UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

A ANÁLISE GENÉTICA MOLECULAR NA CONSERVAÇÃO

DE AVES SILVESTRES

ELABORADO POR:
JOANA DE MOURA GAMA

ORIENTADOR
PROFa. DRa. DENISE MONNERAT NOGUEIRA

SEROPÉDICA
2016

i
 JOANA DE MOURA GAMA

A ANÁLISE GENÉTICA MOLECULAR NA CONSERVAÇÃO

DE AVES SILVESTRES

Monografia apresentada
como requisito parcial
para obtenção do título de
Bacharel em Ciências
Biológicas do Instituto de
Ciências Biológicas e da
Saúde da Universidade
Federal Rural do Rio de
Janeiro.

JUNHO
2016

ii
A ANÁLISE GENÉTICA MOLECULAR NA CONSERVAÇÃO
DE AVES SILVESTRES

JOANA DE MOURA GAMA

M O N O G R A F I A A P R O V A D A E M : ___/___/___

BANCA EXAMINADORA:

PRESIDENTE: ___________________________________

MEMBRO TITULAR: ___________________________________

MEMBRO TITULAR: ___________________________________

MEMBRO SUPLENTE: ___________________________________

i
 AGRADECIMENTOS
São tantas pessoas para que agradecer que eu acho melhor começar por
Deus. O tão odiado pelos biólogos, mas pra mim não. Tenho plena ciência que devo
agradecer a ele por tudo, então vai aí: Obrigada DEUS!
Agradeço ao meu Pai (Antônio Jorge de Oliveira) in memorian, pois ele foi o
primeiro a me incentivar, quando eu era criança e dizia que queria ser cientista, quando
dizia que era especial porque enxergava a televisão em posições diferentes quando
fechava o olho direito ou o esquerdo (rs), e ele dizia que eu era a filha mais inteligente
que ele tinha que eu conseguiria ser tudo. Quando ele me ouvia a falar horas a respeito
de cobras e genética de sapos, tenho certeza que ele não entendia nada, mas balançava a
cabeça e fingia que o assunto era interessante. Sempre me ligava as 7:00h da manhã no
sábado para saber como eu estava e como estava o estágio e ficava indignado como uma
pessoa tão desastrada conseguia trabalhar em um laboratório sem quebrar tudo. Me
incentivou do seu jeito, mas deu super certo. Obrigada PAI essa é pra você!
Agradeço aos meus irmãos/Tios Andréa, Júnior e Márcia, a minha irmã Adriele,
meus primos em especial Hortência Gama e Grasiele Correia por me aturarem nos
feriados que não podia voltar pro Espírito Santo. Ao meu padrasto Adriano. Aos meus
tios Raimundo (in memorian), Luiza, Edi e Lia que sempre me deram apoio e ajuda.
Um agradecimento em especial para minhas duas mães (Sandra e Maria Augusta) que
no começo ficaram bravas ou tristes (não sei bem) com a minha escolha de cursar
biologia e em outro estado (pra completar!!), mas sempre me apoiaram e em nenhum
momento tentaram me fazer desistir, pelo contrário tentaram amenizar meu
‘sofrimento’!!
A minha orientadora Denise Monnerat Nogueira, sempre muito paciente e
calma. Obrigada por me acolher em seu laboratório desde primeiro período, quando não
sabia nada, no máximo minha matrícula. E pela sua paciência quando eu ficava
totalmente desesperada porque minhas amostras não amplificavam, pelas idas a
Marambaia no sol escaldante da restinga atrás do bonitinho do Mimus e também pelos
puxões de orelhas merecidos e por me ensinar a maioria das coisas que eu sei a respeito
da pesquisa.
Aos meus amigos do Laboratório de Genética Animal (Aninha, Bia, Dálethy,
Diego, Emídio, Mayara, Monique e Léo), sempre dando aquele apoio,na vida acadêmica
e pessoal, pelas companhias até tarde no laboratório, muitas vezes na sexta-feira
(Mayara que diga!).

ii
 Ao Christiano, que conheci por causa do projeto com Conopophaga melanops e
rapidamente se tornou um amigo muito querido, sempre pronto a ajudar.
A Maria Amélia, por aceitar participar da minha banca de avaliação,pelos
conselhos com as amostras que não amplificavam e por passar seus conhecimentos nas
aulas de Genética Molecular e Geral.
Ao Heriberto, por aceitar participar da minha banca de avaliação e pelos
ensinamentos na aula de Evolução e Genética Ecológica.
Ao CADIM, por nos acolher nos dado total estrutura para desenvolvimento de
nossas pesquisas, na Marambaia. Ao professor Xerez, por manter esse convênio de pé,
sempre mandado os emails e pedindo autorização. Resolvemos os pepinos, sem sua
administração as coisas seriam muito mais difíceis.
Ao Laboratório de Genética Marinha da Universidade Estadual do Rio de
Janeiro (LGMar/UERJ), por ceder o NanoDrop para quantificação de DNA e
principalmente a Andréa Oliveira, que com toda boa vontade saiu de sua casa, mesmo
doente (tadinha!) e me ensinou a utilizar o equipamento. Sempre com sorriso no rosto.
E também, aos meus amigos Russos do Sci-hub. Muito obrigada.
Não posso esquecer os meus amigos que fizeram esses 5 anos inesquecíveis.
Obrigada Ana Paula e Júlia, minhas primeiras companheiras de casa, passamos
aventuras inesquecíveis fazendo gordices de madrugada e passando o fim de semana
inteiro assistindo séries e filmes e depois ficando desesperadas porque não estudamos e
ainda engordamos!! Ao Kleisson e ao César, por compartilharem sua casa comigo por
um bom tempo, saudades de vocês. Ao meu amigo Edicarlos, que foi ‘pau pra toda
obra’ sempre esteve do meu lado, me ajudando a estudar nas madrugadas da vida ou
comendo um pacote de churros com uma lata de doce de leite, nas madrugadas da vida.
Amigo que é amigo engorda junto. Com ele aprendi muito sobre sapos e biogeografia.
A minha turma 2011-2, nos desesperamos juntos e também demos boas risadas.
Especialmente para Camila, João e Aline (o bonde) que tornaram algumas aulas bem
mais interessantes e mais fáceis. Aline sempre a mais animada, me carregava para todas
as festas e eventos possíveis, inclusive me carregou para a Marambaia na primeira vez
que estive lá. Camilinha obrigada por me aturar e me dar vários ‘bizus’ nas matérias, me
ajudando no carma da biofísica e fisio animal. Joãozinho obrigado por me fazer sorrir
com seus áudios constrangedores no whatsapp. Adoro vocês broa de milho e de
chocolate. Ao Egon, pessoa maravilhosa e um dos melhores amigos da rural. Obrigada
pelas madrugadas de estudo, onde rimos mais do que estudamos. Por sempre me
acompanhar nas tretas e por nunca ter recebido um não vindo de você. Drielly, por

iii
tornar os estudos de bioestatística mais suportáveis e engraçados e as chopadas mais
emocionantes. As amigas Raíssa C e Emily, que sempre me acompanham numa festa ou
num espisódio de Game of Thrones, gostaria de ter conhecido vocês no início da
graduação.
Aos meus amigos do Laboratório de Herpetologia (Gustavo, Raíssa R. e Raoni)
e de Polychaetas (Camilla, Ricardo chileno, Tiago xuxu e Vinícius Miranda (Vini)), o
famoso Herpetochaeta. Por me acolherem em seus laboratórios sempre que precisei,
pelos cafezinhos tomados e as gordices, pelas risadas, por me fazerem companhia, me
ajudar nos estudos, na monografia em tudo, me levar aos campos com vocês e me
ensinarem coisas novas (especialmente Vini). Por serem minha família seropedicana.
Aos professores chefes desses laboratórios Helio Ricardo e Ana Brasil, que se tornaram
mais que professores, grandes amigos, e permitiram entrar em seus laboratórios como se
eu fizesse parte da família. Me ensinaram muito com as conversas filosóficas sobre
ponto de vista e coisas que eu não imaginava, seja no Laboratório ou no Marcelo ou nos
churrascos. Graças a vocês enxergo a Biologia com outros olhos. A galera do
Herpetochaeta só tenho uma coisa para dizer: trabalhando e relaxando, não ops, é siga
em frente olhe para lado. Agora é sério, obrigada.
Agradeço também aos meus amigos biólogos pós-graduandos do grupo
(whatssapp) que muda de nome toda semana Ayesha, Luiz, Taynara, Deize,
Fernandinha, William, Rafaela, Vini e Ed. Sem vocês minhas semanas seriam muito
chatas, minhas festas e comilanças não teriam graça, principalmente sem Deizenilde e
Luiz pé de valsa. Sem essa galera eu saberia muito menos a respeito de biologia.
E por último, mas não menos importante, aos meus companheiros de Casa: Vini
e Kenedy. Por me acolherem nesse ano e serem ótima companhia. O Kenedy por
compartilhar minhas histórias de coração partido e me aturar nos fins de semanas e o
Vini (aparece nos agradecimentos 3x, é pra não reclamar que me aturou 5 anos à toa!),
como já disse por me aturar 5 anos, sendo sempre um bom amigo, que me ajudou desde
ZOO I e II, nos primeiros períodos da faculdade até a monografia, me deu notícias ruins
e boas, mas sempre esteve aqui pra me ajudar.
Cada um citado aqui, de alguma forma foi responsável pela minha conquista.
Muito Obrigada Galera.

iv
 RESUMO

Palavras-chave: Mimus gilvus, CHD, Copophaga melanops, primers heterólogos

A fauna e flora silvestres vêm sofrendo constantemente com a devastação dos

biomas, sendo as aves um dos grupos mais atingidos. O desenvolvimento e
aprimoramento das técnicas moleculares tem propiciado um vasto volume de
informações acerca do genoma, o que vem se mostrando útil em diversos estudos na
conservação de aves silvestres. A genética molecular tem contribuído para os estudos de
biologia reprodutiva, identificação do sexo em espécies sem dimorfismo sexual aparente
e de genética de populações. Esta monografia está dividida em dois capítulos
relacionados à diferentes metodologias genéticas para o estudo de aves silvestres. No
primeiro capítulo é apresentado o estudo referente ao teste de dois conjuntos de primers
heterólogos, ou seja, desenvolvidos originalmente a partir de amostras de diferentes
espécies de aves, para verificar a amplificação cruzada de marcadores de regiões de
microssatélites em Conopophaga melanops. uma espécie endêmica da Mata Atlântica.
Os indivíduos foram capturados na Ilha Grande, Angra dos Reis e na Reserva de Rio
das Pedras, Mangaratiba. A extração do DNA foi feita através da técnica de precipitação
salina e o DNA foi quantificado em NanoDrop (Thermo Scientific ®) Dos primers
testados em apenas um primer (TG01-077) foram amplificadosdois alelos. Deste modo,
foi evidenciado o polimorfismo para este loco, demonstrando ser um loco promissor
para estudos ecológicos, se testado em um maior número de indivíduos. Não foi obtido
sucesso na amplificação do loco de microssatélite com o outro conjunto de primers
(TG01-000). O segundo capítulo é voltado para a confirmação do sexo utilizando a
técnica de Reação em Cadeia da Polimerase para amplificação de um segmento
intrônico do gene codificador da Cromo-helicase ligadora de DNA (CHD) em Mimus
gilvus (Aves: Passeriformes), o sabiá-da-praia, espécie sem dimorfismo sexual aparente.
Foram capturados 6 indivíduos na Ponta da Pombeba, Ilha da Marambaia, RJ. A
extração do DNA foi feita através da técnica de lise celular. Foram utilizados os
iniciadores P2 e P8. Os amplicons de CHD-Z apresentaram 480 pares de bases e o
CHD-W 400 pb, confirmando o sexo em 3 machos e 3 fêmeas. A descrição do tamanho
dos amplicons do gene CHD-Z/CHD-W é inédita para essa espécie.

v
 ABSTRACT

Key-words: Mimus gilvus, CHD, Conopophaga melanops, heterologous primers.

