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DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA
AULAS PRÁTICAS
CASCAVEL
2021
OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DE SORO E PLASMA
OBJETIVOS
Teoria:
O sangue é constituído por uma porção humoral (líquida) e por uma parte figurada
(celular). A porção figurada é formada por diversos tipos celulares: hemácias, plaquetas,
linfócitos, neutrófilos, etc. A porção humoral, constitui o plasma, parte líquida do sangue
contendo várias proteínas: albumina, globulinas, sistemas enzimáticos, etc. Assim, o que
chamamos de sangue total, é um complexo, formado pelos elementos figurados (células)
e pelo plasma.
Em laboratório, quando se deseja obter sangue total, colhe-se o sangue usando-se um
anticoagulante que evite ou retarde a coagulação, que se processa através de um sistema
enzimático existente normalmente no plasma. Os anticoagulantes, portanto, atuam
evitando ou retardando a ativação deste sistema enzimático que leva à coagulação
sanguínea.
Quando se deseja obter plasma, colhe-se o sangue usando-se um anticoagulante como
descrito acima. Submete-se o sangue total assim obtido, a uma centrifugação de modo
que os elementos figurados se depositem no fundo do tubo, pela ação da força centrífuga.
O líquido sobrenadante é o plasma sanguíneo.
Quando se deseja obter soro, colhe-se o sangue dispensando-se o uso de anticoagulantes.
Nestas condições, não haverá retardamento ou inibição dos sistemas enzimáticos
responsáveis pela coagulação e em poucos minutos, haverá a formação do coágulo
sanguíneo. Pelo uso de métodos adequados, pode-se fazer uma retração deste coágulo,
normalmente submetido à temperatura de 37ºC, que após uma centrifugação apresentará
uma cor amarelada característica. Este líquido é o soro sanguíneo.
Coagulação Sanguínea:
Soro: plasma, menos o sistema enzimático responsável pela coagulação sanguínea e seus
substratos consumidos durante o processo de formação do coágulo sanguíneo.
ANTICOAGULANTES
Algumas vezes, deseja-se usar o plasma e não o soro, ou, simplesmente, deseja-se usar o
sangue total não coagulado. Para isto utiliza-se uma substância que impeça ou retarde a
coagulação sanguínea.
Anticoagulantes simples:
⚫ Glicose..............................................................2,05gr
⚫ Citrato de Sódio................................................0,8gr
⚫ Fluoreto de Sódio.............................................0,42gr
⚫ Água destilada qsp...........................................100ml
⚫ Ajustar o pH em 6,1 com uma solução de ácido cítrico a 5%. Esterilizar durante três
dias a 100ºC por trinta minutos de cada vez (tindalização).
⚫ Usar partes iguais de sangue e de solução de Alcever
⚫ mantido estéril em geladeira a 4ºC, o sangue de carneiro colhido em Alcever se
conserva perfeitamente bem, por pelo menos dois meses e meio sem variação da
resistência globular.
VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
ESFREGAÇOS EM LÂMINA
Técnica
1- Puncionar a polpa digita. Deixar o sangue fluir espontaneamente.
2- Colocar uma gota pequena na extremidade de uma lâmina.
3- Colocar a lâmina sobre a mesa ou mantê-la horizontalmente entre o polegar e o médio
da mão esquerda, de modo que a gota de sangue fique a direita e em cima da lâmina
4- Pegar com a mão direita uma segunda lâmina e colocar seu rebordo livre contra a
superfície da primeira, em frente a gota de sangue, formando um ângulo de 45º
5- Tocar o rebordo da lâmina contra a gota de sangue, que imediatamente encherá o
ângulo entre as duas lâminas
6- Impelir a lâmina, guardando sempre o mesmo ângulo, da direita para a esquerda, em
um só movimento, firme e uniforme sem separar uma lâmina da outra. Forma-se, então,
uma camada delgada de sangue.
COLORAÇÃO
Coloração de May-Grunwald-Giemsa
Consiste na coloração sucessiva dos esfregaços com uma mistura de eosinato de azul de
metileno (May-Grunwald) e a mistura de Giemsa, fornecendo coloração a todos os
elementos celulares.
Técnica
1- Colocar a lâmina sobre suporte apropriado. Recobrir o esfregaço com 20 gotas de May-
Grunwald, deixar atuar durante 3 minutos.
