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Ser vivo: alto grau de complexidade química e organização microscópica; existência de sistemas que extraem, transformam e utilizam energia
do ambiente; capacidade de autor replicação; mecanismos que sentem alterações no ambiente e respondem a estas alterações; cada um dos
componentes possui uma função definida além de interagirem entre si de maneira regulada.
TEORIA DO IMPACTO: Moléculas orgânicas vieram do espaço, trazidas por uma espécie de meteoro. Há presença de aminoácidos e bases
nitrogenadas.
TEORIA DAS FENDAS SUBMARINAS: água superaquecida rica em íons de metais de transição e H 2S. Locais de grande atividade biológica,
independente da luz solar. A redução de CO2 por FeS geraria moléculas orgânicas mais complexas.
TEORIA DA ARGILA: Moléculas orgânicas surgiram inicialmente em reações catalisadas por silicatos.
ESTRUTURA DE PROTEÍNAS
o α-hélice: se forma mais facilmente que qualquer outra conformação, devido à otimização na formação de pontes de
hidrogênio. Todas as ligações pépticas de uma α-hélice (exceto aquelas próximas às extremidades da estrutura) formam
pontes de hidrogênio intracadeia. Cada volta da hélice é formada por 3,6 aas.
- As cadeias laterais dos aminoácidos ficam para fora da α-hélice. Aminoácidos L podem formar α-hélices voltadas à
esquerda ou à direita, mas apenas α-hélices à direita são observadas em proteínas.
- A sequência de aminoácidos afeta a estabilidade de α-hélice:
a) Glu-Glu-Glu-Glu ou Glu-Ala-His-Glu-Ala-Met-Glu: não formam α-hélice estável devido à repulsão dos grupos carboxil
com carga negativa. O mesmo se verifica para Asp, Lys e Arg.
b) Aminoácidos volumosos como Asn, Ser, Thr e Cys também desestabilizam a α-hélice se estiverem muitos próximos.
c) Pro e 4H-Pro raramente são observados em α-hélice devido ao fato de o átomo de N ser parte do anel, o que
impossibilita a rotação N-C. Além disso, o N não possui H ligado para formar ponte de H Exceção: colágeno.
d) Gly também desestabiliza a α-hélice devido à flexibilidade conformacional excessiva;
e) Estabilização da α-hélice: interações eletrostáticas entre resíduos de aas de cargas complementares (Glu-Ala-Met-Arg);
Interações hidrofóbicas entre aminoácidos aromáticos (Phe- Ala-Met-Phe)
o Folha β-pregueada: é mantida por pontes de hidrogênio intercadeias que se dispõem perpendicularmente ao eixo da
proteína. Sua estrutura é em zig-zag e há folhas (a) paralelas e (b) antiparalelas.
- quando duas folhas β formam camadas próximas na estrutura de uma proteína, os grupos R dos aminoácidos devem ser
pequenos. Β-queratias como fribroína e teias de aranha possuem alto conteúdo de Gly e Ala.
o Voltas reversas (voltas β): constituem um dos tipos de ligação entre outras estruturas secundárias como α-hélices e folhas
β-pregueadas. Ligam estruturas secundárias em que as cadeias peptídicas apresentam mudança de direção.
- Gly é comum devido ao seu tamanho reduzido e flexibilidade. Pro é comum devido à sua ligação peptídica ser cis ao invés
de trans, o que favorece a curvatura de uma volta reversa.
- normalmente encontradas na superfície de proteínas e podem ser de vários tipos sendo o tipo I mais comum.
Estrutura terciária: Interação ou dobramento entre as estruturas secundárias para formar uma proteína; pode ser estabilizada por
pontes dissulfeto (ligação covalente).
o Organização tridimensional.
o Resulta de dobras na estrutura da proteína estabilizadas por interações entre os radicais dos aminoácidos.
