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Sumário
Conceito de esterilização
Consequências da presença de contaminantes
Aplicação dos processos de esterilização
Modos de ação dos agentes esterilizantes
Métodos de esterilização
◦ Métodos físicos
◦ Métodos químicos
Esterilização de equipamentos
Esterilização de meio
Esterilização de ar
É um processo físico ou químico que destrói ou inativa
todas as formas de vida presentes em um
determinado material, especialmente microrganismos
incluindo bactérias, fungos e vírus
Métodos Métodos
Físicos Químicos
Calor úmido
Líquidos ou gases
Calor seco
Filtração por membranas
Hipoclorito
Fenóis
Meio
Equipamento
Ar
Aplicação dos processos de esterilização
Biorreatores e tubulações • Calor úmido
Bombas, filtros, centrífugas,
misturadores, separadores, colunas • Calor úmido
cromatográficas, homogeneizadores
• Calor úmido (autoclaves)
Material de laboratório • Calor seco (fornos)
• Radiação ultravioleta
• Calor úmido
Meios de cultivo • Filtração em membranas
• Cartuchos esterilizantes
Ar • Cartuchos esterilizantes
• Radiação gama
Embalagens • Calor úmido
• Lavagem com produtos químicos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Agentes
esterilizantes
Célula microbiana
Formação de Alteração de
substâncias letais moléculas essenciais
para manutenção e
sobrevivência celular
Morte do
microrganismo
Modo de ação dos agentes esterilizantes
• Enzimas
• responsáveis pelos processos metabólicos
• Membrana citoplasmática
• que mantém a integridade do conteúdo celular, controlando o
transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo,
além de ser também o local de algumas reações enzimáticas
• Parede celular
• que proporciona rigidez e resistência mecânica aos
microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos
• Dano genético
• responsável pela codificação de alguma enzima essencial
Métodos físicos
Métodos químicos
Métodos físicos
Calor úmido
Calor seco
Irradiação UV
Radiação ionizante
Calor úmido
É um dos métodos mais efetivos para destruição dos MOs
Vapor de água saturado
Associa a temperatura elevada ao alto grau de umidade
Mata os MOs, principalmente pela desnaturação irreversível
de suas proteínas
Destruindo elementos essenciais para sobrevivência e
multiplicação celular (enzimas
enzimas e membranas celulares)
celulares
Carameliza carboidratos produzindo produtos tóxicos
Equipamento – autoclaves (vapor sob pressão)
Aplicação
◦ Tubulações
◦ Reatores vazios
◦ Reatores com meio de cultura
Calor seco
Destrói os MOs através da oxidação de seus constituintes
químicos
Mais lenta e menos eficaz que o calor úmido
Nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo
uma certa proteção às proteínas
Podendo também ocorrer a coagulação de proteínas
Equipamento – estufas, fornos (T>150ºC)
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais e sólidos
Irradiação por luz ultravioleta (UV)
É absorvida por muitas substâncias celulares, mas
significativamente pelos ácidos nucléicos,
nucléicos onde geralmente ocorre
as lesões
Seu efeito letal depende do grau de radiação aplicada
A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220–300
nm (região abiótica)
Fatores que influenciam na sensibilidade microbiana a UV
• pH, estado fisiológico da célula (fase de crescimento) e constituição
genética
Equipamento - câmara de irradiação ultravioleta
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Utensílios metálicos
◦ Embalagens
Radiação ionizante
São radiações eletromagnéticas (α, β, γ, raios X, raios catódicos e
prótons, nêutrons e elétrons de alta energia)
Causam grande variedade de efeitos físicos e bioquímicos em
MOs
Ataca a molécula de DNA levando a perda de viabilidade celular
Podendo causar mutações
Equipamento - câmara de irradiação
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais
◦ Materiais sólidos (pós, solo, alimentos, sementes, embalagens...)
