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Apoio
M
MANUAL DE MÉTODOS DE
Y
CM
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
MY
CY
CMY
DE ALIMENTOS E ÁGUA
K
5ª edição
NEUSELY DA SILVA
VALÉRIA CHRISTINA AMSTALDEN JUNQUEIRA
NELIANE FERRAZ DE ARRUDA SILVEIRA
MARTA HIROMI TANIWAKI
RENATO ABEILAR ROMEIRO GOMES
www.blucher.com.br
MARGARETE MIDORI OKAZAKI
Neusely da Silva
Valéria Christina Amstalden Junqueira
Neliane Ferraz de Arruda Silveira
Marta Hiromi Taniwaki
Renato Abeilar Romeiro Gomes
Margarete Midori Okazaki
Manual de métodos de
análise microbiológica
de alimentos e água
5ª edição
Todos os direitos reservados pela Editora Índice para catálogo sistemático internacional
Edgard Blücher Ltda. 1. Água – Análise microbiológica
2. Alimentos – Análise microbiológica
Reagente de Nitrato ISO 7937 (Mistura da solução Solução de Hipurato de Sódio . . . . . . . . . . . . . . . 530
de ácido 5-amino-2-naftalenossulfônico com Solução Iodo Desinfetante . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
solução de ácido sulfanílico) . . . . . . . . . . . . . 526 Solução de Ninidrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
Reagente de VM para Teste de Vermelho Solução de Ringer ¼ de Concentração . . . . . . . . 530
de Metila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526 Solução de Safranina 0,5% . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
Reagentes de VP para Teste de Voges Proskauer Solução Salina 0,85% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
(Solução 40% de hidróxido de potássio ou Solução Salina Formalinizada (Formalina) . . . . . 531
sódio e solução 5% de alfa-naftol) . . . . . . . . . 526 Solução de Sudan Black 0,3% . . . . . . . . . . . . . . . 531
Reagentes de VP ISO para Teste Voges-Proskauer Solução de Sulfato Ferroso Amoniacal 1% . . . . . 531
(Solução 1-naftol, solução aquosa Solução Tamponada Glicerol Sal . . . . . . . . . . . . . 531
40% hidróxido de potássio, solução Solução Tiossulfato de Sódio 3% ou 10% . . . . . . 531
de creatina) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 527 Solução de Tripolifosfato 2% . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Soluções de Ácido Clorídrico (HCl) . . . . . . . . . . 527 Solução de Verde Malaquita (Aquosa 5%)
Solução de Azul Brilhante de Coomassie . . . . . . 527 = vide Reagentes para Coloração de Esporos
Solução de Azul de Bromotimol 0,04% . . . . . . . . 527 Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
Solução de Citrato de Sódio 2% . . . . . . . . . . . . . 528 (Tampão Butterfield = Água de
Solução de Cloreto Férrico 10% . . . . . . . . . . . . . 528 Diluição Fosfato) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Soluções de Corantes e Indicadores de pH para Tampão Fosfato Conforme ISO 6887-4:2003 . . . 532
Adição em Meios de Cultura . . . . . . . . . . . . . 528 Tampão Fosfato Conforme ISO 6887-5:2010 . . . 532
Solução de Desoxicolato de Sódio 0,5% . . . . . . . 528 Tampão Fosfato com Cloreto de
Solução de Fosfato de Potássio (K2HPO4) 2% . . . 529 Magnésio (PB-MgCl2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Solução de Fosfato de Potássio (K2HPO4) 2% Tampão Fosfato Salina (PBS). . . . . . . . . . . . . . . . 533
com Antiespumante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Tampão Fosfato Salina 0,02M para Teste de
Solução de Hidróxido de Potássio Salina 0,5% . . 529 Lisostafina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Soluções de Hidróxido de Sódio . . . . . . . . . . . . . 529 Vaspar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Solução Hipoclorito de Sódio 100 ou 200 mg/l
(100 ou 200ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 534
Revisões da 5ª edição
Item 1.3.1 (revisado) A esterilização de frascos e utensílios para coleta de amostras em autoclave deve ser feita
a 121±3 ºC por 15 minutos no mínimo. Em estufas deve ser feita a 170±10 ºC por 1 hora no mínimo (ISO
7218:2007/Amd.1:2013).
Item 1.3.4 (revisado) Nas orientações da 21ª edição do Standard Methods for the Examination of Water and Was-
tewater para a coleta de amostras de água havia a recomendação de adicionar EDTA às amostras com teor alto
de metais. Essa recomendação foi suprimida na 22ª edição e também nesta 5ª edição do Manual.
Item 1.4.3 (revisado) A temperatura de estocagem de amostras sob refrigeração recomendada pela 5ª edição do
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods passa de 0 a 4,4 ºC para 0 a 4,0 ºC. O
tempo máximo de seis horas para estocagem de amostras de moluscos e crustáceos foi suprimida na 5ª edição
do Compendium e também deste Manual.
Item 1.4.5 (revisado) A temperatura de estocagem de amostras de água sob refrigeração recomendada pela 22ª
edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt, 2012) passa de 10 ºC para
8 ºC, enfatizando-se a recomendação de que essas amostras não devem ser congeladas.
ca unidade de amostra não pode ser tomado como das e obedecidas as orientações dos capítulos rela-
representativo do lote. cionados aos ensaios específicos em questão.
Nas análises de Salmonella, cujo padrão em ali- m: é o padrão microbiológico estabelecido para
mentos é ausência em qualquer das unidades de um dado microrganismo, num dado alimento. Em
amostra, é comum a prática de compor (misturar) as um plano de três classes esse valor separa um lote
unidades de amostra, para realizar um único ensaio. aceitável de um lote com qualidade intermediária
A presença na amostra composta é inaceitável, in- aceitável.
dependente de quantas ou quais unidades de amos- M: é um limite tolerável, acima do padrão, que
tra estejam contaminadas. Maiores detalhes são pode ser atingido por algumas (c) unidades de
apresentados no capítulo específico de Salmonella. amostra, mas não pode ser ultrapassado por ne-
nhuma. Em um plano de duas classes, M separa o
Planos de amostragem de lotes lote aceitável do inaceitável. Em um plano de três
Sempre que se tratar da avaliação de lotes ou par- classes, separa o lote com qualidade intermediária
tidas, a tomada das n unidades de amostra deverá aceitável do lote inaceitável.