Estrutura quaternária: montagem de subunidade de diferentes polipeptídios para formar uma estrutura funcional; agregação de
cadeias de polipeptídios separadas em uma proteína funcional. É mantida principalmente por ligações iônicas, pontes de hidrogênio
e interações hidrofóbicas. Pontes de dissulfeto também podem estar presentes.
Estruturas super-secundárias:
o Motivos proteicos: são estruturas super-secundárias de repetição. Referem-se ao dobramento proteico apenas, não sendo
possível prever a função da proteína, pois proteínas com diferentes funções podem ter alguns motivos iguais.
- estruturas super-secundárias do tipo meandro β podem formar proteínas com estrutura terciária na forma de barril
chamadas barril β.
o Domínios proteicos: unidades de uma cadeia polipeptídica que se dobram de maneira independente um do outro. Muitas
vezes sua estrutura é mantida mesmo após retirada do outro domínio.
- diferentes domínios normalmente têm diferentes funções como ligação de pequenas moléculas ou interação com outras
proteínas. Domínios com conformações similares geralmente estão associados à mesma função, como é o caso de
domínios de ligação ao DNA, presentes em fatores de transcrição.
CLASSIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
PROTEÍNAS FIBROSAS
Apresentam repetições de elementos de estruturas secundárias.
Insolúvel em água devido ao alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos
Papel estrutural (suporte, forma e forma)
Ex: colágeno; α-queratina; elastina; fibroína.
o α-queratina:
- cabelo, penas e unhas;
- α-hélice direita
- duas α-hélices se enrolam uma sobre a outra formando um “coiled coil” o que aumenta a resistência da estrutura. Esta se
organiza posteriormente em protofilamentos, protofibrilas e filamentos intermediários.
- os pontos de contato entre as duas α-hélices de um “coiled coil” são formados por aminoácidos hidrofóbicos. α-
queratinas são ricas em Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe.
- Rigidez é aumentada por pontes de dissulfeto intercadeias.
o Colágeno:
- rico em Pro e Gly
- alta resistência a tensão.
- componentes de pele, tecido conectivo, parede de vasos sanguíneos, córnea, tendões, cartilagem e osso.
- α-hélice à esquerda forma uma tripla hélice à direita.
- unidades repetitivas de Gly-X-Y, sendo X geralmente Pro e Y geralmente 4-Hyp.
o Elastina:
- fibra elástica com propriedades semelhantes à borracha.
- proteína própria de tecidos conectivos.
o Firbroína:
- proteína da seda, produzida por insetos e aranhas.
- folha β, rica em Ala e Gly.
- não extensível, devido à estrutura já estendida da conformação β, mas flexível devido às interações fracas que unem as
cadeias polipeptídicas.
PROTEÍNAS GLOBULARES
Diferentes segmentos da cadeia polipeptídica (ou diferentes cadeias) dobram-se uma sobre a outra.
Solúveis em água
Funções de transporte, regulação, proteínas motoras, imunoglobulinas e catálise enzimática.
Mioglobina:
o Função: armazenamento e difusão facilitada de O2
o Especialmente abundante em músculos de mamíferos que mergulham em grandes profundidades.
o O alto grau de empacotamento torna interações de Van der Waals mais importantes na estabilização da proteína.
o Formada por 8 segmentos de α-hélice separada por voltas β.
o Cadeia punica de 153 aminoácidos e um grupo heme
Grupo Heme: Presente em mioglobina, hemoglobina e citocromo; o átomo de ferro se encontra coordenado a 4 átomos de
nitrogênio do anel porfirínico. Das duas posições de coordenação livre, uma é ocupada pelo N de uma histidina e outra pelo O 2.
PROTEÍNAS MEMBRANARES
Têm pelo menos uma porção solúvel em água.
São muito importantes na comunicação entre as células
Constituem canais que permitem a passagem de átomos ou pequenas moléculas para o interior da célula.
