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verificação/confirmação de desempenho,
estimativa da incerteza de medição e
controle de qualidade intralaboratorial
Divisão de Ensaios Químicos
Coordenação-Geral de Apoio Laboratorial
DEQ/CGAL
Nov/2014
Sumário
Parte 01 - Introdução e requisitos gerais............................................................................. 3
1.0 Propósito ........................................................................................................................ 3
2.0 Escopo ........................................................................................................................... 3
3.0 Responsabilidades ......................................................................................................... 3
3.1 Evitando contaminação ..................................................................................... 4
3.2 Padrões de Trabalho (Analíticos), de Referência e MRC ................................. 4
3.3 Rastreabilidade de Padrões de Trabalho (Analíticos) ...................................... 5
3.4 Preparação, Uso e Armazenamento de Soluções Padrão .................................. 5
3.5 Reagentes e suas Soluções ................................................................................ 6
3.6 Recepção, Armazenamento e Preparação de Amostras .................................... 6
3.7 Desenvolvimento e Otimização do Procedimento Analítico ............................ 7
3.8 Validação de Procedimentos Analíticos............................................................ 8
3.9 Conduções do Processo de validação e verificação/confirmação de
desempenho ..................................................................................................... 11
3.10 Rastreabilidade Metrológica ......................................................................... 12
Parte 02 – Validação de métodos para as áreas IQA (Identidade e Qualidade de
Alimentos e IQI (Identidade e Qualidade de Insumos)....................................................14
1.0 Introdução .................................................................................................................... 14
1.1 Campo de aplicação........................................................................................14
1.2 Validação e Verificação/Confirmação de desempenho (itens 5.4.2 e 5.4.5 da
ISO/IEC 17025:2005) ................................................................................................... 14
1.3 Cálculo de Incerteza (item 5.4.6 da ISO/IEC 17025:2005)...........................14
1.4 Controle de Qualidade (item 5.9 da ISO/IEC 17025:2005)...........................14
2.0 Objetivos..................................................................................................................... 14
3.0 Procedimentos ............................................................................................................ 15
3.1 Verificação/confirmação de desempenho ...................................................... 15
3.2 Validação intralaboratorial.............................................................................15
3.2.1 Cálculos e Critérios ........................................................................... 16
3.2.1.1 Linearidade e faixa de trabalho ...................................................... 16
3.2.1.2 Seletividade ................................................................................... 17
3.2.1.3 Precisão (repetitividade) / Exatidão ............................................... 17
3.2.1.4 Precisão intermediária .................................................................... 19
3.2.1.5 Limite de quantificação .................................................................. 19
3.2.1.6 Teste de robustez ............................................................................ 20
3.3 Cálculo de incerteza de medição (abordagens “bottom up” e “validation
based”)..............................................................................................................................21
3.3.1 Incerteza da Linearidade (curva de calibração) ................................ 21
3.3.2 Incerteza da precisão intermediária ................................................... 22
3.3.3 Incerteza de equipamentos ................................................................ 23
3.3.4 Incerteza de soluções ......................................................................... 23
3.3.5 Cálculo da incerteza combinada e expandida.................................... 24
3.4 Controle de Qualidade....................................................................................24
3.4.1 Cartas de controle das médias ........................................................... 25
3.4.2 Cartas de controle de amplitude ........................................................ 26
Anexo A – Fluxograma Validação, Verificação/Confirmação de Desempenho .............. 27
Anexo B – Especificidades de métodos de IQA e IQI ..................................................... 28
B.1 Determinação de teor de Medicamentos Veterinários ................................... 29
B.2 Análise de Histamina para controle de pescado e seus derivados ................. 32
Anexo C – Glossário ........................................................................................................ 33
Anexo D – Referências Bibliográficas ............................................................................. 36
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Parte 01 - Introdução e requisitos gerais
1.0 Propósito
2.0 Escopo
3.0 Responsabilidades
Os parâmetros e critérios descritos neste documento devem ser observados por todos
os laboratórios que realizam ensaios pertencentes à Rede Nacional de Laboratórios
Agropecuários, atuantes nas áreas mencionadas no item 2.0.