Métodos químicos
Agentes líquidos – Glutaraldeído
Agentes gasosos – Óxido de etileno
Glutaraldeído
Age na superfície das células
Promove interações glutaraldeído-proteínas gerando diversos
produtos
Interferindo no transporte de aminoácidos de baixo peso
molecular
Podendo ocorrer a aglutinação celular
Ar
Ar
Vapor Vapor esterilizado
Meio de
cultura
esterilizado
121°
121°C, 1 atm Estabilização P e T
Injeção de vapor no interior do reator promovendo expulsão
de todo o ar presente
Fecha-se o reator e injeta-se vapor até a T e P adequada
(121°C, 1atm)
Terminada a esterilização injeta-se ar esterilizado para evitar
que o resfriamento (condensação do vapor) gere vácuo
Após resfriamento e estabilização na pressão o meio de
cultura esterilizado externamente é carregado
Esterilização com reatores com meio de cultura
Ar Ar Água fria
Vapor na Vapor no Vapor no na
serpentina meio meio serpentina Ar
100°
100°C
96 a 97°
97°C 100°
100°C 121°
121°C, 1 atm Resfriamento
Circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a T do meio
de cultura esteja em torno de 96 a 97°C
Injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até atingir 100°C
Fecha-se o reator, a injeção continua até que a T atinja 121°C e a
P 1 atm (mantidas através da serpentina ou camisa)
Resfriamento feito pela circulação de água fria na serpentina ou
camisa
Quando a T atingir 100°C, deve-se injetar ar no tanque para
evitar formação de vácuo pela condensação do vapor
Esterilização de reatores com meio de cultura
Serpentina interna
Serpentina interna
Jaqueta
Serpentina interna
Esterilização em autoclaves
◦ Para biorreatores de pequeno porte (até 30L)
◦ Vidrarias
◦ Meio de cultura...
◦ Modelos verticais e horizontais
◦ Geração de vapor: elétrica, a gás ou externa (caldeira)
Fermentador Vapor
Autoclave
Esterilização em autoclaves (Modo de operação)
Válvula de escape Câmara de vapor Válvula de Manômetro Válvula de controle
segurança
Ar
Resfriamento
Resfriamento Esterilização
Aquecimento
Tm
A destruição dos MOs não se
Temperatura
T mínima letal
dá somente na fase de
esterilização. Durante o
aquecimento e resfriamento, Tf
enquanto a T for superior a T T final do meio esterilizado = T de fermentação
Tempo
Vantagem
Desvantagens
Resfriamento
Aquecimento
Tm
Temperatura
T mínima letal
Tempo
Vantagens
• Microrganismo
• Gênero, espécie, linhagem, existência de esporos, idade da cultura
• Meio de cultivo
• Composição, pH, presença de sólidos em suspensão
• Temperatura
dN Modelo de Rahn
= −k ⋅ N
dt
12
t N ln N ln N = -0,0341t+ 12,163
(minutos) R² = 0,9998Ln
8
25 8,5 . 104 11,35041
ln N Série1
50 3,5 . 104 10,4631 4
Linear (Série1)
100 6,0 . 103 8,699515
200 2,0 . 102 5,298317
0
0 100 200 300
250 40 3,688879 Tempo (min)
• Cálculo do tempo de esterilização
1 N0
ln N = ln N 0 − k ⋅ t t= ln
k N
Problemas Soluções
Os meios não possuem uma única Escolha de um MO altamente resistente ao calor
espécie de MO Ex.: Bacillus stearothermophilus
k depende também do meio e da Experimentos preliminares para determinação
temperatura de k
Aproximação – k≈ 1 min-1 (a 121°C)
Células estarem em forma de -
aglomerados ou protegidas por
partículas sólidas em suspensão
Como a esterilização tem como Probabilidade de falha da esterilização (P=N)
objetivo destruir todos os MOs
vivos – N=0
• Exercício
Um dado volume de meio a esterilizar contém 2,5.1010
microrganismos vivos. O valor da constante de velocidade de
destruição térmica do microrganismo é de 3,4 min-1. Calcule os
tempos de esterilização para que as probabilidades de falha sejam
de 10%, 1% e 0,1%.