DESNATURAÇÃO DAS PROTEÍNAS: É a alteração da estrutura da proteína sem ruptura das ligações peptídicas. A maior parte das proteínas
pode ser renaturada quando o agente desnaturante é retirado.
Agente desnaturantes:
o Físico: Alterações de temperatura; raios-X; Ultrassom.
o Químicos: ácidos e bases fortes; detergentes; uréia; mercaptoetanol.
Alterações das propriedades de uma proteínas desnaturada:
o Redução da solubilidade (precipitação em solução)
o Aumento da digestibilidade por proteases ou agente químicos (ácidos ou bases, por exemplo)
o Perda da atividade biológica (enzimas, hormônios, anticorpos, etc.)
FOLDING (DOBRAMENTO) DE PROTEÍNAS RECÉM-SINTETIZADAS
Não ocorre por acaso nem por tentativa e erro. Supõe-se que estruturas secundárias locais se formam primeiro guiados pelas
preferências devidas à sequência de aminoácidos. Após isto são estabelecidas interações de curta distância para estabelecer
estruturas super-secundárias. O processo continua até a formação de domínios completos e do “folding” da proteína inteira.
Folding assistido: chaperonas
o Dois tipos de chaperonas: Hsp 70 (análogo de DnaK em bactérias) e chaperoninas.
o O dobramento de algumas proteínas necessita de chaperonas.
o Chaperonas DnaJ e DnaK: Não promovem ativamente o dobramento, mas previnem a agregação de proteínas às quais
estão ligadas.
Obs: Além de actina e miosina, também são essenciais à contração muscular as proteínas troponina e tropomiosina, que são responsáveis pela
regulação da contração muscular. A tropomiosina liga-se ao filamento fino bloqueando a ligação das cabeças de miosina. A troponina, uma
2+ 2+
proteína que liga Ca , interage com a tropomiosina. Essa interação é alterada quando impulsos nervosos causam liberação de Ca do retículo
sarcoplasmático, o que expõe a região de interação com a miosina.
4) Função hormonal
Muitos hormônios são proteínas. Hormônios são sintetizados pelas glândulas endócrinas e lançados no sangue a fim de estimular ou
inibir a atividade de certos órgãos. É o caso da insulina produzido no pâncreas responsável pela manutenção da glicemia (taxa de
glicose no sangue).
5) Função nutritiva
Proteínas servem como fontes de aminoácidos. Esses
aminoácidos podem ainda ser oxidados como fonte de
energia. Nos ovos de muitos animais (como os das aves)
o vitelo é particularmente rico em proteínas.
6) Função de defesa
Existem células no organismo capazes de "reconhecer"
proteínas "estranhas" que são chamadas de antígenos.
Na presença dos antígenos o organismo produz
proteínas de defesa, denominado anticorpo. O
anticorpo combina-se, quimicamente, com o antígeno,
de maneira a neutralizar seu efeito. A reação antígeno-
anticorpo é altamente específica, o que significa que um
determinado anticorpo neutraliza apenas o antígeno
responsável pela sua formação.
7) Coagulação sanguínea
Vários são os fatores de coagulação que possuem natureza proteica, como por exemplo: fibrinogênio, protrombina, globulina anti-
hemofílica, etc.
8) Transporte
Pode-se citar como exemplo a hemoglobina, proteína responsável pelo transporte de oxigênio no sangue e a transferrina,
responsável pelo transporte de rro na corrente sanguínea.
Diferença entre mioglobina e hemoglobina: A mioglobina é uma proteína de baixo peso molecular, encontrada nas musculaturas esquelética e
cardíaca. É uma proteína ligadora de oxigênio, atuando como reserva de oxigênio, o que facilita a sua movimentação dentro das células
musculares. Já a hemoglobina é a proteína que contém ferro e transporta oxigênio através dos glóbulos vermelhos pelo organismo.
1) Hemoglobina
Função: transporte de O2
Característica: 4 cadeias sendo duas cadeias α, com 141 aminoácidos cada e duas cadeias β, com 146 aminoácidos cada. Cada cadeia
polipeptídica possui um grupo heme ligado.