seguir um plano de amostragem estatístico ade- c: dentre as n unidades de amostra que constituem
quado. Os mais utilizados são os planos de duas a amostra representativa do lote, c é o número má-
ou três classes estabelecidos pela International ximo de unidades que podem ser aceitas com con-
Commission on Microbiological Specifications tagens acima do padrão m, desde que não acima
for Foods (ICMSF, 2002), adotados pela Agência do limite M. Nos casos em que o padrão micro-
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). biológico é ausência, c é igual a zero e aplica-se o
O plano de duas classes classifica os lotes em plano de duas classes.
duas categorias, aceitável ou inaceitável, depen-
dendo dos resultados da análise das n unidades de Unidade analítica
amostra. É o mais aplicado no caso de ensaios de A unidade de amostra geralmente contém uma
presença/ausência, como Salmonella, por exem- quantidade de produto maior do que a necessária
plo, em que a ausência é aceitável e a presença para a análise, porque, ao se coletar uma unida-
em qualquer das n unidades de amostra é inacei- de de amostra, há sempre o cuidado de se tomar
tável. quantidades suficientes para estocagem de con-
O plano de três classes classifica os lotes em três tra-amostras e prevenção de perdas por aciden-
categorias, aceitável, qualidade intermediária mas te. Unidade analítica é a quantidade de alimento
aceitável e inaceitável. São recomendados para efetivamente utilizada na realização de um ou
ensaios quantitativos, para os quais o padrão não mais ensaios da unidade de amostra. O número
é ausência, mas sim, valores dentro de uma fai- de unidades analíticas necessárias para a análise
xa entre m e M. Os parâmetros utilizados nesses depende do número e tipos de ensaios que serão
planos, para a tomada de decisões a respeito dos realizados na mesma unidade de amostra, sen-
lotes são: do uma para os ensaios gerais de quantificação
n: é o número de unidades de amostras a serem (contagem total de aeróbios mesófilos, contagem
colhidas aleatoriamente de um mesmo lote, para de bolores e leveduras, contagem de coliformes
serem analisadas individualmente. As n unidades totais/termotolerantes/E. coli, contagem de S.
de amostra constituem a amostra representativa do aureus, contagem de B. cereus, contagem de C.
lote. Para ensaios de presença/ausência, não quan- perfringens), uma para cada ensaio de presença/
titativos (Salmonella ou Listeria monocytogenes, ausência (Salmonella, Listeria monocytogenes e
por exemplo) as unidades de amostra poderão ser todos os outros que requeiram enriquecimento em
compostas e realizada uma única análise, porém, caldo específico) e uma para cada outro ensaio
na composição das amostras devem ser consulta- que requeira tratamento diferenciado da amostra
Revisões da 5ª edição
Sem alterações.
Para a homogeneização da amostra e preparo das diluições (menores alíquotas da amostra). Para
diluições, são utilizados os procedimentos des- orientação, as diluições recomendadas para amos-
critos no Capítulo 2. Para a inoculação, a técnica tras com contaminação na faixa de 3 a 1.000/g
do NMP apresenta dois formatos, dependendo de ou ml, são a 10-1, 10-2 e 10-3. Se a contaminação
como as alíquotas são distribuídas. Um é o forma- esperada estiver acima dessa faixa, deve-se ino-
to do teste de diluição múltipla, no qual três, cinco cular diluições mais altas. Caso não seja possível
ou dez alíquotas de uma diluição são inoculadas estimar previamente o nível de contaminação da
numa série de três, cinco ou dez tubos e, depois, amostra, deve-se inocular mais do que três dilui-
uma nova série de três, cinco ou dez alíquotas, ções (pelo menos cinco), partindo-se da diluição
da diluição subsequente, são inoculadas em outra inicial. Se a contaminação estimada estiver abai-
série de tubos e assim por diante. Quanto maior xo dessa faixa, pode-se inocular volumes maiores
o número de diluições e de tubos por diluição, da amostra sem diluição (no caso de líquidos) ou
maior a precisão da contagem. Para a maioria das da primeira diluição (no caso de sólidos), aumen-
situações encontradas na análise de alimentos, tando proporcionalmente o volume de meio de
três diluições com três tubos por diluição são sufi- cultura. A proporção entre o volume inoculado e
cientes para uma boa estimativa do NMP. O outro o volume de meio de cultura recomendado pelo
formato é o do teste de diluição única, no qual Compendium (Petran et al., 2015) é: uma parte
todas as alíquotas inoculadas (geralmente cinco a da amostra ou diluição adicionada a dez partes do
dez) são de uma mesma diluição, com igual quan- caldo. Uma prática bastante comum, que mantém
tidade da amostra. essa proporção, é a inoculação de 10 ml das amos-
tras líquidas, sem diluição, em 10 ml do meio de
cultura em concentração dupla. Essa prática tam-
4.2. Teste de diluição múltipla bém é muito utilizada na inoculação da primeira
diluição de amostras sólidas. Para orientação na
O teste de diluição múltipla é o mais versátil dos
seleção das diluições pode ser consultado o Qua-
formatos da técnica do NMP, porque permite
dro 4.1, que apresenta a quantidade de amostra
abranger uma faixa ampla de concentrações dos
presente nas alíquotas de várias combinações de
microrganismos na amostra, variando-se as di-
diluições, com o limite de detecção da técnica em
luições inoculadas. O procedimento padrão é a
cada combinação. Outras combinações são possí-
inoculação de três diluições decimais sequenciais
veis, particularmente no caso de amostras líqui-
da amostra, três alíquotas por diluição ou, mais
das, que podem ser adicionadas diretamente no
raramente, cinco alíquotas por diluição e/ou cinco
caldo, como a combinação decimal 100 – 10 – 1
diluições. A técnica, entretanto, permite procedi-
ml ou a não decimal 500 – 50 –5, por exemplo. No
mentos não tão comuns, como a inoculação de um
caso de amostras sólidas as opções são mais res-
número maior de diluições decimais, um número
tritas, porque, como já mencionado anteriormen-
maior de alíquotas por diluição ou, mesmo, dilui-
te, nem todos os produtos apresentam distribuição
ções não decimais. Nesses casos o procedimento
de microrganismos homogênea para inoculação
analítico é o mesmo, mas varia a forma de cálculo
direta. Nos casos em que isso ocorre, podem ser
dos resultados. O procedimento padrão traz a van-
utilizadas as mesmas combinações dos produtos
tagem de ter os resultados apresentados em Tabe-
líquidos.
las de NMP, enquanto os não padrão requerem o
uso de fórmulas para o cálculo. A seleção do meio de cultura mais adequado
para a inoculação das alíquotas varia para cada
A seleção das diluições depende da contamina-
ensaio, em função do(s) microrganismo(s) alvo,
ção estimada da amostra, de forma a obter tubos
sendo descrita nos capítulos específicos.
positivos nas menores diluições (maiores alíquo-
tas da amostra) e tubos negativos nas maiores A verificação da presença do(s) microrganis-
Revisões da 5ª edição
Tabela 7.1 (revisada) Incluído método AOAC 2014.05.
