzido em um organismo, ele sofre metabolismo
para poder ser removido mais facilmente do sistema. O metabolismo implica fazer com
que composto fique mais hidrofílico para facilitar a excreção, na maioria das vezes
através da urina, embora também ocorra por outras vias, como vias de excreção biliares
ou pulmonares. [9] Em muitos casos, os metabólitos podem ser detectados por um
período de tempo mais longo comparado ao composto original, uma vez que a
biotransformação pode ocorrer a uma taxa mais rápida que a excreção. Isso é algo que
pode ser utilizado no controle de dopagem.
O metabolismo pode tornar uma substância farmacologicamente inativa e ajudar
em compostos exógenos desintoxicantes. [9–11] No entanto, a atividade farmacológica
também pode ser aumentada, como nos pró-fármacos, ou retida após o metabolismo.
Também há casos em que o metabolito possui habilidades tóxicas. [9] Por causa disso,
o metabolismo de novos fármacos é investigado extensivamente, não apenas em
humanos, mas também em outros modelos metabólicos, antes de ser aprovado pelo
EMA ou FDA.
Não apenas os medicamentos são metabolizados. A maioria dos compostos
endógenos e xenobióticos são metabolizados até certo ponto. Isso inclui pesticidas e
poluentes do meio ambiente também.
As transformações enzimáticas podem ser divididas em dois grupos, fase I e fase
II. [9,10,12] Essas transformações podem ocorrer separadamente ou ser uma
combinação das reações de fase I e fase II. As principais modificações da fase I são a
hidroxilação, redução e hidrólise. Essas são maneiras de introduzir ou remover um
grupo funcional da molécula, como -OH, -NH2 ou -COOH. [9-11] O citocromo P450
(CYP) é o grupo mais importante de enzimas para a biotransformação de fase I. Este
grupo de enzimas está presente em várias espécies diferentes, incluindo mamíferos
como seres humanos e cavalos. [10,13] No metabolismo da fase II, ocorre uma reação
de conjugação enzimática que adiciona uma estrutura hidrofílica maior, como
glucuronídeo, glucosídeo ou sulfato, à molécula. [9,11] Diferentes enzimas são
responsáveis pelas diferentes transformações, por exemplo, a reação de
glucuronidação é realizada pela enzima uridina 5'-difosfo-glucuronosiltransferase (UDP-
glucuronosiltransferase) enquanto a sulfonação é realizada pelas enzimas
sulfotransferase. [ 9]
Comparado às reações da fase I, que são semelhantes entre as espécies, as
transformações metabólicas da fase II mostram diferentes padrões entre diferentes
espécies. [10] Um exemplo é que os cavalos são mais propensos à sulfonação de
esteróides anabolizantes androgênicos, enquanto os humanos tendem a formar mais
glucuronídeos. [13]