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Alterações nos procedimentos de validação, parâmetros e critérios estabelecidos
poderão ser necessários devido à especificidade de determinados métodos de ensaio
ou peculiaridades do laboratório. Nestes casos, modificações poderão ser
consideradas desde que sejam adequadamente justificadas, garantindo sua
consistência científica e conceitual com os princípios deste Manual e o não
comprometimento da rastreabilidade, da comparabilidade e da confiabilidade dos
resultados analíticos gerados.
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A utilização de material/padrão de trabalho é permitida, desde que o material/padrão
de trabalho seja, devidamente, rastreável a um material/padrão de referência, que por
sua vez tenha sido calibrado com um MRC.
Recomenda-se que a preparação das soluções padrão deve ser baseada em sua
massa, usando balanças com resolução de pelo menos 0,1 mg para massas de até
100mg e 0,01mg para massas inferiores a 100 mg, deve-se evitar pesar massas de
padrões inferiores a 10 mg. A massa de tara (do recipiente de pesagem) nunca deve
ser inferior a 0,1g, massa (carga) mínima de calibração das balanças analíticas, que
são balanças da classe I (Portaria Inmetro nº 236 de 1994), pois elas não podem ser
calibradas abaixo de cem vezes a sua divisão de verificação.
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Recomenda-se que logo após o seu preparo e acondicionamento em frasco
adequado, as soluções padrão sejam pesadas. Recomenda-se que essa pesagem
seja refeita antes e após a utilização de qualquer volume dessas soluções. As datas e
valores dessas pesagens e os nomes dos técnicos que prepararam ou utilizaram a
solução padrão devem ser anotados para controle (cadeia de custódia).
1. Origem;
2. Data de recepção;
3. Estado de conservação;
4. Quantidade;
5. Tipo de amostra (especificação).
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Após a recepção, as amostras devem ser encaminhadas para a preparação, antes da
análise, ou armazenadas de acordo com as suas peculiaridades e requisitos
específicos.
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Durante o desenvolvimento e otimização de um procedimento analítico, especial
atenção deve ser dada a algumas de suas etapas, como discutido a seguir:
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10. Realização dos experimentos da pré-validação: dados (registros) e conclusão;
11. Realização dos experimentos da validação: Dados (registros) e conclusão;
12. POP final e definitivo para a execução do procedimento analítico na rotina;
13. Relatório Final de Validação, destacando a informação se o método é
adequado ao uso pretendido.
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INÍCIO
Desenvolver o procedimento
analítico.
Otimizar o procedimento
analítico.
Sim
Validação do
Reotimizar o
procedimento analítico
procedimento analítico.
otimizado. Rever
critérios de
validação. *
Parar o uso do
Não
procedimento na
rotina.
Procedimento Não
Não validado
O procedimento
Sim analítico não pode ser
Causa do usado na rotina.
Utilização do
descontrole Sim
procedimento analítico
encontrada.
na rotina.
Procedimento
novamente
sobre controle.
Durante a rotina:
1. Fazer controles
periódicos com
amostras de
controle.
2. Construir cartas de
controle.
Procurar a causa da
Procedimento
falta de controle
sob controle
estatístico do Não Sim
estatístico
procedimento.
FIM
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3.9 Conduções do Processo de validação e verificação/confirmação de
desempenho
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CREDENCIAMENTO MAPA
Ensaios interlaboratoriais
Cartas de controle
Controle
estatístico
Validação
Procedimento e sistema
analítico. Escopo.
Incerteza de
Adequação ao
medição.
propósito de uso.
Resultado Analítico
confiável, rastreável e
comparável
A abordagem deste ciclo pode ser aplicada para qualquer unidade laboratorial. No
entanto, é necessário considerar algumas características específicas como, por
exemplo, para as áreas de IQA e IQI, nas quais inicialmente devem ser observadas as
orientações descritas na Parte 02 - Item 01.
