Curso:Análise Instrumental Avançada/Módulo:Validação em Análise Química

Docentes:Dra. Thais Vitória da Silva Reis/ Dr.Alexandre Luiz de Souza

Aula 1
(Dra. Thais Vitória da Silva Reis)
Listagem de Docs/Atividades
• 1-Mapas Conceituais
• 2-Artigos e Estudo de Caso
• 3-Exercícios
• 4-Protocolos e Relatórios
• 5-Apostila da Amostragem à Validação: Qualidade e Confiabilidade nas
Análises Químicas
• 6-Orientação sobre Validação de Métodos Analíticos : DOC-CGCRE-008
• 7-Resolução RE 889 Anvisa
• 8-Orientação para Seleção e Uso de Materiais de Referencia :DOC –CGCRE-
016
Curso:Análise Instrumental Avançada
Módulo:Validação em Análise Química
Docente: Dra. Thais Vitória da Silva
 Mapas conceituais: hierarquia de significados
Emprego obrigatório de termo de ligação:
expressão clara da relação entre dois conceitos →
busca pelo significado
Conceitos básicos

Exemplos

x
conceito inicial ÁTOMOS ÁTOMOS ÁTOMOS
+
termo de ligação formam são formados por
+
conceito final MOLÉCULAS MOLÉCULAS MOLÉCULAS
=
PROPOSIÇÃO
Mapa Conceitual - Química do Amor
Mapa Conceitual tipo Teia de Aranha
Mapa Conceitual tipo Fluxograma
Mapa Conceitual tipo Entrada e Saída
Mapa Conceitual Tipo Hierárquico
 Como Construir um Mapa Conceitual
(in Mapas Conceituais e a Aprendizagem Significativa,Marco Antonio Moreira
www.if.ufrgs.br/~moreira/mapasport.pdf)

• 1. Identifique os conceitos-chave do conteúdo que vai mapear e

ponha-os em uma lista. Limite entre 6 e 10 o número de conceitos.

• 2. Ordene os conceitos, colocando o(s) mais geral(is), mais

inclusivo(s), no topo do mapa e,gradualmente, vá agregando os
demais até completar o diagrama de acordo com o princípio da
diferenciação progressiva. Algumas vezes é difícil identificar os
conceitos mais gerais, mais inclusivos; nesse caso é útil analisar o
contexto no qual os conceitos estão sendo considerados ou ter
uma idéia da situação em que tais conceitos devem ser ordenados.
• 3. Se o mapa se refere, por exemplo, a um parágrafo de um texto,
o número de conceitos ficalimitado pelo próprio parágrafo. Se o
mapa incorpora também o seu conhecimento sobre o assunto,além
do contido no texto, conceitos mais específicos podem ser
incluídos no mapa.

• 4. Conecte os conceitos com linhas e rotule essas linhas com uma

ou mais palavras-chave que explicitem a relação entre os
conceitos. Os conceitos e as palavras-chave devem sugerir
umaproposição que expresse o significado da relação.
• 5. Setas podem ser usadas quando se quer dar um sentido a uma
relação. No entanto, o uso de muitas setas acaba por transformar
o mapa conceitual em um diagrama de fluxo.

• 6. Evite palavras que apenas indiquem relações triviais entre os

conceitos. Busque relações horizontais e cruzadas.

• 7. Exemplos podem ser agregados ao mapa, embaixo dos

conceitos correspondentes. Em geral, os exemplos ficam na parte
inferior do mapa.

• 8. Geralmente, o primeiro intento de mapa tem simetria pobre e

alguns conceitos ou grupos de conceitos acabam mal situados em
relação a outros que estão mais relacionados. Nesse caso, é útil
reconstruir o mapa.
• 8. Geralmente, o primeiro intento de mapa tem simetria pobre e
alguns conceitos ou grupos de conceitos acabam mal situados em
relação a outros que estão mais relacionados. Nesse caso, é útil
reconstruir o mapa.

• 9. Talvez neste ponto você já comece a imaginar outras maneiras

de fazer o mapa, outros modos de hierarquizar os conceitos.
Lembre-se que não há um único modo de traçar um mapa
conceitual. À medida que muda sua compreensão sobre as
relações entre os conceitos, ou à medida que você aprende, seu
mapa também muda. Um mapa conceitual é um instrumento
dinâmico, refletindo a compreensão de quem o faz no momento em
que o faz.