The wild fauna and flora have been constantly suffering from the devastation of biomes,
beeing birds group one of the most affected. The development and improvement of
molecular techniques has provided a vast amount of information about the genome,
which has proved useful in several studies on the conservation of wild birds. Molecular
genetics has contributed to the studies of reproductive biology, population genetics and
gender identification in species with no apparent sexual dimorphism. This paper is
divided into two chapters related to different genetic methodologies for the study of
wild birds. In the first chapter, it is presented study on tests of two sets of heterologous
primers, originally developed from samples of different species of birds to verify the
cross-amplification of microsatellite markers in Conopophaga melanops, an endemic
species of the Atlantic. Subjects were captured in Ilha Grande, Angra dos Reis and Rio
das Pedras Reserve, Mangaratiba. DNA was quantified by NanoDrop (Thermo
Scientific ®) device. Of the primers tested only one amplified (TG01-077), showing
polymorphic alleles. Proving to be a promising site for ecological studies on species, if
it is tested on a greater number of individuals. The second chapter is intended to
confirm the sex using the technique of reaction Polymerase Chain for amplification of a
gene intronic segment Chromobox- helicase DNA (CHD) in Mimus gilvus (Aves:
Passeriformes), the tropical mockingbird , species with no apparent sexual dimorphism.
6 individuals were captured at Ponta da Pombeba, Ilha da Marambaia, RJ. DNA. P2 and
P8 primers were used. The amplicons CHD-Z had 480 bp and 400 bp CHD-W,
confirmed sex in 3 male and 3 female. The description of the size of the amplicons of
CHD-Z gene / CHD-W is unprecedented for this species.

vi
 SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................... v
ABSTRACT ............................................................................................................... vi
LISTA DE TABELAS .............................................................................................. vii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ ix
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................. x
CAPÍTULO 1- Identificação de primers com amplificação cruzada para
locos de microssatélites em Conopophoga melanops (Aves: Passeriformes).
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
Espécie Estudada .......................................................................................................... 1
Técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction- Reação em cadeia da polimerse) ....... 3
Eletroforese................................................................................................................... 4
Marcadores de Microssatélites .................................................................................... 5
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 8
Amostras biológicas ..................................................................................................... 9
Extração de DNA........................................................................................................ 11
Quantificação do DNA extraído ................................................................................. 12
Reações em cadeia da polimerase .............................................................................. 13
RESULTADOS ......................................................................................................... 14
DISCUSSÃO .............................................................................................................. 18

CAPÍTULO 2- Confirmação do sexo por DNA no Sabiá-da-praia, Mimus

gilvus (Aves: Passeriformes) da Ilha Marambaia, Mangaratiba, RJ.
INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 19
Espécie Estudada ........................................................................................................ 19
Áreas de Estudo .......................................................................................................... 21
Confirmação do sexo na ausência de dimorfismo sexual aparente ............................ 24
MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 28
Coletas das Amostras Biológicas ............................................................................... 28
Extração de DNA........................................................................................................ 29
Reações de PCR para Confirmação do sexo .............................................................. 30
RESULTADOS ......................................................................................................... 30
DISCUSSÃO .............................................................................................................. 32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 35
ANEXOS ................................................................................................................... 39

vii
 LISTA DE TABELAS

TABELA 1 ................................................................................................................ 14
TABELA 2 ................................................................................................................ 15
TABELA 3 ................................................................................................................ 16
TABELA 4 ................................................................................................................ 31

viii
 LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 ................................................................................................................... 2
FIGURA 2 ................................................................................................................... 2
FIGURA 3 ................................................................................................................... 5
FIGURA 4 ................................................................................................................... 7
FIGURA 5 ................................................................................................................... 8
FIGURA 6 ................................................................................................................. 10
FIGURA 7 ................................................................................................................. 17
FIGURA 8 ................................................................................................................. 17
FIGURA 9 ................................................................................................................. 20
FIGURA 10 ............................................................................................................... 21
FIGURA 11 ............................................................................................................... 21
FIGURA 12 ............................................................................................................... 24
FIGURA 13 ............................................................................................................... 29
FIGURA 14 ............................................................................................................... 29
FIGURA 15 ............................................................................................................... 32

ix
LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 .................................................................................................................. 39

x
 Capítulo 1: Identificação de primers com amplificação cruzada para locos
de microssatélites em Conopophoga melanops (Aves: Passeriformes).

INTRODUÇÃO
Espécie Estudada
Conopophaga melanops (VIEILLOT, 1818), popularmente conhecido como
Cuspidor-de-máscara-preta, da família Conopophagidae é pertencente à maior Ordem
da Classe Aves, os Passeriformes, que abrange 59,1 % do total das espécies. Medem 11
cm de envergadura e o macho se distingue da fêmea por apresentar uma faixa castanha
no centro da cabeça e as laterais pretas, em contraste com a fêmea que possui a cabeça
uniformemente marrom. Possuem como características marcantes os tarsos e dedos
longos e asas e caudas curtas (Figura 1) (SICK,1997). Segundo Helmut Sick (1997), a
espécie é a única do gênero endêmica da Mata Atlântica e vive em baixadas litorâneas
na Serra do Mar, em matas fechadas a pouca altura do solo, ocorrendo da Paraíba a
Santa Catarina (Figura 2). Seu comportamento e suas características morfológicas
sugerem ser uma espécie sedentária. Aves sedentárias, especialmente de sub-bosque,
tornam-se propensas à diferenciação e adaptação local (STOZ et al, 1996; BATES,
2000).
A Mata Atlântica é um dos biomas brasileiro considerado como hotspot de
biodiversidade e vem sendo desmatada desde o descobrimento, com perda de 93% da
sua cobertura vegetal original (MYERS et al., 2000), sendo uma área prioritária para
estudos de conservação. Um hotspot pode ser definido como uma área rica em espécies
endêmicas apresentando perda da sua vegetação acima de 70%. Embora ocorra na
região da Mata Atlântica, C. melanops é encontrado apenas em áreas de vegetação
secundária ou em estágio avançado de regeneração sendo descrito como um bio-
indicador da qualidade do ambiente (HARRISON E GREENSMITH, 1993)A partir do
advento das enzimas de restrição, na década de 60, que cortam o DNA em sequências
específicas, a genética molecular tem sido utilizada para diversos estudos na área da
conservação animal. Por exemplo, com a utilização da técnica de DNA fingerprinting,
sistemas de acasalamento em aves, diferentes da monogamia, foram descritos (BURKE;
BRUFORD, 1987). Posteriormente, com o advento da PCR (do inglês, Polymerase
Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) esta proporção foi intensamente
ampliada, pois inclusive, reduziu a quantidade de amostra biológica necessária para a
extração de DNA, uma vez que em tese, basta uma só célula para gerar ao final de 30
ciclos de amplificação de 1 bilhão de cópias da região de interesse.

1
 A B

Figura 1 A) Casal de Conopophaga melanops no ninho. Foto: Luiz Freire. B) Macho

de C. melanops, destacando as características que o distinguem da fêmea, como a
cabeça laranja e facha transocular preta. Foto: Christiano Pinheiro.

Figura 2. Mapa parcial da Américado Sul onde no Brasil é destacada a distribuição de

Conopophaga melanops nas áreas amarelas compreendendo os estados da Paraíba a
Santa Catarina. Retirado de http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=22703415

2
Técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction- Reação em Cadeia da Polimerase)
A técnica de amplificação do DNA in vitro pela PCR foi desenvolvida
por Saiki, et al.,., (1985) e aprimorada por Mullis, et al.,., (1987) com a descoberta da
Taq, uma DNA polimerase termoestável extraída da bactéria de fontes de águas termais,
Thermus aquaticus. Neste processo, também foram desenvolvidos equipamentos para a
automatização da adição da enzima após cada ciclo, os primeiros “termocicladores”.
Deste modo, foi possível a redução de tempo de execução dos experimentos, dos custos
e complexidade. Antes do advento da técnica, as análises dos polimorfismos eram feitas
através de sondas radioativas, onde eram hibridizadas com membranas contendo o DNA
alvo. Essa metodologia precisava de uma alta quantidade de DNA alvo, além de utilizar
material radioativo, sendo prejudicial ao manipulador. (SAIKI et al., 1988; MATIOLI E
PASSOS-BUENO, 2012).
A técnica de PCR consiste na amplificação exponencial seletiva de uma
determinada sequência de DNA a partir de uma quantidade reduzida de amostra
biológica. Este DNA deve ter sido extraído por métodos adequados para que esteja em
uma concentração mínima 5μg/mL (apesar de ser possível amplificar a partir de menor
concentração) e livre de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucléico, reagentes
de extração, etc.). São utilizados também, iniciadores da reação ou primers que são
pequenas sequências de nucleotídeos (12 a 30 bases) sintetizadas in vitro,
complementares à região que flanqueia a sequência alvo (senso ou forward, F e anti-
senso ou reverse – R, ou seja, que pareiam em cada uma das fitas do DNA, 5’-3’ e 3’-
5’). Além disso, são acrescentados à reação os desoxinucleotídeos trifosfatados ou
dNTPs (dATP,dCTP, dTTP e dGTP), em igual concentração, que serão adicionados
pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Para atividade polimerásica da Taq é
necessária a adição de MgCl2 que é um doador estável de íons Mg2+, além de uma
solução tamponante com íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) para otimização da
reação (VIEIRA, 2001). O volume desejado é completado com água ultra-pura, livre de
DNAses. Todos estes reagentes são adicionado em um tubo tipo plástico eppendorf e
colocados no termociclador. Este equipamento alterna as temperaturas de acordo com a
duração de cada ciclo previamente programado.
Os ciclos de PCR consistem em três etapas: desnaturação; anelamento e
extensão. A fita de DNA é aquecida, em uma temperatura cerca de 94º-99C, o suficiente
para que a dupla cadeia de ácido nucleico se desnature em duas fitas simples através da
desestabilização das ligações de hidrogênio. Após essa etapa, a temperatura é reduzida
para 45-60ºC de acordo com a sequência dos primers, que pareiam (anelam) com a

3
sequência complementar que flanqueia a região de interesse. Um par de primers é
utilizado onde um deles anela no DNA, na fita sentido 3’-5’ e o outro, na fita inversa 5’-
3’. Após o anelamento do primer, a temperatura é elevada a 72 ºC ideal para atividade
da Taq DNA polimerase que a partir do reconhecimento do primer segue replicando por
complementaridade de bases a sequência das fitas molde, processo conhecido como
extensão (DELIDOW et al., 1993; ERLICH, 1989; SAIKI et al., 1988;
SCHOCHETMAN; OU; JONES., 1988; MATIOLI E PASSOS-BUENO, 2012). Ao
final de 10 ciclos, haveria 1024 vezes mais DNA do que na amostra original; em 20
ciclos 1 milhão de vezes mais, em 30 ciclos mais 1 bilhão de fragmentos da sequencia-
alvo. Essas cópias poderão ser visualizadas em matriz de gel de agarose ou
poliacrilamida submetidos a eletroforese (MATIOLI E PASSOS-BUENO, 2012).