Onde
ϴ = fração de sítios proteicos ocupados por O2 (grau de saturação).
Kd = constante de constante de dissociação do complexo proteína-O2.
P50 = pressão parcial de oxigênio em que 50% dos sítios estão ocupados.
- A ligação da primeira molécula de O2 favorece a ligação da segunda, que facilita a 3º e assim por diante. A ligação da
quarta molécula de oxigênio é 300 vezes mais eficiente que a primeira. Esse efeito se deve a mudanças conformacionais em
uma subunidade da hemoglobina que se ligou O2. Isto induz alterações conformacionais nas demais subunidades da
hemoglobina
+
A hemoglobina também carrega H e CO2 : Efeito de Bohr
o Oxigenação e Desoxigenação da hemoglobina: O CO2, produzido pelo metabolismo dos tecidos, se difunde para os capilares
-
sanguíneos. Não sendo muito solúvel o CO2 é transformado em HCO3 (bicarbonato) pela anidrase carbônica, enzima
+
abundante na hemácia. O íon H formado é captado pela hemoglobina ao mesmo tempo em que esta libera o O 2 para as
necessidades dos tecidos. A reação inversa ocorre nos capilares pulmonares, levando à captação de O 2 e liberação de CO2.
o A afinidade da hemoglobina pelo O2 diminui com o aumento da pressão de CO2 e consequente baixa do pH nos tecidos
metabolicamente ativos que têm maior necessidade de O2. Por exemplo, em tecidos musculares ativos há formação de
ácido lático que abaixa o pH para 7,2. Neste pH a hemoglobina libera 10% mais O2, aumentando o suprimento de O2 para o
músculo.
o A conversão de oxi-Hb e Desoxi-Hb é acompanhada por captação de prótons, e sua oxigenação pela liberação de prótons.
o A Hemoglobina, então, exerce um papel fundamental na manutenção do pH plasmático, juntamente com o tampão
bicarbonato sanguíneo.
Regulação da afinidade da hemoglobina por O2 pelo 2,3-bifosfoglicerato (BPG)
A afinidade da hemoblobina pelo O2 é reduzida pela ligação ao 2,3-difosfoglicerato. Sem BPG, a afinidade da hemoglobina pelo O2
seria muito maior e, assim, pouco O2 seria liberado nos capilares. O BPG tem um papel importante na adaptação do organismo
humano a grandes altitudes. Isto ocorre pelo aumento da [BPG] no sangue, o que diminui a afinidade da hemoglobina pelo O2
resultando num aumento na quantidade de O2 liberada nos capilares, o que compensa a falta de oxigênio em grandes altitudes.
Anemia Falciforme
o É causada por uma mutação na qual há substituição de um Glu por uma Val na
cadeia β da hemoglobina, levando à formação da hemoglobina S, anormal. Ocorre
apenas em indivíduos homozigotos para esta mutação.
o Esta mutação provoca uma alteração na estrutura da hemoglobina uma vez que o
glutamato é polar enquanto a valina é apolar. Esta substituição provoca a
associação anormal das hemoglobinas (por interações hidrofóbicas na parte
externa na molécula), o que leva à formação de agregados fibrosos característicos.
Isso leva à deformação da célula dos glóbulos vermelhos, ficando estes com forma
de foice.
o As crises na anemia falciforme são desencadeadas por exercício físico e se
caracterizam por fraqueza, tontura, falta de fôlego e aumento da pulsação. O
conteúdo de hemoglobina no sangue é de aproximadamente metade do valor
normal de 15-16 g/100 mL, devido à fragilidade das hemácias em forma de foice
que se rompem facilmente. Os capilares podem ser obstruídos pelas células
alongadas causando dores e mal funcionamento de órgãos.