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Figura 03. Ciclo de Garantia da Qualidade Analítica (Olivares; Antunes, 2012)
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Parte 02 – Validação de métodos para as áreas IQA
(Identidade e Qualidade de Alimentos) e IQI (Identidade
e qualidade de insumos)
1.0 Introdução:
Esta parte se aplica aos ensaios quantitativos das áreas BEV, POA, POV, AGR, FER,
MEV e ALA. Destaca-se que para algumas áreas ou ensaios, existem algumas
particularidades as quais estão descritas no anexo B deste documento. Desta
maneira, deve-se aplicar a “Parte 02” para as áreas supracitadas, considerando,
quando aplicável, as informações adicionais do anexo B.
2.0 Objetivos
De acordo com a ISO/IEC 17025:2005 destaca-se a obrigatoriedade na validação de
métodos. Apesar de esta validação ser aplicada para métodos não normalizados, a
verificação/confirmação de desempenho dos métodos normalizados também é
obrigatória, pois segundo o item 5.4.2 da ISO/IEC 17025:2005, é necessária a
confirmação de que o laboratório tem condição de operar adequadamente métodos
normalizados antes de implantar os ensaios ou as calibrações;
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desempenho são utilizados para cálculo de incerteza atendendo também ao requisito
5.4.6 da norma;
3.0 Procedimentos
Onde:
X = média das replicatas referentes à análise do MRC
t= t de Student para n números de replicatas
n= número de replicatas (no mínimo 5)
S= desvio padrão para número de n replicatas
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3.2.1 Cálculos e critérios
3.2.1.1.1 Procedimentos
r 0,99;
Inspeção visual da linearidade da curva e os resíduos individuais não devem ser
maiores que 20%. Até um valor de resíduo acima deste limite em cada nível
pode ser aceito por um teste de outlier (quando pelo menos for utilizado 5
replicatas por nível), como, por exemplo, Teste de Grubbs, conforme Figura 02 e
Tabela 1, desde que o r 0,99.
valor suspeito x
G
s
Figura 02– Cálculo de outlier segundo Grubbs
Onde:
x = média dos valores
s= estimativa do desvio padrão destes valores
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Tabela 1–Valores Críticos de G (P=0,05)
Número de Valores
Medidas Críticos
5 1,715
6 1,887
7 2,020
8 2,126
9 2,215
10 2,290
3.2.1.2 Seletividade
3.2.1.2.1 Procedimentos
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho
da medição. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude
do efeito também pode depender da concentração (Inmetro, 2011). Estes efeitos
devem ser avaliados por meio de um estudo.
Experimentos para avaliação da seletividade descritos na literatura sobre
validação de métodos analíticos envolvem ensaios com padrões ou materiais de
referência, amostras com e sem o analito, além da avaliação da capacidade de
identificação do analito de interesse na presença de interferentes. Quando não
há disponibilidade de interferentes, alguns autores sugerem a avaliação da
habilidade de medição do analito por diferentes métodos, técnicas ou por meio
de variações nas condições instrumentais (Inmetro, 2011).
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Os estudos de repetitividade podem ser realizados utilizando os dados do estudo
de recuperação (amostra fortificada);
Quando a amostra a ser utilizada apresentar concentração conhecida do analito
de interesse (como por exemplo, MR, MRC ou amostra fortificada), é possível
avaliar a exatidão pela diferença percentual do valor predito com a média dos
resultados do estudo de precisão.
3.2.1.3.1 Procedimentos
Onde:
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3.2.1.4 Precisão intermediária
3.2.1.4.1 Procedimentos
3.2.1.5.1 Procedimentos
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amostras dentro de uma faixa de trabalho (como por exemplo, para ensaios de
pH, condutividade, turbidez, entre outros);
3.2.1.6.1 Procedimentos
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3.3 Cálculo de incerteza de medição (abordagens “bottom up” e “validation
based”)
Figura 04 – Equação para cálculo do desvio padrão residual (Sxx) segundo guia Eurachem/Citac
[ A
j 1
j ( B0 B1.c j )]2
S
n2
Figura 05 – Equação para cálculo do desvio padrão residual (S) segundo guia Eurachem/Citac
1 1 (C0 C )2
Incerteza S
B1
p n S xx
Figura 06 – Equação para cálculo de incerteza das variações aleatórias em y segundo guia
Eurachem/Citac
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Onde:
B = Coeficiente angular;
Calcular a incerteza pela somatória do desvio padrão (Figura 07) calculada nos
dois níveis de concentração estudados.