• 10. Compartilhe seu mapa com colegas e examine os mapas deles.

Pergunte o que significam as relações, questione a localização de
certos conceitos, a inclusão de alguns que não lhe parecem
importantes.
* Há aplicativos especialmente desenhados para a construção de
mapas conceituais. O mais conhecido deles é o
Cmap: http://cmap.ihmc.us
 Chocolates

• Teobromina (C7H8N4O2, 3,7-dimetilxantina o 3,7-dihidro-3,7-

dimetil-1H-purina-2,6-diona) é um alcalóide da família das metil-
xantinas, da qual também fazem parte a teofilina e a cafeína.
Substância normalmente encontrada no fruto do Theobroma
cacao, e por isso esse composto é normalmente encontrado no
chocolate.
• Teobromina é um alcalóide primário achado no cacau e chocolate;
chocolate contém 0.5-2.7% de teobromina (entretanto chocolate
branco contém poucos vestígios) .
• No fígado humano, a cafeína é metabolizada por enzimas em 10%
teobromina, 4% Teofilina, e 80% Paraxantina.
• As plantas com maiores quantidades são:
• Theobroma cacao
• Theobroma bicolor
• Ilex paraguariensis
• Camellia sinensis
• Cola acuminata
• Theobroma angustifolium
• Paullinia cupana
• Coffea arabica
A quantia de teobramina encontrada no chocolate é pequena o suficiente
para ser consumido seguramente por humanos, mas animais que a
metabolizam mais lentamente, como cachorros, podem sucumbir por
envenenamento por teobromina.
A dose de teobromina que pode ser tóxica em cachorros gira entre 100 e 150
mg/kg. Geralmente chocolates ao leite possuem 154 mg/100g de
teobromina; o meio-amargo cerca de 528 mg/100 g Complicações incluem
problemas digestivos, desidratação, excitabilidade, e uma taxa lenta de
batimentos do coração. Fases posteriores ao envenenamento por
teobromina incluem ataques epiléticos e morte.

Mesmo que a teobromina e a cafeína sejam semelhantes por serem

alcalóides relacionados, a teobromina tem menos impacto no sistema
nervoso central e estimula o coração em um maior grau. Ainda que a
teobromina não seja uma substância viciante, foi apontada como
causadora do vício por chocolate. O chocolate é considerado afrodisíaco,
pois seus efeitos incluem os efeitos estimulativos da teobromina: prazer
induzido pelo hipotálamo, como o efeito da doçura de chocolate e natureza
gordurosa, ou como o chocolate afeta os níveis de serotonina. Enquanto a
serotonina tiver um efeito aprazível, em concentrações altas pode ser
convertida à melatonina que em quantias grandes aumenta o apetite
sexual.
• Como é um estimulante do miocárdio, como também um
vasodilator, aumenta as batidas do coração, contudo também
dilata os vasos sanguíneos, enquanto diminui a pressão
sanguínea. Porém, um recente artigo publicado sugere que a
diminuição da pressão sanguínea pode ser causada através de
flavanols. Além disso, seu efeito de drenagem permite isto ser
usado para tratar falência cardíaca que pode ser causada por uma
acumulação excessiva de fluido.
• Um estudo publicado em 2005 pela Faculdade Imperial de Londres
concluiu que a teobromina tem uma substância que reduz a tosse,
efeito superior à codeína, suprimindo atividade do nervo vago.
Além do mais, a teobromina é útil em tratamentos de asma sendo
que relaxa os músculos, inclusive os achados nos brônquios.
• Há uma possível associação entre teobramina e um risco
aumentado de sofrer de câncer de próstata.
• Teobromina pode causar insônia, tremores, inquietude, ansiedade,
como também contribui para produção aumentada de urina.
Efeitos colaterais adicionais incluem perda de apetite, náusea, e
vômito.
• Cafeína: estimulante do sistema nervoso central
 Quanta cafeína possui uma barra de
chocolate?
• AMOSTRAGEM:objetivo final det. a quantidade de cafeína.

– Todos os chocolates são iguais?

