Processos Endocíticos e Exocíticos nas Sinapses

Faria, Joaquim; Loureiro, Mónica; Menezes, Ana; Santos, Cristiana

Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências da Universidade de

Lisboa, PORTUGAL

Resumo:

A libertação de neurotransmissores e a transmissão de informação por sinapse química

requer todo um conjunto de endocitoses e exocitoses coordenadas. Quando um potencial de
acção chega a uma terminação nervosa, o Ca2+ flui para dentro desta através de canais de
cálcio dependentes de voltagem, dando origem à libertação de neurotransmissores por
exocitose das vesículas sinápticas. Paralelamente, ocorre uma renovação do número de
vesículas sinápticas existentes no terminal nervoso por endocitose. Este processo permite criar
um pool de vesículas para que, aquando da chegada de um novo potencial de acção, possa
ocorrer nova libertação de neurotransmissores. A maquinaria celular envolvida desempenha
um papel crucial no funcionamento deste processo. A calmodulina e a sinaptotagmina são
ambas sensores de cálcio, sendo que a primeira actua nos processos endocíticos e a segunda
nos exocíticos. O complexo de proteínas SNARE funciona como mediador da exocitose
sináptica, ao passo que a sinaptofisina é necessária para que a endocitose ocorra de modo
eficiente. Outras proteínas, como as Rab e o complexo exocisto, também exercem funções
importantes no decorrer da estimulação neuronal. Todo este ciclo é desencadeado pelo cálcio:
por um lado, este exerce um efeito regulador de retroacção negativa dos processos
endocíticos; por outro, é este que dá origem à fusão das vesículas sinápticas por activação da
sinaptotagmina.

Introdução:

A transmissão por sinapse química representa a principal forma de comunicação

neuronal entre células e está na base de todas as funções do sistema nervoso, desde a
percepção sensorial à memória. O processo inicia-se com a libertação de uma substância
transmissora do neurónio pré-sináptico, como consequência de um potencial de acção. Segue-
se a difusão desta substância ao longo da fenda sináptica extracelular que, posteriormente, se
vai ligar a receptores localizados na membrana da célula pós-sináptica e induzir, assim,
alterações nas propriedades eléctricas da mesma. Uma sinapse química de vertebrados
particularmente bem estudada é a junção neuromuscular.

São os processos endocíticos nos terminais nervosos que possibilitam a existência de

um pool de vesículas para a libertação de neurotransmissores a partir de um terminal pré-
sináptico. Após ocorrer a libertação de neurotransmissores, é necessário que o número de
vesículas no terminal nervoso seja renovado, para que novas vesículas estejam disponíveis em

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quantidade suficiente na ocorrência de um novo potencial de acção. Deste modo, é garantida
uma libertação eficiente do neurotransmissor.

A percepção da possível existência de dois tipos de endocitose remonta aos anos 70,
altura em que se iniciaram os estudos sobre a renovação das vesículas nos terminais nervosos.
Desde aí tem-se vindo a tentar perceber as diferenças entre os dois modelos endocíticos: a
endocitose mediada por clatrina e a endocitose do tipo kiss and run. As diferenças entre
ambos estão relacionadas não só com o mecanismo envolvido, como também com o local de
acção – locais activos ou nas proximidades –, e ainda com o tipo de proteínas envolvidas em
cada um dos processos, requerendo a endocitose mediada por clatrina uma maior maquinaria
proteica do que a de tipo kiss and run (Morgan J. R. et al., 2002).

Um outro processo fundamental para a transmissão sináptica é a exocitose, que define

a fusão de vesículas com a membrana plasmática da célula com consequente libertação dos
seus conteúdos. Este mecanismo constitui o passo final da via de secreção que se inicia,
geralmente, no retículo endoplasmático, passa pelo complexo de Golgi e termina no exterior
da célula. Tem como funções a adição de membrana extra e dos seus constituintes à
membrana plasmática, a partir das membranas das vesículas e, ainda, a libertação dos
conteúdos das mesmas no espaço extracelular (Lin & Scheller, 2000). A exocitose diferencia-se
em duas vias: exocitose constitutiva, que visa a manutenção dos constituintes da membrana
plasmática e do ambiente extracelular, ocorrendo na ausência de sinais externos; e exocitose
regulada que, ao contrário da anterior, não só é limitada a células que desempenham funções
mais específicas, como também se dá em resposta a certos estímulos, tal como o aumento da
concentração de cálcio (Lin & Scheller, 2000). É a partir deste tipo de exocitose que se dá a
libertação dos neurotransmissores nas sinapses.

A fusão exocítica de vesículas envolve a formação de um poro de fusão, canal este que
atravessa ambas as membranas plasmática e vesicular, e possibilita a libertação do conteúdo
para o exterior da célula. Todo este processo, desde a formação e transporte das vesículas
sinápticas à sua fusão, pode ser dividido em cinco passos: trafficking; tethering; docking;
priming e fusion. A maquinaria molecular interveniente é, de igual modo, de extrema
importância, e inclui pequenas GTPases das subfamílias Ral, Rab e Rho, que regulam os
processos da formação, tráfego e fusão de vesículas; o complexo exocisto, que participa no
encaminhar das vesículas para as zonas específicas de fusão na membrana plasmática; e as
proteínas SNARE, fundamentais na fusão vesicular. É a interacção entre estes dois últimos
intervenientes, SNAREs e exocisto, que permite a fusão das membranas nos domínios alvo da
membrana plasmática da célula, durante o processo de exocitose.

Neste artigo fazemos uma abordagem geral acerca dos processos endocíticos e
exocíticos fundamentais nas sinapses, descrevendo as variedades de mecanismos existentes
ao explorarem-se as diferenças fisiológicas que levam à ocorrência de cada. A importância e
modo de regulação da maquinaria molecular é outro tópico essencial, destacando-se as
proteínas sinaptofisina e calmodulina no caso da endocitose, e as SNAREs e sinaptotagmina na
exocitose. O papel fundamental do cálcio na regulação destes mesmos processos e, ainda, os
vários passos em que se desenrolam são igualmente desenvolvidos. Em suma, tentámos que o

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nosso trabalho fosse o mais útil possível para a compreensão do tema como um todo e que
abordasse uma grande variedade de assuntos dentro da Bioquímica.

Introdução histórica:

As primeiras demonstrações de endocitose em terminais sinápticos foram realizadas

no início dos anos 70 por Heuser e Reese e pelo grupo de Ceccarelli. Nestes estudos, os
terminais sinápticos eram estimulados vigorosamente, de modo a conseguir causar o maior
número possível de fusão das vesículas com o terminal pré-sináptico. O que se observou foi
que, apesar de o número de eventos exocíticos ter sido muito elevado, apenas se deu uma
eliminação parcial do número de vesículas. Esta observação levou a concluir que o número de
vesículas no pool deve ter sido renovado de modo a responder à actividade exocítica. Porém,
apesar de ambos os grupos usarem métodos idênticos e o mesmo tipo de sinapses, foram
obtidas diferenças nos resultados referentes aos tempos, local e identidades moleculares.

Enquanto o grupo de Heuser e Reese defendia que a endocitose ocorria a partir de

vesículas revestidas, de modo relativamente lento e com ocorrência distante dos locais activos
das sinapses, o grupo de Ceccarelli defendia que não era necessária a formação de vesículas
revestidas, sendo o processo relativamente rápido e ocorrendo nas zonas activas.

No final dos anos 70 e 80, a investigação por parte de ambos os grupos incidiu nos
tempos envolvidos no processo, tendo sido também realizada em paralelo alguma
investigação sobre o local de acção no neurónio. Nos anos 80, outros grupos começaram
também a desenvolver estudos nesta área, tendo sido nos anos 90 que houve uma maior
incidência em estudos sobre a importância relativa de cada tipo de endocitose e as condições
que os favorecem, os mediadores proteicos requeridos para cada um dos modelos e os passos
do processo endocítico em que estão envolvidos. (Morgan J. R. et al., 2002).

Quanto ao processo de exocitose, os primeiros estudos começaram a ser

desenvolvidos na década de 50, maioritariamente ao nível neuronal, com a transmissão de
sinapses químicas. Por essa altura surgiu a ideia de se explicar a libertação de acetilcolina,
observada na junção neuromuscular, com a existência de vesículas sinápticas (Fatt & Katz,
1952). Contudo, os avanços iniciais nesta área, com recurso a técnicas como a electrofisiologia
e microscopia electrónica, foram sucedidos por um período de estagnação, tendo as mesmas
atingido todo o seu potencial.