( x x)
i
2
S i 1
n 1
uc ( y ( p, q...)) u ( p ) 2 u (q ) 2 ...
Figura 08 – Cálculo para somatória das incertezas de dois níveis de concentração
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Onde:
u (y(p,q)= soma das incertezas
u(p), u(q) etc = valores de cada incerteza a ser somada
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Solução adquirida Solução preparada em laboratório Solução padronizada em laboratório
com certificado
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Entre os diferentes tipos de cartas de controle, podem ser aplicadas as cartas de
controle das médias – Shewhart (Konieczka; Namiesnik, 2009) ou amplitude
(Funk; Dammann; Donnevert, 2007) conforme apresentado a seguir.
Figura 10 – Teste T
Onde:
Xm = Média dos resultados
U = Valor predito
SD = Desvio Padrão
n = Número de replicatas
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3.4.2 Cartas de controle de amplitude (Funk; Dammann; Donnevert, 2007)
Analisar entre 10 e 20 amostras em duplicata;
Calcular a amplitude relativa (diferença entre os resultados divididos pela média
e multiplicados por 100) para cada duplicata;
Considerar que em alguns ensaios a amplitude relativa não é diretamente
proporcional a concentração da amostra. Nestes casos, pode se estudar o uso
de mais de uma carta de controle contemplando diferentes níveis;
Eliminar os outliers dos resultados de amplitude por testes estatísticos
apropriados;
Calcular a média da amplitude;
Marcar o número consecutivo de resultados no eixo X do gráfico e os valores
das características observadas no eixo y;
Marque uma linha central no gráfico correspondendo ao valor de referência;
Traçar 02 linhas paralelas acima da linha central e duas abaixo, correspondendo
a: Limite superior de aviso (média da amplitude x 2,809); Limite inferior de aviso
(média da amplitude x 0,039); Limite superior de ação (média da amplitude x
3,267); Limite inferior de ação (média da amplitude x 0,000);
Com a carta preparada, avaliar amostras em duplicata na rotina (conforme
frequência estabelecida segundo as necessidades de cada unidade) e continuar
a inserir os dados de controle avaliando conforme Tabela 04;
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Anexo A
SIM SIM
/ EXATIDÃO
Fim
SELETIVIDADE
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Anexo B
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Área MEV/IQI
B.1 DETERMINAÇÃO DE TEOR DE MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
Seletividade
Procedimento:
Em geral, a verificação da seletividade de um procedimento cromatográfico deve
garantir que o pico de interesse seja atribuído a um só componente. Para garantir a
pureza do pico, pode-se utilizar detectores de arranjo de fotodiodos, espectrômetros
de massas ou colunas cromatográficas com polaridades diferentes.
Além disso, deve-se garantir que todos os reagentes usados durante o processo
analítico não interferem no sinal do pico de interesse.
Critério de aceitabilidade:
Comprovação de que não ocorra coeluição com os picos de interesse.
Linearidade
Procedimento:
O estudo da linearidade deverá ser realizado utilizando curvas de adição-padrão.
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O 1º ponto da curva pode ser a amostra diluída na concentração definida pelo método
e os pontos subsequentes a amostra diluída adicionada de padrão. A curva deve ter
no mínimo cinco níveis de concentração, com pelo menos seis replicatas de preparo.
Construir a curva de calibração, calcular o r (coeficiente de correlação) e os resíduos
para cada ponto.
Avaliar a distribuição dos resíduos e verificar a existência de outliers (como, por
exemplo, teste de Grubbs, Jacknife ou outros).