Eletroforese
Após a amplificação das sequências alvo do DNA, os fragmentos são
submetidos à eletroforese em uma matriz. A eletroforese é uma técnica baseada na
migração diferencial de compostos iônicos, podendo ser DNA (ácidos nucleicos com
carga negativa), em um campo elétrico. O DNA composto por carga negativa, quando
aplicado em uma matriz de gel, submetida a um campo elétrico migra em direção ao
pólo positivo. O tipo de matriz utilizada pode ser gel de agarose ou poliacrilamida
, dependendo do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e
visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se
normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50
kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos
pequenos, de até 1kb (Figura 3) (SAMBROOK; RUSSEL,2001).

4
Figura 3. À esquerda, cuba de eletroforese, evidenciando os polos positivo e negativo
e à direita, esquema representando um gel de agarose que demonstra a separação dos
fragmentos de DNA de acordo com o número de pares de bases.

Marcadores Microssatélites
Os microssatélites também denominados SSR (Simple Sequence Repeats) e SRT
(Short Tandem Repeats), são sequências encontradas no DNA nuclear que se
caracterizam por apresentar repetições sequenciais curtas ou em tandem, de 1-6 pares de
bases (pb) distribuídas aleatoriamente no genoma dos eucariotos. São herdados de
forma Mendeliana e apresentam alto grau de polimorfismo por loco, onde os alelos são
de natureza codominante (HUGHES; QUELLER, 1993; WRIGHT; BENTZEN, 1994).
Foram descobertos em 1980, mas a partir de 1990 passaram a ser intensamente usados
em estudos de genética de populações voltados para a conservação de animais silvestres
(ELLEGREN, 2004). Em geral, a maioria dos microssatélites se localizam em regiões
não codificantes, inter-gênicas ou em íntrons embora mais raramente, possam estar
associados a sequências codificantes (LI et al., 2002). Microssatélites de regiões
codificantes, geralmente, possuem repetições de trinucleotídeos e estão associados com
doenças em humanos, seu mecanismo de mutação difere dos outros microssatélites do
genoma (ELLEGREN, 2004). Quanto ao genótipo, os indivíduos podem ser
homozigotos ou heterozigotos, onde os homozigotos possuem dois alelos com o mesmo
número de repetições nos cromossomos homólogos, enquanto os heterozigotos possuem
número de repetições diferentes (OLIVEIRA et al., 2006).
As altas de taxas de polimorfismo dos microssatélites podem ser explicadas por
dois tipos de mutações:

5
 1- Slippage: ou deslizamento da polimerase, que ocorre durante a replicação
DNA na fase S da Intérfase. Neste processo, após a desnaturação da molécula de DNA
por ação prévia enzima helicase que atua rompendo as ligações de hidrogênio, as
proteínas globulares ligantes de fita simples, ou SSBPs (single stranded binding
proteins) acoplam-se mantendo separada a dupla-fita, formando a forquilha de
replicação. Como as fitas de DNA tem polaridade oposta e a DNA polimerase só atua
no sentido 5’→3’, uma das fitas é replicada continuamente no sentido 5’→3’ e a outra
tem replicação descontínua, gerando os denominados fragmentos de Okazaki. Na
síntese contínua a enzima RNA primase adiciona os primeiros nucleotídeos, fornecendo
a hidroxila livre no carbono 3’ da molécula de açúcar para que a DNA polimerase possa
prosseguir com a replicação. Na fita descontínua vários segmentos iniciadores são
adicionados pela RNA polimerase. O deslizamento da DNA polimerase ocorre quando
há um pareamento desigual da fita molde com a DNA polimerase. Quando esse
pareamento ocorre no sentindo 5’→3’, há uma adição de uma repetição de bases na
nova fita, de maneira que a replicação não seja semiconservativa. Quando o
deslizamento da DNA polimerase ocorre no sentido 3’→5, ocorre uma deleção de bases
nitrogenadas, diminuindo as repetições de bases (Figura 4) (LI et al., 2002; SNUSTAD;
SIMMONS; MOTTA, 2000.);
2- Por crossing-over desigual alterando o tamanho dos locos de microssatélites.
O crossing-over ou recombinação homóloga ocorre na prófase I da Meiose. Durante
essa fase os cromossomos homólogos realizam a sinapse permitindo a permuta de
alelos. No crossing-over desigual apenas uma parte de um dos dois cromossomos
homólogos sofre a permuta (Figura 5).
O grande número de alelos observado nos locos de microssatélites é devido a
alta taxa dessas mutações. Assim os alelos variam mais em número de repetições do que
na sequência de bases nitrogenadas (LI et al., 2002).
Os microssatélites são classificados de acordo com o tipo de repetições, como:
perfeitos, imperfeitos, interrompidos e compostos. Nos microssatélites perfeitos, as
sequências de repetições das bases não são interrompidas, seguindo a mesma sequência
ao longo dos pares de bases, como exemplo: TATATATATATA ou (TA)6. Nos
imperfeitos existe uma base diferente de todo o restante da sequência de repetições:
TATATACTATA, ou (TA)3CTATA; já nos interrompidos há uma pequena sequência
de pares de bases inserida ao longo da sequência do microssatélite: TATACGTGTATA,
ou (TA)2CGTG(TA)2 e nos microssatélites compostos, há duas sequências repetidas e

6
adjacentes: TATATAGTGTGT, ou (TA)3(GT)3. (DAWSON et al., 2010; OLIVEIRA et
al., 2006)

Figura 4. As bases nitrogenadas estão representadas por setas não preenchidas A)

Processo normal da replicação do DNA. B) Deslizamento (Slippage) da DNA
polimerase durante a replicação. Na replicação são formadas alças que provocam um
mal pareamento das fitas homólogas, no reparo desse mal pareamento ocorre o deslize
da DNA polimerase. C) Escorregamento da DNA polimerase acrescentando bases na
fita de DNA. D) Deslizamento da DNA polimerase originando deleções de bases.
Adaptado de SCHOCHETMAN et al. (1988).

7
Figura 5. Crossing-over desigual cromossomos homólogos onde as cromátides estão
mal alinhadas levando à duplicação de um segmento e a deleção do outro. As regiões
pretas e cinzas representam as regiões repetitivas do genoma. Retirado de
SCHOCHETMAN et al. 1988.
Marcadores Heterólogos de Microssatélite

Primers heterólogos são sequências iniciadoras da replicação do DNA que

realizam amplificação cruzada, ou seja, amplificam uma dada região do genoma em
uma alta gama de espécies, diferentes daquela para o qual foi desenvolvido
originalmente, podendo ser viável para diversos estudos. Os marcadores de
microssatélites costumam apresentar amplificação cruzada para espécies
filogeneticamente próximas. O desenvolvimento de primers heterólogos têm sido o
objetivo de vários pesquisadores, embora apenas um pequeno número desses
marcadores tem sido identificado (DAWSON et al., 2010).
A identificação desses primers é vantajosa, pois o desenvolvimento de
iniciadores da PCR para cada nova espécie a ser analisada, tem se tornado um obstáculo
por exigir expertise na área, demandar recursos e tempo. Para tal, são necessários
laboratórios com infraestrutura para o desenvolvimento, desde clonagem dos
fragmentos até o sequenciamento (DAWSON et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2006;
PRIMMER; MØLLER; ELLEGREN, 1996; SELKOE; TOONEN, 2006).
Alguns autores têm utilizado marcadores heterólogos e demonstrado certo
sucesso na taxa de amplificação em espécies filogeneticamente próximas. Tem sido
observado que quanto maior a distância filogenética, menor a chance de amplificação,

8
havendo menor número de alelos, devido a ocorrência de mutações nas regiões
flanqueadoras, onde os primers pareiam (PRIMMER et al., 1996; PRIMMER E
MERILO, 2002; LILLANDT et al., 2002). O sucesso da amplificação cruzada se dá
pela natureza homóloga nas regiões flanqueadoras dos microssatélites (PRIMMER E
MERILO, 2002). A amplificação cruzada em aves tem se mostrado vantajosa, pois
existe baixa frequência de microssatélites no genoma destes (LILLANDT et al., 2002).
Para síntese desses marcadores o primeiro passo é a identificação de um
marcador de sequência genética ou EST (Expressed Sequence Tag ou Etiquetas de
Sequência Expressa) que permite identificar, detectar e caracterizar rapidamente genes
expressos de um determinado organismo. Em aves, estas sequências têm sido utilizadas
para se obter marcadores de microssatélites como fonte para análise genética de
populações em vários táxons (ELLIS E BURKE, 2007).
Nas aves essas sequências foram utilizadas para desenvolver microssatélites para
Gallliformes e Passeriformes. Desse modo, primers de microssatélites foram
desenvolvidos apresentando amplificação cruzada em espécies tão distantes como
Taeniopygia guttata, Zebra finch ou Diamante-mandarim (Passeriformes) e Gallus
gallus, galo doméstico (Galliformes), a partir de sequências EST homólogas.. Os
primers foram projetados para facilitar os estudos, possuindo temperatura de fusão e
anelamento semelhantes e mesmas condições de PCR. Essas espécies foram escolhidas
por serem filogeneticamente distantes e desse modo, seria possível identificar locos
altamente polimórficos e conservados dentro da Classe Aves, sendo ideal para estudos
de ecológicos em uma ampla gama de espécies. (DAWSON et al., 2010).
O objetivo deste capítulo foi: Verificar a ocorrência de amplificação cruzada de
primers de microssatélites desenvolvidos para as espécies Taeniopygia guttata
(Passeriformes) e Gallus gallus (Galliformes) (DAWSON et al., 2010), em
Conopophaga melanops, visando futuros estudos ecológicos para esta espécie.