Com o avançar dos anos, sobretudo por volta da década de 90, foram surgindo novas
técnicas para a medição e controlo da concentração pré-sináptica de cálcio com o uso de
corantes fluorescentes e compostos fotossensíveis que se ligam ao Ca2+, bem como o
aparecimento de métodos para simular a difusão do mesmo no neurónio pré-sináptico. Foram
também desenvolvidas novas técnicas para monitorar a secreção, tais como medições da área
da membrana pré-sináptica através da sua capacitância e, ainda, da absorção e libertação com
corantes fluorescentes em vesículas endocitadas (Zucker R, 1996), bem como a aplicação da
engenharia genética e biologia de membranas a proteínas que participam não só na fusão de
vesículas sinápticas, como também em outros passos do tráfego das mesmas (targeting,

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docking e priming). Modificações a cada um destes passos podem alterar a força das conexões
sinápticas e participar assim na plasticidade sináptica (Lin & Scheller, 2000).

A técnica de patch clamp permitiu, entretanto, a análise electrofisiológica de tecidos

outrora inacessíveis. Desta forma, o processo de exocitose foi sendo sucessivamente elucidado
ao longo dos anos, estabelecendo-se agora como uma nova fronteira na investigação biológica
(Zucker R, 1996).

Processos Endocíticos:

1- Comparação entre endocitose rápida (“Kiss and run”) e endocitose lenta (mediada por
clatrina):

- Diferenças de mecanismo de acção, mediadores proteicos, local de acção no neurónio,

rapidez de acção:

Existem dois tipos de processos endocíticos com características distintas nas sinapses,
a endocitose mediada por clatrina e a endocitose rápida denominada por kiss and run.

Pelo tipo de endocitose kiss and run as vesículas apenas se fundem de modo
transiente e incompleto com a membrana plasmática, por meio de formação de um poro de
pequenas dimensões (Granseth B. et al., 2007), sendo posteriormente recuperadas quase
instantaneamente como estruturas intactas a partir da zona activa (Jung N. & Haucke V.,
2007).

Por outro lado, a endocitose mediada por clatrina, ocorre após fusão completa da
vesícula com a membrana, sendo um mecanismo bastante mais lento e que necessita da
presença de várias proteínas acessórias que se ligam à membrana antes de ocorrer a
endocitose (Zhu Y. et al., 2009). Ainda em contraste com a endocitose do tipo kiss and run, a
endocitose mediada por clatrina vai ocorrer não nas zonas activas, mas sim nas suas
proximidades (Brodin L. et al., 2000) (Morgan J. R et al., 2002).

Verificou-se que os dois processos de endocitose ocorrem em locais diferentes nos

terminais sinápticos. Enquanto que a endocitose rápida é observada nas zonas activas, a
endocitose mediada por clatrina ocorre em regiões usualmente conhecidas por zonas
periactivas que rodeiam as zonas activas e estendem-se cerca de um micrometro para além do
limite destas (Brodin L. et al., 2000).

Nestas zonas activas onde vesículas estão prontas para ser libertadas durante a
exocitose, também é observada a endocitose kiss and run, que acontece imediatamente após
a abertura do poro de fusão durante a exocitose, sendo recuperada a membrana da vesícula
sem a necessidade de recorrer a uma maquinaria mais complexa. Sendo então nas zonas
periactivas onde se concentra toda a maquinaria necessária para a endocitose mediada por
clatrina (Jarousse N. et al., 2001).

Na endocitose mediada por clatrina, a formação de uma vesícula revestida é um

processo altamente cooperativo e sob forte controlo regulatório, podendo dividir-se em 4

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 fases: recrutamento do revestimento de clatrina, maturação, fissão da vesícula e libertação do
revestimento.

Fig. 1 - Representação esquemática das várias fases da endocitose mediada por clatrina e respectivas imagens por
microscopia electrónica. (Slepnev & Camilli, 2000).

Os componentes do revestimento das vesículas servem principalmente para formar

uma membrana curva. São estes a clatrina, que reveste toda a vesícula, a AP-2, (AP – adaptor
protein) que associa a clatrina à membrana lipídica, e a AP-180, que deverá estar envolvida na
regulação do tamanho das vesículas e também possui domínios de reconhecimento de outras
proteínas.

Proteínas acessórias como a epsina, a sinaptotagmina e a endofilina vão sendo

recrutadas à medida que a invaginação aumenta de tamanho e de curvatura ajudando assim à
sua maturação. Antes da fissão a invaginação adopta uma conformação característica em que
existe um estrangulamento da membrana por acção da dinamina, julga-se que vai
constringindo ou esticando esta região da membrana até que finalmente se rompa e dê
origem a uma vesícula revestida de clatrina.

Poucas são as vesículas com o revestimento de clatrina que são detectadas em

terminais sinápticos o que leva a presumir que estas são rapidamente destituídas da sua
camada exterior. Pensa-se que a auxilina e a sinaptojanina tenham uma grande importância
neste processo afectando a estabilidade das ligações entre clatrina e AP-2 facilitando a
remoção destes (Takei K. & Haucke V., 2001).

Os mecanismos inerentes à endocitose rápida kiss and run, ainda não são totalmente
compreendidos e foram menos estudados do que o outro tipo de endocitose.

Estudos recentes indicam que os dois tipos de endocitoses são regulados pela mesma
cascata de sinalização cálcio/calmodulina/calcineurina e apontam para uma necessidade da
dinamina para que qualquer endocitose possa ser realizada. Estas observações revelam que
são partilhados mecanismos semelhantes nas fases de iniciação e de fissão evidenciando
também que a endocitose rápida não necessita de uma maquinaria proteica tão complexa pois
as vesículas já não precisam de se libertar de um revestimento intrincado como as
provenientes de uma endocitose lenta (Sun T. et al., 2010).

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 Em diversos estudos, em que se utilizaram métodos de capacitância (Morgan J. R. et
al., 2002), sondas fluorescentes (Ryan T. A. et al., 1995) e técnicas de imagem óptica (Granseth
B. et al., 2007), foram obtidas escalas de tempos distintas para os processos endocíticos,
existindo resultados numa escala de tempo entre 1 e 5 segundos, enquanto noutros casos era
observada uma escala de tempo entre 30 a 60 segundos (Ryan T. A. et al., 1995). As diferenças
entre os valores obtidos foram interpretadas como pertencentes a dois mecanismos
endocíticos com cinéticas diferentes (Granseth B. et al., 2007).

Com o intuito de perceber qual a importância relativa de cada um dos mecanismos

durante o processo endocítico, foram realizados estudos utilizando sondas fluorescentes como
a FM 1-43, de modo a conseguir acompanhar a renovação de vesículas sinápticas, em
neurónios do hipocampo de ratinhos (Ryan T. A. et al., 1995). Chegou-se à conclusão de que
quando é usado 5% do pool de vesículas no processo exocítico, as vesículas são recuperadas
por um mecanismo lento de endocitose, com um tempo médio de 40 segundos. Aumentando
o número de vesiculas exocitadas para cerca de 25%, a recuperação deu-se pelo mesmo
mecanismo, apesar de, nos primeiros 5 segundos, se ter observado uma pequena aceleração.
Outros autores (Wu W. et al., 2005) observaram ainda que, mesmo em casos de elevada
estimulação, quando a concentração de cálcio começa a diminuir, é observada uma maior
prevalência do processo endocítico lento face ao modelo kiss and run.

Posteriormente foram feitos estudos em que, contrariamente ao referido

anteriormente, se induziram despolarizações de membrana intensas e repetidas, tentando
simular situações de actividade neuronal intensa (Wu W. et al., 2005). Constatou-se que, sob
estas condições, o tipo de endocitose rápida kiss and run apresenta um papel dominante face
à endocitose mediada por clatrina.

O facto da endocitose kiss and run ser activada durante elevada estimulação é de
grande importância fisiológica, uma vez que, nestas condições, ocorre a fusão de um elevado
número de vesículas, o que pode levar à alteração da estrutura dos terminais nervosos. Deste
modo, é sugerido por alguns autores (Wu XS. & Wu LG., 2009) que a endocitose do tipo kiss
and run, activada durante uma estimulação rápida, é importante para manter a estrutura
normal dos terminais nervosos por recuperação das vesículas que se fundiram com a
membrana.