Critério de aceitabilidade:
r ≥ 0,99
Sempre que se confirme a presença de outliers, o ponto experimental deve ser
retirado e o teste é refeito. Pontos experimentais podem ser retirados em até no
máximo 22,2%.
O não atendimento dos critérios acima implica na necessidade de refazer a curva em
todos os níveis.
Limite de quantificação
Procedimento:
Conforme descrito no texto principal.
Robustez
Procedimento:
Conforme descrito no texto principal.
Incerteza de Medição
Procedimento:
Conforme descrito no texto principal.
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Rotina Analítica: Curva de Adição Padrão e Amostras de Controle de Qualidade
(ACQ)
Todos os procedimentos adotados na rotina analítica deverão ser respaldados pelos
estudos de validação do procedimento.
A curva de adição-padrão utilizada na rotina deve conter pelo menos cinco níveis,
devendo ser elaborada conforme estudada na validação do procedimento.
Produtos com a concentração já determinada ou padrões internos podem ser
utilizados como ACQs e devem ser adicionados em toda batelada analítica.
O laboratório deve, obrigatoriamente, fazer uso de cartas controle para monitorar as
ACQs, conforme descrito no texto principal.
Bibliografia:
USP, 2014. United States Pharmacopeia, 37nd ed, Rockville: United States Pharmacopeial
Convention; 2013.
MAPA, 2011. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Guia de Validação e
Controle de Qualidade Analítica: Fármacos e Contaminantes em Produto para Alimentação
Animal e Medicamentos Veterinários. Secretaria de Defesa Agropecuária, Brasília, 2011.
NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods,
http://www.itl.nist.gov/div898/handbook/eda/section3/eda35h1.htm.
GRUBBS, F. Procedures for Detecting Outlying Observations in Samples. Technometrics,
11(1), 1-2, 1969.
HORWITZ, W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance
studies. Pure Appl. Chem., 67, 331-343, 1995.
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Área POA/IQA
B.2 ANÁLISE DE HISTAMINA PARA CONTROLE DE PESCADO E SEUS
DERIVADOS
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Anexo C
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Validação é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que
os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos (item
5.4.5.1 – ISO/IEC 17025:2005);
Avaliação de desempenho é a confirmação de que o laboratório tem condição de
operar adequadamente métodos normalizados antes de implantar os ensaios ou as
calibrações. Se o método normalizado mudar, a confirmação deve ser repetida (item
5.4.2 – ISO/IEC 17025:2005);
Ensaio de proficiência (EP) é a determinação de desempenho de ensaio de
laboratórios, através de comparações interlaboratoriais;
Comparação interlaboratorial – organização, desempenho e avaliação de ensaios
nos mesmos itens, ou em itens de ensaio similares, por dois ou mais laboratórios de
acordo com condições predeterminadas;
Material de referência (MR) – material ou substância que tem um ou mais valores de
propriedades que são suficientemente homogêneos e bem estabelecidos, para ser
usado na calibração de um aparelho, na avaliação de um método de medição ou
atribuição de valores a materiais;
Material de referência certificado (MRC) – material de referência, acompanhado por
um certificado, com um ou mais valores de propriedades, e certificado por um
procedimento que estabelece sua rastreabilidade à obtenção exata da unidade na qual
valores da propriedade são expressos, e cada valor certificado é acompanhado por
uma incerteza para um nível de confiança estabelecido;
Precisão – normalmente determinada para circunstâncias específicas de medição e
as três formas mais comuns de expressá-la são: por meio da repetitividade, precisão
intermediária e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressas pelo desvio padrão
e coeficiente de variação. O coeficiente de variação (CV, usualmente expresso em %),
também conhecido como desvio padrão relativo (DPR);
Precisão (repetitividade) – as condições de repetitividade podem ser caracterizadas
utilizando: Mesmo procedimento de medição; mesmo observador; mesmo instrumento
usado sob mesmas condições; mesmo local, e repetições no menor espaço de tempo
possível. A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da
característica da dispersão dos resultados e pode ser determinada por meio da análise
de padrões, material de referência, amostra de concentração conhecida ou adição do
analito ao branco da amostra, em várias concentrações na faixa de trabalho;
Precisão intermediária – de acordo com a ISO 5725-3, refere-se à precisão avaliada
sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método,
no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou
mais), tais como: diferentes analistas; diferentes equipamentos; diferentes tempos.
