UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

AULAS PRÁTICAS

ISABELA ANGELI DE LIMA

CASCAVEL
2021
 OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DE SORO E PLASMA

OBJETIVOS

Diferenciar soro e plasma, conhecer os métodos de obtenção de sangue, soro e plasma, e

princípios da coagulação.

Teoria:

O sangue é constituído por uma porção humoral (líquida) e por uma parte figurada
(celular). A porção figurada é formada por diversos tipos celulares: hemácias, plaquetas,
linfócitos, neutrófilos, etc. A porção humoral, constitui o plasma, parte líquida do sangue
contendo várias proteínas: albumina, globulinas, sistemas enzimáticos, etc. Assim, o que
chamamos de sangue total, é um complexo, formado pelos elementos figurados (células)
e pelo plasma.
Em laboratório, quando se deseja obter sangue total, colhe-se o sangue usando-se um
anticoagulante que evite ou retarde a coagulação, que se processa através de um sistema
enzimático existente normalmente no plasma. Os anticoagulantes, portanto, atuam
evitando ou retardando a ativação deste sistema enzimático que leva à coagulação
sanguínea.
Quando se deseja obter plasma, colhe-se o sangue usando-se um anticoagulante como
descrito acima. Submete-se o sangue total assim obtido, a uma centrifugação de modo
que os elementos figurados se depositem no fundo do tubo, pela ação da força centrífuga.
O líquido sobrenadante é o plasma sanguíneo.
Quando se deseja obter soro, colhe-se o sangue dispensando-se o uso de anticoagulantes.
Nestas condições, não haverá retardamento ou inibição dos sistemas enzimáticos
responsáveis pela coagulação e em poucos minutos, haverá a formação do coágulo
sanguíneo. Pelo uso de métodos adequados, pode-se fazer uma retração deste coágulo,
normalmente submetido à temperatura de 37ºC, que após uma centrifugação apresentará
uma cor amarelada característica. Este líquido é o soro sanguíneo.

Coagulação Sanguínea:

A coagulação sanguínea é a conversão de sangue líquido em gel ou coágulo sólido. O

principal evento é a conversão de fibrinogênio solúvel em filamentos insolúveis de
fibrina, embora a própria fibrina forme apenas 0,15% do coágulo do sangue total.
Esta conversão é a última etapa em uma complexa cascata enzimática. Os componentes
(fatores) estão presentes como precursores inativos (zimogênios) que são enzimas
proteolíticas, que são convertidos em enzimas ativas por clivagem proteolítica em locais
específicos. A ativação de uma pequena quantidade de um fator catalisa a formação de
maiores quantidades do próximo fator que catalisa a formação de quantidades ainda
maiores do próximo, e assim por diante, produzindo uma amplificação, que resulta na
formação extremamente rápida de fibrina.
Há duas principais vias para a formação de fibrina, uma denominada intrínseca (porque
todos os componentes estão no sangue) e a outra extrínseca (porque alguns componentes
são provenientes do exterior dos vasos). Há extensas interações entre os fatores em cada
via.
RESUMINDO:

Sangue total: Elementos figurados = hemácias, plaquetas, linfócitos, monócitos,

neutrófilos, etc.
Plasma = parte líquida do sangue, contendo várias substâncias, entre elas
o sistema enzimático responsável pela coagulação.

Plasma: sangue total, menos os elementos figurados, separados mecanicamente, por

centrifugação.

Soro: plasma, menos o sistema enzimático responsável pela coagulação sanguínea e seus
substratos consumidos durante o processo de formação do coágulo sanguíneo.

Coleta e preparo do soro:

1- fazer a sangria de acordo com a necessidade de sangue

2- transferir o sangue para tubos de ensaio, ocupando no máximo ¼ do volume do tubo
3- colocar os tubos à temperatura ambiente, da maneira mais inclinada possível de modo
a se obter um coágulo fino
4- após a total coagulação descolar suavemente o coágulo com auxílio de um bastão de
vidro e levar os tubos a banho-maria à 37º C, por trinta minutos, para que ocorra retração
do coágulo
5- com uma pipeta Pasteur munida de uma pêra de borracha, aspirar o líquido
sobrenadante e transferir para tubos de centrífuga
6- centrifugar a 1500 rpm por quinze minutos
7- com auxílio de uma pipeta Pasteur munida de uma pêra de borracha retirar o soro e
transferir para um frasco apropriado
8- rotular: data, nome do operador e demais dados que se façam necessários par a perfeita
identificação do soro, no momento de uso
9- estocar em freezer, a -20ºC ou em geladeira à 4º C, neste caso, tendo-se cuidado de
acrescentar conservante
Coleta e preparo do plasma:

1- fazer a sangria de acordo com a necessidade de sangue, usando-se um anticoagulante.