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 Fig. 2 - Visão geral dos passos envolvidos na endocitose mediada pela proteína clatrina com respectivas
proteínas intervenientes em cada passo. Os passos estão numerados segundo a ordem sequencial em que
ocorrem na mediação. Interacções proteína-proteína e proteína-lípido desempenham um papel fundamental na
nucleação do revestimento. (PIP2, Fosfatidilinasitol 4,5-bifosfato.) (Takei & Haucke, 2001)

2- Exemplos de reguladores proteicos:

-Sinaptofisina

A sinaptofisina é a proteína maioritária das vesículas endocíticas sinápticas,

constituindo cerca de 10% de todo o seu material proteico. Em estudos em ratinhos com
knockout da sinaptofisina (Know E. & Chapman R., 2011), observou-se que esta não é
necessária para que a endocitose ocorra, continuando a dar-se libertação sináptica mesmo na
sua ausência e não se observando alterações morfológicas nas vesículas. Porém, verificou-se
que a sua presença é necessária para que a endocitose ocorra de modo eficiente, tanto
durante como após a estimulação neuronal contínua.

Uma vez que os processos endocíticos durante e após estimulação são diferentes,
foram realizados estudos (Know E. & Chapman R., 2011) com o intuito de perceber se a
sinaptofisina regula ambos os processos do mesmo modo. Para isso, os autores focaram-se na
porção C-terminal, da sinaptofisina, que faz ligação à dinamina I (proteína que se pensa ser
responsável por mediar a fissão de vesículas durante a endocitose). Chegou-se à conclusão de
que esta região C-terminal é importante para a endocitose que ocorre durante mas não após a
transmissão sináptica. O que está de acordo com o facto de a sinaptofisina apenas recrutar a
dinamina I para a formação de vesículas na presença de concentrações de Ca2+ intracelular
relativamente elevadas (Daly C. et al., 2000). Estas observações indicam que diferentes
domínios da sinaptofisina estão envolvidos no controlo da endocitose, dependendo se esta
ocorre durante ou após estimulação.

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 Foram realizados estudos com o intuito de perceber a função do complexo
sinaptofisina/dinamina I na regulação dos processos endocíticos (Daly C. et al., 2000). Para
perceber a importância do complexo, os autores bloquearam a interacção das duas proteínas.
Após um minuto de estimulação contínua, observou-se uma forte diminuição da libertação de
sinal durante a ocorrência de potenciais de acção. Os autores concluíram que o impedimento
da interacção da sinaptofisina com a dinamina I resulta numa diminuição da disponibilidade de
vesículas para se dar a exocitose, durante períodos de elevada frequência de estimulação, o
que está de acordo com resultados de artigos posteriores (Know E. & Chapman R., 2011).

Porém, foi observado que bloqueando o complexo apenas a endocitose rápida, kiss
and run, diminuía. O que está de acordo, mais uma vez, com o facto de a sinaptofisina apenas
se ligar à dinamina I na presença de concentrações de cálcio relativamente elevadas.

Para além de se ligar com a dinamina I a sinaptofisina forma ainda um complexo com a
sinaptobrevina nos terminais nervosos. A interacção entre as duas proteínas ocorre na região
transmembranar da sinaptofisina, tendo sido observado que esta interacção ocorre nos
terminais nervosos em repouso e diminui com o aumento de cálcio intracelular, ao contrário
do que ocorre com a interacção com a dinamina I, sendo que a porção citosólica C-terminal
não é necessária para esta interacção.

É então possível concluir que a presença da proteína sinaptofisina é necessária para

que o processo endocítico ocorra de modo eficaz nos terminais nervosos, tanto no caso da
endocitose mediada por clatrina como na endocitose do tipo kiss and run. É ainda possível
verificar que cada tipo de endocitose apresenta interacções com proteínas diferentes,
utilizando para isso domínios distintos. A sinaptofisina é possivelmente controlada pelos níveis
intracelulares de cálcio, uma vez que para valores elevados se observa uma interacção da
sinaptofisina com a dinamina I e uma tendência para diminuir a ligação com a sinaptobrevina,
contrariamente ao que se observa para baixas concentrações de cálcio intracelulares.

- Calmodulina

No processo de endocitose, tanto a forma rápida como a lenta, é dependente da

concentração de iões Ca2+ e dependente do sensor calmodulina sendo este sensor muito
importante para o estímulo endocítico.

A calmodulina (CALcium MODULated proteIN) é uma proteína que é sensível aos níveis
de cálcio. É composta por 2 domínios globulares ligados por uma hélice α muito flexível, cada
um dos domínios das extremidades é capaz de estabelecer ligações com 2 iões de cálcio, tendo
a capacidade de se ligar a 4 iões de Ca2+ no total.

Usando medições de capacitância é possível concluir que o bloqueio do complexo

2+
Ca /calmodulina inibe a taxa de endocitose, na sequência de um impulso de despolarização
associado a um grande fluxo de iões Ca2+, no entanto, não existe efeito em resposta a
estímulos mais fracos (Yao L. & Sakaba T., 2012).

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 Em modelos que se assemelham à capacidade de uma sinapse não perturbada, a
calmodulina é essencial para o recrutamento rápido de vesículas após um impulso, sem
influenciar a taxa de endocitose (Yao L. & Sakaba T., 2012).

Alguns autores (Wu XS. et al., 2009) sugerem que a calmodulina é o principal sensor de
2+
Ca na endocitose, sendo os resultados de L. Yao e T. Sakaba consistentes com esta hipótese.
Os resultados sugerem ainda que a presença de calmodulina aumenta a taxa de endocitose,
numa relação de dependência com a actividade, mas sem no entanto ser necessária a sua
presença para a ocorrência de endocitose. Dado que a endocitose não é completamente
bloqueada pela ausência de calmodulina têm de existir outros sensores, ainda por identificar,
que também estimulem este processo. Estes resultados coincidem também com a ideia de que
o complexo cálcio/calmodulina modela a capacidade endocítica, à semelhança do papel de
Ca2+ em culturas de neurónios do hipocampo (Balaji J. et al., 2008).

Após a exocitose, o desimpedimento da zona activa é uma acção de pós-fusão, que

pode afectar a cadeia de acções a montante. A inibição de calmodulina bloqueia o
recrutamento de vesículas sinápticas para o pool de libertação rápida e também a remoção de
membrana (Wu XS. et al., 2009). No entanto a relação entre os dois processos permanece
indeterminada.

Foram sugeridas duas possibilidades para o papel da calmodulina no recrutamento de

vesículas sinápticas. Por um lado, a calmodulina pode actuar um passo antes da exocitose,
aumentando a taxa de activação (priming) de vesículas sinápticas, tendo como consequência o
aumento do recrutamento de vesículas sinápticas para o pool de libertação rápida. A outra
possibilidade sugere a acção da calmodulina entre a fase de exocitose e endocitose, antes da
fissão de vesículas, passos intermédios como a remoção de materiais das zonas activas, o seu
transporte e também a formação de depressões revestidas de clatrina, mas a possível
interacção da calmodulina com tais processos não pode ser detectada por estudos de
capacitância pois só conseguem detectar a fissão de membrana ficando-se por enquanto sem
saber todas as possibilidades da implicação real por parte da calmodulina (Yao L. & Sakaba T.,
2012).

Processos Exocíticos:

1 – A exocitose e os seus diferentes tipos e mecanismos:

Podemos definir o processo de exocitose como a fusão de uma vesícula secretora

intracelular com a membrana plasmática da célula. Todas as células eucarióticas dependem
deste processo para o seu crescimento e diferenciação, uma vez que é o único mecanismo
pelo qual uma célula consegue adicionar membrana extra à sua membrana plasmática. A
exocitose é considerada como um dos principais meios de comunicação química entre
neurónios.