– Barra de chocolate é suficientemente homogênea
– Chocolate com amêndoas, nozes, etc.=heterogêneo

*estratégias de amostragem para materiais homogêneos é

diferente das dos heterogêneos.
-Valores médios da massa de chocolate e da massa de
nozes precisam ser conhecidos
 Preparo da amostra

• Pesagem de certa massa de chocolate

• Extração da gordura dissolvendo-a em algum hidrocarboneto
– A extração da gordura requer triturar o chocolate em um
gral
– Necessário gelar para moer, só aí pesados
– 10 mL de solvente orgânico (éter),agitação vigorosa(3X)
– Solvente residual é removido e o resíduo=chocolate
desengordurado ( diferença dos tubos dá a massa de
chocolate)
 Analitos: cafeina e teobromina
• Transferência quantitativa dos analitos :transferir o
chocolate desengordurado para um béquer e dissolver em
água(usar aquecimento)=pasta(suspensão de sólido no
líquido)
• Aquecimento em BM, para extrair toda cafeina e
teobromina do chocolate
• Centrifugar, filtrar.
 Análise Química
• Escolha do solvente:tentativa e erro
• Acido Acético: Síilica-O- acido acético Sílica-OH
• Análise Cromatográfica:
• A cafeína é mais solúvel que a teobromina na camada de
hidrocarboneto portanto fixa-se nas partículas de sílica da coluna
• Solvente=água + metanol+ac.acético
• Fig. 01-Amostra
• Fig 02.Padrões 50 microgramas de cafeina e 50 microgramas de
teobromina/g solução
Curvas de Calibração
 Interpretação de resultados
(g de analito/100 mg de chocolate)

Analito Chocolate preto Chocolate Branco

teobromina 0,392±0,002 0,010±0,007

cafeina 0,050±0,003 0,009±0,0014

 Desenvolvimento de Metodologia

1- Amostragem

2- Preparação da amostra

3- Desenvolvimento do método

4- Calibração do Instrumento

5- Cálculo do Limite de Detecção

6- Validação

7- Implantação
 ANÁLISE INSTRUMENTAL
Leitura sugerida :
Da Amostragem à Validação
Profa. Dra.Thais Vitória da Silva Reis

Qualidade e Confiabilidade nas

Análises Químicas
 AMOSTRAGEM

• Etapa mais crítica do processo analítico

• O erro de amostragem provoca a liberação de resultados falsos

e/ou não representativos

Preparação da Amostra:

• Preservar amostras em meio adequado(s) (l) ou(g);

• Diluir quando suas concentrações prováveis sejam
elevadas(quando necessário)
• Solubilizar amostras sólidas (s):
– Solução aquosa;
– Dissoluções em ácidos;
– Fusões para sólidos insolúveis em meio aquoso(fusão ácida,
alcalina)
 Preparações inadequadas

Podem resultar:

-em contaminações,

-perda do analito,

-dissolução incompleta e/ou precipitação incompleta do analito.

 Desenvolvimento do Método

• Definir analitos;

• Escolher parâmetro físico para a medida do analito em questão(um

ou mais comprimentos de onda ,determinado
potencial,determinada temperatura etc);

• Otimizar o sistema e definir condições de operação( chama de

acetileno/Óxido nitroso para determinação de Cálcio por
EAA);fluxo de gás...

• Investigar as interferências e Corrigí-las( uso de raias de

ressonância alternativas;extração de interferentes por solventes
ou troca iônica, etc)

• Definir a intervalo de calibração

 Calibração do instrumento de medida

• Uso de Brancos(solução contem os mesmos reagentes e matriz

dos padrões exceto o analito que se deseja determinar);
recomenda-se uso de dois padrões (uso de 2 tampóes para
Potenciometria)

• Uso de padrões
– Devem possuir concentrações superiores à faixa que se
pretende tarbalhar(permitirá interpolações), na ordem
de grandeza da concentração que se pretende
determinar.
– Usar soluções de pureza analítica, estáveis
– Usar materiais de boa procedência assim como vidrarias
de classe A
 Limites de detecção:
concentração de analito capaz de produzir sinal 3x maior que
o ruído produz

• CALCULO: multipica=se -se por por 3 o desvio padrão da solução

branco, expresso em concentração,

• ou de uma solução com concentração adequadamente baixa

 Limite de Detecção

• Limite de Detecção Instrumental (LDI)