Este anticoagulante deve ser escolhido de acordo com a técnica ser realizada.
2- transferir o sangue para tubos de centrífuga e centrifugar a 1500 rpm por quinze
minutos
3- com o auxílio de uma pipeta Pasteur munida de uma pêra de borracha, retirar o
sobrenadante e transferir para o frasco apropriado
4- rotular e estocar a 4ºC com conservantes, ou a -20ºC.

ANTICOAGULANTES

Algumas vezes, deseja-se usar o plasma e não o soro, ou, simplesmente, deseja-se usar o
sangue total não coagulado. Para isto utiliza-se uma substância que impeça ou retarde a
coagulação sanguínea.

Anticoagulantes simples:

⚫ Oxalato de Sódio ou Potássio a 2% (20 mg/ml)

⚫ Citrato de Sódio a 3% (30 mg/ml)
⚫ Heparina a 0,05% (0,5 mg/ml)
⚫ EDTA a 1% (10 mg/ml)

Solução conservante de sangue (Solução de Alcever).

⚫ Glicose..............................................................2,05gr
⚫ Citrato de Sódio................................................0,8gr
⚫ Fluoreto de Sódio.............................................0,42gr
⚫ Água destilada qsp...........................................100ml
⚫ Ajustar o pH em 6,1 com uma solução de ácido cítrico a 5%. Esterilizar durante três
dias a 100ºC por trinta minutos de cada vez (tindalização).
⚫ Usar partes iguais de sangue e de solução de Alcever
⚫ mantido estéril em geladeira a 4ºC, o sangue de carneiro colhido em Alcever se
conserva perfeitamente bem, por pelo menos dois meses e meio sem variação da
resistência globular.
 VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Em condições normais, os elementos morfológicos do sangue (eritrócitos, leucócitos e

plaquetas) mantém-se em equilíbrio sempre constante, devido a um vasto sistema
denominado sistema hemolítico-poético, isto é, com função hemolítica ou de destruição
das células do sangue e hemopoese ou de fabricação constante de novas células
sanguíneas.
Em condições patológicas, os órgãos hematopoéticos (medula óssea, gânglios linfáticos,
baço e timo) podem perder a sua especificidade de formação. Uma forma de evidenciar
esta perda do equilíbrio é através de visualização das células sanguíneas.

ESFREGAÇOS EM LÂMINA

Material e soluções necessárias

1- Equipamento para punção digital

2- Lâminas limpas e desengorduradas
3- Corante específico

Técnica
1- Puncionar a polpa digita. Deixar o sangue fluir espontaneamente.
2- Colocar uma gota pequena na extremidade de uma lâmina.
3- Colocar a lâmina sobre a mesa ou mantê-la horizontalmente entre o polegar e o médio
da mão esquerda, de modo que a gota de sangue fique a direita e em cima da lâmina
4- Pegar com a mão direita uma segunda lâmina e colocar seu rebordo livre contra a
superfície da primeira, em frente a gota de sangue, formando um ângulo de 45º
5- Tocar o rebordo da lâmina contra a gota de sangue, que imediatamente encherá o
ângulo entre as duas lâminas
6- Impelir a lâmina, guardando sempre o mesmo ângulo, da direita para a esquerda, em
um só movimento, firme e uniforme sem separar uma lâmina da outra. Forma-se, então,
uma camada delgada de sangue.

COLORAÇÃO

Coloração de May-Grunwald-Giemsa

Consiste na coloração sucessiva dos esfregaços com uma mistura de eosinato de azul de
metileno (May-Grunwald) e a mistura de Giemsa, fornecendo coloração a todos os
elementos celulares.

Corante de May-Grunwald pode ser adquirido no comércio em solução ou preparado no

laboratório, dissolvendo-se 0,2g do pó em 100ml de álcool metílico.