É possível distinguir-se dois tipos de exocitose, a chamada constitutiva e a regulada

que, ao contrário da outra, é accionada por Ca2+. A exocitose constitutiva diz respeito a todas
as fusões nas quais vesículas são formadas, transportadas e exocitadas de forma contínua, sem

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sofrerem regulação a curto prazo. Um exemplo importante é o transporte de proteínas, tais
como receptores, que desempenham a sua função na membrana plasmática. Por outro lado, a
exocitose regulada geralmente requer o armazenamento de membranas percursoras em pools
intracelulares especializados, a partir dos quais são mobilizadas com a activação de cascatas de
sinalização. A composição destas membranas geralmente é diferente da relativa à membrana
plasmática. Este tipo de exocitose permite, ainda, uma entrega controlada de produtos de
secreção como proteínas ou neurotransmissores, ou então a incorporação regulada de
constituintes especializados da membrana plasmática, como transportadores e canais. A
exocitose regulada é, na maioria dos casos, accionada por segundos mensageiros em resposta
à activação dos receptores ou à despolarização da membrana, sendo o cálcio o mais comum
(Jahn R, 2004). As sinapses são um bom exemplo deste tipo de exocitose, com a secreção de
neurotransmissores aquando da fusão de vesículas secretoras com a membrana plasmática,
dependente de Ca2+.

Para além da classificação referida, pode-se ainda definir dois mecanismos diferentes
quanto à fusão de vesículas exocíticas na membrana plasmática. Desta forma, através do dito
mecanismo clássico apresenta-se a fusão completa ou de tudo ou nada onde, ao nível de
sinapses, uma vesícula funde-se com a membrana pré-sináptica e liberta o seu conteúdo para
a fenda. A membrana da vesícula é depois reciclada. Alternativamente, uma vesícula sináptica
pode formar um poro de fusão transiente na membrana pré-sináptica e libertar apenas parte
do seu conteúdo. Neste mecanismo de exocitose, designado por kiss and run, a vesícula é
depois reutilizada. Células com vesículas de maiores dimensões utilizam primariamente a
exocitose por fusão completa, e apenas ocasionalmente por kiss and run. Dentro deste último
processo há ainda que diferenciar modos de libertação do conteúdo das vesículas, tais como
eventos simples, onde uma pequena vesícula sináptica forma um poro de fusão na membrana
pré-sináptica e liberta o seu conteúdo na fenda, afastando-se de seguida da membrana, e
eventos mais complexos, que ocorrem quando o poro de fusão se intercala rapidamente entre
uma forma aberta e uma fechada, permitindo repetições da libertação parcial do conteúdo da
vesícula (Wightman & Haynes, 2004).

Fig. 3 - Representação dos dois mecanismos de fusão exocítica na membrana plasmática da célula: (a) fusão
completa, na qual a membrana da vesícula sináptica é reciclada após a libertação dos neurotransmissores, e kiss
and run, com secreção através de um poro de fusão transiente, dividindo-se este último em eventos simples (b)
e complexos (c). (Wightman, R.M. & Haynes, C.L., 2004).

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 A partir de estudos realizados por Bruns e Jahn (1995) observou-se que pequenas
respostas, presumivelmente originadas pela fusão de vesículas pequenas, se deveram à
libertação de cerca de 5 000 moléculas em 100 μs, o que sugere uma abertura rápida de um
poro de fusão. Quanto a respostas maiores, originadas estas possivelmente pela fusão de
vesículas grandes e densas, levaram à libertação de cerca de 80 000 moléculas por um poro
que, inicialmente, se abriu da mesma forma como o do caso anterior, mas agora com uma
dilatação progressiva. Não é ainda muito claro se, na maioria das situações, este poro volta a
fechar ou se se dilata de todo, resultando numa fusão completa (Zucker R, 1996).

A vantagem da exocitose por kiss and run assenta no facto de, e sabendo que o
processo de reciclagem de vesículas pelo compartimento endossomal é relativamente lento,
esta levar a uma maior longevidade de uma vesícula sináptica. No caso de neurónios do
mesencéfalo, o uso eficiente de vesículas é necessário devido a um número relativamente
pequeno de vesículas sinápticas ai presentes. Especificamente falando do processo de kiss and
run complexo, este pode apresentar-se como uma forma mais económica de exocitose, sendo
assim vantajoso no caso da existência de poucas vesículas carregadas (Wightman & Haynes,
2004).

Em relação às vesículas secretoras, estas apresentam um aspecto variável consoante o seu

conteúdo. Assim, as vesículas que contêm acetilcolina, glicina, GABA ou glutamato são
pequenas e claras, enquanto que as que contêm catecolaminas são pequenas e densas, e
ainda as que contêm neuropéptidos apresentam-se como grandes e densas. Atendendo a esta
classificação, as vesículas participam em funções neuronais distintas e a sua exocitose é
desencadeada por diferentes padrões de estimulação.

2 – A via exocítica:

A libertação regulada de neurotransmissores controla a comunicação neuronal e está

na base de todas as funções do sistema nervoso. Para que tal aconteça, as vesículas vão sendo
transportadas por compartimentos até atingirem a membrana plasmática, através de um
processo composto por vários passos. Cada um destes envolve a cisão da vesícula do
compartimento dador, sendo posteriormente levada para um compartimento aceitador. Neste
dá-se o docking e fusão da vesícula e o seu conteúdo ou é libertado ou transformado. Estes
vários passos vão-se repetindo até que o conteúdo atinja a membrana plasmática.

A via exocítica envolve o movimento das vesículas para a região subplasmalemal da

célula, onde são situadas e ancoradas em locais de libertação na membrana plasmática. Nesse
momento há a conversão para um estado no qual o conteúdo se encontra pronto para ser
libertado, passando por processos de priming dependentes de ATP e dá-se, por fim, a fusão de
membranas com a consequente libertação do conteúdo das vesículas (Burgoyne & Morgan,
2003).

Podemos assim separar o processo da exocitose em cinco passos fundamentais:

trafficking; tethering; docking; priming e fusion. O primeiro, relativo ao tráfego vesicular,
envolve a migração das vesículas até à membrana plasmática. O citoesqueleto e várias

- 11 -
 proteínas motoras facilitam este processo. Assim que as vesículas chegam às zonas activas
estabelecem a primeira interacção com a membrana plasmática à qual se irão fundir, para que
assim sejam dirigidas para essas zonas. Este é definido como o passo seguinte, no qual se
formam ligações com uma certa distância entre a vesícula e a superfície da membrana, tal
como se de pesca se tratasse. Estas interacções estão envolvidas na concentração de vesículas
sinápticas numa sinapse. O docking ocorre quando as vesículas, após a primeira interacção
com a membrana, são ancoradas a esta através de uma proteína ou complexo proteico. Os
processos de tethering e docking antecedem a formação do complexo SNARE, que se
encontrará descrito na secção 4. De seguida, a exocitose de vesículas sinápticas dá-se num
processo constituído por dois passos, um primeiro de priming que inclui todos os rearranjos
moleculares e modificações dependentes de ATP de proteínas e lípidos, seguido pela rápida
fusão de membranas desencadeada pelo influxo Ca2+ e libertação, quase instantaneamente,
dos neurotransmissores. É importante referir que, o processo de priming só ocorre na
exocitose regulada.

Fig. 4 - Vias de transporte nos terminais nervosos. As vesículas sinápticas preenchidas com neurotransmissores ficam
armazenadas no citoplasma até serem translocados para as zonas activas, onde atracam (docking). O priming envolve
todos os passos necessários para que o complexo exocítico fique pronto para libertar os neurotransmissores. Após
exocitose, as proteínas das vesículas encontram-se em clusters, sendo recuperadas por endocitose. Apesar de algumas
controvérsias, pensa-se que esta recuperação ocorre, geralmente, por endocitose mediada por clatrina. Após o
desencapsulamento da clatrina, as vesículas sinápticas são regeneradas dentro do terminal nervoso, passando
provavelmente por um intermediário endossomal. (Jahn et al., 2012)

3 – Maquinaria molecular e estruturas envolvidas:

O processo de exocitose de vesículas sinápticas é controlado por toda uma maquinaria

celular proteica, sendo esta conservada de organismo para organismo. As proteínas SNARE
(soluble NSF-attachment receptor) são componentes essenciais desta maquinaria, juntamente
com o ATPase NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor), a sinaptotagmina, a classe de proteínas
Rab (proteínas G e seus efectores), o complexo exocisto e as SM (Sec1/Munc18-like) ou nSec1
(homólogo neuronal da proteína Sec1 de levedura, também designada como Munc18). Muitos

- 12 -
outros factores que interagem com as proteínas SNARE têm sido estudados, como as
complexinas, VAP33 e as sinaptofisinas.