Item 7.1.3 (revisado) Revisão bibliográfica sobre bolores termorresistentes atualizada.
Item 7.2.A (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações no método.
Item 7.2.B (novo) Incluídos métodos de plaqueamento ISO 21527-1:2008 e ISO 21527-2:2008 para contagem de
bolores e leveduras em alimentos.
Item 7.3 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem alte-
rações no método de fungos psicrotróficos.
Item 7.4 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com alte-
ração em todos os itens do método de bolores termorresistentes.
Item 7.6 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com a
seguintes alterações no método de leveduras osmofílicas:
Item 7.6.2.1 O filtro membrana de poro 0,80μm foi substituído pelo de poro 0,45μm.
Item 7.6.2.2 Foram introduzidas mais opções de diluentes para a análise.
temperatura etc.), seu efeito restritivo sobre a velo- Os fungos infecciosos raramente são associados
cidade de crescimento torna-se mais acentuado. aos alimentos, porém, certas leveduras de origem
A temperatura ótima de crescimento da maioria alimentar podem desencadear reações alérgicas
dos fungos encontra-se na faixa de 25 a 28 ºC, não e alguns bolores podem provocar infecções em
crescendo bem nas temperaturas mesófilas (35-37 indivíduos imunodeprimidos. Vários bolores pro-
ºC) e raramente nas temperaturas de bactérias ter- duzem micotoxinas, que são metabólitos tóxicos
motolerantes (45 ºC). Seu crescimento não é inco- formados durante o crescimento. Os gêneros de
mum sob condições de refrigeração (5 ºC), porém, bolores toxigênicos mais importantes são Asper-
abaixo de 10 ºC negativos os alimentos podem ser gillus, Penicillium e Fusarium.
considerados microbiologicamente estáveis.
Os bolores deteriorantes de alimentos, como quase 7.1.1. Comentários sobre os
todos os outros fungos filamentosos, exigem oxi- métodos de análise de bolores e
gênio para crescimento, podendo ser considera- leveduras totais
dos aeróbios estritos. No entanto, várias espécies
são eficientes em utilizar pequenas quantidades de A quantificação de bolores e leveduras em alimen-
oxigênio, de forma que o efeito do O2 é depen- tos é feita pelo método de contagem padrão em
dente da quantidade absoluta dissolvida no subs- placas, determinando-se o número de unidades
trato, e não da concentração presente na atmos- formadoras de colônias (UFC). O método mais
fera. Ao contrário dos bolores, muitas espécies recomendado é o plaqueamento em superfície,
de leveduras são capazes de crescer na completa para aumentar a exposição ao oxigênio e evitar
ausência de O2 e em diferentes concentrações de o “stress” causado pelo meio de cultura quente.
CO2. Isso as torna os deteriorantes mais comuns Vários meios podem ser utilizados:
de alimentos líquidos engarrafados, nos quais o O Capítulo 21 do Compendium (Ryu & Wolf-Hall,
crescimento dos bolores é limitado pela dispo- 2015) recomenda o Ágar Dicloran Rosa de Ben-
nibilidade de oxigênio. Eventualmente, algumas gala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com
espécies de bolores dos gêneros Mucor, Rhizopus, atividade de água superior a 0,95 e o Ágar Di-
Byssochlamys e Fusarium podem crescer nesses cloran Glicerol 18 (DG18), para alimentos de ati-
produtos, provocando deterioração. vidade de água menor ou igual a 0,95. O DRBC
A consistência do alimento, assim como a atmos- contém cloranfenicol, para inibir bactérias, além
fera de armazenamento, exerce uma considerável de dicloran e rosa de bengala, para restringir o es-
influência sobre os tipos de fungos que irão pro- palhamento da colônia. O DG18, além de cloran-
vocar a deterioração do produto. Em linhas gerais, fenicol e dicloran, contém também glicerol, que
as leveduras predominam em alimentos líquidos, reduz a atividade de água do meio.
porque são unicelulares e se dispersam mais facil- O Capítulo 8 do Standard Methods for the Exami-
mente em líquidos. Além disso, substratos líqui- nation of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004)
dos oferecem maior oportunidade para desenvol- recomenda o DRBC para produtos lácteos em geral
vimento de condições anaeróbias, ideais para as e o Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfeni-
leveduras fermentativas. Os bolores, ao contrário, col (YEGC) para amostras com predomínio de le-
são favorecidos por substratos sólidos firmes, em veduras ou com leveduras injuriadas pelo processa-
cuja superfície há fácil acesso ao oxigênio. Por mento. Nesses produtos o DRBC recupera menos
outro lado, essa afirmação não deve ser entendi- leveduras do que o YEGC. Para produtos não sub-
da como absoluta, sugerindo que leveduras não metidos a tratamento térmico, acidificação ou outro
possam deteriorar alimentos sólidos ou bolores tratamento que possa provocar injúrias às células,
alimentos líquidos. Simplesmente, as leveduras pode também ser utilizado Ágar Batata Dextrose
são mais competitivas em líquidos, provocando Acidificado (PDA-AC), porém, algumas bactérias
alterações percebidas mais fácil ou rapidamente. podem crescer neste meio (Taniwaki et al., 1999).
Revisões da 5ª edição
Item 10.1.1 (revisado) Taxonomia atualizada.
Item 10.1.2 (revisado) Epidemiologia atualizada.
Quadro 10.3 (revisado) Acrescentado método AOAC 2003.11.
Item 10.4.2.c (revisado) O tempo de incubação do BP passa a ser 46±2h.
Item 10.5 (novo). Adicionado método de plaqueamento ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 para contagem estafiloco-
cos coagulase positiva em alimentos.
Item 10.6 (novo). Adicionado método do NMP APHA/AWWA/WEF:2012 para Staphylococcus aureus em água.