Corante de Giemsa pode ser adquirido no comércio em solução ou preparado ou

preparado no laboratório, segundo a fórmula

a) Solução estoque de Giemsa

Giemsa em pó............................................0,3 g
Glicerina....................................................25ml
Álcool metílico puro.................................25ml

b) Solução diluída de Giemsa

uma gota de solução estoque para cada ml de água destilada (5 ml para cada lâmina)

Técnica

1- Colocar a lâmina sobre suporte apropriado. Recobrir o esfregaço com 20 gotas de May-
Grunwald, deixar atuar durante 3 minutos.
2- acrescentar 20 gotas de água destilada durante 1 minuto
3- Escorrer a mistura e sem lavar, recobrir o esfregaço com 20 gotas da solução diluída
de Giemsa (preparada no momento do uso), aguardar 1 minuto
4- Lavar a preparação abundantemente em água corrente
5- Deixar secar espontaneamente em posição vertical. Examinar com objetiva de imersão

REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO DIRETA E INDIRETA

CONTEÚDO:
Reação de aglutinação direta e indireta

Reações de aglutinação ocorrem entre um antígeno particulado e seu anticorpo específico

(aglutinação direta o ativa) ou entre uma partícula inerte (hemácia, látex, partículas de
gelatina, poliestireno) recoberto por antígeno (Ag) solúvel e seu anticorpo (Ac) específico
ou vice-versa (aglutinação indireta ou passiva).
Devem-se à formação de pontes por anticorpos bivalentes ligados a determinantes
antigênicos de superfícies de partículas adjacentes.
As interações Ag-Ac podem ser divididas em três categorias:
Primária: ligação Ag-Ac
Secundária: precipitação, aglutinação e fixação de complemento
Terciária: expressão biológica (bacteriólise, hemólise)
São, em geral, simples, em lâminas ou em tubos, porém, necessitam de uma cuidadosa
padronização e do uso de controles positivos e negativos. Alguns fatores como a
concentração da suspensão de antígeno, temperatura, tempo de incubação e eletrólitos no
diluente que mantêm o pH ao redor de 7,0.
A titulação de soros aglutinantes é feita com quantidades decrescentes de soro e
quantidade constante de antígeno. O título é a maior diluição do soro que apresenta
aglutinação visível.
Estes testes podem ser;
Qualitativos: presença ou ausência de Ac (triagem)
Semi-quantitativos: Concentração de Ac aglutinante (titulação)
Bactérias e outras suspensões celulares são aglutinadas quando misturadas a anticorpos
específicos. A reação de aglutinação é realizada para detecção e dosagem de anticorpos
no soro ou para identificação de microrganismos.

Antígenos solúveis
Quando combinados com anticorpos específicos levam a precipitação, cujos complexos
Ag-Ac formam grandes agregados insolúveis. Os mesmos antígenos, se ligados natural
ou artificialmente às partículas, por exemplo, células bacterianas, hemácias, partículas de
látex, formarão aglutinados. Este fenômeno é denominado de aglutinação.
Até certo ponto a precipitação e a aglutinação podem ser consideradas como
manifestações de uma mesma manifestação Ag-Ac, tendo como diferença básica a forma
física do antígeno em teste. Em ambas as reações ocorre uma reunião reversível em dois
estágios. No primeiro estágio, os anticorpos presentes no soro imune reagem com
determinantes antigênicos específicos existentes no antígeno. A facilidade de combinação
entre o antígeno e ao anticorpo depende de diversos fatores: pH do meio, força iônica,
temperatura de reação, concentração de antígeno e de anticorpo, natureza do anticorpo,
tempo de reação, anticorpos incompletos e fenômeno pró-zona.
Quando a reação de acoplamento primário alcança seu equilíbrio, ocorre o segundo
estágio, que é a formação do mosaico, como na precipitação o antígeno é uma molécula
solúvel, é preciso que se forme um mosaico grande antes que se possa observar um
agregado visível.
Para que seja construído um mosaico de magnitude suficiente, são necessários grande
número de moléculas de anticorpos e os reagentes de vem estar presentes numa proporção
ótima.
Na aglutinação, por outro lado, antígeno faz parte de uma grande partícula insolúvel sendo
necessário um número relativamente pequeno de moléculas para que o ocorra uma
agregação visível. Consequentemente, a aglutinação é um ensaio sorológico mais sensível
para a detecção de anticorpos do que a precipitação. Algumas vezes, pode ser necessário
converter-se um sistema de precipitação em um sistema da aglutinação, para que aumente
a sensibilidade do ensaio (aglutinação indireta).
A intensidade das reações sorológicas é geralmente avaliada pelo título ou seja, o
resultado quantitativo é dado pela maior diluição da reação em que se observa
determinado efeito (aglutinação).