3.1 Proteínas SNARE

As proteínas SNARE foram as primeiras moléculas a ser identificadas como mediadores

do processo sináptico. Originalmente descobertas como as proteínas sinápticas sinaptobrevina
(ou VAMP, vesicle-associated membrane protein), sintaxina e SNAP-25, verificou-se mais tarde
que também actuam como receptores para proteínas solúveis envolvidas no tráfego do
complexo de Golgi. Estudos realizados com proteínas tipo-SNARE requeridas para a secreção
em leveduras indicaram que estas desempenham uma função comum a todos os tráfegos de
membrana (Sudhof & Rizo, 2011). Apesar de, geralmente, se encontrarem localizadas num
mesmo compartimento de membrana, as proteínas SNARE encontram-se subdivididas em dois
grupos: as associadas especificamente a vesículas (v-SNARE), às quais corresponde a
sinaptobrevina, e as localizadas na membrana alvo (t-SNARE), que incluem a SNAP-25 e a
sintaxina.

Fig. 5 - Estrutura do núcleo do complexo sináptico SNARE. O complexo é formado por quatro hélices α paralelas:
domínio H3 da sintaxina, domínio coiled-coil da VAMP, hélice aminoterminal da SNAP-25 e hélice carboxiterminal
da SNAP-25. (Lin et al., 2000)

A sequência de aminoácidos destas proteínas sugere que estas exercem um papel na

ancoragem e fusão de vesículas. As SNAREs estão associadas à membrana através de um
domínio transmembranar único e todas possuem uma ou mais hélices α capazes de formar
coiled-coils (ou motivos SNARE) (Jahn & Fasshauer, 2012).

As SNAREs passam por um ciclo regulado de assemblagem/desassemblagem,

catalisado pelo ATPase NSF. Quando entram em contacto, estas proteínas (v- e t-SNARE)
associam-se em hélice α no chamado complexo trans-SNARE, que leva à aproximação das duas

- 13 -
membranas envolventes. Esta assemblagem é acompanhada por uma grande libertação de
energia, que é utilizada para dar início à fusão das membranas. Após fusão, o complexo
ternário SNARE assume a sua configuração de energia mais baixa e é dissociado pelo NSF,
juntamente com o seu cofactor SNAP. A sinaptobrevina é depois endocitada e reciclada, de
modo a que possa ser utilizada noutro ciclo exocítico.

3.2 Proteínas SM (Sec1/Munc18):

Outro componente obrigatório da maquinaria envolvida na exocitose das vesículas

sinápticas é a família de proteínas SM (ou Munc18/nSec1). São proteínas citosólicas com cerca
de 600 resíduos de aminoácidos que actuam lado a lado com as SNAREs (Sudhof & Rizo, 2011).

Sec1/Munc18 liga-se à sintaxina, dando origem ao complexo sintaxina/Munc-18, o

qual se pensa que preceda e/ou regule o priming vesicular, um processo mediado pelas
diferentes proteínas SNARE. Munc18-1, um membro da família de proteínas SM, promove
directamente a estabilidade da sintaxina na exocitose sináptica. Estudos mostraram que a
ausência desta proteína nas vesículas sinápticas causa perda total da actividade exocítica (Jahn
& Fasshauer, 2012).

Enquanto que estas proteínas são claramente indispensáveis na exocitose das

vesículas sinápticas, a sua função no processo de fusão ainda não está completamente claro. A
eliminação de Munc18 em células de rato elimina por complexo a libertação de
neurotransmissores, mas não surte qualquer efeito no docking das vesículas. Tal facto sugere,
então, que esta proteína actua apenas após docking (Li & Chin, 2003). Em mamíferos, estudos
revelaram que a Munc18 interage selectivamente com a sintaxina-1 na sua conformação
fechada, uma conformação que previne a interacção desta SNARE com as restantes. Mais
recentemente, foi proposto que a Munc18 pode ter um comportamento semelhante a um
chaperone, na maneira em que regula a transição da sintaxina-1 entre a sua conformação
fechada e aberta, tornando assim possível a formação do complexo SNARE, em conjunto com
outras proteínas, como é o caso das GTPases Rab3, descritas mais adiante (Li & Chin, 2003).

3.3 Sinaptotagminas

As sinaptotagminas são proteínas intrínsecas da membrana constituídas por múltiplos

domínios, responsáveis por inúmeras interacções moleculares, dos quais se destacam dois
domínios citoplasmáticos C2. A sinaptotagmina-1 (syt1) está localizada nas v. Dentro deste
último processo há ainda que diferenciar modos de libertação do conteúdo das vesículas, tais
como eventos simples, onde uma pequena vesícula sináptica forma um poro de fusão na
membrana pré-sináptica e liberta o seu conteúdo na fenda, afastando-se de seguida da
membrana, e eventos mais complexos, que ocorrem quando o poro de fusão se intercala
rapidamente entre uma forma aberta e uma fechada, permitindo repetições da libertação
parcial do conteúdo da vesícula e é quem aí desencadeia a exocitose induzida por cálcio. Os
seus dois domínios C2, C2A e C2B, inserem-se na membrana após ligação ao cálcio, iniciando-
se assim o processo de fusão (Sascha Martens et. al, 2007).

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Fig. 6 - Estrutura cristalina dos domínios C2A e C2B da syt1 humana [número de acesso no Protein Data Bank: 2R83].

Na presença de cálcio, a syt1 liga-se aos fosfolípidos membranares a partir de ambos

os domínios C2. O domínio C2A da sinaptotagmina liga três iões Ca2+, ao passo que o C2B liga
apenas dois. Para além disso, a ligação desta proteína ao cálcio parece originar a rápida
penetração dos seus domínios nas membranas lipídicas em processos de exocitose rápida.
Estas propriedades levam a crer que a sinaptotagmina funciona como uma máquina sensível a
cálcio que se liga a fosfolípidos, de modo a promover a fusão de vesículas sinápticas, através
da aproximação das duas membranas intervenientes (Li & Chin, 2003). Para além dos
fosfolípidos, a sinaptotagmina-1 pode ainda interagir com outras moléculas de uma forma
dependente de Ca2+, incluindo outras sinaptotagminas, sintaxina-1, SNAP-25, complexo SNARE
e canais de cálcio.

As sinaptotagminas pertencem a uma família de proteínas de ligação ao cálcio

específicas de eucariotas complexos, expressas principalmente nos neurónios. A não existência
destas proteínas em leveduras sugere que não fazem parte da maquinaria celular básica
conservada de tráfego de membrana. Tal como referido anteriormente, a sinaptotagmina-1
representa um derradeiro sensor de Ca2+ em mecanismos de exocitose sináptica desencadeada
por cálcio (Li & Chin, 2003). A ausência deste grupo de proteínas leva à perda de exocitose
rápida; por outro lado, o facto do processo sináptico continuar a ocorrer por exocitose lenta,
sugere que existem outras proteínas de ligação ao cálcio envolvidas, como diferentes
isoformas de sinaptotagminas ou proteínas relacionadas (por exemplo, Doc2) (Jahn &
Fasshauer, 2012).

3.4 Proteínas Rab:

As proteínas Rab pertencem a uma família de pequenas GTPases monoméricas que

participam no transporte de vesículas. Estas proteínas foram inicialmente descobertas em
levedura, onde foram identificadas como reguladoras de eventos de tráfego intracelular. Em
humanos, existem cerca de 60 proteínas Rab diferentes, das quais a Rab3 é a que se encontra

- 15 -
directamente envolvida na exocitose regulada de neurotransmissores e hormonas (Li & Chin,
2003).

Estas proteínas têm um papel importante na especificidade do transporte vesicular. Tal

como as SNAREs, cada uma possui uma distribuição característica nas membranas celulares e
estão presentes na superfície citosólica de todos os organelos. A sua principal função na
exocitose sináptica passa pela regulação de vários níveis do tráfego vesicular, incluindo a
mobilidade, o docking e a fusão das vesículas (Li & Chin, 2003). Muitas vesículas
transportadoras só se formam se um tipo específico de proteína Rab e SNARE estiverem
acopladas à sua membrana, permitindo assim que a vesícula se funda correctamente.