2- acrescentar 20 gotas de água destilada durante 1 minuto
3- Escorrer a mistura e sem lavar, recobrir o esfregaço com 20 gotas da solução diluída
de Giemsa (preparada no momento do uso), aguardar 1 minuto
4- Lavar a preparação abundantemente em água corrente
5- Deixar secar espontaneamente em posição vertical. Examinar com objetiva de imersão
Antígenos solúveis
Quando combinados com anticorpos específicos levam a precipitação, cujos complexos
Ag-Ac formam grandes agregados insolúveis. Os mesmos antígenos, se ligados natural
ou artificialmente às partículas, por exemplo, células bacterianas, hemácias, partículas de
látex, formarão aglutinados. Este fenômeno é denominado de aglutinação.
Até certo ponto a precipitação e a aglutinação podem ser consideradas como
manifestações de uma mesma manifestação Ag-Ac, tendo como diferença básica a forma
física do antígeno em teste. Em ambas as reações ocorre uma reunião reversível em dois
estágios. No primeiro estágio, os anticorpos presentes no soro imune reagem com
determinantes antigênicos específicos existentes no antígeno. A facilidade de combinação
entre o antígeno e ao anticorpo depende de diversos fatores: pH do meio, força iônica,
temperatura de reação, concentração de antígeno e de anticorpo, natureza do anticorpo,
tempo de reação, anticorpos incompletos e fenômeno pró-zona.
Quando a reação de acoplamento primário alcança seu equilíbrio, ocorre o segundo
estágio, que é a formação do mosaico, como na precipitação o antígeno é uma molécula
solúvel, é preciso que se forme um mosaico grande antes que se possa observar um
agregado visível.
Para que seja construído um mosaico de magnitude suficiente, são necessários grande
número de moléculas de anticorpos e os reagentes de vem estar presentes numa proporção
ótima.
Na aglutinação, por outro lado, antígeno faz parte de uma grande partícula insolúvel sendo
necessário um número relativamente pequeno de moléculas para que o ocorra uma
agregação visível. Consequentemente, a aglutinação é um ensaio sorológico mais sensível
para a detecção de anticorpos do que a precipitação. Algumas vezes, pode ser necessário
converter-se um sistema de precipitação em um sistema da aglutinação, para que aumente
a sensibilidade do ensaio (aglutinação indireta).
A intensidade das reações sorológicas é geralmente avaliada pelo título ou seja, o
resultado quantitativo é dado pela maior diluição da reação em que se observa
determinado efeito (aglutinação).
Reações de Aglutinação:
Bactérias e outras suspensões celulares são aglutinadas quando misturadas a anticorpos
específicos. A reação de aglutinação e dosagem de anticorpos no soro ou para a
identificação de microrganismos.
Material
Estante com 11 tubos
Pipetas sorológicas
Antígeno Hemácias humanas
PBS – Salina Fisiológica tamponada com fosfatos – pH= 7,2
Técnica:
Ocorre a participação do Ag, Ac e partícula inerte. Este teste é utilizado para: gravidez,
tétano, difteria, citomegalovírus, etc. Ex. detecção da proteína C reativa. Esta proteína
está presente no soro de pacientes acometidos de inflamação. Este teste é utilizado para
monitoramento da atividade da doença em pacientes com febre reumática, artrite
reumatóide, pré e pós-cirurgia, além de estar presente em infecções bacterianas e virais.
Material
Estante com 11 tubos
Pipetas sorológicas
Antígeno – Ovalbumina
Hemácias de carneiro
PBS – Salina Fsiológica tamponada com fosfatos – pH= 7,2
Técnica:
IMUNOHEMATOLOGIA
Teoria:
Técnica:
Misturar uma gota de sangue colhido ou diluído a 5% em solução salina com uma gota
de soro anti-A, anti-B e anti-D.
hemácias + anti-A= -
hemácias + anti-B= + Tipo B
hemácias + anti-A= -
hemácias + anti-B= - Tipo O
hemácias + anti-A= +
Tipo AB
hemácias + anti-B= +
O indivíduo tipado como O pode na verdade, ser um Bombay = genótipo hh
Para caracterização desse indivíduo:
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1942, um grupo de cientistas da Universidade Harvard, nos Estados Unidos, estudava
a possibilidade de conjugar proteínas e isocianatos de hidrocarbonetos carcinogênicos,
que por acaso era fluorescentes. Entre eles, Albert H. Coons, lembrou-se de fazer o
mesmo tipo de marcação com anticorpos antipneumococo (proteínas). Verificou que
pneumococos aglutinados com tais anticorpos marcados, eram nitidamente fluorescentes
sob microscopia de iluminação ultravioleta. Esse mesmo grupo (Coons, Greech e Jones),
aumentou a intensidade de fluorescência emitida, conjugando anticorpos ao isotiocianato
de fluoresceína, que apresenta maior atividade fluorescente e que emite uma fluorescência
de coloração esverdeada.