MATERIAL E MÉTODOS
Amostras Biológicas
Foi coletado sangue de 20 indivíduos de Conopophaga melanops, sendo 10
indivíduos capturados na Ilha Grande, município de Angra dos Reis e os demais 10
indivíduos na Reserva Ecológica de Rio das Pedras (ReRP), ambas situadas no estado
do Rio de Janeiro (Figura 6).
O sangue foi coletado mantendo-se a proporção de 1% em relação ao peso do
corpo (CAMPBELL 1994), com capilar heparinizado por meio de punção da veia do

9
tíbio-tarsal com agulha hipodérmica (calibre 0,30x 13 30 G ½) (licença Sisbio/ ICMBIO
nº 15998-2). Após a coleta, o sangue foi transferido para armazenamento em tubo
plástico tipo eppendorf de 1,5mL contendo 1 mL de etanol absoluto, posteriormente
sendo mantido na geladeira, para evitar evaporação.

Figura 6. A) Mapa do Brasil evidenciando o Estado do Rio de Janeiro. B) Mapa do

Estado do Rio de Janeiro, mostrando a distância entre a Reserva de Rio das Pedras, em
Mangaratiba e Ilha Grande, em Angra dos Reis, local onde foram coletadas as
amostras de Conopophaga melanops utilizadas neste estudo. Retirada de Silva, 2011.

A Ilha Grande é a maior das ilhas do litoral de Angra dos Reis, no Estado do
Rio de Janeiro (23º15’ S, 44º15’ W), com 28 km de leste-oeste e 12 km norte- sul e uma
área de 19.300 hectares. Toda Ilha Grande é uma área de proteção ambiental de acordo
com o a constituição do Rio de Janeiro, artigo 266 (ALHO; SCHNEIDER;
VASCONCELLOS, 2002). Por ser uma ilha continental a flora é muito similar ao
continente, é composta de espécies nativas da mata atlântica e exóticas , em sua maioria
localizada nas ruas e nos quintais das vilas. As florestas pertencem ao domínio
ombrófila densa ou floresta pluvial tropical, sendo encontradas as seguintes fisionomias:
floresta ombrófila densa submontana (de 50 a 500 m), floresta ombrófila densa montana
(500 m), floresta ombrófila densa das terras baixas (0-50 m), comunidade aluvial e
restinga (INEA, 2013). Há dois tipos de relevo, montanha e planícies costeiras, sendo
predominante o relevo montanhoso. As montanhas são formadas por pedras ígneas e as
10
planícies costeiras são formadas por sedimentos inconsolidado datando entre o
Pleistoceno superior e o Holoceno. O clima na região é tropical, com temperaturas e
precipitações alta durante o verão, com médias anuais de 23,2ºC. As chuvas são intensas
o ano todo, porém com maior frequência no verão e menor no inverno, com precipitação
anual de 1977 mm (ALHO; SCHNEIDER; VASCONCELLOS, 2002; INEA, 2013).
A Reserva Rio das Pedras fica localizada no Município de Mangaratiba, oeste do
Estado do Rio de Janeiro (22º59’ S, 44º05’ O), próximo à Baía de Sepetiba. É uma
Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN), possui 1.360 hectares, com altitude
entre 20 a 1.050 metros de altitude, é cortada por dois rios principais: o Rio Grande e o
Rio Borboleta. O clima é subquente, com temperaturas anuais de 22ºC, a temperatura
máxima obervada é de 38ºC e mínima de 12 ºC. Possui alta precipitação pluviométrica,
com uma média anual de 1900 mm, sendo os meses de Dezembro, Janeiro e Fevereiro
que correspondem a precipitação máxima. Seu domínio morfoclimático é a Mata
Atlântica, correspondendo a Floresta Pluvial Atlântica em diversos níveis de sucessão.
Altitudes abaixo de 200 m cobertos por mata secundária rala e acima de 200 m coberta
por mata secundária densa. Antigamente vários trechos eram utilizados para cultivo de
bananeiras, na área da reserva, que ainda são encontradas em áreas de 500 m de altura
(CARVALHO-E-SILVA; RAMOS; CARVALHO-E-SILVA, 2008; LOPES;
CHAUTEMS; ANDREATA, 2005; MEDEIROS; FONSECA; ANDREATA, 2004;
MYNSSEN; WINDISCH, 2004)

Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído a partir do sangue utilizando a técnica de
precipitação por Acetato de Amônio (NICHOLLS et al., 2000). Aproximadamente 50
μL de sangue foram adicionados em tubo do tipo eppendorf contendo 250 μL de
solução de digestão (20mM EDTA, 120mM NaCl e 50 mM Tris (base)) e 20 μL de
proteinase K (10 mg/mL). Os tubos foram homogeneizados no vórtex e levados ao
banho-maria a 55ºC por um mínimo de 4 horas ou 37ºC overnight. Após a digestão,
foram adicionados, 300 μL de solução de acetato de amônio 4M (pH 7,5). As amostras
foram homogeneizadas novamente em vortex em períodos regulares enquanto
permaneceram por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram realizadas
três centrifugações. Uma a 13.000 rpm/10 minutos, para precipitação das impurezas e o
sobrenadante aspirado com micropipeta e transferido para outro tubo plástico de 1,5
mL, estéril e identificado onde foi adicionado 1 mL de etanol absoluto. O tubo contendo
o precipitado foi descartado. As outras duas centrifugações foram realizadas a 13.000

11
rpm/15 min. Após a segunda centrifugação o etanol absoluto foi descartado, e logo em
seguida foi adicionado 1 mL de etanol 70% para lavar o pellet (precipitado). Após a
terceira centrifugação o etanol 70% foi descartado e os tubos foram mantidos abertos e
invertidos sobre papel-toalha, até que todo etanol tenha evaporado, deixando os tubos
totalmente secos. Uma vez secos, foram adicionados de 100 – 250 μL de solução
tampão (50 mM Tris e 0,1 mM EDTA. pH 8,0). A quantidade adicionada foi
proporcional ao tamanho do pellet. Em seguida, os frascos foram agitados gentilmente
para deslocar o pellet que fica aderido à parede do tubo, levados ao banho-maria (37ºC/
30 min.) para completa dissolução do DNA.

Quantificação do DNA extraído.

A primeira quantificação do DNA foi feita em gel de agarose 0,8%, corado com
Brometo de Etídio (10 mg/ mL) e uma alíquota foi diluída para a concentração de
aproximadamente 10 ng/µL. Nessa metodologia 2 µL das amostras são adicionadas aos
poços formados no gel de agarose imerso em uma solução tampão em cuba de
eletroforese. Para dar peso á amostra de DNA e possibilitar a aferição do seu
deslocamento no gel foram acrescentados a estas 0,5 μL de tampão de arrasto que
consiste de glicerol e corante azul de bromofenol (Loading Dye 6x). Em seguida, foram
submetidas à eletroforese a 77 volts (V) por 30 min. A quantificação em gel de agarose
é feita por comparação das bandas geradas no gel pelas amostras de DNA e as bandas
de uma amostra de DNA extraído de fago Lambda (λ), o qual já tem a concentração
conhecida. O brometo de etídio adicionado ao gel se intercala entre as bases na dupla
fita de DNA e quando submetido a luz UV em um transiluminador, emite fluorescência
e a estimativa de concentração da amostra é feita através da intensidade da
fluorescência. No gel é aplicado1 μL de DNA de fago λ de 25 ng/μL, a partir dessa
concentração analisamos a intensidade da fluorescência e estimamos a concentração das
amostras. As fotos dos géis foram capturadas através do aparelho de imagem LPIX
(Loccus Biotecnologia). Essa metodologia foi utilizada nas primeiras quantificações,
mas os resultados não foram satisfatórios, pois as bandas apareciam com arrasto no gel
dificultando a estimativa da concentração.

12
 Para uma quantificação precisa foi utilizado NanoDrop 2000/2000c
Spectrophotometer (Thermo Scientific ®), no Laboratório de Genética Marinha da
Universidade Estadual do Rio de Janeiro (LGMar/UERJ). Esse aparelho quantifica o
DNA de acordo com a lei de Lambert-Beer.

Onde c é a concentração do DNA em ng/µL, Abs a absorbância de 260 nm, que

corresponde ao pico de absorção de UVs do DNA, letra ‘e’ corresponde o coeficiente de
extinção (que para o DNA corresponde 50 ng.cm/ µL) e a letra ‘b’ corresponde a altura
da coluna criada pelo espectrofotômetro (que nesse caso corresponde a 1 cm). Assim
quando o NanoDrop mede a absorbância a 260 nm obtêm-se um valor, que multiplicado
por 50 (constante e) indica a concentração de DNA na amostra, em ng/µL.
Outra absorbância que o NanoDrop mede é a de 280 nm, que corresponde ao
pico de absorção de UV de proteínas, e a 230 nm, que corresponde ao pico de absorção
de UVs de contaminantes orgânicos. Assim, fazendo a razão entre 260/280 e 260/230
pode-se verificar a pureza da amostra, se esta contaminada com proteínas ou solventes
orgânicos, como Fenol e Tris. Considera-se uma amostra pura quando a razão entre as
absorbâncias estão entre 1,8 e 2,0. Após a quantificação a solução estoque de DNA
(mais concentrada) foi armazenada em freezer a -20 ºC e uma alíquota foi diluída para a
concentração adequada à PCR, de 10ng/uL, mantida em geladeira durante as análises.

Reações em Cadeia da Polimerase (PCR)

A PCR utilizando os primers TG01-000 (F: TTGCTACCARAATGGAATGT,
R: TCCTAACCATGAGAAGCAGA) e TG01-077 (F:
GGTATGTCACTTATCAAAAACAAGC, R: AAATGGCAGGTAAGGTACTCTC)
foi preparada seguindo o protocolo descrito por Dawson et al.,. (2010) (Tabela 1). Para
cada reação de 10 μL foram adicionados 1 μL de solução Tampão 10X , 0,8 μL de
MgCl2, 0,2 μL de dNTP na concentração de 10 μM , 1 μL dos primers senso e anti-
senso na concentração de 10 μM, 0,8 μL de, 0,05 μL de Taq DNA polimerase (5U) e 2
μL de DNA genômico na concentração de 10 ng/ μL. Os ciclos programados no
termociclador constituíram de um período inicial de desnaturação de 94ºC por 3
minutos , seguindo de 35 ciclos de amplificação a 94ºC por 30 segundos, 56º C por 30
segundos, 72ºC por 30 segundos e um ciclo final de extensão a 72ºC por 10 minutos. Os
produtos da PCR foram separados por eletroforese durante 2h a 120 V em gel de
poliacrilamida a 12%. Foram aplicados 1μL de DNA Ladder, padrão de peso molecular

13
de 100 pb, utilizado para identificar o tamanho aproximado de uma molécula num gel
após a eletroforese. Em cada poço do gel foram aplicados 2 μL de produto da PCR. Foi
utilizado controle negativo (reações sem DNA para investigar ocorrência de
contaminação) em todas as reações de amplificação. Para visualização das bandas, o gel
foi corado com solução de nitrato de prata a 0,2% e para a revelação foi utilizada
solução de hidróxido de sódio a 3%. A imagem do gel foi registrada com equipamento
LPixEX®- Loccus biotecnologia.