Reações de Aglutinação:
Bactérias e outras suspensões celulares são aglutinadas quando misturadas a anticorpos
específicos. A reação de aglutinação e dosagem de anticorpos no soro ou para a
identificação de microrganismos.

Reação de Aglutinação Direta:

Esta reação é observada quando o antígeno é parte integrante da partícula (microrganismo

ou célula). Ex. sistema ABO em hemácias humanas.

Material
Estante com 11 tubos
Pipetas sorológicas
Antígeno Hemácias humanas
PBS – Salina Fisiológica tamponada com fosfatos – pH= 7,2

Técnica:

1- diluir o soro conforme o esquema abaixo:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Controle
PBS 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Soro 0,5 - - - - - - - - - -
agitar cada tubo com a pipeta e transferir 0,5 ml para o próximo tubo até o último e
desprezar 0,5 ml do último.
diluiç. 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240

2- Acrescentar 0,2 ml de hemácias em todos os tubos (antígeno)

3- Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente
4- Centrifugar por 1 minuto a 1500 rpm
5- Fazer a leitura, comparando com o tubo controle
6- anotar o resultado em título da reação

Reação de Aglutinação Indireta

Ocorre a participação do Ag, Ac e partícula inerte. Este teste é utilizado para: gravidez,
tétano, difteria, citomegalovírus, etc. Ex. detecção da proteína C reativa. Esta proteína
está presente no soro de pacientes acometidos de inflamação. Este teste é utilizado para
monitoramento da atividade da doença em pacientes com febre reumática, artrite
reumatóide, pré e pós-cirurgia, além de estar presente em infecções bacterianas e virais.

Material
Estante com 11 tubos
Pipetas sorológicas
Antígeno – Ovalbumina
Hemácias de carneiro
PBS – Salina Fsiológica tamponada com fosfatos – pH= 7,2

Técnica:

a) sensibilização das hemácias

1- a um volume de hemácias de carneiro a 2%, acrescentar um volume de antígeno
(ovalbumina a 5 mg/ml)
2- incubar 15 minutos à temperatura ambiente
3- Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos, desprezar o sobrenadante e ressuspender o
sedimento em PBS, ao volume inicial

b) hemaglutinação (aglutinação indireta) em tubos

1- diluir o soro de acordo com o esquema anterior

2- transferir, sempre, 0,1 ml do tubo anterior para o posterior e desprezar 0,1 ml do último
(10º)
3- acrescentar 0,2 ml da suspensão de hemácias sensibilizadas em todos os tubos e agitar
levemente
4- incubar por 30 minutos à temperatura ambiente
5- centrifugar por 1 minuto a 1000rpm
6- fazer leitura comparando os tubos da reação com tubo controle
7- anotar o resultado em título

IMUNOHEMATOLOGIA
Teoria:

A composição antigênica dos tecidos no homem é muito complexa e variada graças à

presença principalmente do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC). Já a
complexidade antigênica das hemácias é menor e isto facilita na prática, as transfusões
sanguíneas.
Apesar da presença de 23 grupos de antígenos, apenas dois são usados na determinação
do tipo sanguíneo, os chamados fenótipos ABO e Rh, pois são os antígenos mais
fortemente reagentes. Alguns outros mais conhecidos são os tipos MNS, Duffy, Kidd e
Kell.
A demonstração do fenótipo ABO ou Rh pode ser feita através de testes sorológicos, a
Reação de Aglutinação Direta em meio salino ou coloidal.
Os antígenos ABO são açúcares ligados a glicoesfingolipídeos na superfície dos
eritrócitos que são determinados por três genes (A, B ou O) que são responsáveis pela
presença de cada um dos antígenos. O fenótipo Rh pode ser positivo ou negativo
dependendo da presença ou não do antígeno D na superfície da hemácia. O soro de
pessoas Rh positivas normalmente não contém anti-D. Anticorpos anti-D ocorrem no
indivíduo que foram expostos previamente a hemácias Rh positivas. As duas maneiras
mais prováveis de eritrócitos de Rh positivos atingirem a circulação de indivíduos Rh
negativos são a passagem de eritrócitos de um feto Rh positivo para a mãe Rh negativa
através da placenta, quase sempre por ocasião do parto, mas as vezes no final da gravidez
e também por transfusão de sangue.