Metabolismo in vivo e in vitro

Existem diferentes maneiras de investigar o metabolismo de um medicamento.
Para fins de controle de dopagem em equinos, os resultados mais precisos serão
alcançados ao investigar os metabólitos no cavalo, como foi feito no artigo I-III, do que
usar um modelo metabólico alternativo. No entanto, nem sempre é possível realizar
experimentos in vivo. O metabolismo pode assim ser estudado em modelos metabólicos
in vitro. O fígado é considerado o principal órgão de transformação metabólica, embora
outros tecidos, como os rins, tenham um papel importante. [9,10,12,14] Devido à sua
importância, o tecido hepático é frequentemente usado como modelo in vitro para o
metabolismo humano. O sistema in vitro mais popular são os microssomas hepáticos
humanos (HLM) e é um método bem estabelecido para investigar a biotransformação
de medicamentos. Foram utilizados microssomas de fígado humano e equino no artigo
IV para gerar metabólitos de drogas. O HLM é fácil de usar e está disponível
comercialmente a baixo custo, o que aumenta sua popularidade.
Os microssomas hepáticos são vesículas formadas por pedaços do retículo
endoplasmático dos hepatócitos e separadas de outros componentes por diferencial
centrifugação. A maioria das enzimas presentes são da família CYP, mas elas contêm
também enzimas UDP-glucuronosiltransferase, que estão envolvidas no metabolismo
da fase II. [12] Mas devido à falta de outras enzimas da fase II, o fígado os microssomas
são úteis principalmente na previsão de metabólitos da fase I. Uma vez que é um
sistema metabólico incompleto, os resultados não podem ser traduzidos diretamente
para a situação in vivo e as diferenças são qualitativas e quantitativas natureza. [12,14]
O fígado também pode ser usado para preparar outros modelos metabólicos,
como hepatócitos ou fatias de fígado. Como esses sistemas são mais semelhantes a
todo fígado, eles devem dar um resultado mais parecido com a situação in vivo. A
desvantagem é que esses modelos são mais complicados de usar. [12]
Animais de laboratório também são usados como modelos in vivo para prever
quais transformações ocorrerão em humanos. Em muitos casos, eles fornecem uma
visão mais precisa representação comparada aos modelos in vitro. [10,12,14] Ainda
assim, existem diferenças de espécies e nenhum modelo animal replica perfeitamente
o padrão metabólico dos seres humanos.
O uso de modelos metabólicos no controle de doping pode ter múltiplos
propósitos. Os modelos in vitro poderiam ser usados para prever potenciais metabólitos
in vivo que poderia ser usado como alvos analíticos. Se for esse o caso, é importante
escolha um modelo que tenha resultados qualitativos semelhantes aos in vivo.
Outro uso de modelos metabólicos é para a produção de metabólitos. Os
metabólitos podem ser utilizados para auxiliar na caracterização de metabólitos in vivo
ou como compostos de referência. Então o modelo deve ser capaz de produzir grandes
quantidades do (s) metabolito (s) desejado (s). Outro exemplo de um modelo metabólico
alternativo é a incubação com o fungo Cunninghamella elegans (C. elegans).

Cunninghamella elegans (ESTRUTURA EM TOPICOS)

-
Espectrometria de massa e analisadores de massa
-
Os compostos investigados
Nesta tese, foram estudadas cinco substâncias pertencentes a duas classes
farmacológicas diferentes. A primeira classe foi de moduladores seletivos de receptores
de andrógenos (SARMs) onde os compostos SARM S1, S4, S22 foram investigados em
cavalos (documentos I e II). O SARM LGD-4033 que possui um esqueleto estrutural
diferente também foi estudado no cavalo (artigo III). A ultima substancia estudada é um
inibidor do domínio prolil hidroxilase do fator induzível por hipóxia (HIF) (PHD) chamado
roxadustat e foi investigado in vitro (artigo IV).
Todos os cinco compostos são de interesse de uma perspectiva de controle de
doping. Eles são proibidos pela WADA e atletas humanos testaram positivo para ambos
os SARMs e roxadustat. [27–30] Se esses compostos são utilizados em esportes
humanos, é provável que eles também sejam usados em cavalos de corrida.
Para as SARMs S1, S4, S22 e LGD-4033, havia pouca ou nenhuma informação
sobre os metabólitos em cavalos, embora os metabólitos da urina humana e dos
modelos in vitro tivessem sido publicados. Para roxadustat, houve nenhum dado sobre
seus metabólitos foi publicado em nenhuma espécie antes de nosso trabalho. No
momento da redação desta tese, nenhum desses compostos foi aprovado como
medicamento farmacêutico por qualquer autoridade reguladora.