Com base no teste de coagulase e na resistência coágulo sem participação do CRF e não é inibido
à novobiocina a 2ª edição do Bergey’s Manual of pelos anticorpos da coagulase livre. A detecção é
Systematic Bacteriology (Schleifer & Bell, 2009b) feita pelo teste de coagulase em lâmina.
divide as espécies de Staphylococcus em grupos. As principais características dos estafilococos
Os grupos mais importantes são: coagulase positivos encontram-se no Quadro
▪ Grupo S. epidermidis (incluindo S. epider- 10.1. De acordo com Schleifer & Bell (2009b),
midis, S. capitis, S. caprae, S. haemolyticus, S. aureus subsp. aureus é o patógeno mais co-
S. hominis, S. saccharolyticus, S. warneri) e mum, entre os estafilococos coagulase positivos
Grupo S. simulans (incluindo S. simulans, S. e várias cepas produzem enterotoxinas. S. aureus
carnosos), que são coagulase negativos e sus- subsp. anaerobius é encontrado em abscessos de
ceptíveis à novobiocina. carneiros e também é patogênico para caprinos.
▪ Grupo S. saprophyticus (incluindo S. sapro- Essa subspécie produz coagulase mas não produz
phyticus, S. cohnii, S. xylosus) e Grupo S. enterotoxinas. S. intermedius é patógeno oportu-
sciuri (incluindo S. sciuri, S. lentus, S. vitu- nista para cães. S. hyicus é associado à infecções
linus), que são coagulase negativos e resisten- em suínos, lesões de pele em bovinos e equinos,
tes à novobiocina. osteomielite em aves e bovinos e, ocasionalmen-
te, mastite em bovinos. S. delphini é associado à
▪ Grupo S. intermedius (incluindo S. interme-
lesões de pele em golfinhos. S. schleiferi subsp.
dius, S. delphini) e Grupo S. aureus (incluin-
coagulans é associado à otite em cães.
do S. aureus subsp. aureus, S. aureus subsp.
anaerobius), que são coagulase positivos e Dentre os estafilococos coagulase positivos S. au-
susceptíveis à novobiocina. reus, S. hyicus e S. intermedius são as espécies
associadas com intoxicações alimentares (Bennett
10.1.1.2. Os estafilococos coagulase & Hait, 2011).
positivos 10.1.1.3. Os estafilococos produtores de
Os estafilococos coagulase positivos são S. au- enterotoxinas
reus, S. intermedius, S. delphini e S. schleiferi Várias espécies de estafilococos produzem enteroto-
subsp. coagulans. S. hyicus é coagulase variável. xinas, incluindo coagulase positivos e negativos. As
Essas espécies são consideradas patógenos poten- principais características que diferenciam estas es-
cialmente sérios (Schleifer & Bell, 2009b) e, por pécies encontram-se apresentadas no Quadro 10.2.
essa razão, a produção de coagulase é considerada
uma indicação de patogenicidade entre as espé- 10.1.1.4. Staphylococcus aureus
cies de Staphylococcus. A espécie S. aureus é subdividida em duas subs-
De acordo com MacFaddin (2000), coagulase é pécies, S. aureus subsp. aureus e S. aureus subsp.
uma enzima que converte fibrinogênio em fibrina, anaerobius. As características que diferenciam es-
formando um coágulo visível. A enzima pode ser sas duas subspécies encontram-se no Quadro 10.1.
encontrada em duas formas, a coagulase ligada ou S. aureus subsp. anaerobius cresce em condições
“clumping factor” e a coagulase livre ou “clotting microaeróbicas e anaeróbicas, mas o crescimento
factor”. A coagulase livre é extracelular e reage em condições aeróbicas é fraco. Diferencia-se de
com uma substância do plasma chamada de “coa- S. aureus subsp. aureus em três características:
gulase-reacting factor” (CRF), formando um com- não produz pigmento e “clumping factor”, não
plexo coagulase-CRF. Esse complexo converte fi- fermenta o manitol em condições anaeróbicas e
brinogênio em fibrina indiretamente, produzindo não cresce a 45 ºC. A temperatura ótima de cresci-
o coágulo. A detecção é feita através do teste de mento varia entre 30 e 40 ºC, não cresce a 20 nem
coagulase em tubo. O “clumping factor”, que está a 45 ºC. Todas as cepas toleram 10% de NaCl,
localizado na superfície da parede celular, forma o a maioria não tolera 15%. O primeiro isolamento
Revisões da 5ª edição
Item 13.1.1 (revisado) Taxonomia atualizada.
Item 13.1.2 (revisado) Comentários sobre os métodos de análise atualizados.
Item 13.4.2 (revisado) Inserida etapa de confirmação e orientações sobre o cálculo de resultados.
Item 13.5 (novo) Inserido Método de filtração em membrana ISO7899-2:2000 para contagem de enterococos em
água.
são das cepas dessas espécies em novas espécies, foram descritas: S. entericus (Vela et al., 2002),
designadas como “grupo bovis” ou “complexo S. henryi e S. cabali (Milinovich et al., 2008) e
S.bovis/S.equinus” ou ainda “grupo S.bovis/S. S. danieliae (Clavel et al., 2013). O antigeno do
equinus” (Whiley & Hardie, 2009). Com base em grupo D esta presente em S. entericus e S. henryi,
estudos de hibridização DNA-DNA as linhagens mas não em S. cabali e S. danieliae.
tipo de S. bovis e de S.equinus mostraram per- Assim, o termo Streptococcus fecais atualmente
tencer ao mesmo grupo de similaridade, de for- representa estas espécies associadas ao trato in-
ma que esses dois nomes são hoje reconhecidos testinal de humanos e outros animais, cuja origem
como sinônimos, sendo S. equinus o epíteto que e nomenclatura encontram-se descritas na Tabela
tem prioridade. 13.1.
Atualmente (2016) há quatro espécies no “com-
plexo S.bovis/S.equinus”: S. equinus, S. alactoly- Características bioquímicas dos Streptococ-
ticus, S. infantarius e S. gallolyticus (subdividida cus fecais (Svec & DeVriese, 2009): Todos os
em três subspécies, gallolyticus, macedonicus e estreptococos fecais são bactérias lácticas com
pasteurianus) (Whiley & Hardie, 2009, DSMZ, metabolismo de carboidratos homofermentativo,
2016, Euzéby, 2016). O antígeno do grupo D de produzindo ácido láctico como produto final da
Lancefield é encontrado nas quatro espécies (se fermentação, sem gás. A morfologia é de cocos,
não em todas as cepas, pelo menos em algumas Gram positivos, imóveis, arranjados em cadeias.
cepas de cada espécie). Além dessas, quatro ou- Não esporogênicos, não pigmentados. Catalase
tras espécies isoladas do intestino de animais já negativos, anaeróbios facultativos. A temperatura
Tabela 13.1. Espécies do gênero Streptococcus associadas ao trato intestinal de humanos e outros ani-
mais e origem relatada.
