VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Dra. Adriane Medeiros Nunes

Laboratório de Metrologia Química

Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel

Pelotas, 26 de Outubro 2010

Introdução
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas
está sendo cada vez mais exigida e reconhecida. Através da sua:

Comparabilidade

Rastreabilidade

Confiabilidade

Resultados Analíticos não confiáveis podem conduzir:

Decisões desastrosas
Prejuízos financeiros irreparáveis
2
Introdução
Para garantir que um novo método analítico gere
informações

Confiáveis Interpretáveis

Sobre a amostra

Ele deve sofrer uma avaliação denominada

validação

3
 Conceitos do processo de validação

Vários autores definem validação de métodos conceitos estão em

continua evolução

Algumas definições podem ser transcritas:

-“A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às
exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados”
(ANVISA).

- “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método

sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação
requer” (ISO/IEC 17025).

- “A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro,

sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma evidência
documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer” (USP).
4
Validação de métodos
Dentro do âmbito geral do termo validação de métodos é possível
distinguir dois tipos:

- Validação no laboratório (“in house validation”)

Consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para

validar um método novo que tenha sido desenvolvido ou para verificar
que um método adotado está bem aplicado.

5
Validação de métodos

- Validação completa
Envolve todas as características de desempenho e um ESTUDO
INTERLABORATORIAL.

Utilizado para verificar como a metodologia se

comporta com uma determinada matriz em
vários laboratórios

-Estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia

- Incerteza expandida associada à metodologia como um todo
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Legislação

No Brasil, existem duas agências credenciadoras para verificar a

competência de laboratórios de ensaios:

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade

Industrial.

Disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos

Resoluções: são documentos com poder de lei, que devem ser obedecidos.

Guias: são documentos que sugerem uma linha a ser seguida e são, portanto,
abertos para interpretação: “recomendações”.

7
Parâmetros analíticos para validação de métodos

- Parâmetros de desempenho analítico

- Características de desempenho
- Parâmetros de mérito
8
1- Seletividade ou Especificidade

Uma amostra, de maneira geral, consiste:

- Analitos a serem medidos;

Amostra - Matriz;
- Outros componentes.
(que podem ter algum efeito na medição)

 Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado de

específico.

Um método que produz resposta para vários analitos, mas que pode
distinguir a resposta do analito da de outros, é chamado seletivo.

9
 Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade
relativa de matriz pode diminuir

HG AAS
Consiste na formação de hidretos voláteis a partir do elemento em
solução ácida na presença de um agente redutor adequado

Tabela 1- Propriedades de alguns Hidretos empregados para AAS

Hidreto Ponto de Fusão Ponto de Ebulição Solubilidade em H2O

(°C) (°C) (µg.ml-1)
AsH3 - 116,3 - 62,4 696
GeH4 - 164,8 - 88,1 insolúvel
SbH3 - 88 - 18,4 4100
SeH2 - 65,7 - 41,3 37700-68000 10
1- Seletividade ou Especificidade

Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade

relativa de matriz pode diminuir

Hidreto + Ar + H2 +
traços de O2

Fig. 1- Sistema de Geração de Hidretos em batelada (adaptado de Welz & Melcher,1983)

11
2- Linearidade e Faixa de aplicação

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de
uma determinada faixa de concentração.

 A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta

medida e a concentração do analito;

 A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como

expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser
determinado na amostra real.

Curva de
Calibração 12
 Regressão linear

y = ax + b

y = resposta medida (absorvância, altura ou área do pico, etc.);

x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x=0.

13
Coeficiente de correlação linear (r):

-indica o quanto pode ser considerada adequada a reta como

modelo matemático.
-> 0,90 é ideal.
-Qualidade da curva obtida: quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza
dos coeficientes de regressão estimados.

14
3- Limite de Detecção (LD)

O LD representa a menor concentração de analito que pode ser detectada,

mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado
procedimento experimental.

menor concentração de analito na

3s B
amostra que produz um sinal que pode
ser distinguido do sinal do branco,
LOD =
a
dentro de certo critério estatístico.

sendo “a” a inclinação da curva de calibração e “s” o desvio-padrão de

10 medidas do branco.
15
4 - Limite de Quantificação

É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser

determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas.

10s B
LOD =
a

sendo “a” a inclinação da curva analítica “s” o desvio-padrão de 10

medidas do branco.

16
5- Precisão e Exatidão

São dois termos muito importante em química analítica.

Precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado.

Ex. se uma grandeza for medida várias vezes e os valores forem muito próximos uns
dos outros, a medida é precisa.