ENZIMAS
1) Características
Velocidades de reação muito maiores;
Condições de reação (pH, temperatura, pressão) muito mais brandas;
Alta especificidade de substratos e produtos (não formam produtos secundários);
o O sítio de ligação ao substrato consiste em geral de uma cavidade na superfície da proteína
que é geometricamente complementar ao substrato. Os aminoácidos do sítio ativo se
organizam de maneira a interagirem com o substrato.
o Enzimas interagem com seus substratos através de interações fracas: pontes de H, interações
eletrostáticas, hidrofóbicas e de van der Waals. Geralmente, após a ligação ao substrato,
ocorre ainda um ajuste induzido no sítio ativo da enzima.
o Especificidade geométrica: As enzimas apresentam, em geral, especificidade geométrica (ajuste
ao sítio ativo). Este grau de especificidade pode variar. Poucas enzimas são específicas para um
único substrato. A maioria catalisa reações de substratos correlatos, mas com eficiências
diferentes. Algumas enzimas como as digestivas, são mais permissivas aceitando vários tipos
de substratos, mas a eficiência da reação enzimática pode variar de acordo com o substrato.
o Estereoespecificidade: As enzimas são altamente estereoespecíficas nas reações que catalisam. As enzimas são quirais por
natureza (formadas apenas por L-aminoácidos) e, por isso, seus sítios ativos são assimétricos. A tripsina, por exemplo,
hidrolisa polipeptídeos formados por L-aminoácidos, mas não tem efeito sobre aqueles formados por D-aminoácidos.
Capacidade de regulação: atividade varia em resposta às concentrações de substratos e produtos. A regulação pode ser feita por
controle alostérico, modificações covalentes e variações na síntese das enzimas.
o Controle da disponibilidade de enzima: velocidade de síntese x velocidade de degradação.
o Controle da atividade enzimática em enzimas regulatórias: controle da afinidade da enzima pelo substrato
+
- Associação de ligantes a enzimas alostéricas: por exemplo, O2, CO2, H e BPG na hemoglobina
- Modificações covalentes: por exemplo, fosforilação.
Maior parte das enzimas são proteínas;
A atividade catalítica depende da integridade da conformação nativa;
Enzimas apresentam uma variedade muito grande de tamanho.
Algumas enzimas necessitam de cofatores (íons metálicos) ou coenzimas (moléculas orgânicas complexas);
o Coenzimas: atuam como carreadores transientes de grupos funcionais específicos, a maioria é derivada de vitaminas.
Cofator ou coenzima que são fortemente ligados a uma enzima são chamados de grupos prostéticos;
Enzima + cofator ou coenzima holoenzima. A parte proteica é chamada de apoenzima ou apoproteína.
1) Enzimas regulatórias
Controlam a velocidade de uma via metabólica. Em vias metabólicas, o produto de uma enzima torna-se o substrato da via seguinte.
Isto permite o uso eficiente dos recursos da célula, para aumentar a produção de energia apenas quando isto se faz necessário.
Ajustes na velocidade de reações catalisadas por enzimas regulatórias fazem com que a célula se adapte às suas necessidades
energéticas e de biomoléculas. Na maior parte das vias metabólicas multienzimáticas, a primeira enzima da via é uma regulatória.
2) Enzimas alostéricas
Tem sua atividade regulada por moduladores alostéricos, geralmente metabólitos pequenos
ou cofatores enzimáticos. Outras enzimas tem sua atividade regulada por modificações
covalentes. Ambas possuem normalmente várias subunidades. Em alguns casos, o sítio
regulatório e o sitio ativo estão em subunidades diferentes. Há ainda enzimas que são
reguladas por clivagem proteolítica e aquelas em que a atividade é estimulada ou inibida
quando estão ligadas a diferentes proteínas regulatórias.
Passam por alterações conformacionais induzidas pela ligação de moduladores que podem
ser estimulatórios ou inibitórios.eles afetam a atividade de outros sítios da proteína. A
ligação do modulador é não covalente e reversível.