Sinônimos Grupo
Espécie Origem (referência)
(DSMZ, 2016, Euzéby, 2016) Lancefield
Streptococcus alactolyticus Farrow et al., Streptococcus intestinalis D
Intestino de suínos e fezes de galinhas (1).
1985 (grupo bovis) (heterotypic synonym) (ocasionalmente G)
Streptococcus equinus Andrews & Horder Streptococcus bovis Fezes humanas, suínas e de ruminantes
D
1906 (grupo bovis) (heterotypic synonym) (bovinos, equinos, ovinos e outros) (1).
Fezes de vários animais incluindo marsu-
S. gallolyticus subsp. gallolyticus
piais (koala, canguru, gambá) e mamíferos
(Osawa et al., 1996) Schlegel et al. 2003 - D
(bovinos, equinos, pequenos ruminantes)
emend. Beck et al., 2008 (grupo bovis)
e outros) (1).
Streptococcus waius
S. gallolyticus subsp. macedonicus
(heterotypic syn.), Produtos lácteos e
(Tsakalidou et al., 1998) F ou não reativo
Streptococcus macedonicus indústria de laticínios (1).
Schlegel et al., 2003 (grupo bovis)
(basonym)
A linhagem tipo foi isolada das fezes
de uma criança e as outras cepas foram
Streptococcus infantarius Schlegel et al.
S. lutetiensis D ou não reativo isoladas de alimentos (produtos lácteos,
2000 (grupo bovis)
ervilhas congeladas) e de espécimes clíni-
cos (sangue e um caso de endocardite) (1).
Isolado das fezes e do intestino de um
Streptococcus entericus Vela et al. 2002 Nova espécie D bezerro com enterite, mas o habitat é
desconhecido (1).
Streptococcus caballi Milinovich et al. Isolado do reto de cavalos com laminite
Nova espécie -
2008 equina induzida por oligofrutose (3).
Streptococcus henryi Milinovich et al. Isolado do reto de cavalos com laminite
Nova espécie D
2008 equina induzida por oligofrutose (3).
Streptococcus danieliae Clavel et al. 2013 Nova espécie Não reativo Isolado do intestino de ratos (2)
Referências: 1) Whiley & Hardie (2009), 2) Clavel et al. (2013), 3) Milinovich et al. (2008).
Revisões da 5ª edição
Item 16.1.2 (revisado) Epidemiologia atualizada.
Item 16.1.3 (revisado) Ecologia atualizada.
Quadro 16.1. Características bioquímicas de Cronobacter spp. e outras enterobactérias (Iversen et al., 2007).
Espécie α-GLI VP ADH ODC SAC RAF CEL ARA CIT VM ADO SOR LDC H2S
Cronobacter spp. + + + + + + + + + - - - - -
Buttiauxella agrestis v - - + - + + + + + - - - -
Citrobacter koseri - - v + v - + + + + + + - -
Citrobacter freundii - - v - v v v + v + - + - +
Edwardsiella tarda - - - + - - - - - + - - + +
Enterobacter aerogenes - + - + + + + + + - + + + -
Enterobacter asburiae - - v + + v + + + + - + - -
Enterobacter cancerogenus - + + + - - + + + - - - - -
Enterobacter cloacae - + + + + + + + + - v + - -
Enterobacter georgoviae - + - + + + + + + - - - + -
Enterobacter hormaechei - + v + + - + + + v - - - -
Enterobacter pyrinus v v - + + - + + - v - - + -
Enterobacter helveticus + - - - - - + + - + - - - -
Enterobacter turicensis + - - - - - + + - + - - - -
Escherichia coli - - v v v v - + - + - + (+) -
Hafnia alvei (-) (+) - + - - (-) + - v - - + -
Klebsiella pneumoniae (-) + - - + + + + + - + + + -
Kluyvera spp. v - - + + + + + (+) + - v v -
Leclercia adecarboxylata - - - - v v + + - + + - - -
Morganella morganii - - - + - - - - - + - - - (-)
Pantoea spp. - v - - v v v + v v - v - -
Proteus vulgaris + - - v (+) - - - v v - - - +
Providencia spp. - - - - v - - - v + v - - v
Rahnella aquatilis - - v - + + + + (-) - - + - -
Raoultella terrigena - + - (-) + + + + v v + + + -
Salmonella sv. - - v (+) - - v (+) v + - v (+) v
Serratia marcescens v + - + + - - - + (-) v + + -
Yersinia enterocolitica - - - + + - v + - + - + - -
α-GLI = produção da enzima α-glicosidase, VP = Voges Proskauer, ADH = arginina dehidrolase, ODC = ornitina descarboxilase, SAC = ácido a partir de saca-
rose, RAF = ácido a partir de rafinose, CEL = ácido a partir de celobiose, ARA = ácido a partir de arabinose, CIT = utilização do citrato, VM = vermelho
de metila, ADO = ácido a partir de adonitol, SOR = ácido a partir de sorbitol, LDC = lisina descarboxilase, H2S = produção de sulfeto de hidrogênio.
+ = 90 a 100% das cepas positivas, (+) = 80 a 90% das cepas positivas, v = 20 a 80% das cepas positivas, (-) = 10 a 20% das cepas positivas, - = menos de 10%
das cepas positivas.
Quadro 16.2. Características bioquímicas das espécies de Cronobacter spp. (Iversen et al., 2008).
C. dublinensis C. dublinensis C. dublinensis
C. Cronobacter C.
Características a C. sakazakii C. turicensis subsp. subsp. subsp.
malonaticus genosp. 1 muytjensii
dublinensis lactaridi lausannensis
Indol b - - - - + + + v
Dulcitol c - - + + + - - -
Lactulose + + + + + + + -
Malonato d - + + v + + - -
Maltitol + + + + - + + -
Palatinose + + + + v + + +
Putrescina + v + v + + + v
Melezitose - - + - - + - -
Turanose + + + v v + v -
myo-Inositol c v v + + + + + -
cis-Aconitato + + + + v + + +
trans-Acontitato - + - + v + + +
1-0-metil-α-D-
+ + + + - + + +
glicopiranosídeo
4-Aminobutirato + + + v + + + +
+ = 90 a 100% das cepas positivas, v = 20 a 80% das cepas positivas, - = menos de 10% das cepas positivas.
a Dados obtidos usando o Biotype 100 System (BioMérieux) com o Biotype Medium 1, exceto quando especificada outra condição.
b Usando reagente de Kovacs após crescimento em caldo triptona.
c Dado obtido usando o Biolog Phenotype MicroArray (Biolog).
d Usando o Caldo Malonato Fenilalanina.