Determinação dos antígenos ABO e Rh.

Técnica:

Misturar uma gota de sangue colhido ou diluído a 5% em solução salina com uma gota
de soro anti-A, anti-B e anti-D.

Tipagem ABO Tipagem Rh

hemácias + anti-A= + hemácias + anti-D= + Rh positivo

Tipo A
hemácias + anti-B= -
hemácias + anti-D= - Rh negativo

hemácias + anti-A= -
hemácias + anti-B= + Tipo B

hemácias + anti-A= -
hemácias + anti-B= - Tipo O

hemácias + anti-A= +
Tipo AB
hemácias + anti-B= +
O indivíduo tipado como O pode na verdade, ser um Bombay = genótipo hh
Para caracterização desse indivíduo:

hemácias + anti-H= + Tipo O

hemácias + anti-H= - Bombay – hh

IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1942, um grupo de cientistas da Universidade Harvard, nos Estados Unidos, estudava
a possibilidade de conjugar proteínas e isocianatos de hidrocarbonetos carcinogênicos,
que por acaso era fluorescentes. Entre eles, Albert H. Coons, lembrou-se de fazer o
mesmo tipo de marcação com anticorpos antipneumococo (proteínas). Verificou que
pneumococos aglutinados com tais anticorpos marcados, eram nitidamente fluorescentes
sob microscopia de iluminação ultravioleta. Esse mesmo grupo (Coons, Greech e Jones),
aumentou a intensidade de fluorescência emitida, conjugando anticorpos ao isotiocianato
de fluoresceína, que apresenta maior atividade fluorescente e que emite uma fluorescência
de coloração esverdeada.

Bases Físicas da Fluorescência:

A luz é uma forma de energia radiante de espectro eletromagnético, constituída de fótons

providos de movimentos vibratórios ou ondulatórios, que se irradia com velocidade
constante (3x1010 cm/s). O comprimento de onde caracteriza as diferentes formas de
radiação. Verificou-se que maior será a energia quanto menor for o comprimento de onda.
A luz visível constitui uma pequena porção do espectro eletromagnético,
aproximadamente entre os comprimentos de onda de 4000 a 7000 A (Angstrons) ou 400
a 700 nm (nanômetros).
Para técnica de imunofluorescência, somente são de interesses as radiações
eletromagnéticas que, incidindo sobre substâncias fluorescentes, induzem a emissão
caracterizada por frequência e comprimento dentro do espectro de luz visível. Para
alcançar este objetivo, é empregada a radiação ultravioleta de alta frequência.

Fluorescência:

É descrita como a propriedade de uma substância emitir luz quando excitada por fótons,
em determinadas condições. Ao absorver energia luminosa, uma substância pode perder
ou degradar na forma de energia mecânica ou térmica, pela inércia das moléculas ou pelo
atrito. Entretanto, algumas substâncias têm a propriedade de armazenar energia luminosa
e de liberá-la posteriormente, ainda como energia luminosa (fenômeno de
fotoluminescência ou luminescência). Se os períodos de armazenamento são longos,
podendo haver emissão de luz bem depois de cessada a excitação luminosa, o fenômeno
é denominado Fosforescência. Se esse períodos são curtos, da ordem de 10-7 a 10-8
segundos temos fluorescência.
O fenômeno da fluorescência resulta da absorção da energia dos fótons da radiação
excitadora, por elétrons dos orbitais periféricos das moléculas, que passam a ocupar níveis
eletrônicos mais elevados ou de excitabilidade molecular.
Esses elétrons tendem a voltar ao estado fundamental ou de repouso, após curto espaço
de tempo, graças a emissão de radiação luminosa. Como parte da energia absorvida se
degrada em energia térmica ou mecânica, a luz fluorescente emitida tem menor energia
ou seja, maior comprimento de onda, que a radiação excitadora (lei de Stroker, 1852).