Exatidão se refere a quão próximo um valor de uma medida está do “valor real”.

Ex. se um padrão conhecido estiver disponível (Material de referência), a exatidão é

o quão próximo o valor determinado está do valor padrão.

17
Precisão e Exatidão
Um dado constituinte em um mesmo material é determinado por três
métodos diferentes, (a), (b), e (c), onde foram feitas 5 medidas em cada
método.
Xv
(valor verdadeiro)

(a) Medidas precisas e exatas

Medidas precisas, mas

(b)
inexatas

Medidas imprecisas e
(c) inexatas

16 17 18 19 20 21 22

18
Exatidão

É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação

ao valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro.

Checagem da Exatidão (“Validação”)

- Materiais certificados de referência (CRMs)

- Técnicas alternativas
- Teste da recuperação

19
20
Testes de recuperação

A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de

amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo
(spike).

As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo menos

três diferentes concentrações:

próximo ao limite de detecção;

próximo à concentração máxima permissível;
concentração próxima à média da faixa de uso do método.

21
Limitação do procedimento:
-O analito adicionado não está necessariamente na mesma forma
que a presente na amostra. A presença de analitos adicionados em
uma forma mais facilmente detectável pode ocasionar avaliações
excessivamente otimistas da recuperação.

onde:
C1 = concentração determinada na amostra adicionada.
C2 = concentração determinada na amostra não adicionada.
C3 = concentração adicionada. 22
Metas - LABmequi

 Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para a determinação de

metais em produtos alimentícios de carne por Espectrometria de Absorção
Atômica (AAS).

23
 Determinação de Na e K em carnes
processadas após tratamento com TMAH
por FAES

24
Atualmente....

25
Introdução

NaCl

- Principal aditivo para a conservação da carne

- Controla o crescimento microbiológico
- Intensifica o paladar do alimento

77% Comida Processada 6% Adição na

Ingestão

12% Ocorrência
Natural

5% Comida
Caseira

Pesquisas indicam a carne como

sendo a segunda maior fonte de sal
na dieta, sendo que os cereais são
os principais.

26
 Current 2010
Targets
Revised 2010 Targets Targets for 2012
(g salt or mg sodium
Main Product Category Sub Categories (where relevant) (g salt or mg sodium per (g salt or mg
per 100g)*
100g)* sodium per 100g)*

1. Meat Products 1.1 Bacon 3.5g salt or 1400mg 3.13g salt or 1250mg sodium 2.88g salt or 1150mg
Includes all types of injection cured sodium (average) (average) sodium (average p)
bacon, e.g. sliced back, streaky, smoked
and unsmoked bacon, bacon joints etc.
Excludes all dry and immersion cured
bacon.
≈11% ≈20%
1.2 Ham/other cured meats 2.5g salt or 1000mg 2.0g salt or 800mg sodium 1.63g salt or 650mg
Includes hams, cured pork loin and sodium (average) (average) sodium (average p)
shoulder etc. Excludes ‘Protected
Designation of Origin’ and traditional
speciality guaranteed products,.

≈20% ≈35%
1.3 Sausages 1.4g salt or 550mg   1.13g salt or 450mg
1.3.1 Sausages Includes all fresh, chilled sodium (maximum) sodium (maximum)
and frozen meat sausages, e.g. pork,
beef, chicken, turkey, etc.

≈20%
1.3.2 Cooked sausages and sausage 1.8g salt or 700mg 1.63g salt or 650mg sodium 1.5g salt or 600mg
meat products Includes all cooked sodium (maximum) (maximum) sodium (maximum)
sausages and sausage meat products
e.g. stuffing, turkey roll with stuffing etc.
Excludes Scotch eggs (see category
22.1).

≈10% ≈20%
1.4 Meat Pies 1.5g salt or 600mg 1.38g salt or 550mg sodium 1.13g salt or 450mg
1.4.1 Delicatessen, pork pies and sodium (maximum) (maximum) sodium (maximum)
sausage rolls Includes all delicatessen
pies, pork pies and sausage rolls e.g.
game pie, cranberry topped pork pie,
Melton Mowbray pork pie etc.
27
≈8% ≈25%
Atualmente, industrias alimentícias (que pertencem a Comunidade Européia)
têm respondido de forma positiva a redução do nível de sal em seus produtos
alimentícios.