Fluorescência:
É descrita como a propriedade de uma substância emitir luz quando excitada por fótons,
em determinadas condições. Ao absorver energia luminosa, uma substância pode perder
ou degradar na forma de energia mecânica ou térmica, pela inércia das moléculas ou pelo
atrito. Entretanto, algumas substâncias têm a propriedade de armazenar energia luminosa
e de liberá-la posteriormente, ainda como energia luminosa (fenômeno de
fotoluminescência ou luminescência). Se os períodos de armazenamento são longos,
podendo haver emissão de luz bem depois de cessada a excitação luminosa, o fenômeno
é denominado Fosforescência. Se esse períodos são curtos, da ordem de 10-7 a 10-8
segundos temos fluorescência.
O fenômeno da fluorescência resulta da absorção da energia dos fótons da radiação
excitadora, por elétrons dos orbitais periféricos das moléculas, que passam a ocupar níveis
eletrônicos mais elevados ou de excitabilidade molecular.
Esses elétrons tendem a voltar ao estado fundamental ou de repouso, após curto espaço
de tempo, graças a emissão de radiação luminosa. Como parte da energia absorvida se
degrada em energia térmica ou mecânica, a luz fluorescente emitida tem menor energia
ou seja, maior comprimento de onda, que a radiação excitadora (lei de Stroker, 1852).
Uma vez que um bom fluorocromo para as práticas imunológicas deve ter inúmeras
qualidades somente poucas substâncias dão resultado satisfatório. Até o presente, os
seguinte fluorocromos são usados, alguns com maior frequência:
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), Cloreto de Ácido-1-dimetilamina-naftaleno-
sulfônico (DIS ou DANS), Lisamina-Rodamina-B-200 usada como Cloridrato de
Lisamina-Rodamina-B-200 (RB200-SC) ou Isocianato de Tetrametil Rodamina
(MRITC), Isocianato de Rodamna-B (RBTIC), Aminorrosamina-B e 4-Acetaminida-4-
Isocianato estilbene-2-ácidodissulfônico (S/TS).
O Microscópio de Imunofluorescência:
Técnicas de Imunofluorescência:
Imunofluorescência Indireta (IFI): este método foi desenvolvido por Weller e Coons
em 1954, quando estudavam o vírus da varíola e Herpes-vírus, em culturas de células,
usando um soro antigamaglobulina humana conjugado com fluorocromo.
Esta reação é realizada em duas etapas: na primeira sobre uma preparação do antígeno
fixada à lâmina de microscópio aplica-se o soro no qual se deseja pesquisar os anticorpos
específicos, após a incubação e lavagens da lâmina, realiza-se a segunda etapa.
Na segunda etapa são adicionadas imunoglobulinas conjugadas ao fluorocromo com
especificidade para os determinantes antigênicos das moléculas de anticorpos ligadas ao
antígeno.
A Imunofluorescência indireta tem maior aplicação que a direta, pois com somente um
conjugado fluorescente, pode-se identificar muitos tipos de anticorpos (formados em
diferentes doenças) da mesma espécie, bastando ter-se o antígeno correspondente fixo na
lâmina. Desta maneira, a técnica é útil na pesquisa de anticorpos circulantes permitindo
o diagnóstico de várias doenças, como toxoplasmose, sífilis, chagas, esquistossomose e
pesquisa de anticorpos antiDNA, antifibras musculares, antimitocôndrias.
Técnica:
Tubo 1 2 3 4 5
PBS (ml) 1,9 0,5 0,5 0,5 0,5
Agitar cada tubo com a pipeta e transferir 0,5 ml para o próximo tubo até o último
e desprezar 0,5 ml do último.
Leitura:
IMUNOCROMATOGRAFIA
- velocidade de execução
- fácil técnica (execução e leitura)
- alta sensibilidade
- teste qualitativo (pode ser quantitativo, porém exige equipamento para leitura)
- falsos positivos