Fluorocromos utilizados para marcação de anticorpos na Imunofluorescência:

Muitas substâncias químicas, em certas condições de excitação, adquirem fluorescência

característica de cor e intensidade (são os fluorocromos). Estas substâncias são os
hidrocarbonetos aromáticos policondensados e compostos cíclicos. Entretanto das
múltiplas substâncias fluorescentes que podem ser usadas na prática imunológica,
somente algumas dão bons resultados.
Fluorocromos mais utilizados:

Uma vez que um bom fluorocromo para as práticas imunológicas deve ter inúmeras
qualidades somente poucas substâncias dão resultado satisfatório. Até o presente, os
seguinte fluorocromos são usados, alguns com maior frequência:
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), Cloreto de Ácido-1-dimetilamina-naftaleno-
sulfônico (DIS ou DANS), Lisamina-Rodamina-B-200 usada como Cloridrato de
Lisamina-Rodamina-B-200 (RB200-SC) ou Isocianato de Tetrametil Rodamina
(MRITC), Isocianato de Rodamna-B (RBTIC), Aminorrosamina-B e 4-Acetaminida-4-
Isocianato estilbene-2-ácidodissulfônico (S/TS).

O Microscópio de Imunofluorescência:

O microscópio para a observação de preparados fluorescentes, é um microscópio normal,

equipado com acessórios característicos, como o sistema de iluminação e o sistema de
filtros.
A fonte de luz deve ser capaz de emitir radiações num comprimento de onda que melhor
coincida com o espectro de absorção do fluorocromo e, assim, possa excitar ao máximo
a resposta fluorescente visível. Porém, essa radiação não deve chegar à ocular do
microscópio juntamente com a radiação emitida após a excitação do fluorocromo, pois
irá prejudicar o contraste da imagem. Assim sendo, as radiações provenientes da fonte
luminosa deve selecionadas sucessivamente, através de um sistema de filtros, que
selecionem as radiações de comprimento de onda que melhor excitem o fluorocromo e,
ao mesmo tempo, evitem que essas radiações chegando ao sistema ocular cause dano ao
observador.

Técnicas de Imunofluorescência:

Imunofluorescência Direta (IFD): este é o método mais simples de marcação de

anticorpos com fluorocromos, aplicado pela primeira vez por Coons e colaboradores, em
1942, em seus estudos sobre a coloração de pneumococos em secreções de tecidos.
Nesta reação, o anticorpo específico é conjugado com um fluorocromo, de modo que, ao
reagir com o antígeno correspondente, forme um complexo fluorescente. Esta técnica tem
aplicação na sorotipagem de microrganismos (E. coli, estreptococos, Candida, Leptospira
e outros) e na pesquisa de microrganismos como Treponema pallidum em lesões sifilíticas
e Mycobacterium tuberculosis em escarro.

Imunofluorescência Indireta (IFI): este método foi desenvolvido por Weller e Coons
em 1954, quando estudavam o vírus da varíola e Herpes-vírus, em culturas de células,
usando um soro antigamaglobulina humana conjugado com fluorocromo.
Esta reação é realizada em duas etapas: na primeira sobre uma preparação do antígeno
fixada à lâmina de microscópio aplica-se o soro no qual se deseja pesquisar os anticorpos
específicos, após a incubação e lavagens da lâmina, realiza-se a segunda etapa.
Na segunda etapa são adicionadas imunoglobulinas conjugadas ao fluorocromo com
especificidade para os determinantes antigênicos das moléculas de anticorpos ligadas ao
antígeno.
A Imunofluorescência indireta tem maior aplicação que a direta, pois com somente um
conjugado fluorescente, pode-se identificar muitos tipos de anticorpos (formados em
diferentes doenças) da mesma espécie, bastando ter-se o antígeno correspondente fixo na
lâmina. Desta maneira, a técnica é útil na pesquisa de anticorpos circulantes permitindo
o diagnóstico de várias doenças, como toxoplasmose, sífilis, chagas, esquistossomose e
pesquisa de anticorpos antiDNA, antifibras musculares, antimitocôndrias.

