16/09/2014

Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular

Reação de polimerização em cadeia
ou
Polimerização em cadeia do DNA

Profa. Dra. Cristina Maria Meireles Campofiorito

HISTÓRICO

• O advento da Biologia Molecular

 1940 - Bases da Biologia Molecular:

estudo da estrutura e função das
moléculas biológicas.

 1944 – Avery, MacLeod e McCarty –

ácido desoxirribonucléico (DNA)
continha a informação genética.

HISTÓRICO
 1952 – Hershey e Chase - DNA tem a capacidade de
controlar as células : experiência com bacteriófagos.

 1950 – Chargaff – distribuição dos nucleotídeos

(identificados pelas bases nitrogenadas) possuia um
padrão: quantidade de timina era igual a de adenina
e guanina igual a de citosina.

 1953 – utilizando os dados sobre a molécula de DNA

obtidos através de cristalografia de raios X por
Rosalind Franklin, James Watson e Francis Crick
propuseram o modelo dupla hélice do DNA: duas
cadeias de nucleotídeos enroladas em espiral e
ligadas entre sí pelas bases - como o material
genético se duplica e produção do RNA , síntese
protéica e controle da atividade celular).

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Estrutura de Dupla
Hélice Capacidade de
Replicação
(Watson e Crick -
1953)

HISTÓRICO Estrutura do DNA

 1956 – processos de autoduplicação do DNA

 1960 – decifração do código genético dos

aminoácidos

 1961 – processo de transcrição do RNA.

 1962 – processo de tradução do RNA para

sintetizar proteínas.

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Extração de RNA/DNA

PCR se constitui hoje no método de rotina

para isolar rapidamente sequências
específicas a partir de uma mistura
complexa de seqüências genômicas
ou de cDNAs.

Reagente utilizado : Fenol/Clorofórmio ou Trizol

Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”

de onde foi isolado o Thermus aquaticus
1984 - PCR foi apresentada pela primeira
em um encontro científico

Publicação:
Mullis and Faloona, 1987
Saiki at al. 1988

1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase

termoestável de Thermus aquaticus.
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para
fazer PCR.

JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p.

289-297 Vol. 98, No. I
Quem inventou a PCR
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a
Nonsporulating Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE

Department of Microbiology, Indiana University,

Bloomington, Indiana 47401
Kary Mullis, geneticista
The isolation of a new thermophilic bacterium, Nobel Prize em Química (1993)
Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is
described. Successful enrichment requires pelo desenvolvimento de um
incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient método que permite sintetizar, em
media relatively dilute with respect to the
organic components. poucas horas e in vitro, uma grande
Strains of T. aquaticus have been isolated from quantidade de um determinado
Thermus a variety of thermal springs in Yellowstone
National Park and from a thermal spring in
California. The organism has also been isolated
fragmento de DNA
Seus estudos em 1985 permitiram
acquaticus from man-made thermal habitats, such as hot
tap water, in geographical locations quite
distant from thermal springs. Isolates of T.
amplificar o DNA

Aquaticus are gram-negative nonsporulating

nonmotile rods which frequently form long
filaments at supraoptimal temperatures or in the
stationary phase. The optimum temperature
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985).
for growth is 70 C, the maximum 79 C, and Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction
the minimum about 40 C. The generation time site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
at the optimum is about 50 min.

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PCR requer 7 componentes essenciais:

Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode
- DNA polimerase termoestável ser amplificada por PCR.
-(enzima que vai copiar o DNA)

- Um par de oligonucleotídeos A localização da seqüência alvo é feita pelos

para iniciar a síntese de DNA (primers)
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
-Bases nitrogenadas (A C T G)
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion
divalente,
usualmente Mg2+
- Tampão para manter o pH
- Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)
- Template de DNA
iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 17
“mers” são usualmente seletivos o suficiente para
localizar um sítio único em um genoma de alta
complexidade, tal como o genoma humano.
O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na
template se faz pelo estabelecimento de pontes de
hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional
descrito por Watson e Crick:
A T
C G

PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos:

Cópia molecular - Desnaturação da template por aquecimento
- Pareamento dos iniciadores à seqüência alvo fita única
- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
Capaz de copiar e multiplicar parte de uma “sentença”

TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCT
AAGCATTTCGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCT
AGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAAC
AACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGA
CTACGTAGCTAGACTAGATGCATAGCTAGCAGTACTTGCATGA
CTGACTACGTAGCTAGCCGTTAGCTAACGTAGGTTACGCATGG
ATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGT
AGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGAT
TAACAACCACTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAG
GATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAG
CATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACTGAGGATAGGCTACGTA
CGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAACTAGCTAGGATCACT
GAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC

A TÉCNICA DE PCR

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DNA POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’
Duplicação de DNA
 Todas as DNA-POLIMERASES requerem para
seu funcionamento:
DNA POLIMERASES • Molécula de DNA - molde
• “Primer” de oligonucleotídeo (iniciador)
• Magnésio
• dNTPs

Cinética da PCR:

- Fase de “screening” - ciclos iniciais

A TÉCNICA DE PCR
Os “primers” (ou iniciadores) procuram a “template” de DNA
com as sequências que lhes são complementares; nesta fase agem
como as sondas nos experimentos de hibridização.
Encontrar a sequência complementar não é tão difícil, pois os
primers estão em considerável excesso em relação à template.