É a concentração do analito que é equivalente a 3 vezes o desvio
padrão do sinal do branco(usar H2O pura para branco)
• Limite de Detecção do Método (LDM)
• É a mínima concentração de um de um analito que pode ser
definido, medido e reportado com 99% de confiança de que o
mesmo é maior que zero

• Em geral um maior nível de ruído devido a matriz da amostra

produz limites de detecção do método maiores do que os limites
de detecção instrumental (são mais realísticos pois consideram a
matriz)
• Limite de Quantificação Limite de Quantificação
• É a mínima concentração de um analito que pode ser
medido/quantificado e reportado com confiança . Em geral, usa-se
de 5-10 vezes o Limite de Detecção
 Validação

• Processo que fornece evidência documentada de que o

método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer (USP)
(prova que um método analítico é aceitável para os propósitos
a que se destina)
• Assegura a aplicabilidade e o alcance do método durante as
operações de rotina do laboratório,estabelecendo limites
destes parâmetros, por meio de figuras de mérito

• Figuras de Mérito:
– São indicadores quantitativos da base e do bom desempenho das
técnicas
– Seletividade,ajuste da curva analítica;determinação da faixa de
linearidade;sensibilidade do método(representada pelos limites de
detecção)e quantificação(LQ),precisão exatidão e robustez.
 Especificidade
capacidade de um método em distinguir o analito de todo o
resto que se encontra presente na amostra
• Eletroferograma de cefotaxima,contaminada intencionalmente com 0,2%
em peso por todas as impurezas normalmente presentes a partir da
síntese.(os pequenos picos correspondem as impurezas
desconhecidas)/separação por cromatografia eletrocinética micelar
• Há separação da linha de base do analito das demais
impurezas=especificidade
• No desenvolvimento de métodos:
• Decide-se quais impurezas devem ser deliberadamente
adicionadas para testar a especificidade

• Na análise de Formulação de uma droga:

• Compara-se a droga pura com outra amostra contendo excipientes
–substâncias que dão consistência e forma desejadas,
• -adições de possíveis produtos de degradação
• -intermediários de síntese
• Os produtos e degradação podem ser introduzidos , sujeitando-se
a amostra a luz, calor, umidade ,ácidos para que decomponha no
máximo 20 da amostra original
 Precisão
reprodutibilidade de um resultado
• Precisão intrínseca do ensaio
– Análise pela mesma pessoa, no mesmo dia de várias alíquotas
e material homogêneo(estima-se o quão reprodutível o
método pode ser)
– Espera-se que a possibilidade de variação dentro do próprio
ensaio seja maior que a do instrumento(há várias etapas
envolvidas)
• Precisão Intermediária(robustez)
– Variação observada quando um ensaio é feito por pessoas
diferentes ,em dias diferentes, no mesmo laboratório(os
reagentes podem ser preparados independentemente e
diferentes lotes de coluna cromatográfica podem ser usados)
• É a medida mais geral da reprodutibilidade
• É a capacidade de resistir a pequenas variações dos parâmetroa
analíticos sem alterar precisão e exatidão
• Precisão interlaboratorial
– Reprodutibilidade observada quando alíquotas de
mesma amostra são analisadas por diferentes pessoas,
em diferentes laboratórios , em dias diferentes usando
equipamento e reagentes de cada laboratório.
– É a medida mais geral da reprodutibilidade de um
procedimento
– Ex. quando a conc. de analito diminue , diminue a
precisão interlaboratorial:C=10% peso....precisão
interlaboratorial~3%;C=1ppm....~16%
• Analisar diferentes replicatas replicatas da mesma amostra no
mesmo tempo

• Analisar a mesma amostra em tempos diferentes

• Analisar a mesma amostra em dias diferentes

• Calcular o desvio Padrão (SD)

• Calcular o Desvio Padrão Relativo (%RSD)

 Exatidão
proximidade do valor verdadeiro
• Aquisição de material certificado de procedência idônea.

• Participação em programas interlaboratoriais.

• Comparação com outras metodologias (via úmida úmida).

• Fazer testes de recuperação.