Muitas vezes o modulador pode ser o próprio substrato (enzimas homotrópicas) ou diferente
do substrato (enzima heterotrópica).
o Enzimas alostéricas-inibição por “feedback”: em alguns sistemas multienzimáticos, a enzimas regulatória é inibida pelo
produto final da via sempre que a concentração deste produto excede as necessidades da célula. Quando a enzima
regulatória é inibida, todas as outras enzimas que catalisam etapas subsequentes são inibidas, devido à menor
disponibilidade de seus substratos.
NOMENCLATURA DE ENZIMAS
+ -
1) Catálise ácido-base: utiliza íons H ou OH presentes na água, ou ainda cadeias laterais de aminoácidos.
2) Catálise covalente: uma ligação covalente transiente é formada entre enzima e substrato. Envolve a participação de nucleófilos.
3) Catálise dependente de íon metálico: pode estar ligado à enzima ou ser obtido da solução juntamente com o substrato. Interações
iônicas entre metal ligado à enzima e o substrato podem ajudar a orientar o substrato ou estabilizar cargas no estado de transição.
Metais podem também mediar reações reversíveis de oxirredução.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
1) Considerações cinéticas
Uma enzima liga-se primeiro a seu substrato, de maneira reversível, para formar um complexo enzima-substrato.
O complexo ES então se desfaz liberando enzima e produto
k K
1 2
E + S ES Rápida ES E +P Lenta
k- k-
1 2
A segunda etapa é a etapa limitante da velocidade, então a velocidade da reação global depende de [ES].
Em baixa [S], a maior parte da enzima se encontra na forma não ligada ao substrato E. neste caso, a velocidade inicial da reação é
dependente de [S] já que E é constante.
A velocidade máxima ocorre quando a enzima se encontra saturada pelo substrato, ou seja, praticamente toda enzima está na forma
ES. Nesta condição, aumentos adicionais de [S] não tem efeito sobre à velocidade inicial da reação. Esta saturação é característica de
reações catalisadas por enzimas.
o Equação de Michaelis-Menten
- no inicio da reação, a concentração de produto é negligenciável e a
reação P S pode ser ignorada. Desta maneira, a reação global se torna:
- Todas as enzimas que possuem uma curva hiperbólica de V o em relação à [S] seguem a cinética de
Michaelis-Menten. No entanto, enzimas regulatórias não seguem a cinética de Michaelis-Menten.
Muitas enzimas que seguem a cinética de Michaelis-Menten tem mecanismos mais complexos que o de
duas etapas inicialmente proposto por Michaelis-Menten, com várias etapas intermediárias. Apesar de
a relação Km=[S] quando Vo=Vmáx/2, ser verdadeira para muitas enzimas, o significado real de Km e Vmáx
pode diferir entre diferentes enzimas.
o Equação de Lineweaver-Burk
- A determinação experimental de Km e Vmáx pode ser feita de maneira mais precisa pelo gráfico de Lineweaver-Burk.
-Para uma reação em duas etapas:uhuauhuhuhhhhhhhhhhhsuuSSe a etapa 2 é a limitante da velocidade, k2<< k1 Assim,
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
Inibidores enzimáticos são espécies que interferem com o processo de catálise, diminuindo a velocidade da reação ou impedindo
este processo.Os inibidores enzimáticos são divididos em duas classes: reversíveis e irreversíveis.
o Reversível: A ligação do inibidor à enzima é reversível, ou seja, um aumento na concentração do substrato desloca a ligação
do inibidor à enzima. Pode ser dividia em 3 classes: 1) competitiva,2) não-competitiva e 3) mista.
1) 2) 3)
Competitiva: O inibidor compete com o substrato pela ligação ao sítio ativo. Os inibidores desta classe geralmente são
compostos que se parecem estruturalmente com o substrato, ligando-se à enzima para formar um complexo EI que
não leva à catálise. (a inibição pode ser revertida com a adição de mais substrato)
Não-competitiva: o inibidor não compete com o substrato pela ligação à enzima, ligando-se a um sítio diferente do
sítio ativo. O inibidor se liga apenas a ES, mas não à enzima livre.