Vantagens da Técnica Indireta:

Maior sensibilidade, pois a cada determinante antigênico liga-se uma molécula de

anticorpo do soro, mas neste anticorpo podem-se ligar várias moléculas de anticorpos
fluorescentes, permitindo a detecção de quantidade mínimas de anticorpos do paciente.
Podem ser pesquisados anticorpos de diferentes especificidades com um mesmo
conjugado, pois o anticorpo marcado com o fluorocromo tem especificidade para as
imunoglobulinas da espécie.
A técnica permite detectar a classe do anticorpo sérico. Basta usar um conjugado
contendo anticorpos com especificidade para a cadeia pesada característica de cada classe
de imunoglobulinas (IgM, IgG, IgA). Isto é muito importante em certo processos
infecciosos, onde a presença de anticorpos da classe IgM pode ser indicativo de processo
infeccioso agudo, permitindo conhecimento da precocidade da infecção.
Por diluições adequadas para cada soro em estudo, pode-se ter ideia semi-quantitativa do
nível de cada anticorpo sérico.

Técnica:

Preparação das lâminas e fixação do antígeno:

1- utilizar lâminas extrafinas, contendo um retículo quadriculado

2- antes de fixar o antígeno sobre as lâminas, mergulhá-las em álcool 70% e enxugá-las
uma a uma
3- uma vez distribuído o antígeno nas lâminas, deixá-las a temperatura ambiente ou a
37ºC,para que ocorra a fixação
4- embrulhar as lâminas primeiramente em papel impermeável e depois com papel
alumínio e estocar em freezer a -20ºC. Fazer pacotes pequenos, contendo poucas lâminas.

Técnica da Imunofluorescência Indireta para Doença de Chagas

1- inativar o soro a 56ºC por 30 minutos e fazer as diluições abaixo:

Tubo 1 2 3 4 5
PBS (ml) 1,9 0,5 0,5 0,5 0,5

Soro (ml) 0,1 - - - -

Agitar cada tubo com a pipeta e transferir 0,5 ml para o próximo tubo até o último
e desprezar 0,5 ml do último.

diluição 1/20 1/40 1/80 1/160

1/320
Observação: incluir soros controles positivos e negativos

2- pingar as várias diluições do soro sobre as áreas da lâmina contendo o antígeno

previamente fixado
3- colocar a lâmina em câmara úmida e incubar a 37ºC por 15 minutos
4- lavar a lâmina 3 vezes com PBS pH=7,2 (5 minutos por lavagem)
5- secar com papel de filtro cuidadosamente
6- recobrir a preparação com gotas de antigamaglobulina humana marcada com
fluorocromo (conjugado) e repetir a incubação e as lavagens. O conjugado deve ser
diluído, sendo o seu título previamente estabelecido em solução de Azul de Evans
7- Cobrir a preparação com solução de glicerina alcalina, recobrir com lamínula e fixar
com esmalte
8- examinar ao microscópio de imunofluorescência

Leitura:

Positivo: fluorescência localizada principalmente na periferia do parasito, tanto no corpo

como no flagelo
Negativo: ausência de fluorescência com os parasitos corados levemente em vermelho ou
discreta fluorescência localizada intracelularmente e não periférica

IMUNOCROMATOGRAFIA

Os testes imunocromatográficos ou testes rápidos são técnicas desenvolvidas nos anos 60

e a partir dos testes diagnósticos para o HIV, tem ganho maior importância, sendo
desenvolvidos exames para diversos usos tais como doenças infectocontagiosas (dengue,
giárdia, leishmaniose e HVB), além de testes para hormônios (beta-hcg – exame
gestacional) ou testes bioquímicos (troponina – exame para infarto do miocárdio).
Os usos dos testes imunocromatográficos se baseiam principalmente quando se necessita
de decisões rápidas (ex. definição de infarto ou uso de coquetel anti-HIV) ou quando o
local para realização do teste é desprovido de estrutura (também se enquadram aqui os
autotestes).
Algumas vantagens relacionadas aos testes rápidos são:

- velocidade de execução
- fácil técnica (execução e leitura)
- alta sensibilidade

Algumas desvantagens também podem ser relatadas:

- teste qualitativo (pode ser quantitativo, porém exige equipamento para leitura)
- falsos positivos

O princípio do teste baseia-se na capacidade dos antígenos ou anticorpos do soro se

aderirem ao anticorpo ou antígeno ligado à uma matriz de nitrocelulose, sobre a qual o
soro escorre. A revelação se dá pelo aparecimento de linha visível, sendo esta causada
pela ligação de um conjugado (antígeno ou anticorpo marcado com ouro coloidal – cor
vermelha).