 Exatidão
(Modos de verificar a proximidade do valor verdadeiro)
• 1-Análise de Material de Referência Padrão
( em matriz semelhante a amostra desconhecida)
* o método usado deverá fornecer o valor certificado do analito
no material de referência dentro da precisão do método usado
• 2-Comparação de resultados: de dois ou mais métodos
analíticos diferentes
*Devem concordar dentro da precisão esperada para cada
método
• 3-Análise de Branco (propositadamente contaminado com
Conc.conhecida de analito)
– Composição da matriz=composição de amostra
– Usar amostra em triplicata ,onde os três níveis de
concentração variarão de 0,5-1,5 vezes a faixa esperada de
concentração da amostra
– As adições propositais devem cobrir 3 níveis ,varrendo a faixa
esperada de 0,1-2% em peso
• 4-Em caso de impossibilidade de preparar Branco com
mesma composição da matriz da amostra, efetuar adições de
padrão do analito.

OBS-Método mais comum de avaliação de Exatidão:

contaminação proposital( NEM SEMPRE MATERIAL DE REFERÊNCIA
E 2º MÉTODO ANALÍTICO ESTÃO DISPONÍVEIS)

*Ex. de especificação para exatidão:

a análise identificará 100±2% do valor da contaminação
proposital;

*para impurezas pode ser que a especificação se situe

dentro de 0,1% em peso do valor absolutoou ±10% do valor
relativo
 Faixa
(intervalo de concentrações no qual a linearidade ,
precisão e exatidão são aceitáveis)

• Exemplo:Faixa de um componente principal de uma mistura

• Intervalo de concentração ≥ 0,995

• Identificação de contaminação proposital 100±2%
• Precisão Interlaboratorial ±15%
 Limites de Detecção e de Quantificação
(menor quantidade de analito que é significativamente
diferente do branco)
• Descrição de Caso :Procedimento que produz Limite de
Detecção com 99% de Probabilidade de ser maior que o
branco
• Suposição: Desvio padrão do sinal proveniente de amostras
(com conc. Próximas ao limite de detecção) sejam semelhantes
ao desvio padrão, proveniente dos brancos.

• 1-Estima-se o limite de detecção( apartir de nossa experiencia

anterior com o método)-Prepara-se uma amostra de Conc ~1 a 5
vezes o limite de detecção
• 2-Mede-se o sinal das n amostras repetidas(n≥7)
• 3-Calcula-se o desvi padrão (s) das n medidas
• 4- Mede-se o sinal das n amostras em branco(sem analito)e
determina-se o valor médio: y branco
• 5-Multiplica-se s pelo valor da distribuição t de Student(
corresponde a n-1 graus de liberdade) e 98% de confiança
• O sinal (limite de detecção) será, y ld

Limite de Detecção: y ld =y branco+t.s (Equação1)

• 6-Obtenção do Limite de Detecção da Concentração

pode ser obtido a partir do limite de detecção do sinal através de
Curva de Calibração.
Para C.Calibração linear:
Sinal corrigido=y amostra-y branco é proporcional à C da amostra

Reta de calibração: y amostra – y branco= m . Conc da amostra

Graus de Liberdade(n-1) Valor de t para
a equação (1)
6 3,143

7 2,998

8 2,896

9 2,821

10 2,764

15 2,606
• Y amostra: sinal observado para a amostra
• M = coeficiente angular da CCalibração

A conc da amostra no limite de detecção será obtida:

Substituindo-se y amostra por y ld

Limite de DETECÇÃO DA CONCENTRAÇÃO:

Conc. Mínima detectável=t.s/m

Outras definições de Limite de Detecção: valores de

distribuição de t na tabela anterior são próximos de 3 outra
definição será:
y ld =ybranco+3s
Limite de Quantificação :Y = ybranco + 10s
ld
• Sinal forte para ser medido com mais exatidão
 Robustez
(capacidade do método não ser afetado por pequenas
variações feitas deliberadamente sobre os parâmetros da
operação)

• Ex. Método Cromatográfico

• Robusto= não é afetado por pequenas variações na
composição de solvente , pH,volume de
injeção,comprimento de onda de detecção
• Testes de robustez: composição do solvente na fase
móvel pode ser variada em ±2% , pH do eluente
variado em± 0,1 pH, temperatura de coluna em ±5ºC
• ( variações toleráveis)
• Otimização do Procedimento :planejamento fatorial
fracionário=procura-se efeito princiapl variando os fatores
envolvidos simultâneamente

• Eletroforese capilar:
• Vol de solução pequenos( usa-se a solução preparada por
meses)
• Ex.
• Tampão fosfato/borato estável por 3 meses(frasco plástico
a 25 C)
• Solução de cromato e brometo de tetradecilmetilamonio
mó é estavel por 1 dia
• Soluções com ciclodestrinas são favcilmente atacáveis por
bactérias
 Resumindo....
• O conjunto de operações que objetiva determinar o valor de uma
grandeza é chamado de MEDIÇÃO(vocabulário Internacional de
Têrmos Fundamentais e Gerais em Metrologia-VIM/INMETRO
2007).