Resolução:
1 2,5.1010
Para P = 0,1(10%) t= ln = 7,7 min
3,4 0,1
1 2,5.1010
Para P = 0,01(1%) t= ln = 8,4 min
3,4 0,01
1 2,5.1010
Para P = 0,001(0,1%) t= ln = 9,1 min
3,4 0,001
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de
esterilização
N2 θ N3
• N1 – Nº inicial de células vivas 1 1
• P – Probabilidade de falha Te
• Tm – Temperatura mínima letal
Resfriamento
N1 Esterilização
P1
• Te – Temperatura de esterilização 1
• k = f(T)
Aquecimento
Tm
Temperatura
• As curvas de aquecimento e
resfriamento do meio
Tf
Ti
t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de esterilização
t2
N1 θ
•Aquecimento
N 2 ∫t1
Aquecimento ln = k A .dt N2 N3
N Te
•Esterilização
Esterilização ln 2 = ke .θ
Resfriamento
N3 N1 Esterilização
P1
t
N3 4
P t∫3
•Resfriamento
Resfriamento ln = k R .dt
Aquecimento
Tm
Temperatura
t t
N1 2 4
Ti
Tempo de esterilização
t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo
Tempo de
esterilização
N2 N3
θ
• Aquecimento e 1 1
Te
resfriamento são Esterilização
muito rápidos N1 P1
Resfriamento
Aquecimento
1
Tm
Temperatura
t t
N1 2 4
N1
ln = ke .θ Ti
P
t1t2 t3 t4
Tempo de esterilização Tempo
• Exercício (esterilização descontínua)
Um meio com 100 m3 de volume a esterilizar tem uma concentração
de microrganismos vivos igual a 7,2.109 células/litro. A temperatura
de esterilização é 120oC, a temperatura mínima letal do
microrganismo 80oC e a probabilidade de falha é 0,1%. A variação
da constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo
(min-1) com a temperatura (oC) é dada pela equação abaixo. Como
também as curvas de aquecimento e resfriamento do meio. Calcule
o tempo de esterilização deste mosto.
k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
N1=7,2.1014Células
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
θ =?
Tempo de esterilização t t
N1 2 4
• Cálculo de ke
• Cálculo de kA e kR
• A partir das curvas (A e R) e da equação de Bigelow – Tabela (t, T e k)
• Cálculo de kA e kR
• Tabelas A e R - curvas (t x k) – obtém-se as equações – integra-se
80
∫k
24
A .dt ≅ 19,40
20
∫k
0
R .dt ≅ 3,23
t t
N1 2 4
7,2 • 1014
ln = 1,6θ + 19,40 + 3,23
0,001
θ ≅ 12 min
t t
• Resolução: N1 2 4
tn
h
∫ k(t)dt ≈ 3
[ k(t0 ) + 4k(t1 ) + 2k(t2 ) + 4k(t3 ) +... + 2k(tn−2 ) + 4k(tn−1 ) + k(tn )]
t0
tn − t0
h=
n
Resolução:
t t
N1 2 4
• Aerossóis microbianos
Solo: ventos
Água: gotas d’água que se desprendem da superfície
Irrigação com efluentes de esgoto
Colheitas
Abatedouros
Criação de animais
Depósitos de resíduos
Esterilização - Ar
• Pouco utilizada
• Exige temperaturas elevadas
• Grandes tempos de esterilização
• Compressores e resfriadores
• Utilizada para pequenas instalações (laboratório e escala piloto)
• Esterilização de ar na saída de fermentações com patógenos
Esterilização – Ar
Aquecimento
Inviabilidade do processo
• Materiais filtrantes
• Carvão
• Algodão
• Papel
• Materiais fibrosos: lã de vidro
• Materiais sinterizados: vidro, metais e materiais cerâmicos
• Materiais poliméricos: membranas de náilon, teflon
• Membranas seletivas (esterilizar o ar e provocar o enriquecimento
com oxigênio) – Futuramente
Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros de materiais fibrosos (lã de vidro)