Tabela 1. Informações sobre o tipo de microssatélite amplificado com os primers

desenvolvidos para Zebra finch (ZF) ou Diamante-mandarim (Taenopygia guttata) e
Domestic chicken (CH), galo doméstico (Gallus gallus) com relação à temperatura de
anelamento (TA) e número de pares de bases (pb) dos alelos (A) amplificados em cada
espécie.

Tipo de microssatélite TA(oC) A (ZF) A (CH)

Primers em ZF/CH

TG01-000 (AT)8,8,3,2,3,8 F:55.67 253pb 190pb

/ (AT)9 R:55.99
TG01-077 (A)11 (CA)3/(A)12 & (CA) F:58,28 153pb 154pb
R:57, 89

RESULTADOS
Os resultados da quantificação em gel de agarose foram superestimados. De
acordo com a estimativa comparada ao DNA padrão de fago (ƛ), a concentração do
DNA foi considerada entre 30-95 ng/μL. Por esse motivo, quando as amostras foram
diluídas para 10 ng/μL como no protocolo descrito por Dawson et al. 2009, as amostras
não amplificavam.
Nos resultados da quantificação do NanoDrop, a concentração variou de 15,3-
73 ng/μL, enquanto na faixa de absorbância de 260/280 variaram de 1,68-1,86. Para a
faixa de absorbância de 260/230 variaram de 1,61-2.03. Estes resultados demonstram
que o DNA estava em boa qualidade, sem contaminantes orgânicos e proteínas.
Após a quantificação do DNA, foram realizados testes de concentração para
estimar qual melhor concentração do primer e do DNA para a PCR (Tabela 2). Os

14
melhores resultados do teste foram com as amostras 3, 4, 5 e 6. As amostras 3 e 4 com
25 ng/ μL de DNA combinado com primers na concentração de 1 μM e as amostras 5 e
6 com concentração do DNA em 10 ng/μL e primer com 1 μM. Assim, os primers
TG01-077 e TG01-000 foram testados em 20 amostras. Apenas 13 amostras (Tabela 2)
amplificaram utilizando o primer TG01-077, algumas apresentado dois alelos
amplificados e outras com apenas um. Os alelos variaram de 150pb o menor e 200 pb
para o maior alelo (Figuras 7 e 8, Tabela 3). Mesmo com os testes realizados nenhuma
amostra amplificou para o primer TG01-000.

Tabela 2. Teste para avaliar a concentração ideal de primer x DNA para amplificação de
locos de microssatélites por Reação em Cadeia da Polimerase. Em negrito estão os
códigos das amostras de Conopophaga melanops, uma da Ilha Grande (C34) e outra, da
Reserva Estadual Rio das Pedras (C69) diluídas para concentrações de 50, 25, 10 e 5
ng/μL. Os primers foram diluídos para as concentrações de 10, 5 e 2,5μM. Todas as
concentrações de primers e DNA foram combinadas para a avaliação do melhor
resultado de amplificação. Os números de 1 a 8 correspondem a identificação das PCRs.

Concentração
primer TG01- 50 ng/μL 25 ng/μL 10 ng/μL 2,5 ng/μL

000 DNA

10 μM 1 2 3 4 5 6 7 8
5 μM 9 11 12 13 14 15 16
2,5μM 17 18 19 20 21 22 23 24
Amostras C 69 C34 C69 C34 C69 C34 C69 C34

15
Tabela 3. Número da anilha (A), código das amostras (CA), localidades de coleta das
amostras de Conopophaga melanops- Reserva Estadual Rio das Pedras (RERP) ou Ilha
Grande (IG), número de alelos (NA) e número de pares de bases (pb) amplificados para
cada o loco de microssatélite utilizando o primer heterólogo TG01-077.

A CA Localidade NA L (pb)

E120430 C69 RERP 1 180

E80329 29 RERP 1 160
E80333 33 RERP 1 160
E120403 C62 RERP 2 160/180
E120428 CO1 RERP 1 160
E14400 C4 IG 1 160
E47436 C5 IG 2 160/180
E47543 C02 IG 1 160
E67876 76 IG 1 160
E67827 27 IG 1 160
E67853 53 IG 2 160/200
E95659 C34 IG 1 180
E74314 14 IG 2 160/200

16
 L C4 C5 C02 C62 C01

200 pb→

100 pb→

Figura 7. Gel de poliacrilamida 5% corado em solução de nitrato de prata 0,2 % com

fragmentos amplificados por PCR com o primer TG01-077,. L representa Ladder de
100 pb. As amostras C4, C5 e C02 foram indivíduos de Conopophaga melanops
capturados na Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ e as amostras C62 e C01 foram
capturados na Reserva Estadual de Rio das Pedras.

L N 14 76 33 29 27 53

200 pb→

100 pb→

Figura 8. Gel de poliacrilamida 12% corado em solução de nitrato de prata 0,2 % com
fragmentos amplificados por PCR com o primer TG01-077. L representa Ladder de 100
pb. N representa o negativo. As amostras 14, 76, 27 e 53 foram dos indivíduos de
Conopophaga melanops capturados na Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ e as amostras 33
e 29 foram capturadas na Reserva Estadual de Rio das Pedras.

17
DISCUSSÃO
Dos dois primers testados, houve amplificação cruzada de apenas um, a partir
das amostras de Conopophaga melanops. Com relação ao loco amplificado utilizando o
primer TG01-077 os testes de ajuste de concentração foram eficazes para a amplificação
e foi comprovado polimorfismo neste loco para Conopophaga melanops. Três alelos
foram detectados em amostras de 13 indivíduos. Não houve amplificação nos outros 7
indivíduos, isso pode ter acontecido por problemas na extração do DNA. Os alelos
apresentaram aproximadamente 160pb, 180pb e 200pb. Dos 13 indivíduos estudados, 4
são heterozigotos e 9 homozigotos (Tabela 3). Nos indivíduos testados por Dawson et.
al (2010) os alelos variam de 149-153pb em T. guttata e de 151-154pb em G. gallus. A
variação de tamanho dos alelos observado para C. melanops está de acordo com o
observado para as espécies originais. A taxa de polimorfismo de 30% das amostras de
Conopophaga melanops demonstra que este é um loco promissor para ser testado em
um maior número de indivíduos com potencial para ser utilizado em futuros estudos
ecológico para a espécie.
Não houve amplificação das amostras de Conopophaga melanops utilizando o
primer TG01-000. Este resultado foi inesperado, uma vez que esse loco amplificou com
alto grau de heterozigosidade para todas as 21 espécies testadas por Dawnson et al.
(2010). A temperatura de anelamento que foi utilizada para a amplificação deste loco
em Conopophaga melanops foi a mesma indicada por Dawson et al. (2010), porém
ajustes podem ser necessários quando utilizado em espécie diferente da original.
Mutações na região flanqueadora do loco podem ocorrer em espécies próximas
dificultando o pareamento do primer. Reduzindo a temperatura de pareamento também
pode ser reduzida a estringência ou especificidade do primer à sequência alvo tornando
possível por vezes a amplificação (SAMBROOK, 1989) Embora testes de concentração
tenham sido efetuados, estes não foram suficientes para permitir a amplificação.

Capítulo 2 - Confirmação do sexo por DNA no Sabiá-da-praia, Mimus

gilvus (Aves: Passeriformes) da Ilha Marambaia, Mangaratiba, RJ.

18
INTRODUÇÃO
Espécie estudada
A família Mimidae é um táxon exclusivo das Américas, ocorrendo do sul do
Canadá até a Argentina e o Chile. É composta por 34 espécies e no Brasil é representada
por 3 espécies do gênero Mimus: Mimus saturninus, Mimus triurus e Mimus gilvus.
Conhecido popularmente como Sabiá-da-praia, M. gilvus tem sua distribuição na
Antigua e Barbuda, Aruba, Barbados, Belize, Colômbia, Dominica, El Salvador, Guiana
Francesa, Granada, Guadalupe, Guatemala, Guiana, Honduras, Martinica, México,
Monteserrat, Nicarágua, Panamá, São Cristovão e Nevis, Santa Lucia, São Vicente e
Granadinas, Suriname, Trinidad e Tobago, Venezuela, Bolívia, Costa Rica e Equador
(ARGEL-DE-OLIVEIRA, 1994). No Brasil, sua distribuição se estende pelo litoral
desde o extremo norte, em Roraima, até o estado do Rio de Janeiro, na Restinga da
Marambaia (Figura 9) (Araújo e Maciel, 1998 apud Zanon, 2010, p. 23).
As espécies de Mimus não se destacam pelos coloridos das penas, e sim pela
beleza do canto e habilidade de imitar sons alheios, como mímicos, sugerido pelo nome
da família e do gênero, sendo também no inglês chamados de Mockingbirds, pássaros
zombadores (ARGEL-DE-OLIVEIRA, 1994). Medem em torno de 26 cm do bico até a
ponta da cauda, possuem cauda longa e graduada; asas curtas e arredondadas; pernas
longas e fortes (adaptadas a hábitos terrícolas); bico delgado podendo ser reto ou
curvado para baixo, coloração cinza-claro, fronte, sobrancelhas e lado inferior branco
puro, flancos rajados de negro. A íris é vermelha alaranjada e no imaturo é cinzenta, não
possuindo dimorfismo sexual (Figura 10). Mimus gilvus é considerado onívoro,
forrageando o solo e as plantas atrás de frutos e insetos (ARGEL-DE-OLIVEIRA, 1994;
SICK, 2001). Os frutos compõem 80% da sua dieta (SOUZA; LOISELLE; ALVES,
2008).
Quanto ao seu status de conservação a espécie é considerada “em perigo” de
extinção nos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, de acordo com listas divulgadas
pelos governos de estado (Simon et al., 2007, http://institutolife.org/wp-
content/uploads/2014/02/Lista-da-Fauna-Ameacada-deExtincao-RJ.pdf). No Brasil
oriental essa espécie só ocorre nas restingas, de vegetação esparsa e rica em cactos,
onde são vistos pousados sobre os espinhos (SICK, 2001). As principais ameaças à
espécie são a destruição de seu hábitat e a captura para o mercado clandestino de aves
de gaiola. Recente estudo verificou que essa espécie sofreu uma redução da sua área de
ocorrência de 62,6% a 92% em 20 anos, devido ao alto nível de degradação das

19
restingas fluminenses, havendo um declínio populacional. Isso pode ser observado,
através da distribuição no Rio de Janeiro, que antigamente se dava da Marambaia até
Barra de Itabapoana, na fronteira com Espírito Santo e hoje essa distribuição ocorre da
Marambaia até a Restinga de Jurubatiba em Macaé, ocorrendo buracos na distribuição
onde anteriormente era contínua. (Figura 11). (ZANON; VALE; ALVES, 2015)

Figura 9. Distribuição de Mimus gilvus, na América Central e do Sul, evidenciando em

amarelo os países onde ocorre: Antigua e Barbuda; Aruba; Barbados; Belize; Colômbia;
Dominica; El Salvador; Guiana Francesa; Granada; Guadalupe; Guatemala; Guiana;
Honduras; Martinica, México; Monteserrat; Nicarágua; Panamá; São e Nevis; Santa Lucia;
São Vicente e Granadinas; Suriname; Trinidad e Tobago; Venezuela, Bolívia, Costa Rica e
Equador. No Brasil está presente nos estados de extremo norte, em Roraima, até o estado do
Rio de Janeiro, particularmente em restingas. Retirado de
http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=22711029.