Mista: O inibidor também se liga a um sítio diferente do sítio ativo, mas liga-se tanto a E quanto a ES.Afeta Km e
Vmáx.Na prática, tanto a inibição acompetitiva quanto a mista são observadas apenas para enzimas com dois ou mais
substratos.
o Irreversível: ligam-se covalentemente ou destroem um grupo funcional da enzima que é essencial à atividade enzimática.
-Mecanismo de ação da aspririna: A aspirina inibe a reação catalisada pela cicloxigenase que produz prostaglandinas,
responsáveis pelo mecanismo de inflamação e dor.
ANTIMETABÓLITOS (VENENOS)
Constituem análogos estruturais de substratos enzimáticos que, ao contrário dos inibidores competitivos, geram produtos. Os
produtos são obviamente diferentes dos obtidos a partir dos substratos e não servem de substrato para as enzimas seguintes em vias
metabólicas. A conseqüência é a interrupção da via metabólica.
Muitos são de ocorrência natural e constituem mecanismos de defesa de vegetais contra a ingestão de folhas, sementes ou frutos
por pássaros, insetos e mamíferos. Muitos são análogos de aminoácidos que são incorporados em proteínas e resultam em formas
inativas.
Fluoroacetato é um antimetabólito presente em algumas plantas e que constitui um análogo de acetato. Forma fluoroacetil-
coenzima A, inibindo o ciclo de Krebs. (presente em veneno para ratos)
Tem como objetivo determinar caracteristicas fisicas como peso molecular, ponto isoelétrico e número de subunidades, bem como a
natureza do aminoácidos constituintes e sua sequência.
1) Purificação de Proteínas:
o Planejamento de um processo de purificação de proteína:
o
Escolha do material de partida Lise das células Precipitação de proteínas Diálise para retirada de sal
contaminantes com (NH4)2SO4
“Salting in” e “Salting out”: a solubilidade de proteínas é afetada pela concentração de sal de duas maneiras
o Em concentrações baixas de sal, a solubilidade de uma proteína aumenta com a [sal] (“salting in”)
o Em concentrações mais altas de sal, a solubilidade de uma proteína diminui com o auemnto da [sal]. Quando a
concentração de sal é suficientemente elevada, a proteína deve estar quase completamente precipiitada (“salting out”)
- devido ao fato de a solubilidade de diferentes proteínas em alta concentração de sal variar bastante, a técnica de “salting
out” é bastante usada nas etapas iniciais de purificação de proteínas.
- o sal mais usado para esta finalidade é o (NH4)2SO4.
2) Métodos utilizados na lise de tecidos e células:
o Liquidificador (quebra tecido conjuntivo e também as células, também pode romper organelas)
o Homogeneizador tipo Potter (rompe as células, mas deixa as organelas intactas)
o Sonicação
o Ciclos de congelamento/descongelamento
o Detergentes
Para a detecção dos aminoácidos por HPLC, estes são derivatizados com um
composto fluorescente (OPA, o-ftalaldeído). A identificação dos picos de cada
aminoácido se dá pela comparação com padrões. Um pico com o mesmo tempo
de retenção de um padrão identifica aquele aminoácido.
Clivagem de uma proteína com Tripsina: tripisina cliva proteínas após resíduos de Arg ou Lys
Clivagem de uma proteína com Quimiotripsina: quimiotripsina cliva proteínas após resíduos de aminoácidos aromáticos.
Clivagem de uma proteína com brometo de cianogênio: brometo de cianogênio cliva proteínas em resíduos de metionina.
SEQUENCIAMENTO DE PEPTÍDEOS ATRAVÉS DA DEGRADAÇÃ DE EDMAN