• Mensurando(Objeto de Medição)

• Valor Verdadeiro(consistente com a definição de uma dada

grandeza).
• Valor Convencional(atribuído a grandeza específica e aceito(por
convenção),com incerteza apropriada
Valor verdadeiro Valor Verdadeiro Convencional

Erros de Medição(pH solução-pH certificado no frasco)

(resultado da medição-valor verdadeiro)

Erro de Indicação do Instrumento Erro Sistemático

nºinfinito de medições,do
mesmo mensurando,
sob condições de
repetitividade-valor
verdadeiro.
Erro aleatório(Erro global –Erro Sistemático)
• Tendência( do instrumento de medição)

• É estimada pela média dos erros de indicação(de um nº apropriado

de medições)

• < nº de Medições< Confiabilidade das medida

• Tendência e Repetitividade:
• Realizada em tempos pequenos(ensaios que demandam tempo
longo,não é possível ter reprodutibilidade, pois mudam as
condições)

• Equipamentos : faixa de indicação (intervalo entre > e < valor

que o mostrador apresenta; faixa de medição :faixa de detecção
do mensurando na qual admite-se que a medição fica dentro dos
limites;resolução(mostrador analógico R=VD e Digitais:
R=increnteto digital onde VD+ valor de divisão de escala
 Validação de métodos
Confirmar por exame ou evidência que os requisitos
específicos para determinado uso sã atendidos

(NBR ISO/IEC 17025,2005)

Deseja-se garantir a Qualidade dos Resultados do Ensaio

e de calibrações !

Como garantir esta Qualidade ?

Quais as Formas de Validar ?
PROCEDIMENTOS DE CONTROLE DE QUALIDADE PARA MONITORAR
D VALIDAÇÃO DE RESULTADOS:

USAR MATERIAIS DE REFERÊNCIA

AVALIAR SEMPRE(SISTEMATICAMENTE) OS FATORES QUE INFLUEM

NO RESULTADO

Avaliar as incertezas

Proceder a ensaios /Calibrações co replicatas com o mesmo

Método ou métodos diferentes

Participar de programas de comparação interlaboratorial e

intralaboratorial
Exemplo de Validação/Estudo de Caso

Acessar a referência:

Projeto de Qualidade da Água

VII Seminário Rio Metrologia,4-5 Agosto de 2009
Débora França de Andrade-Quali-H2O.
 Para a Área Química
(DOQ –CGCRE-008Orientação sobre Validação de Métodos e
Ensaios Químicos)
• Características de Desempenho do
Método/parâmetros de validação devem
incluir:
– Especificidade e seletividade
– Faixa de Trabalho e faixa linear de trabalho
– Linearidade
– Sensibilidade
– Limite de detecção
– Limite de Quantificação
– Exatidão e tendência(bias)
– Precisão
– Robustez
– Incerteza
Rastreabilidade
Pirâmide de Rastreabilidade
 Rastreabilidade
Propriedade de um resultado de medição ou valor de padrão
estar relacionado à grandezas estabelecidas(padrões
internacionais) através de cadeia contínua de comparações
tendo todas as incertezas estabelecidas

Por meio de :
1-Calibração do Equipamento rastreada com padões
apropriados(material de referencia=subst. Pura /SI)
2-Método primário de Medição(rastreável diretamente ao
SI)...menor incerteza com respeito à referência
3-Utilizando Materiais de Referência(MR)da subst.
Pura(adição de padrão)
4-Medição de Material de Referência Certificado(MRC)
..compara-se os resultados vs uma matiz certificada(reduz
incerteza)
5-Medição usando procedimento aceito(baseado em norma
nacional ou Internacional)