Fabricantes de produtos cárneos vêm investindo no desenvolvimento de

metodologias alternativas para a redução da concentração de sal (NaCl)
nas comidas processadas

Vários trabalhos estão sendo desenvolvidos com este objetivo

Substituindo o máximo possível de Na+ por K+, bem como por

outros antioxidantes naturais

28
Segundo Romans et al. (2001)
Para carnes curadas a concentração de Na+ pode ser reduzida por uma mistura de
até 50:50 de NaCl com KCl, por possuir sabor aceitável.
> 50% de substituição – resulta em sabores indesejáveis resultantes do k+

Cheng et al. (2007)

Investigaram a interação da oxidação lipídica e a oxidação do pigmentos causados
pela substituição do NaCl por KCl em amostras de carnes suínas

-Foi verificado que a redução do nível de NaCl não alterou significativamente a

pigmentação durante o período de refrigeração.

-Com 50% de substituição – não houve diferenças significativas nos valores de

pH, pigmentos totais e ferro heme.

29
Objetivo

Avaliar o uso de TMAH no preparo das amostras de carnes processadas para a

determinação de Na e K por Espectrometria de Emissão Atômica com Chama
(FAES) / Propor uma metodologia simples e barata para o controle desses
elementos em amostras de carnes destinadas a exportação.

 Os resultados serão comparados através de diferentes

procedimentos de preparo de amostras;

 Através do uso de diferentes técnicas analíticas;

30
 Espectrômetro 1 (FAES1/FAAS)

 Espectrômetro de Absorção Atômica (Shimadzu) - modelo AA-6300

 Corretor de Fundo de Deutério;
 Chama ar-aceliteno foi utilizada para todas as determinações;
 Lâmpada de Cátodo Oco de Na (589.0 nm) e K (766.5 nm);

31
 Espectrômetro 2 (FAES 2)

 Fotômetro de Chama (Micronal) – modelo B462;

 Chama – Gás butano;
 Volume de amostra – 5 mL mim-1;

32
 Amostras
Amostras comerciais (Diferentes fabricantes):
 Almôndega;
 Carne Bovina Fatiada;
 Salsicha.

Tratamento das Amostras

 Inicialmente lavadas com Água Milli-Q;

 Cortadas;
 Homogeneizadas – microprocessador;
 Mantidas sob refrigeração à -16 °C em frascos de PEAD;
 Antes da análise as amostras foram descongeladas e homogeneizadas.

33
 Metodologia

Almôndega Carne fatiada Salsicha

≈ 250,0 mg de amostra moída e úmida foram tratadas e aferidas a 50 mL

Digestão Ácida Solubilização com CH2O2

2,5 mL HNO3 10,0 mL

Solubilização com TMAH
2,0 mL H2O2 Tº ≈ 50 ºC no US
400 µL de TMAH (25,0 % m/v) t=2h
T ≈ 90 ºC
º

Concentração final – 0,2% m/v TMAH

t=2h
Solubilização T° ambiente

Simples
Seguro
Reprodutível

34
 DIGESTÃO ÁCIDA

Força do ácido Poder complexante

Ponto de ebulição Segurança na manipulação

Poder oxidante Pureza

HCl, HNO3, H2SO4, HF e H3PO4; H2O2

PONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICA

Ácido Concentração P.E. (°C)

HCl 37% (m/v) 110

HF 49% (m/v) 108
HNO3 70% (m/v) 120
Água-régia (HCl:HNO3 3:1) v/v 112
H2SO4 98,3% (m/v) 338
H3PO4 85% (m/v) 150 35
 DIGESTÃO ÁCIDA

Temperaturas desejáveis para a digestão de

amostras biológicas

Decomposição com HNO3 (apresenta o menor Ponto de Ebulição)

 Altos teores de GORDURAS
(queijo, manteiga, óleo vegetal) 170 °C
 Altos teores de PROTEÍNAS
(carne bovina, soro, albumina) 150 °C
 Altos teores de CARBOHIDRATOS
(trigo, milho, áçúcar, etc.) 140 °C

36
DIGESTÃO ÁCIDA

37
 SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH

Amostras biológicas em geral podem ser facilmente solubilizadas com

TMAH em temperatura ambiente, sem a necessidade de aplicação de
energias para o aquecimento, como as microondas ou ultra-sônicas.