20
 A B

Figura 10. A) Mimus gilvus (Aves: Passeriformes) na Ponta da Pombeba, Ilha da

Marambaia, RJ. Utilizando cacto como poleiro. Foto: Joana Gama. B) Cor da íris
alaranjada, que ocorre em indivíduos adultos. Foto: Ramiro Melinsky.

Figura 11. Lado superior esquerdo: mapa do Brasil, evidenciando o Estado do Rio de Janeiro.
1) Antiga distribuição de Mimus gilvus, ao longo de todo estado do Rio de Janeiro. 2)
Distribuição atual, linha em negrito mostrando os locais onde M. gilvus ainda é encontrado.
Retirado de ZANON; VALE; ALVES (2015).

Área de Estudo
Na Marambaia, limites ao sul da distribuição dessa espécie são observados três
formações vegetais podem ser identificadas: o Manguezal, a Restinga e a Floresta
Atlântica. A Floresta Atlântica ocupa uma área de 2125,43 há, seu dossel é formado por
árvores entre 12- 30 metros de altura. Porém em vários trechos são encontradas árvores
entre 6-10 metros, destacando-se as espécies pioneiras que ocupam clareiras abertas, por

21
causa de distúrbios antrópicos. No estrato arbustivo encontre-se bem representadas as
famílias Rubiaceae, Piperaceae e Myrtacea, e no estrato inferior sobressaem às famílias
Marantaceae, Araceae e Piperaceae. O manguezal ocupa uma faixa de 437,71 ha, é
pobre em oxigênio, com espécies que crescem em solo lodoso, os troncos e raízes são
periodicamente submersos e apresentam adaptações fisiológicas especiais. As espécies
mais encontradas no mangue da Marambaia são o mangue-vermelho (Rhizophora
mangle), mangue-branco (Laguncuria racemosa) e mangue-siriuba (Avicennia
schaueriana). E a restinga, é de formações herbáceas e arbóreas, essas vegetações
podem ocorrer sobre dunas e cordões arenosos e ainda entre cordões. Ocupa uma área
de 4.961,3 ha km. Na parte leste da restinga, denominada ponta da pombeba ocorre o
Mimus gilvus. A vegetação embora tenha sofrido interferências, encontra-se
relativamente bem preservada. (CONDE; LIMA; PEIXOTO,2005)
A ilha da Marambaia, limite ao sul da distribuição dessa espécie, localiza-se na
baía de Sepetiba, no sul do Estado do Rio de Janeiro (23º01’56.90’’S; 43º53’37.89’’O)
(Figura 12). Possui uma estreita faixa de areia onde se encontra a Restinga da
Marambaia. Na ilha da Marambaia o ecossistema ainda se encontra bem preservado,
devido a esta ser uma área de acesso restrito pela Marinha do Brasil há cinquenta anos e
também por ser oficialmente uma Área de Proteção Ambiental (Área de Proteção
Ambiental de Mangaratiba – Decreto 9.802 de 1987). Na década de 80, foi assinado um
convênio entre a UFRRJ e a Marinha do Brasil, que fornece apoio para a realização de
projetos de pesquisa elaborados por alunos e professores da universidade (ANTONINI,
2007). O relevo varia de plano até 100 m de altitude, sendo seu maior ponto de altitude
o Pico da Marambaia, que atinge 641 m (CONDE; LIMA; PEIXOTO, 2005). O clima é
considerado Tropical Chuvoso, com maior temperatura média mensal ocorrendo em
fevereiro (26,8ºC) e menor média mensal em agosto (20,9ºC). As chuvas são
abundantes no verão e escassas no inverno e a média anual de precipitação é superior a
1000 mm A umidade relativa do ar é alta, aproximadamente 81% diminuindo um pouco
no inverno, devido a posição geográfica, que sofre com a proximidade do mar. Os
ventos provenientes do norte, com velocidade média de 2,2 a 2,7 m/s, são
predominantes na região entre os meses de janeiro a julho, embora também ocorram
ventos do Sul e Sudeste. Os ventos do Sul predominam entre agosto e dezembro, com
velocidade média de 3,2m/s (MATTOS, 2005).
Na parte leste da ilha está localizada a restinga da Marambaia, que possui uma
extensão de areia com aproximadamente 40 km, distribuindo-se por três municípios:
Rio de Janeiro, Itaguaí e Mangaratiba. São encontradas formações herbáceas e arbóreas.

22
A extremidade oeste mede 3.500m de largura e a extremidade leste 1.800m, sendo
separada do continente pelo Canal do Bacalhau. A parte norte da Restinga está voltada
para Baía de Sepetiba e a face sul pelo Oceano Atlântico (PEREIRA; DE MENEZES;
SCHULTZ, 2008; RONCARATI E MENEZES, 2005) (Figura 10).
A formação da restinga aconteceu a partir do final da última transgressão, no
quaternário. Ela é formada por dois cordões arenosos um interno e um externo de idades
distintas. O cordão arenoso interno se deu há cerca de 1.500 A.P através de correntes
litorâneas procedentes do oeste, que penetravam através da abertura primitiva da
enseada, provocando uma nova corrente que passou a circundar a enseada. Essa nova
corrente ressuspendeu areias do fundo marinho e foi perdendo velocidade e capacidade
de transporte de sedimentos, na altura do Pico da Marambaia, que nessa época era uma
ilha. Os sedimentos foram sendo depositados à leste da ilha, formando a primeira raiz
do cordão interno arenoso, que começaria a migrar rumo a leste até a Ponta de
Guaratiba, assim isolando parcialmente a enseada primitiva do mar aberto, originando a
Baía de Sepetiba. A formação do cordão arenoso externo foi feita pelo mesmo
mecanismo de correntes litorâneas, responsáveis pela formação do cordão interno. As
correntes litorâneas mobilizaram areias submersas na face sul do cordão interno e da
plataforma continental. Após a formação do cordão, a depressão criada formou uma
laguna, e posteriormente as cúspides tabulares e triangulares da laguna e baía. Na
Marambaia a origem dessa cúspide esta baseada na movimentação das areias do cordão
interno, através da ação erosiva das correntes de circulação interna, formando uma
cúspide em forma de esporão, denominada Ponta da Pombeba (RONCARATI E
MENEZES, 2005). A Ponta da Pombeba (23º 04 S/ 43º53 W), esta localizada entre duas
baias, na parte leste da Marambaia, voltada para o continente, entre a restinga e a ilha. A
porção oeste é banhada pela baía da Marambaia e a norte pela baía de Sepetiba.
(CONDE; LIMA; PEIXOTO, 2005).

23
Figura 12. A) Mapa da América Latina, destacando em vermelho o estado do Rio de
Janeiro, no Brasil. B) Mapa do Rio de Janeiro, evidenciando a Marambaia. C) Mapa da
Marambaia, Mangaratiba. Local onde o marcador amarelo se encontra, indica a Ponta
da Pombeba (23º 04 S/ 43º53 W),

Confirmação do sexo na ausência de dimorfismo sexual aparente nas aves.

A confirmação do sexo é muito importante para completar estudos
comportamentais, populacionais e avaliar a proporção sexual para o manejo de espécies
em extinção (ANCIÃES; NASSIF; LAMA, 2002; GRIFFITHS et al., 1998). Em
algumas aves que possuem dimorfismo sexual a diferenciação do sexo é facilmente
observada, pois estas apresentam plumagens e tamanho diferentes entre machos e
fêmeas, podendo também exibir comportamento característico ao sexo – como exemplo
o dançarino-de-coroa-vermelha (Machaeropterus regulus) da família Pipridae. O macho
possui a parte superior da cabeça vermelho escarlate, o dorso verde-oliváceo, e o ventre
creme com listras finas avermelhadas, a plumagem da fêmea é semelhante, mas com as
listras ventrais apagadas e sem a coroa vermelha. Além de dimorfismo sexual essa
espécie possui comportamento de corte onde o macho faz uma sequência de
movimentos para chamar atenção da fêmea, no acasalamento (SILVA et al., 2000). Há
também aquelas que não possuem dimorfismo quando filhotes, como é caso do
Tangarazinho (Ilicura militares), em que machos jovens e machos sexualmente
imaturos apresentam plumagem inicial indistinguível da plumagem das fêmeas
(ANCIÃES; NASSIF; LAMA, 2002). Estima-se que em 50% das espécies de aves do

24
mundo se enquadram nesse exemplo (GRIFFITHS et al., 1998). Por outro lado, existem
aves que não possuem dimorfismo sexual aparente, sendo macho e fêmea idênticos
quando adultos, diferindo dos filhotes por sutis características morfológicas como, no
caso do sabiá-da-praia (M. gilvus), no adulto a coloração da íris é amarela e no juvenil é
mais escura chegando ao um tom acinzentado, e os flancos rajados (RIDGELY E
TUDOR, 1989; SICK, 2001.).
Existem várias técnicas em que podemos confirmar o sexo das aves, entre elas a
laparoscopia, análise da cloaca e sexagem de esteroide fecal (ANTUNES; OLIVEIRA,
2006; BERCOVITZ et al., 1978; GRIFFITHS, 2000; MILLER; FREDERIC, 1955). A
laparoscopia é um procedimento cirúrgico para a visualização das gônadas. Essa técnica
é feita através de um instrumento telescópio muito fino introduzido em um pequeno
orifício feito cirurgicamente. Para a execução dessas técnicas é necessário o uso de
anestesia e de recuperação após a cirurgia, podendo trazer complicações e estresse à
ave. Para aves de pequeno porte a tarefa se torna ainda mais complicada, por causa da
escala cirúrgica, podendo perfurar um saco aéreo. Por esses motivos essa técnica se
torna pouco prática e usual, além de cara (GRIFFITHS, 2000). O método de análise da
cloaca consiste em inserir um espéculo nasal modificado, uma espécie de pinça, para
permitir a identificação das características da cloaca. Os machos possuem duas papilas
cônicas, uma de cada lado da cloaca, que terminam em canais deferentes, já as fêmeas
não possuem esse canal, mas o oviduto pode ser visto na parede da cloaca, no lado
esquerdo. Nessa técnica o especulo nasal é modificado, e caso não seja executada
corretamente danos podem ser causados ao tecido da cloaca. Além disso, se a época de
reprodução da ave não for conhecida o especulo deve ser inserido em aves sexualmente
maduras com extremo cuidado, pois pode ferir a fêmea com ovo no oviduto (MILLER
E FREDERIC, 1955). Na sexagem fecal são coletados os excrementos das aves
determinando a relação entre os hormônios femininos (estrógenos) e masculinos
(andrógenos), feita através da razão estrógeno/andrógenos. Esses hormônios são usados
como parâmetro por apresentarem importância na maturação sexual das aves. Se a razão
entre eles tiver valores altos devido à alta concentração de estrógenos e baixa
concentração de andrógenos, a ave será identificada como fêmea. Se o resultado for
baixo (o inverso do primeiro), será identificada como macho. Alguns fatores como
época reprodutiva e maturação sexual, podem influenciar nos resultados, pois os níveis
de esteroides aumentam durante o desenvolvimento sexual e durante a época
reprodutiva, sendo assim apenas 70% dos resultados correto (ANTUNES E OLIVEIRA,
2006; BERCOVITZ et al., 1978).