Revisões da 5ª edição
Item 19.1.1 (revisado) Taxonomia e nomenclatura atualizadas.
Item 19.1.4 (revisado) Epidemiologia atualizada.
Quadro 19.4 (atualizado) Inseridos métodos AOAC 2009.03, 2013.01, 2013.02, 2013.09 e 2014.01.
Item 19.2.2.a (corrigido) Na nota a.2 o procedimento diferenciado é para cacau, não para coco.
Item 19.3 (revisado) A versão de dezembro de 2007 do método BAM/FDA foi substituída pela versão de agosto
de 2016, com as seguintes alterações:
Item 19.3.2.a (revisado) Alterado procedimento para preparação de amostras de ovos (Notas a.4.1 e a.4.2,
Quadro 19.6).
Item 19.4 (revisado) A versão de fevereiro de 2008 do método mlG/FSIS/USDA foi substituída pela versão de
janeiro de 2017, com as seguintes alterações:
Item 19.4.2.a (revisado) Alterado procedimento para preparação das amostras.
Item 19.4.2.b (corrigido) No enriquecimento seletivo em TTH, transferir 0,5±0,05 ml da amostra enriquecida
para 10 ml (não 100 ml) de Caldo Tetrationato Hajna (TTH).
b) Em 1980 foi publicada a “Approved Lists sinônimos de Salmonella enterica subsp. en-
of Bacterial Names” (Skerman et al., 1980), terica. A requisição foi negada porque incluía
que objetivou rever todos os nomes de espé- o reconhecimento de uma única espécie no
cies bacterianas existentes e estabelecer uma gênero Salmonella (uma questão taxonômica)
lista com aqueles considerados válidos. Essa o que ultrapassava as atribuições da comissão
lista foi publicada e colocada em vigor em judicial (restrita à questões de nomenclatura)
01/01/1980. A partir desta data a citação dos (Grimont et al., 2000). Ainda assim, o uso do
nomes mantidos na lista deveria ser feita com nome Salmonella enterica disseminou-se entre
destaque (geralmente em itálico) e qualquer os bacteriologistas, mesmo não tendo sido va-
proposta de nome publicada fora do Interna- lidado (Euzéby, 2016b).
tional Journal of Systematic and Evolutionary e) Em 2005 a Comissão Judicial resolveu se
Microbiology (IJSEM), periódico oficial de ta- manifestar sobre o assunto, emitindo a Opi-
xonomia bacteriana, só seria considerada vali- nião Judicial 80 (Judicial Commission of the
da após ser reconhecida pelo IJSEM, em uma International Committee on Systematics of
lista publicada periodicamente com os nomes Prokaryotes, 2005), que tratava de várias no-
validados. O gênero Salmonella foi incluído vas requisições resultantes da requisição ini-
na lista de 01/01/80 com cinco espécies: Sal- cial de Le Minor & Popoff. A comissão decidiu
monella choleraesuis, Salmonella enteritidis, que o epíteto enterica deveria ser conservado
Salmonella typhi, Salmonella typhimurium e sobre todos os anteriores e que as subspécies
Salmonella arizonae (Euzéby, 2016b). e novas combinações de nomes propostas por
c) Com base em estudos de DNA, Le Minor et al. Le Minor & Popoff (1987) deveriam ser con-
(1982, 1986) consideraram que todas as cepas sideradas válidas. No entanto, a comissão não
de Salmonella existentes constituíam uma úni- rejeitou, concomitantemente, o epíteto chole-
ca espécie (Salmonella choleraesuis), com sete raesuis, gerando uma situação problemática,
subspécies: S. choleraesuis subsp. arizonae, S. ou seja, após a Opinião Judicial 80, existem
choleraesuis subsp. bongori, S. choleraesuis dois sistemas de nomenclatura de Salmonella,
subsp. choleraesuis, S. choleraesuis subsp. ambos igualmente válidos (Quadro 19.1): o
diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, sistema “velho” (ou seja, nomes validamen-
S. choleraesuis subsp. indica e S. choleraesuis te publicados antes da publicação do parecer
subsp. salamae. Posteriormente Reeves et al. Judicial 80) e o sistema “novo” (ou seja, no-
(1989) elevaram a subspécie bongori à catego- mes validamente publicados em consequência
ria de espécie. O nome Salmonella bongori e das conclusões Judicial 80). Os dois sistemas
os outros seis nomes das subspécies de S. cho- podem ser usados, mas o “velho” tem sido
leraesuis propostos por Le Minor continuam abandonado por um número crescente de orga-
válidos (Euzéby 2016a,b). nizações (Euzéby, 2016b), incluindo o “World
d) Em 1987 Le Minor & Popoff (1987) submete- Health Organization Collaborating Center for
ram uma solicitação à “Judicial Commission Reference and Research on Salmonella”, o
of the International Committee on Systemati- “Center for Disease Control and Prevention”
cs of Prokaryotes” propondo substituir epite- (CDC) e a “American Society for Microbio-
to choleaesuis pelo epíteto enterica no nome logy” (ASM) (Ellermeier & Slauch, 2005). Os
das sete subspécies de Salmonella, porque o nomes dos sorotipos não são mais considera-
epíteto choleraesusis também era usado na de- dos como nomes de espécies e, portanto, não
nominação de um sorotipo. Eles também re- devem ser impressos em itálico. Somente os
quisitaram que os nomes Salmonella cholerae- sorotipos de S. enterica subsp enterica conti-
suis, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi e nuam recebendo nomes (geralmente referên-
Salmonella typhimurium fossem considerados cias geográficas), enquanto os das outras su-
Revisões da 5ª edição
Item 22.1.1 (novo) Incluída revisão bibliográfica sobre as características dos esporos bacterianos.
Item 22.1.2 (revisado) Taxonomia atualizada.