O ciclo de hidrólise e ligação do GTP está directamente relacionado ao ancoramento

vesicular. Como todas as outras GTPases, as proteínas Rabs deslocam-se entre a membrana
celular e o citosol. Mais especificamente, um enzima chamada GDI catalisa a troca de GDP,
ligado ao Rab citosólico, por GTP, o que leva a alterações conformacionais na Rab que
permitem que ela se ligue a uma proteína membranar da vesícula de transporte. Após fusão, o
GTP ligado à Rab é, então, hidrolisado, sofrendo novamente mudanças na sua conformação,
sendo posteriormente libertado no citosol para que o ciclo se repita novamente.

As diversas acções das Rab são mediadas pelos seus efectores, que normalmente
interagem com a conformação activa destas proteínas (ligadas ao GTP) A Rab3 têm, pelo
menos, cinco potenciais efectores, dos quais os mais importantes são a rabfilina e a RIM (Li &
Chin, 2003). A rabfilina é uma proteína associada às vesículas sinápticas, que participa nos
processos exo-endocíticos nas sinapses. No caso da RIM, esta proteína está localizada nas
zonas activas e liga-se especificamente à Rab na sua forma activa, de modo a prevenir a
hidrólise precoce. Esta multiplicidade nos efectores pode reflectir diferentes acções das Rabs
em compartimentos de membrana distintos, bem como apoia a, já referida, coordenação de
inúmeras etapas do tráfego vesicular por parte destas proteínas. Alguns estudos sugerem
ainda que as proteínas Rab são necessárias para a assemblagem das v-SNARES e das t-SNARES
e, consequente, formação do complexo SNARE (Morten Sogaard et al,1994).

3.5 O complexo exocisto:

Um dos componentes participantes da maquinaria geral de fusão é o exocisto, um

complexo necessário para os passos finais da exocitose, quer constitutiva, quer regulada. A sua
função é dirigir a vesícula para domínios específicos da membrana plasmática no passo inicial
do docking, também designado por tethering, e localiza-se especificamente em zonas de fusão
vesicular, sugerindo assim a sua importância na definição das mesmas. O exocisto é composto
por oito proteínas: Sec3p, Sec5p, Sec6p, Sec8p, Sec10p, Sec15p, Exo70p e Exo84p. Foi, ainda,
primeiramente identificado em levedura e, a partir de estudos nesse mesmo organismo,
sugeriu-se que o exocisto actua antes da formação do complexo SNARE e depois do Sec4p, um
GTPase Rab que se encontra associado a vesículas secretoras e é necessário para a exocitose
(Li & Chin, 2003).

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 O complexo exocisto, no caso da levedura, apresenta o componente Sec15p a interagir
directamente com a forma do Sec4p ligada a GTP, interacção esta que, juntamente com as
interacções proteína-proteína no complexo, controla o docking inicial das vesículas secretoras
às zonas de fusão (Li & Chin, 2003). Outros membros da família Rho de pequenos GTPases,
como o Rho1, Rho3 e Cdc42 interagem também com os componentes Sec3p e Exo70p do
exocisto, encontrando-se o primeiro associado à membrana plasmática.

No mamífero, o exocisto interage com a sintaxina 1 neuronal pertencente às Q-

SNAREs, o que sugere um possível envolvimento do complexo na exocitose de vesículas
sinápticas. É através do componente Sec5p que se dá a interacção com a forma da Ral ligada a
GTP, um pequeno GTPase ausente na levedura. Esta proteína apresenta duas isoformas, RalA e
RalB, nas quais a primeira se encontra enriquecida no cérebro e associada a vesículas
sinápticas (Li & Chin, 2003). A interacção entre o exocisto e a Ral pode, tal como no caso da
levedura, regular o recrutamento de vesículas sinápticas às zonas de fusão exocíticas. O
componente Exo70 aparenta, nos mamíferos, ser o único associado à membrana plasmática.

Uma vez que não há um complexo semelhante ao exocisto que seja necessário para
outros passos do tráfego membranar na via secretora, é possível concluir que o exocisto não é
um elemento fundamental da maquinaria básica de fusão membranar, participando antes nos
passos especializados que levam à exocitose (Yun Kee et al, 1997).

As proteínas SNARE interagem com o complexo exocisto para facilitarem a fusão entre
as membranas plasmática e das vesículas.

Importância do Ca2+ na regulação dos processos exo-endocíticos:

Tem-se verificado a existência de uma correlação entre os processos endocíticos nas

sinapses e as concentrações de cálcio intracelular. No entanto, diferentes estudos têm
revelado resultados distintos; ao passo que alguns autores apoiam o facto de o cálcio não
exercer um efeito directo nos processos endocíticos (Ryan T. A. et al., 1996), existem
evidências que suportam o facto de o cálcio ser essencial para iniciar a endocitose (Wu XS. &
Wu LG., 2009), havendo ainda quem defenda a existência de um efeito de retroacção negativa
(Leitz J. & Kavalali T., 2011).

O facto de terem sido feitos estudos em processos de endocitose em massa em vez de

em processos endocíticos individuais pode ser a causa da existência de resultados tão
distintos. Com o intuito de perceber de que modo o cálcio regula estes processos, foram
realizados estudos utilizando uma sonda marcada com a molécula fluorescente, a pHluorina,
sensível a alterações de pH, de modo a ser possível monitorizar a recuperação de vesículas
individuais ao longo do tempo (Leitz J. & Kavalali T., 2011), permitindo estudar a probabilidade
de recuperação de vesiculas individuais em função da concentração de cálcio. Os autores
chegaram à conclusão de que o aumento das concentrações de cálcio extracelular leva a uma
diminuição da recuperação das vesículas, contribuindo para a permanência das mesmas na
superfície da membrana sináptica. Este comportamento aponta para um efeito de retroacção
negativa por parte do cálcio, o que está de acordo com resultados obtidos por outros autores,

- 17 -
que observaram uma diminuição da constante de tempo após elevada estimulação (Wu W. et
al., 2005).

O efeito da concentração de cálcio foi estudado, tanto para baixos níveis de actividade
sináptica, como para actividade elevada, tendo-se observado que, durante baixa actividade, o
efeito regulatório do cálcio funciona de um modo negativo, diminuindo a taxa de recuperação
das vesículas. O mesmo foi observado para elevada actividade, havendo uma diminuição
gradual dos níveis de endocitose conforme a concentração de cálcio intracelular aumenta no
terminal.

Os autores questionaram-se ainda se esta diminuição de endocitose observada com o

aumento das concentrações de cálcio intracelular era significativa para as concentrações de
cálcio presentes em situações fisiológicas, em casos de maior intensidade de estimulação. Para
isso, registaram as ondas obtidas por fluorescência a partir de estimulações sucessivas a
frequências de 1 Hz. Foi estimado que seria de esperar uma diminuição da endocitose em
cerca de 15-40%. De facto para uma concentração de cálcio de 4 mM, valor inferior ao
fisiológico, foi observada uma diminuição da endocitose em cerca de 13-33%, sendo que a 8
mM de cálcio extracelular foi observada uma diminuição do nível de endocitose em cerca de
0,5%- 9% em relação ao anterior. Deste modo foi possível concluir que ocorre realmente uma
diminuição significativa da taxa de endocitose para concentrações de cálcio fisiológicas
elevadas. Porém, a percentagem foi inferior à esperada teoricamente, tendo-se observado
ainda que a diminuição progressiva da taxa de endocitose com o aumento da concentração de
cálcio tende para um valor inferior limite, o que leva a concluir que existe um valor limite
mínimo para a taxa de recuperação das vesículas nas sinapses.

A nível exocítico e, sabendo que, em sinapses rápidas este processo requer elevada
concentração pré-sináptica de cálcio, foram feitas diversas experiências, nomeadamente em
neurónios bipolares da retina de peixe-dourado por Heidelberger et al., apercebendo-se estes
que essa concentração necessária teria que ultrapassar os 50 μM para que as velocidades de
secreção se igualassem às atingidas por despolarização (Heidelberger et al., 1994). Ao mesmo
tempo, na junção neuromuscular de lagostim, um aumento transiente na concentração pré-
sináptica de cálcio até cerca de 75 μM desencadeou uma neurosecreção de magnitude e
cinéticas semelhantes à libertação faseada que acompanha um potencial de acção (Landò &
Zucker, 1994). A partir destas experiências foi demonstrada uma dependência não linear da
velocidade de secreção no nível da concentração pré-sináptica de cálcio. Estes estudos
sugerem ainda que, pelo menos, quatro iões Ca2+ se devem ligar com cooperatividade e
afinidades positivas de 10-150 μM a um complexo alvo para desencadear uma secreção rápida
(Zucker R., 1996). Para além do modelo anterior, existem ainda outras possibilidades, como a
de Vogel et al. (1996), na qual a secreção é acelerada pela activação dependente de Ca2+ de
complexos de fusão vesicular, contidos nas vesículas.