25
 Outra opção é através da citogenética, onde os cromossomos autossomos e
sexuais podem ser visualizados e contados. A cultura é feita com células vivas, nelas é
adicionado uma solução de colchicina para interromper o ciclo em divisão celular, na
fase de metáfase. Nessa fase o material genético está mais condensado e
individualizado, tornando a morfologia dos cromossomos mais fácil de observar. A
cultura de células é colocada e uma lâmina e corada com Giemsa. As lâminas são
analisadas ao microscópio e o cariótipo montado. As aves possuem uma grande
quantidade de cromossomos, variando de 40 a 126 macro e microcromossomos. Os
macromossomos têm morfologia definida e os micro não. Nas aves o sexo genético é
determinado inicialmente por cromossomos sexuais distintos denominados Z e W,
sendo as fêmeas o sexo heterogamético (ZW) e os machos homogaméticos (ZZ). O
cromossomo Z é, em geral, um macrocromossomo de tamanho médio e o cromossomo
W é um dos menores dentre os macrocromossomos (GRIFFITHS, 2000; HAMMAR,
1966). Na prática problemas como método de coleta e de cultura das células, fazem da
citogenética um processo complicado e demorado para a sexagem de aves. O melhor
método de cultura de celular é através da polpa de penas em crescimento, que podem ser
coletadas na muda ou arrancadas, esperando de 10-15 para o crescimento do canhão
onde as células vivas serão extraídas. Isso reduz a praticidade da técnica, uma vez que
pode ser difícil arrancar as penas de aves silvestres e depois esperar que cresçam. Para
isso teríamos que deixar a ave em cativeiro, causando um estresse ou sendo inviável em
algumas situações (GRIFFITHS, 2000).
Com intuito de melhorar as técnicas de identificação do sexo e eliminar as
limitações das antigas técnicas, estudos foram sendo aprimorados e a sexagem
molecular tem se mostrado uma técnica eficiente, prática e pouco invasiva para
identificação do sexo, uma vez que ela pode ser realizada com poucas gotas de sangue
ou algumas penas com bulbo, jovens ou adultas. Na sexagem molecular a distinção
entre o sexo feminino e o masculino é feita através de genes, que são regiões
conservadas em muitas espécies e podem ser amplificadas através de primers
especializados. A determinação cromossômica nas aves é designada pelo gene Cromo-
helicase ligadora de DNA (CHD), localizado nos cromossomos sexuais das aves, é
homólogo ao gene CHD do rato. Por serem espécies filogeneticamente distantes, pode-
se dizer que o gene é bastante conservado, amplificando assim em quase todas as
espécies de aves, com exceção das ratitas. O gene CHD-W está localizado no
cromossomo W das Aves, que apenas as fêmeas possuem, por serem ZW. Uma segunda
similar cópia do gene esta localizadas no cromossomo Z, é denominado CHD-Z. Os

26
primers P2 e P8 amplificam íntrons localizados entres os genes CHD-Z e CHD-W, os
íntros são bastante conservados e estão presentes no genoma das aves desde do ancestral
comum de Eoaves e Neoaves (ELLEGREN; FRIDOLFSSON, 1997; GRIFFITHS;
DAAN; DIJKSTRA, 1996; GRIFFITHS et al., 1998). Nas aves fêmeas (ZZ), pode-se
obsevar na eletroforese uma banda, e nos machos (ZW) duas bandas. Polimorfismos no
loco do CHD-Z podem ocorrer, variando no comprimento dos íntrons. Assim os machos
que possuem polimorfismos terão íntrons de diferentes tamanhos e duas bandas poderão
ser observadas na eletroforese, como nas fêmeas. Impossibilitando a identificação do
sexo (SHIZUKA; LYON, 2008). Aqui serão abordados, apenas, os primers propostos
por Fridolfsson e Ellegren(1999) e Griffiths et al. (1998), pois são os primers mais
utilizados para a confirmação do sexo.
Fridolfsson e Ellegren (1999) desenvolveramos primers 2550F (5'-
GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3') e 2718R (5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-
3') altamente conservados, que amplificam íntrons de tamanhos diferentes dos genes
CHD de aves ao longo de toda filogenia. Uma diferença de tamanho foi verificada entre
os introns dos genes, no CHD-W apresentou tamanho entre 400 e 450 pb e o CHD-Z
tamanhos variando entre 600 e 650 pb. Desse modo, machos e fêmeas puderam ser
identificados, pela diferença de tamanho entre os fragmentos. As fêmeas possuíam dois
fragmentos, um com tamanho entre 400 e 450pb (CHD-W) e outro fragmento entre 600
e 650pb (CHD-Z), enquanto os machos possuíam apenas um fragmento entre 400 e 450
(CHD-W) (FRIDOLFSSON; ELLEGREN, 1999), quando analisados por eletroforese
em gel. Griffiths et al. (1998) utilizaram uma técnica similar à descrita acima, porém
amplificando diferentes introns. Os introns amplificados são de sequências homólogas
ao gene CHD de diversos vertebrados, amplificados por um par de primers
denominados P8 (5'-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3') e P2 (5'-
TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3'). Também foram gerados fragmentos de diferentes
tamanhos para as regiões intrônicas amplificadas do gene CHD ligado aos cromossomos
sexuais Z e W.
A técnica descrita por Griffiths obteve sucesso em 99% nas amostras testadas ,
servindo para a sexagem de todas as aves, com exceção das ratitas. Diferentemente da
técnica descrita por Fridolfsson e Ellegren (1999), que em três espécies de
passeriformes os fragmentos foram indistinguíveis (os fragmentos amplificados foram
de idênticos tamanhos no macho e na fêmea). Isso acontece porque há uma divergência
no sítio de iniciação do gene CHD-W, impedindo a amplificação da sequência

27
específica das fêmeas nos passeriformes (FRIDOLFSSON; ELLEGREN, 1999;
GRIFFITHS et al., 1998).
Os objetivos deste capítulo foram: confirmar o sexo de indivíduos de Mimus
gilvus, o sabiá-da-praia, capturados na Ponta da Pombeba, Maramabaia, Mangaratiba,
Rio de Janeiro, sem dimorfismo sexual aparente, utilizando a análise genética molecular
, através dos primers P2 e P8 descritos por Griffiths et al. (1998). Descrever o tamanho
dos fragmentos CHDZ/CHDW ainda não conhecido para esta espécie comparando-os
com a espécie congênere e outras espécies.

MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras biológicas
O trabalho de campo foi realizado uma vez por mês, durante 6 meses, com
duração de dois dias. Foram utilizadas 3 redes ornitológicas de neblina (1,2x2,0m e
malha de 36mm) (Figura 13), sendo colocadas onde as aves sobrevoavam com
frequência. O Playback, que é uma gravação do canto da espécie foi colocado próximo
à rede, pois foi visto que ele melhora o esforço de captura, atraindo as aves para rede.
(LIMA; ROPER, 2009). As redes foram abertas na parte da manhã, por volta das 8h
30min, e fechadas no horário em que temperatura estava mais alta, neste horário as aves
costumam ter baixa atividade (das 11h00min até as 14h00min). Após as 14h00min as
redes eram abertas novamente e fechadas às 16h30min, em um total de 5 horas diárias.
Os indivíduos capturados foram identificados, pesados e anilhados com anilhas
metálicas fornecidas pelo CEMAVE/ICMBio (Centro Nacional de Pesquisa e
Conservação de Aves Silvestres/Instituto Chico Mendes/Ministério do Meio Ambiente).
As amostras de sangue foram coletadas de aproximadamente 7 indivíduos de M.
gilvus. Para a extração de sangue, o local foi desinfetado com álcool 70% e as penugens
retiradas. A punção da veia braquial foi feita com agulha calibre 13x 4, 5 mm(26G1/2).
Foram extraídos 50 a 100 µL de sangue (2 a 3 gotas) coletados com capilar
heparinizado. O local da extração foi pressionado com algodão embebido em álcool e
foi verificado se a coagulação procedeu normalmente. O sangue foi armazenado em
tubo plástico de 1,5 mL contendo 1 mL de álcool etílico absoluto (Figura 14). Cada tubo
foi identificado com o nome da espécie, data de coleta, local da coleta e o número da
anilha, sendo mantido em temperatura ambiente até chegar ao laboratório quando foi
armazenado em geladeira a 4°C para evitar evaporação. O sangue de um indivíduo de
M. gilvus proveniente do Centro de Triagem de Animais Silvestres do estado do Rio de
Janeiro (CETAS/RJ), também foi coletado.

28
 Figura 13. Redes de neblina Ornitológicas (1,2x2,0m e malha de 36mm),
evidenciando a formação de bolsas na rede.

Figura 14. Extração do sangue de Mimus gilvus. A) Punção da veia braquial feita com
agulha calibre 13x4,5 mm (26G1/2) e B: Coleta do sangue com capilar heparinizado.
Evidenciando a anilha colorida e prata. Foto: Monique Macedo

Extração do DNA.
A extração do DNA foi realizada pelas técnicas de lise celular (KHATIB;
GRUENBAUM, 1996), que consiste em romper a membrana das células e liberar o
DNA, juntamente com as proteínas e restos celulares. A técnica de lise celular é simples

29
e rápida. Adiciona-se em tubos de 1,5 mL um pequeno volume de sangue com 40 μL de
NaOH (50 μM), sendo colocado então em banho-maria à 99ºC por 10 Min. Após esse
tempo, os tubos são centrifugados a 1200 RPM. Para neutralizar a reação de lise são
adicionados 50 μL de tampão TRIS-HCl 1M; pH 8,0 e por fim até 300 μL de água ultra-
pura de acordo com a coloração da solução para que ao final mantenha uma cor âmbar.
Não é necessária a quantificação já que na lise celular as impurezas permanecem na
solução com o DNA, não apresentando bom resultado em gel.