Item 22.2 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
Item 22.3 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
Item 22.4 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
Item 22.5 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
Item 22.6 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
Item 22.7 (2010) Excluídos métodos APHA (2001) para a detecção ou contagem de Alicyclobacillus.
que é semelhante para Bacillus e Clostridium. um espaço substancial. Sua forma varia de uma
Fase 0 é a célula vegetativa. Fase I é a formação espécie para outra e sua função é desconhecida.
de um filamento axial da cromatina, com duas có-
Mecanismos de resistência do esporo. Nichol-
pias do cromossomo. Fase II é a divisão celular
son et al. (2000) fizeram uma revisão sobre os
assimétrica, para formar uma célula maior (célula
mecanismos de resistência dos esporos, que ainda
mãe ou esporângio) e uma célula menor (pres-
não são bem compreendidos. A genética é extre-
poro ou foresporo). Fase III é engolfamento do
mamente importante para a resistência ao calor: os
presporo pela célula mãe. Fase IV é a formação
esporos de termófilos são mais resistentes do que
do córtex, com duas camadas de peptidoglicano
os esporos de mesófilos, que por sua vez são mais
em torno da presporo, e a formação da parede das
resistentes do que os esporos de psicrófilos. As
células germinativas primordiais (que irão formar
condições de esporulação também têm um efeito
a camada de peptidoglicano de uma nova célula
significativo, particularmente a temperatura, uma
após a germinação). Fase V é a construção da
vez que esporulação a uma elevada temperatura
capa, uma estrutura complexa de proteínas na su-
resulta em esporos com maior resistência ao calor.
perfície exterior do presporo. Depois que o córtex
O teor de água do núcleo parece estar inversamen-
e a capa são formados o presporo desidrata e ad-
te relacionado com a resistência dos esporos ao
quire sua aparência brilhante. Fase VI é a matura-
calor. A capa parece impedir o acesso de enzimas
ção, quando o esporo adquire sua refratividade e
capazes de lizar o peptidoglicano do córtex e pro-
resistência plena.
teger contra o peróxido de hidrogênio e a radiação
Estrutura do esporo. Driks (2004) descreveu a UV. As SASPs parecem proteger o DNA do calor
estrutura dos esporos de Bacillus, que é composta e de danos oxidativos. Logan & De Vos (2009b)
de várias camadas concêntricas. A camada interior também fazem referência ao ácido piridina-2-6-
é o núcleo, onde está localizado o cromossomo. dicarboxilico, também chamado de ácido dipico-
O núcleo é preenchido com pequenas proteínas línico (DPA), um componente único dos esporos,
solúveis em ácido (small acid-soluble proteins - que compreende 5-14% do peso seco. O Ca 2+ e
SASP), que saturam o DNA e mantém o material outros cátions divalentes estão quelados ao DPA,
genético num estado cristalino estável. As SASPs mas o seu papel exato na resistência de esporos
são sintetizadas apenas durante a esporulação e ainda é incerto.
são degradadas quando a germinação do esporo
Germinação. Logan & De Vos (2009b) descre-
começa. Ligam-se ao DNA e alteram as proprieda-
veram o mecanismo de germinação no gênero
des conformacionais e químicas da molécula, que
Bacillus, que envolve três etapas: ativação, ger-
se torna menos reativa a vários produtos químicos.
minação e crescimento. A ativação pode ser con-
Em redor do núcleo há uma membrana lipídica e, seguida por aplicação de calor (tempo e tempera-
em seguida, uma camada espessa de peptidoglica- tura subletais para o microrganismo) ou por enve-
no especializado, o córtex, o que difere do pepti- lhecimento em baixa temperatura. Os esporos de
doglicano normalmente encontrado na parede ce- várias espécies não requerem o passo de ativação,
lular. O córtex é responsável pela baixa atividade mas os métodos para o isolamento de esporos em
de água do esporo. alimentos sempre usam o calor, para destruir as
Rodeando o córtex há a complexa estrutura de células vegetativas.
proteína da capa, em várias camadas, que serve de A germinação pode ser induzida por exposição
barreira contra a entrada de grandes moléculas tó- a nutrientes como aminoácidos e açúcares, por
xicas e desempenha um papel na germinação. Os misturas destes, por não-nutrientes (dodecilami-
esporos de B. anthracis e de algumas outras espé- na, por exemplo), por enzimas e por alta pressão
cies de Bacillus possuem uma camada adicional, hidrostática. Para muitas espécies, L-alanina é um
o exosporium, que é separada do revestimento por germinante importante, enquanto a D-alanina atua
Revisões da 5ª edição
Item 25.1 (revisado) Atualizado procedimento de descontaminação de resíduos contaminados conforme a ISO
7218:2007/Amd.1:2013.
Item 25.4 (revisado) Atualizado procedimento de esterilização conforme a ISO 7218:2007/Amd.1:2013.
Item 25.6.1 (revisado) Atualizado procedimento de verificação de limpeza da vidraria conforme a ISO 7218:2007/
Amd.1:2013.
Item 25.6.2.b (revisado) Indicadores biológicos - o ideal é que sejam utilizados em cada batelada.
a limpeza de utensílios que não permitem a intro- te, deve-se seguir as recomendações do fabri-
dução de escovas (como pipetas, por exemplo), cante do detergente aplicado.
ou para a remoção de resíduos mais resistentes c) Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar
à ação dos detergentes. Nesses casos, pode ser os frascos e demais utensílios, lembrando de
utilizada a solução alcoólica 1N de hidróxido de remover também as anotações de lápis e cane-
sódio. tas dermatográficas e vidrográficas. Não con-
O enxágue dos utensílios deve ser feito de forma seguindo uma boa limpeza (principalmente
a garantir a completa remoção dos resíduos de do material que não pode ser esfregado com
detergente ou solução alcoólica de hidróxido de escovas), mergulhar em solução alcoólica 1N
sódio utilizados. Os resíduos desses compostos de NaOH e deixar de molho por alguns minu-
podem interferir com os resultados das análises, tos a algumas horas, dependendo da aderência
tanto por alteração das características dos meios do material a ser removido. Proteger as mãos
de cultura, como por inibição do crescimento dos com luvas de borracha e utilizar pinças de aço
microrganismos. Como detergentes e soluções inoxidável para manusear o material de molho
de limpeza apresentam uma forte afinidade pelas em solução de NaOH.
superfícies da vidraria e demais utensílios (razão c.1) Preparo da solução alcoólica 1N de hi-
pela qual são eficientes no deslocamento da sujei- dróxido de sódio. Adicionar e dissolver, aos
ra), sua completa remoção exige seis a doze en- poucos e cuidadosamente, 40g de NaOH em
xágues sucessivos em água corrente, seguidos de um béquer com 100 ml de água destilada,
um a vários enxágues em água destilada. colocado dentro de um banho de água fria.