Em sinapses entre células nervosas observa-se um aumento na concentração pré-

sináptica de cálcio durante os potenciais de acção, aumento este que se dá nas chamadas
zonas activas, onde ocorre o docking de vesículas na vizinhança de clusters de canais de Ca2+. A
existência destes “microdomínios” é sugerida a partir de três tipos de experiências, uma
primeira através de simulações da difusão de Ca2+ a partir dos referidos clusters na presença

- 18 -
de um tampão lentamente difusível, sendo atingidas concentrações de cerca de 150 μM em
zonas situadas entre conjuntos de canais de Ca2+, locais onde são ancoradas vesículas. Estas
mesmas conclusões foram igualmente obtidas por experiências em células cilíadas do sáculo
de rã, por medições da actividade dos canais de potássio activados por Ca2+ que se encontram
simultaneamente localizados com os canais pré-sinápticos de Ca2+ (Roberts, 1994). Um outro
tipo de experiência realizada foi a observação de domínios de Ca2+ em células cilíadas da
cóclea de tartaruga (Tucker e Fettiplace, 1995) e nas sinapses gigantes da lula (Llinás et al.,
1995). Por último, estudou-se também a secreção desencadeada pela entrada de Ca2+ por
misturas de canais activados por alta voltagem de tipo N e P/Q, com a acção de bloqueadores
específicos. Esta experiência levou à conclusão de que, a dependência não linear da secreção
induzida de cálcio no número de canais abertos pode ser desencadeada por microdomínios de
Ca2+ compostos por múltiplos canais em cluster.

Uma questão interessante é, ainda, a de como estes canais de Ca2+ se encontram

organizados em relação às vesículas. De acordo com o modelo proposto por Meinrenken et al.
(2002), as vesículas encontram-se possivelmente distribuídas de forma aleatória nas zonas
activas, enquanto que os canais de Ca2+ permanecem em cluster. Adicionalmente, a distância
de uma vesícula ao cluster varia entre 30 a 300 nm (média ~ 100 nm), e vesículas com
diferentes localizações serão, não só expostas a diferentes transientes de Ca2+, como também
apresentam diferentes probabilidades de libertação (de <0.01 a 1). Este modelo prevê ainda
que o único passo na cascata de sinalização cuja velocidade depende da concentração de Ca2+,
é a ligação deste ao seu sensor, o que explica a razão para o facto do atraso sináptico, definido
pelo tempo que decorre entre o potencial de acção e a libertação dos neurotransmissores, ser
relativamente independente da concentração de Ca2+, situação esta contrária à dependência
apresentada pela magnitude da libertação.

A velocidade com que o cálcio desencadeia a libertação dos conteúdos das vesículas,
inferior a 400 μs, sugere que a ligação de Ca2+ ao respectivo sensor apenas induz a abertura do
poro de fusão, não dando início a uma cascata complexa de reacções. A probabilidade de
abertura do poro de fusão depende da tensão e composição das membranas envolvidas, e
portanto, qualquer alteração destes factores na membrana plasmática irá afectar a libertação
dos neurotransmissores (Südhof T, 2004).

Quando um potencial de acção invade um nervo terminal, o influxo de cálcio induz a

libertação de neurotransmissores com uma especificidade temporal excepcional. O principal
problema é entender o forte acoplamento entre o aumento do Ca2+ intracelular através da
abertura dos canais de cálcio pré-sinápticos após a chegada de um potencial de acção, e a
activação da maquinaria de fusão das vesículas sinápticas exocíticas. A probabilidade de fusão
aumenta drasticamente nos 200 µsecs que se seguem ao influxo de Ca2+, voltando a valores
mais baixos no espaço de 1 msec (George J. Augustine, 2001). De modo a assegurar a
fidelidade temporal da transmissão sináptica, a libertação de neurotransmissores regulada por
cálcio é extremamente rápida e precisa, o que a distingue de outros processos de tráfego de
membrana.

Apesar de já terem sido descobertas algumas proteínas envolvidas na exocitose (já

descritas anteriormente neste artigo), muitos aspectos deste mecanismo e da sua regulação

- 19 -
por parte do Ca2+ permanecem desconhecidos. As proteínas pré-sinápticas SNARE, compostas
pela sinaptobrevina, pela sintaxina e pela SNAP-25, são essenciais na transmissão sináptica.
Estas formam um complexo cujo núcleo é formado por quatro hélices α, complexo este que
interage com os sensores de cálcio para promover a exocitose sináptica (Jahn et al., 2003).
Desta forma, a identificação dos sensores de cálcio é crucial para o desvendar dos mecanismos
que regulam a transmissão sináptica. A sinaptotagmina-1 é, actualmente, uma das proteínas
melhor caracterizadas que actua como principal sensor de Ca2+ (Martens et. al, 2007).

Mas afinal qual é o papel exacto do cálcio nas sinapses? Quando um potencial de
acção chega a um terminal pré-sináptico, despolariza a membrana o suficiente para que ocorra
a abertura dos canais de cálcio dependentes de voltagem. O gradiente de cálcio através da
membrana é tal que, quando os canais abrem, é produzida uma corrente de cálcio em direcção
ao interior da membrana, levando à entrada deste ião na célula. O cálcio é rapidamente ligado
pela sinaptotagmina pré-sináptica (George J. Augustine, 2001). A activação desta proteína dá,
então, origem à fusão das vesículas com a membrana pré-sináptica (Martens et. al, 2007) e à
consequente libertação de neurotransmissores. Esta libertação desencadeada pelo influxo de
Ca2+ é feita por canais de tipo P/Q ou N, enquanto que canais de Ca2+ de tipo R ou L raramente
se envolvem. Uma vez que o cálcio provoca a conversão de um sinal eléctrico (o potencial de
acção) num químico (a libertação de neurotransmissores), este pode ser considerado como o
“gatilho” para a transdução electroquímica (o termo significa, literalmente, a conversão de
energia eléctrica em informação química).

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Conclusões:

Cada tipo de endocitose apresenta interacções entre proteínas diferentes, capazes de

se associar a domínios distintos dependendo da via endocítica. Para que a endocitose rápida e
a lenta ocorram de maneira correcta é necessária pelo menos a existência de sinaptofisina e
de calmodulina que ajudam a recrutar as proteínas necessárias para estes processos e modular
de modo eficaz os mesmos.

A exocitose é controlada e regulada por toda uma maquinaria celular proteica, sendo
os seus componentes fundamentais as proteínas SNARE, o ATPase NSF, a sinaptotagmina, as
proteínas Rab, o complexo exocisto entre muitos outros factores, como complexinas, VAP33 e
as sinaptofisinas.

O processo de kiss and run, que se trata numa primeira fase de uma exocitose até ao
instante da fusão da vesícula (kiss) e que rapidamente se torna numa endocitose no momento
da fissão (run), processo activado durante uma estimulação rápida e/ou no caso da existência
de poucas vesículas carregadas, é importante para manter a estrutura funcional dos terminais
sinápticos recuperando vesículas que não se fundiram totalmente com a membrana.
Altamente regulado, apresenta-se como uma forma eficaz e mais económica de exocitose e
endocitose havendo vantagens como poupança de recursos tanto de maquinaria proteica
como de componentes vesiculares e também uma maior taxa de retorno de vesículas.

Foi possível concluir a existência de um papel regulador por parte do cálcio sobre os
processos endocíticos tendo-se verificado um efeito de retroacção negativa por parte do
mesmo uma vez que é observada uma diminuição da taxa de recuperação de vesículas com o
aumento dos níveis de cálcio intracelular.

Nos processos exocíticos observa-se uma dependência não linear entre estes e as
concentrações de cálcio. Observou-se ainda a existência de microdomínios onde se verifica um
aumento da concentração pré-sináptica de cálcio.