Reações de PCR para a confirmação do sexo

Foi preparada a PCR com os primers P2 (5'-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3')
e P8 (5'-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3'), para amplificação dos genes
CHDZ/CHDW de acordo com Griffiths et al. (1998). As reações continham 10 μL, em
tubos de 0,2 mL, e consistiram de 1 μL de DNA (10 ng/μL), 5 μL de Green Master Mix
(Promega®), 1 μL de cada primer P2 e P8 (10 μM) e 2 μL de água livre de nucleases
(Promega®). A reação de amplificação foi realizada em um termociclador Pro Flex
PCR System (Life Technologies ®) com os seguintes ciclos de temperatura: um período
de desnaturação inicial a 94°C durante 2 min., seguido por 40 ciclos de 94 °C por 45
segundos, 50 °C por 45 segundos e 72 °C 45s e um período de extensão final de 72 °C
por 5 min (GRIFFITHS et al., 1998). Os produtos da PCR foram separados por
eletroforese durante 2h a 120 V (volts) em gel de poliacrilamida a 12 %, corado com
nitrato de prata 0,2% e revelado com solução de hidróxido de sódio (3% de NaOH,
0,6% de formol). Foram aplicados 1μL de DNA Ladder (padrão de peso molecular) de
100 pb e 4 μL de produto da PCR em cada poço do gel. Foi utilizado controle negativo
(reações sem DNA para investigar ocorrência de contaminação) em todas as fases de
amplificação. Posteriormente a imagem do gel foi registrada com equipamento
LPixEX®- Loccus biotecnologia.

RESULTADO
Foi confirmado o sexo em 6 indivíduos de Mimus gilvus. Nesta espécie, o
tamanho dos fragmentos referentes aos genes CHDZ, é de 480 pb e ao CHDW, 400 pb
(Tabela 4). Dentre os indivíduos analisados foram identificados 3 machos (amostras
83,85, 86 ) e 3 fêmeas (amostras 82, 84, 87 e Mg ). O controle negativo (N, Figura 16)
não amplificou, mostrando que não houve contaminação dos reagentes. Uma quarta
fêmea proveniente do Centro de Triagem de Animais Silvestres do estado do Rio de
Janeiro (CETAS/RJ), localizado em Seropédica, foi usada como controle positivo da

30
reação (amostra Mg, Figura 16 ). Este indivíduo foi apreendido do tráfico de animais
silvestres a confirmação do sexo foi feita para realizar a soltura.

Tabela 4. Tabela 1. Resultado da determinação do sexo de 6 indivíduos de Mimus

gilvus da Marambaia, Mangaratiba, RJ, discriminando o número da anilha (NA), o
código da amostra de DNA (CA), o sexo (S) de cada indivíduo, o sexo cromossômico
(C) e o tamanho dos fragmentos dos genes CHDZ/CHDW amplificados por PCR
usando os primers P2 e P8 (Griffiths et al,. 1998).

NA (CA) S C CHDZ CHDW

H81082/ 82 F ZW 480 400

H81083/ 83 M ZZ 480 —

H81084/ 84 F ZW 480 400

H81085/ 85 M ZZ 480 —

H81086/ 86 M ZZ 480 —

H81087/ 87 F ZW 480 400

31
 L 82 83 84 85 86 87 N Mg

500 pb→

400 pb→

Figura 15. Gel de poliacrilamida 12% corado em solução de nitrato de prata 0,2 % com
fragmentos amplificados por PCR com os primers P2 e P8 a partir de amostras extraídas
por lise celular, para confirmação do sexo em Mimus gilvus. L representa DNA Ladder
de 100pb; 82, 83, 84, 85, 86 e 87 - produtos de PCR seis indivíduos de Mimus gilvus
capturados na Ponta da Pombeba, Mangaratiba, RJ; Mg controle positivo fêmea de M.
gilvus proveniente do CETAS/RJ e N controle negativo da reação. Sendo fêmeas os
indivíduos 82, 84 e 87 e machos 83,85 86

DISCUSSÃO
A sexagem tem se comprovado como uma ferramenta valiosa para estudos
comportamentais e populacionais em espécies sem dimorfismo sexual aparente
(ANCIÃES; NASSIF; LAMA, 2002; FARIA; CARRARA; RODRIGUES, 2007;
MIYAKI et al., 1998). É essencial para o sucesso reprodutivo das espécies mantidas em
cativeiro, principalmente no caso das espécies monogâmicas e sem dimorfismo sexual,
o que dificulta o manejo para formação de casais. Mesmo no caso da reprodução para
32
fins comerciais, a confirmação do sexo é necessária até mesmo no momento da venda.
A criação em cativeiro e comercialização de algumas espécies, com autorização do
IBAMA pode reduzir a retirada dos animais do seu hábitat natural e a compra de
animais silvestres no comércio ilegal.
Para a conservação de espécies pode ser necessária a reintrodução da ave em seu
habitat natural, sendo importante saber o sexo das aves introduzidas, para que haja
soltura da mesma quantidade de machos e fêmeas, mantendo o equilíbrio entre a razão
sexual. A proporção sexual é crítica em espécies monogâmicas ameaçadas de extinção,
pois o maior número de aves de um sexo implica em um número de casais limitado,
interferindo no tamanho da nova geração (FRANCISCO; MOREIRA, 2012; MIYAKI
et al., 1998; RASO; WERTHER, 2004).
Um exemplo emblemático que ocorreu há pouco tempo no Brasil e bastante
divulgado no noticiário foi o da última ararinha-azul do planeta, Cyanopsitta spixii. Em
1995, no extremo norte da Bahia, na região de Juazeiro, estava a última ararinha- azul
de vida livre. Visando a formação de casal, na esperança de evitar a extinção da espécie,
o sexo teria que ser confirmado. Por não possuir dimorfismo sexual, através de
observações comportamentais, se inferiu que era um macho. Porém, não se tinha
certeza, pois para confirmar o sexo com precisão a ave teria que ser capturada, o que
causaria risco à sobrevivência da ave. Por esse motivo, a sexagem molecular foi
realizada a partir da extração de DNA de uma pena adulta encontrada no solo,
confirmando que a última ararinha-azul do planeta realmente era um macho
(GRIFFITHS; TIWARI, 1995).Isso possibilitou a soltura de uma fêmea. Infelizmente,
mesmo formando um casal os pesquisadores perderam o sinal dos animais que
posteriormente foram encontrados mortos e atualmente a espécie é considerada extinta
na natureza.
Em Mimus gilvus o tamanho do amplicon do gene CHD-Z foi de 480 pb e o
CHD-W 400 pb. Este é o padrão esperado para Passeriformes, onde o tamanho do
íntron do CHD-Z varia entre 300-480 pares de bases e o gene CHD W de 200-450 pb
(CAMARGO, 2014; MATSUI, 2013; RUBIO, 2014; VIEIRA, 2009). Não foi
observado polimorfismo do gene CHD-Z em Mimus gilvus.
Para os Psittaciformes, ordem filogeneticamente mais próxima de Passeriformes,
pertencente ao clado Passerea e a super ordem Passerimorphae, assim como M.gilvus
(JARVIS et al., 2014) (ANEXO I). O padrão de CHD-Z varia de 340-400 pb e o CHD-
W de 380-420 pb. (MIYAKI et al., 1998). O tamanho dos amplicons nessa ordem é
menos variável e a diferença entre eles em termos de pares de base é menor do que o

33
observado para M. gilvus e outros Passeriformes. Isso pode decorrer do fato da ordem
Passeriformes abranger mais famílias que a ordem Psittaciformes, sendo assim uma
ordem mais diversa, com mais eventos de mutação entre as espécies.
Em Sphenisciformes, Ordem onde os pinguim pertencem, localizada no clado
Passerea, mas a super ordem Procellarimorphae (ANEXO 1), o padrão descrito é de
360pb para CHD-Z e 400pb para CHD-W (REIS et al., 2011). Na Ordem
Columbiformes (a qual pertencem os pombos), clado Columbea, irmão de Passerea e
Superordem Columbimorphae, os padrões são de 360pb para o CHD-Z e 390 pb para
CHD-W, em Columba livia domestica e Caloenas nicobarica , também tiveram seu
amplicons do gene CHD-Z (360-400pb) maiores do que CHD-W (320-390pb)
(GRIFFITHS et al., 1998). Em Galliformes, também pertencente ao clado Columbea os
íntrons variam de 300-320pb para CHD-Z e 350-380pb em CHD-W (GRIFFITHS et al.,
1998; JENSEN; PERNASETTI; DURRANT, 2003).
Geralmente os íntrons amplificados do CHD-W costumam ter um tamanho
maior que os íntrons amplificados do gene CHD-Z (ELLEGREN, 1996; GRIFFITHS et
al., 1998), em nossos resultados os amplicons do gene CHD-Z (480 pb) foram maior
que os amplicons de CHD-W (400 pb). O mesmo padrão foi observado em Mimus
saturninus, espécie congênere da analisada neste estudo, onde a banda CHD-Z é maior
com tamanho entre 300-400 pb, enquanto o CHD-W possui tamanho de 200pb
(MATSUI, 2013). A grande diferença de tamanho entre os padrões de amplicons nas
espécies pode ser explicada pela diferença do gel utilizado na eletroforese. Matsui
(2013), utlilizou gel de agarose 3% enquanto neste estudo foi utilizado gel de
poliacrilamida 12% que tem um maior poder de resolução na mensuração do tamanho
dos amplicons.
O tamanho encontrado para o fragmento amplificado do gene CHD-Z em M.
gilvus, foi o maior com relação às Ordens aqui comparadas, e a diferença em pares de
bases entre os amplicons de CHD-Z e CHD-W, 80pb, também foram maiores, com a
exceção de Mimus saturninus (100 pb).
A técnica de sexagem testada aqui usando o protocolo de Griffiths et al. (1998),
mostra que é altamente eficaz para sexagem de Mimus gilvus. Como a diferença em
pares de bases dos amplicons de CHD é grande (80pb), na eletroforese o gel agarose e
poliacrilamida podem ser utilizados com sucesso para a confirmação do sexo. A
descrição do padrão de amplicons dos genes CHDZ/W para Mimus gilvus poderá
auxiliar futuros estudos, que são altamente necessários para a espécie.

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 ANEXOS

Apêndice 1. Filogenia do clado Aves, utilizada como base para discussão do capítulo 2.
Retirada do artigo ‘Whole-genome analyses resolve early branches in the tree of life of
modern birds.’’(JARVIS et al., 2014).

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