Cuidado: A dissolução da soda libera uma
Procedimento para a lavagem quantidade significativa de calor e a solução
a) Remover todo o material descontaminado pre- obtida é extremamente caústica. Aguardar o
sente nos frascos e utensílios, antes de iniciar resfriamento e completar o volume para um
a lavagem. Meios de cultura sólidos devem litro com etanol 96%.
ser removidos das placas com uma espátula e, d) Enxaguar todo o material em água corrente,
quando contidos em tubos e outros frascos de por seis a 12 vezes sucessivas, enchendo e
boca estreita, devem ser aquecidos, fundidos e esvaziando totalmente os frascos. Enxaguar
vertidos na pia. em seguida com água destilada ou deionizada
b) Mergulhar todo o material em solução deter- várias vezes (Taylor & Perez, 2015). No caso
gente e deixar de molho por duas horas ou um de pipetas, recomenda-se recorrer ao auxílio
pouco mais, dependendo do grau de aderência de um lavador de pipetas, mantendo cada ba-
do material a ser removido. Fazer uma pré-la- telada sob enxágue contínuo, por pelo menos
vagem dos frascos e utensílios em água cor- uma hora.
rente, para evitar a introdução de excesso de
matéria orgânica nas bacias de lavagem (esse
material pode deteriorar-se e desenvolver odor 25.3. Acondicionamento
desagradável na água do molho). Os tubos de
Durham devem ser colocados de molho em Atenção: as recomendações deste item, bem
frasco separado, resistente ao calor, e subme- como as do 25.4 (esterilização), referem-se aos
tidos à ação do vapor fluente por 15 minutos, frascos e utensílios vazios. Material com meios
para remoção dos resíduos de meio de cultura. de cultura, diluentes e reagentes devem ser prepa-
As pipetas devem ter o algodão do bocal re- rados, acondicionados e esterilizados seguindo as
movido antes do período de permanência de orientações do Capítulo 26 e Anexo 1.
molho. Para a preparação da solução detergen-
Revisões da 5ª edição
Ágar/Caldo Acetamida (correção): Vermelho de fenol = 1 ml da solução 1,2%; pH = 7,0±0,2.
Ágar Azul de Toluidina DNA (correção): Cloreto de cálcio anidro = 1,1 mg.
Ágar Baird-Parker (alteração): preparação da solução de telurito de potássio e da emulsão de gema de ovo.
Caldo Dextrose Púrpura de Bromocresol (alteração): preparação e concentração da solução de púrpura de bro-
mocresol e quantidade adicionada ao meio.
Ágar Gentamicina Tálio Carbonato Fluorogênico (alteração) na formulação e preparação.
Ágar Lisina Arginina Ferro (correção) esterilizar 12min a 121 ºC.
Ágar Lisina Ferro (correção) esterilizar 12min a 121 ºC.
Ágar Lisina Ferro Duplamente Modificado (alteração) introduzidos equivalentes comerciais da base completa
e do suplemento.
Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (correção) esterilizar 15min a 121 ºC e estocar a solução de polimixina
B no escuro a 4 ºC.
Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (alteração) usar 80 ml de solução D-Cicloserina 0,5% para 900 ml de base.
Ágar Vermelho Violeta Bile (complementação) na forma de preparação do meio.
Ágar Vermelho Violeta Bile com Glicose (complementação) na forma de preparação do meio.
Reagentes para Coloração de Gram (substituído) pela formulação de Hucker.
*Não incluído na formulação do Difco & BBL Manual. Ágar Azul de Toluidina DNA
Preparação. Dissolver os ingredientes, fundir o
ágar (se presente) e esterilizar a 121 ºC/15min. Referência(s): BAM (FDA, 2015a).
Equivalentes comerciais. APT Agar (ACUME- Aplicação. Meio para confirmação de S. aureus
DIA 7302), APT Agar (DIFCO 265430), APT (teste de DNase termoestável), método APHA
Agar (MERCK 1.10453), APT Broth (DIFCO 39.61/62/63:2015.
265510). Composição
Cloreto de
Cloreto de sódio (NaCl) 10g 1,1 mg
cálcio anidro
Ágar APT Acidificado TRIS (hidroximetil-
6,1g Ágar 10g
aminometano)
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Ácido deoxirribonucléico
0,3g Água purificada 1 litro
rello, 2015), p. 894. (DNA)
Azul de o-toluidina 0,083g pH 9,0±0,2
Aplicação. Meio para isolamento de bactérias lá-
ticas, método APHA 19.52:2015, é usado como Preparação do meio. Dissolver 6,1g do Tris em
sobrecamada do MRS para a contagem de bacté- um litro de água purificada e ajustar o pH em 9,0.
rias lácticas deteriorantes em molhos para saladas. Adicionar os demais ingredientes, exceto o azul de
Preparação. Preparar o meio adicionando ácido o-toluidina, aos 1.000 ml de Tris, dissolver e aque-
tartárico (solução aquosa 10%, esterilizada a 121 cer até a completa fusão do ágar. Dissolver o azul
ºC/15min) ao Ágar APT estéril, fundido e resfria- de o-toluidina no meio. Distribuir em frascos com
do, até que o pH chegue a 4,0±0,2. as tampas bem rosqueada, para evitar a evapora-
ção. Não é necessário esterilizar se for usado ime-
diatamente. Estéril (121 ºC/15min) pode ser esto-
Ágar APT BCP 2% Sacarose cado por até quatro meses à temperatura ambiente
e utilizado mesmo após várias etapas de fusão.
Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto- Preparação das lâminas ou placas para o teste
rello, 2015), p. 894. de DNAse. Fundir o meio e verter 3 ml sobre uma
Aplicação. Meio para isolamento de bactérias lá- lâmina de vidro limpa e seca, distribuindo bem
ticas, método APHA 19.52:2015, é usado para para recobrir toda a superfície. Aguardar a solidi-
contar bactérias lácticas deteriorantes em carnes. ficação e, com o auxílio de pipetas de Pasteur ou
Preparação. Preparar o meio adicionando 20g de tubos capilares, fazer até 12 cavidades de aproxi-
sacarose e 0,032g de BCP (púrpura de bromocre- madamente 2mm de diâmetro no meio, removen-
sol, 2 ml da solução aquosa 1,6%) a um litro de do o ágar das cavidades por aspiração. Alternati-
APT, antes da esterilização. vamente, o meio pode ser distribuído e perfurado
C
Apoio
M
MANUAL DE MÉTODOS DE
Y
CM
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
MY
CY
CMY
DE ALIMENTOS E ÁGUA
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5ª edição
NEUSELY DA SILVA
VALÉRIA CHRISTINA AMSTALDEN JUNQUEIRA
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