Moduladores seletivos de receptores de andrógenos

Atrofia muscular e densidade óssea reduzida podem ser debilitantes e reduzir
severamente a qualidade de vida das pessoas afetadas. Estes sintomas podem ocorrer
devido a caquexia do câncer, doença crônica ou podem estar relacionados à idade.
Andrógeno seletivo moduladores de receptor são uma classe farmacológica de
compostos que estão sob desenvolvimento como tratamento médico para osteoporose
e perda de massa muscular [31–33] Eles também são investigados como tratamento
para câncer de mama [34] e como um contraceptivo potencial masculino. [31,32,35]
Esses compostos são receptores parciais agonistas que estimulam o crescimento
muscular e aumentam a densidade óssea. No entanto, eles são seletivos ao tecido e
muitos dos efeitos colaterais normalmente associados à terapia com androgênio, como
eventos da próstata, virilização e doenças cardiovasculares, são reduzidos.
[31,33,34,36]
A combinação de aumento da massa muscular, mas efeitos colaterais reduzidos
são também tornando os SARMs interessantes para atletas que desejam melhorar seu
desempenho. Apesar de ter sido proibido de usar dentro e fora da competição pela
WADA desde 2008, [37] vários casos positivos são relatados a cada ano. [27–30]
Como mencionado, existem várias classes estruturais diferentes de SARMs, por
exemplo arilpropionamidas, quinolinas e hidantoínas bicíclicas. Os SARMs investigados
S1, S4 e S22 (Figura 5 A-C, artigos I e II) pertencem ao classe arilpropionamida,
enquanto o LGD-4033 possui um pirrolidina-benzonitrila estrutura (Figura 5 D, artigo III).
[31,38]
O metabolismo da classe arilpropionamida, incluindo SARMs S1, S4 e S22, tinha
sido previamente investigado in vivo e em diferentes modelos in vitro. A ampla gama de
sistemas metabólicos investigados compreende microssomas hepáticos (HLM) e fração
S9 [39], microssomas hepáticos de cavalo (ELM) [40], fração S9 de fígado bovino [41],
fungo C. elegans [42], cachorro [43], bezerro [41], e humano [44,45]. Casos positivos de
SARM S4, também conhecidos como andarina, também foram relatados em amostras
de doping de urina humana [46,47] e na O composto parental também foi identificado
em uma amostra de plasma de um cavalo de corrida [48].
No entanto, nenhum estudo metabólico foi realizado no cavalo.
Desses três SARMs, apenas o S22 ainda está em ensaios clínicos. Ele está
sendo desenvolvido sob o nome enobosarm e está atualmente em estudos de fase II
como tratamento para câncer de mama e incontinência urinária de esforço. [49]
 O SARM LGD-4033 também é conhecido como VK5211 e na web online lojas, é
vendido sob os nomes Ligandrol e Anabolicum. Está atualmente em ensaios clínicos de
fase II para melhorar a recuperação após fratura de quadril. [50] Seus metabólitos
também foram investigados em uma amostra de urina de um atleta humano [51], em
HLM [38,52], após conversão eletroquímica e após incubação com C. elegans (artigo
3). Também neste caso, nenhum estudo de administração com o objetivo de
identificação de metabólitos equinos.

Figura 5. As estruturas químicas dos quatro moduladores seletivos de receptores de

andrógenos estudado A) SARM S1, B) SARM S4, C) SARM S22 e D) LGD-4033

O metabolismo da classe arilpropionamida, incluindo SARMs S1, S4 e S22, tinha sido

previamente investigado in vivo e em diferentes in vitro modelos. A ampla gama de
sistemas metabólicos investigados compreendia microssomas hepáticos (HLM) e fração
S9 [39], microssomas hepáticos de cavalo (ELM) [40], fração S9 de fígado bovino [41],
fungo C. elegans [42], cachorro [43], bezerro [41], e humano [44,45]. Casos positivos de
SARM S4, também conhecidos como andarina, também foram relatados em amostras
de doping de urina humana [46,47] e o composto parental também foi identificado em
uma amostra de plasma de um cavalo de corrida [48].
No entanto, nenhum estudo metabólico foi realizado no cavalo. Desses três SARMs,
apenas o S22 ainda está em ensaios clínicos. Ele está sendo desenvolvido sob o nome
enobosarm e está atualmente em estudos de fase II como tratamento para câncer de
mama e incontinência urinária de esforço. [49]
O SARM LGD-4033 também é conhecido como VK5211 e na web online lojas, é vendido
sob os nomes Ligandrol e Anabolicum. Está atualmente em ensaios clínicos de fase II
para melhorar a recuperação após fratura de quadril. [50] Seus metabólitos também
foram investigados em uma amostra de urina de um atleta humano [51], em HLM
[38,52], após conversão eletroquímica e após incubação com C. elegans (artigo 3).
Também neste caso, nenhum estudo de administração com o objetivo de identificação
de metabólitos equinos.