- Fase intermediária:
O processo de amplificação está ocorrendo, com os primers agindo
de modo permitir o acúmulo exponencial do fragmento de DNA. O
pareamento do primer com a sequência que lhe é complementar já
está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências
alvos.

- Fase tardia ou fase de platô:

A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à
competição dos produtso gerados com primers.

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O crescimento linear (plot semi-log) do número de cópias ocorre até

um determinado número de ciclos. A saturação ocorre quando a
concentração de produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ 1012
moléculas por 100 l.
1 g de DNA
genômico tem As causas do platô são várias:
3 x 105 cópias - Perda da atividade da enzima
do genoma de - Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA
- Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em
mamíferos detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidade
de amplificação de produtos inespecíficos.
- Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase
- Acúmulo de pirofosfato (PiPi)
- Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados
com eficiência menor mas também foram se acumulando
etc

Eficiência da amplificação

A eficiência média de amplificação é 0,85. Pequenas alterações para menos

podem fazer com o produto não seja detectado.
Redução de 1% na eficiência, redução de 15% no produto final após 25
ciclos.

Parâmetros mais importantes para a otimização de PCR:

- Temperatura de “annealing” dos primers MgCl2: testar de 0,5 a 5 mM em steps de 0,5 ou 1 mM

- Regime de ciclos (para multiplex, até 10 mM)
- Composição do tampão - Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou
nenhum produto
Componentes do tampão para PCR (10 X): - Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem
- Tris.HCl - 100 mM (pH 8.3 a 25oC) baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou
- KCl - 500 mM “smear”.
- gelatina 1 mg/mL ou
- Albumina bovina estas substâncias aumentam a A concentração de Mg2+ deve superar em 1,2 mM a
- 0,1% Tween-20 ouestabilidade da enzima concentração total de dNTPs, porque esta é a
- 0,1% Laureth 12 ou concentração de Mg2+ livre necessária para atividade
- 0,1% NP-40 ótima da enzima.

- MgCl2 - 15 mM

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Nunca negligencie os controles !!!!

Primers: Controles:
- 1 tubo sem template
A concentração ótima de “primer” é - 1 tubo apenas com o primer 1
entre 0,1 e 0,5 M - 1 tubo apenas com o primer 2
Ambos os membros do par devem - Controle positivo, para testar os reagentes
ser usados na mesma concentração.

Boas práticas indispensáveis:

Excesso de “primers” induz - Descongele os tampões e os dNTPs completamente no gelo
aparecimento de produtos - Misture no vortex ou batendo nos tubos
inespecíficos e formação de dímeros - centrifugue por 1 segundo antes de pipetar
de “primers”.
- Verifique sempre a calibração dos pipetadores

Termociclador:
Caso uma reação tenha
funcionado antes e deixou de
funcionar, é bem possível que o
problema esteja no
termociclador. Verifique a
temperatura do bloco em várias
poças, verifique a velocidade de
variação da temperatura. Teste Reagentes:
em outro termociclador. Use apenas fornecedores
confiáveis que controlam a
qualidade de todos os lotes de
Pipetadores: seus produtos.
Verifique a calibração dos Evite repetidos congelamentos
pipetadores semanalmente! e descongelamentos dos
Use pipetadores apropriados para primers e dos dNTPs. Faça
alíquotas.
o volume que está sendo
Primers quebrados podem não
pipetado. se “anelar” ou se “anelar”
inespecificamente.

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Exames feitos de rotina nos

Exames feitos de rotina nos
laboratórios de análises clínicas
 Mycobacterium tuberculosis
laboratórios de análises clínicas
 Citomegalovírus  Neisseria gonorrhoeae
 Micobactérias
 Chlamydia trachomatis
 X-frágil
 Creatinina, depuração, soro e urina  Microdeleções do cromossomo Y
 Hepatite B  Outras mutções
 Hepatite C, plasma  Epstein Barr
 Protrombina e Fator V Leiden, Mutação do  Citomegalovirus
gene, pesquisa, sangue total  Eritrovirus
 Dengue
 BCR-ABL, Rearranjo por PCR.
 Herpes
 HIV  C. pneumoniae e M. pneumoniae
 Toxoplasma gondii  Outros

Diagnóstico molecular – gripe aviária Diagnóstico molecular – meningite e

pneumonia bacteriana

HIV
Aplicações

 Teste de
Identificação
de indivíduos

 polimorfismo

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PCR em tempo real

Hot Start
In situ
Inverse
Tipos de PCR Long
Multiplex
Nested
Competitive
Touchdown
Degenerate Métodos mais utilizados: Reagente Sybr Green ou
Fast método Taq Man