500 µL de TMAH (25% m/v)

~ 250 mg de
amostra seca

Solução resultante:
 Apresentam características de suspensão;
 Baixo fator de solubilização;
 Permanecendo estável durante meses
38
 Estocadas a temperatura ambiente
 SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH

INCONVENIENTES:

 Odor de amina;
 Alta viscosidade da solução;
 Otimização do procedimento de análise;
 Possíveis interferências não-espectrais

39
Resultados e Discussão

mg/g (média ± SD) (RSD)

O emprego das amostras úmidas
ou secas apresentaram resultados Amostras Secas Amostras Úmidas

de concentrações similares. Carne Bovina

K 3,25 ± 0,06 (1,8) 3,18 ± 0,06 (1,9)

250 mg da amostra moída Na 12,69 ± 0,04 (0,3) 13,67 ± 0,05 (0,4)

foram suficiente para obter Salsicha
resultados exatos e precisos
K 3,23 ± 0,11 (3,4) 3,33 ± 0,04 (1,2)

Na 29,34 ± 0,12 (0,4) 30,53 ± 0,20 (0,6)

Almôndega
K 4,86 ± 0,05 (1,0) 5,02 ± 0,10 (2,0)

Amostras tratadas Na 10,90 ± 0,13 (1,2) 10,52 ± 0,04 (0,4)

com TMAH

40
 Parâmetros de mérito para as três metodologias de preparo de amostra:

Faixa de TMAH CH2O2 HNO3

Analito Calibração
(mg L-1)
a LD a LD a LD
(mg L‑1) (µg L-1) R (mg L‑1) (µg L-1) R (mg L‑1) (µg L-1) R

K 0,2 – 0,8 0,5922 4,6 0,9986 0,5697 5,7 0,9986 0,6048 2,8 0,9989

Na 0,1 – 0,6 0,8679 1,4 0,9992 0,8004 3,6 0,9977 0,8275 1,0 0,9942

Boa Linearidade das curvas de calibração;

Sensibilidades semelhantes.

41
 Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas após
tratamento com diferentes procedimentos de preparo de amostras por FAES.
TMAH CH2O2 HNO3
Analito Amostra Ve RSD LOD Ve RSD LOD Ve RSD LOD
(mg g-1) (%) (µg g-1) (mg g-1) (%) (µg g-1) (mg g-1) (%) (µg g-1)
A 3,18±0,05 1,6 2,0 3,39±0,04 1,2 3,0 3,11±0,04 1,3 1,5

K B 3,33±0,03 0,9 3,59±0,08 2,2 3,22±0,01 0,3

C 5,02±0,10 2,0 5,70±0,03 0,5 5,21±0,03 0,6

A 13,67±0,05 0,4 0,8 14,18±0,20 1,4 2,0 13,85±0,08 0,6 0,6

Na B 30,53±0,20 0,6 31,56±0,30 0,9 30,92±0,19 0,6

C 10,52±0,04 0,4 9,98±0,10 1,0 9,68±0,16 1,6
A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.

 Das amostras de carne analisadas a salsicha foi que apresentou maior conc. de Na;

 Comparado com as metas atuais exigidas pela EU a concentração de Na nas amostras

de Salsicha é 6X maior;

 As amostras analisadas apresentaram concentrações de Na muito maior que as

informadas no rótulo;

 Exemplo: 0,68 m/g de Na (Rótulo) – 10 mg/g (Valor Encontrado).

42
Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas por FAAS
e FAES 2, após tratamento com TMAH.

FAES FAAS
Analito Amostra Ve RSD R Ve RSD R
(mg g-1) (%) (mg g-1) (%)
A 3,52±0,26 7,4 0,9966 3,21±0,17 5,3 0,9988
K B 3,47±0,02 0,6 3,27±0,05 1,5

C 5,37±0,48 8,9 5,45±0,20 3,7

A 13,63±0,54 4,0 0,9980 13,32±0,18 1,3 0,9954

Na B 31,93±0,58 1,8 29,60±0,50 1,7

C 9,82±0,16 1,6 10,69±0,05 0,5

A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.

As soluções foram
preparadas em meio de
CsCl2 (0,09% m/v)

43
 Conclusão

 As altas concentrações de Na encontradas nas amostras analisadas e a

grande discrepância nos níveis desse elemento informado em seus rótulos,
enfatizam a importância do Brasil em reduzir o teor de sal nos alimentos
processados e implementar um controle de qualidade.

O método de preparação das amostras com TMAH mostrou-se:

 Ser uma metodologia simples que fornece resultados exatos e precisos para a
determinação de Na e K por FAES;

 Empregando poucas quantidades de amostras e reagentes;

 Sendo eficiente na solubilização das amostras estudadas mesmo com um

elevado teor de gordura, o mesmo comportamento não foi observado com a
digestão ácida em copo aberto.

 Em conclusão, o procedimento desenvolvido pode substituir com sucesso os

procedimentos convencionais, pois não foram observadas diferenças
significativas com um nível de confiança de 95%.
44
 AGRADECIMENTOS

Pelo apoio financeiro e bolsas concedidas:

45
AGRADECIMENTOS

46
SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH

47