Relativamente à probabilidade de fusão das vesículas, após influxo de Ca2+ ocorre um

aumento abrupto nos 200 µs voltando a valores mais baixos passado 1 ms. A libertação de
neurotransmissores, regulada por cálcio, é extremamente rápida e precisa, ao contrário de
muitos outros processos de tráfego de membrana. Esta baixo tempo de resposta permite
assegurar a fidelidade temporal da transmissão sináptica.

- 21 -
Referências:

Alés, E. et al., 1999. High calcium concentrations shift the mode of exocytosis to the kiss-and-
run mechanism. Nature cell biology, 1(1), pp.40–44.

An, S. & Zenisek, D., 2004. Regulation of exocytosis in neurons and neuroendocrine cells.
Current opinion in neurobiology, 14(5), pp.522–530.

Augustine, G.J., 2001. How does calcium trigger neurotransmitter release? Current opinion in
neurobiology, 11(3), pp.320–326.

Balaji, J., Armbruster, M. & Ryan, T.A., 2008. Calcium control of endocytic capacity at a CNS
synapse. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience,
28(26), pp.6742–6749.

Brodin, L., Löw, P. & Shupliakov, O., 2000. Sequential steps in clathrin-mediated synaptic
vesicle endocytosis. Current opinion in neurobiology, 10(3), pp.312–320.

Bruns, D. & Jahn, R, 1995. Real-time measurement of transmitter release from single synaptic
vesicles. Nature, 377(6544), pp.62–65.

Burgoyne, R.D. & Morgan, A., 2003. Secretory granule exocytosis. Physiological reviews, 83(2),
pp.581–632.

Daly, C. et al., 2000. Synaptophysin regulates clathrin-independent endocytosis of synaptic

vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
97(11), pp.6120–6125.

Fatt, P. & Katz, B., 1952. Spontaneous subthreshold activity at motor nerve endings. The
Journal of Physiology, 117(1), pp.109–128.

Gordon, S.L., Leube, R.E. & Cousin, M.A., 2011. Synaptophysin is required for synaptobrevin
retrieval during synaptic vesicle endocytosis. The Journal of neuroscience: the official journal
of the Society for Neuroscience, 31(39), pp.14032–14036.

Granseth, B. et al., 2007. Clathrin-mediated endocytosis: the physiological mechanism of

vesicle retrieval at hippocampal synapses. The Journal of physiology, 585(Pt 3), pp.681–686.

Heidelberger, R., 2001. ATP is required at an early step in compensatory endocytosis in

synaptic terminals. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for
Neuroscience, 21(17), pp.6467–6474.

Heidelberger, R. et al., 1994. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic

terminal. Nature, 371(6497), pp.513–515.

Jahn, Reinhard, 2004. Principles of exocytosis and membrane fusion. Annals of the New York
Academy of Sciences, 1014, pp.170–178.

Jahn, R. & Fasshauer, D., 2012. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles.
Nature, 490(7419), pp.201–207.

- 22 -
Jarousse, N. & Kelly, R.B., 2001. Endocytotic mechanisms in synapses. Current opinion in cell
biology, 13(4), pp.461–469.

Jung, N. & Haucke, Volker, 2007. Clathrin-mediated endocytosis at synapses. Traffic

(Copenhagen, Denmark), 8(9), pp.1129–1136.

Kee, Y. et al., 1997. Subunit structure of the mammalian exocyst complex. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 94(26), pp.14438–14443.

Kwon, S.E. & Chapman, E.R., 2011. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle
endocytosis in central neurons. Neuron, 70(5), pp.847–854.

Landò, L. & Zucker, R.S., 1994. Ca2+ cooperativity in neurosecretion measured using photolabile
Ca2+ chelators. Journal of neurophysiology, 72(2), pp.825–830.

Leitz, J. & Kavalali, E.T., 2011. Ca2+ influx slows single synaptic vesicle endocytosis. The Journal
of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 31(45), pp.16318–16326.

Li, L. & Chin, L.-S., 2003. The molecular machinery of synaptic vesicle exocytosis. Cellular and
molecular life sciences: CMLS, 60(5), pp.942–960.

Lin, R.C. & Scheller, R.H., 2000. Mechanisms of synaptic vesicle exocytosis. Annual review of
cell and developmental biology, 16, pp.19–49.

Llinás, R., Sugimori, M. & Silver, R.B., 1995. The concept of calcium concentration
microdomains in synaptic transmission. Neuropharmacology, 34(11), pp.1443–1451.

Martens, S., Kozlov, M.M. & McMahon, H.T., 2007. How synaptotagmin promotes membrane
fusion. Science (New York, N.Y.), 316(5828), pp.1205–1208.

Meinrenken, C.J., Borst, J.G.G. & Sakmann, B., 2002. Calcium secretion coupling at calyx of held
governed by nonuniform channel-vesicle topography. The Journal of neuroscience: the official
journal of the Society for Neuroscience, 22(5), pp.1648–1667.

Morgan, J.R., Augustine, G.J. & Lafer, E.M., 2002. Synaptic vesicle endocytosis: the races,
places, and molecular faces. Neuromolecular medicine, 2(2), pp.101–114.

Pumplin, D.W., Reese, T.S. & Llinás, R., 1981. Are the presynaptic membrane particles the
calcium channels? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 78(11), pp.7210–7213.

Roberts, W.M., 1994. Localization of calcium signals by a mobile calcium buffer in frog saccular
hair cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 14(5
Pt 2), pp.3246–3262.

Rosa, P. & Fratangeli, A., 2010. Cholesterol and synaptic vesicle exocytosis. Communicative &
integrative biology, 3(4), pp.352–353.

- 23 -
Ryan, T.A., Smith, S.J. & Reuter, H., 1996. The timing of synaptic vesicle endocytosis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(11),
pp.5567–5571.

Slepnev, V. I. & Camilli, P., 2000. Acessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle
endocytosis. Nature Reviews Neuroscience,1, pp. 161-172

Sun, T. et al., 2010. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow
endocytosis at central synapses. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society
for Neuroscience, 30(35), pp.11838–11847.

Südhof, T.C. & Rizo, J., 2011. Synaptic vesicle exocytosis. Cold Spring Harbor perspectives in
biology, 3(12).

Takei, K. & Haucke, V, 2001. Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors pull the trigger.
Trends in cell biology, 11(9), pp.385–391.

Tucker, T. & Fettiplace, R., 1995. Confocal imaging of calcium microdomaline-

height:1.231;/spanins and calcium extrusion in turtle hair cells. Neuron, 15(6), pp.1323–1335.

Vogel, S.S., Blank, P.S. & Zimmerberg, J., 1996. Poisson-distributed active fusion complexes
underlie the control of the rate and extent of exocytosis by calcium. The Journal of cell biology,
134(2), pp.329–338.

Weimer, R.M. & Jorgensen, E.M., 2003. Controversies in synaptic vesicle exocytosis. Journal of
cell science, 116(Pt 18), pp.3661–3666.

Wightman, R.M. & Haynes, C.L., 2004. Synaptic vesicles really do kiss and run. Nature
neuroscience, 7(4), pp.321–322.

Wu, L.-G., 2004. Kinetic regulation of vesicle endocytosis at synapses. Trends in neurosciences,
27(9), pp.548–554.

Wu, W. et al., 2005. Activity-dependent acceleration of endocytosis at a central synapse. The

Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 25(50), pp.11676–
11683.

Wu, X.-S. et al., 2009. Ca2+ and calmodulin initiate all forms of endocytosis during
depolarization at a nerve terminal. Nature neuroscience, 12(8), pp.1003–1010.

Wu, X.-S. & Wu, L.-G., 2009. Rapid endocytosis does not recycle vesicles within the readily
releasable pool. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for
Neuroscience, 29(35), pp.11038–11042.

Yao, L. & Sakaba, T., 2012. Activity-dependent modulation of endocytosis by calmodulin at a

large central synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 109(1), pp.291–296.

- 24 -
Zhu, Y., Xu, Jian & Heinemann, S.F., 2009a. Synaptic vesicle exocytosis-endocytosis at central
synapses: Fine-tuning at differential patterns of neuronal activity. Communicative &
integrative biology, 2(5), pp.418–419.

Zhu, Y., Xu, Jian & Heinemann, S.F., 2009b. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed
by single-vesicle imaging. Neuron, 61(3), pp.397–411.

Zucker, R.S., 1996. Exocytosis: a molecular and physiological perspective. Neuron, 17(6),
pp.1049–1055.

- 25 -