Esta medida de precisão representa a variabilidade dos resultados em um laboratório.
Na maioria dos casos, o valor de precisão intermediária é função do nível de
concentração do ensaio e o seu cálculo é efetuado, preferencialmente, a partir dos
resultados obtidos, após eliminação dos resultados discrepantes. A visualização
gráfica dos valores também pode ser útil para identificá-los;
Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância (analito) em exame;
Incerteza de medição – de acordo com o VIM trata-se de um parâmetro não negativo
que caracteriza a dispersão dos valores atribuídos a um mensurando, com base nas
informações utilizadas, ou seja, este não possui influência contraproducente definindo
uma faixa para o resultado obtido de acordo com as práticas metodológicas utilizadas
A incerteza de medição compreende componentes provenientes de efeitos
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sistemáticos, tais como componentes associadas a correções e valores atribuídos a
padrões, assim como a incerteza definicional. Algumas vezes não são corrigidos
efeitos sistemáticos estimados; em vez disso são incorporadas componentes de
incerteza de medição associadas;
Limite de detecção (LD) – é a menor quantidade de um analito que pode ser
detectado em uma amostra, mas não necessariamente quantificado como um valor
exato;
Limite de quantificação (LQ) – é a menor quantidade de um analito que pode ser
quantitativamente determinada em uma amostra com adequada precisão e exatidão;
Robustez – susceptibilidade de um procedimento analítico a alterações das
condições experimentais, as quais podem ser expressas como uma lista dos materiais
da amostra, das substâncias a analisar, das condições de armazenamento, das
condições ambientais e/ou de preparação da amostra em que o método pode ser
aplicado tal como apresentado ou com pequenas alterações específicas.
Relativamente a todas as condições experimentais que possam, na prática, estar
sujeitas a variações (por exemplo, estabilidade dos reagentes, composição da
amostra, pH, temperatura), devem ser indicadas quaisquer alterações susceptíveis de
afetar os resultados analíticos (Manual de Garantia de Qualidade Analítica, 2011);
Incerteza de medição – parâmetro não negativo que caracteriza a dispersão dos
valores atribuídos a um mensurando, com base nas informações utilizadas. (VIM,
2012);
Abordagem “validation based” – é baseada em estudos de validação inter e
intralaboratórios (precisão, exatidão, robustez). O cálculo é geralmente baseado no
desvio padrão das informações disponíveis (Olivares, 2012);
Abordagem “bottom up”- é baseado na identificação, quantificação e combinação de
todas as fontes individuais de incerteza. Geralmente é uma abordagem mais
complexa, pois considera todas as fontes de incerteza do método analítico. Este
cálculo é aplicado utilizando principalmente a incerteza dos equipamentos
volumétricos (ex. Frascos volumétricos e micropipetas, balanças e outros instrumentos
que requerem calibração, os quais geralmente apresentam suas incertezas
expandidas expressas em seus certificados de calibração) (Olivares, 2012).
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Anexo D
Referências Bibliográficas
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BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E. Como fazer experimentos. 3.
ed. Campinas, SP: Editora Unicamp, 2007. ISBN 978-85-268-0753-2.
Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in
Food and Feed. Document No. SANCO/12495/2011de 01/01/2012).
OLIVARES, I.R.B.; LOPES, F.A. Essential steps to providing reliable results using the
Analytical Quality Assurance Cycle Trends in Analytical Chemistry, Vol. 35, 2012.
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KONIECZKA, P.; NAMIESNIK, J. Quality Assurance and Quality Control in the
Analytical Chemical Laboratory – A Practical Approach. CRC press Taylor & Francis
Group. 2009.
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