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Toxicology Letters 151 (2004) 481–487

Potencialidade genotóxica do extrato aquoso preparado a partir

das folhas de Chrysobalanus icaco L.

S.C. Ferreira-Machado a, M.P. Rodrigues a, A.P.M. Nunes a,

F.J.S. Dantas a, J.C.P. De Mattos a, C.R. Silva a, E.G. Moura b,
R.J.A.C. Bezerra a, A. Caldeira-de-Araujo a,ÿ
a
Departamento de Biof ´ÿsica e Biometria, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Av. 28 de setembro, 87, Rio de Janeiro
20551-030, Brazil Departamento de Ciˆencias Fisiológicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia
b
Roberto Alcantara Gomes, Av. 28 de setembro, 87, Rio de Janeiro 20551-030, Brazil

Recebido em 23 de março de 2004; recebido na forma revisada em 23 de março de 2004; aceito em 24 de março de 2004

Disponível online em 24 de abril de 2004

Abstrato

As plantas têm sido relacionadas à nossa vida, sendo utilizadas como remédios, independentemente das evidências científicas de efeitos
colaterais. Este trabalho analisa os efeitos toxicológicos do extrato aquoso de Chrysobalanus icaco L., utilizado em diversas patologias. Foi
estudado através de: (i) alteração da topologia do plasmídeo pUC 9.1; (ii) sobrevivência de cepas bacterianas submetidas ou não a tratamento
prévio com SnCl2; (iii) eficiência de transformação da cepa de E. coli pelo tratamento com o plasmídeo pUC 9.1. Em (i), o tratamento do
plasmídeo resultou em quebras de fita simples de DNA (SSB). Verificou-se uma diminuição do efeito letal induzido pelo SnCl2 na presença do
extrato, enquanto não foi observada redução da sobrevivência da bactéria C. icaco . A eficiência de transformação do plasmídeo também foi
reduzida. Os resultados sugerem que o extrato pode apresentar um potencial efeito genotóxico, demonstrado tanto pela indução de SSB em
plasmídeo quanto em experimentos de eficiência de transformação. Por fim, apresenta ação antioxidante. © 2004 Publicado pela Elsevier
Ireland Ltd.

Palavras-chave: Chrysobalanus icaco; plasmídeo pUC 9.1; Escherichia coli; Potencialidade genotóxica

1. Introdução efeitos colaterais. Várias práticas de medicina tradicional foram

Durante a última década, as plantas têm sido empregadas na
prevenção e tratamento de doenças. Seu uso tem aumentado
consideravelmente entre as populações, pois acredita-se que
sejam benéficos e tenham poucos benefícios significativos.
ÿ
Autor correspondente. Tel.: +55-21-25876391; fax:
+55-21-22543532.
desenvolvidas em diferentes culturas e regiões, com base em
experiências indígenas, filosofia e atitudes pessoais sem um
desenvolvimento paralelo de padrões internacionais e métodos
apropriados para avaliar a medicina tradicional (Rates, 2001; Ankli
et al., 2002; Steenkamp , 2003). O conceito de que esses produtos
são “naturais” não é adequado nem suficiente para garantir
segurança e eficácia.

E-mail address: adriano@uerj.br (A. Caldeira-de-Araujo). Além disso, a quantidade de informações disponíveis sobre

0378-4274/$ – ver matéria inicial © 2004 Publicado por Elsevier Ireland Ltd. doi:10.1016/
j.toxlet.2004.03.014
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a toxicidade e propriedades terapêuticas no organismo
humano sobre diversas ervas medicinais ainda é bastante
limitada. A maioria das informações não tem respaldo
científico. As ervas medicinais têm seu uso como medicamento
baseado apenas no uso popular tradicional, que vem sendo
passado de geração em geração (Beyerstein, 2001; Talalay,
2001; Ernst, 2002).
Recentemente, tem aumentado o interesse na pesquisa
das propriedades antioxidantes de diversas plantas contra
radicais livres ou espécies reativas de oxigênio (ROS), para
prevenir lesões celulares no organismo humano. As ROS são
geradas a partir de fontes endógenas e exógenas e podem
estar envolvidas na etiologia de várias doenças humanas.
ROS, como os radicais hidroxila (OH•), produzidos nas células,
são capazes de danificar importantes alvos celulares, como
membranas e ácido desoxirribonucléico (DNA) (Reiniger et al.,
1998; Nakagawa e Yokozawa, 2002; Auddy et al., 2003; Lee
et al., 2003; Sroka e Cisowski, 2003). Dantas e cols. (2002)
relataram os efeitos tóxicos do cloreto estanoso, um poderoso
agente redutor usado para embalar alimentos enlatados, em
amálgamas dentais e para preparar radiofármacos
99mTecnécio, na geração de ROS na linha celular K562.
Destaca-se, neste trabalho, a espécie de planta medicinal
pouco estudada Chrysobalanus icaco Linnaeus (C. icaco),
também conhecida como abajeru, coco-ameixa e muitos
outros nomes populares. É um arbusto de porte médio,
originário das áreas costeiras do continente americano,
pertencente à família Chrysobal anaceae (Dahlgren, 1980). O
consumo de C. icaco na forma de chá preparado com diversas
partes da planta tem sido bastante utilizado, na medicina
popular, para o controle de diversas patologias como leucorreia,
hemorragias e diarreia crônica. A espécie também é conhecida
por apresentar efeitos diuréticos, hipoglicemiantes e
antiangiogênicos (Costa, 1977; Vargas-Simon et al., 1997;
Paulo et al., 2000). Na literatura, há pelo menos uma publicação
mostrando a indução de apoptose por triterpenóides obtidos
do extrato metanólico das folhas de C. icaco (Fernandes et al.,
2003).
O uso abusivo do extrato das folhas de C. icaco e o pouco
conhecimento de seus efeitos terapêuticos e colaterais
enfatizam a necessidade de um estudo mais aprofundado,
incluindo a avaliação de sua toxicidade em diversos sistemas biológicos.
O objetivo deste trabalho foi examinar a atividade antioxidante
relativa e o potencial genotóxico de
Extrato aquoso de C. icaco , por ser bastante utilizado pela
população. Esta pesquisa foi realizada em três modelos
experimentais: (i) análise por eletroforese em gel de agarose
das mudanças de conformação estrutural do plasmídeo pUC
9.1, previamente tratado com diferentes concentrações do
extrato; (ii) sobrevivência de cepas de Escherichia coli (E. coli)
tratadas com extrato aquoso, isoladamente ou simultaneamente
com cloreto estanoso; e (iii) a capacidade dos plasmídeos
tratados em transformar células competentes de E. coli
AB1157 (tipo selvagem).
2. Material e métodos
2.1. Material vegetal e reagentes
C. icaco foi coletada em uma área de restinga em Cabo
Frio, Rio de Janeiro, Brasil, de outubro a novembro de 2002,
entre 9 e 10 horas da manhã, sendo as folhas processadas
todas de uma vez para obtenção de todo o extrato utilizado
neste trabalho. A planta foi classificada e depositada no
Herbarium Bradeanum, da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro sob o registro nº 85422. As decocções foram
preparadas da maneira tradicional: 10 g de folhas foram
fervidas em 1 L de água em fogo lento por 5 min e resfriado à
temperatura ambiente (25 ÿC). Em seguida, o sobrenadante
foi filtrado com filtro pa per. Por fim, o filtrado foi liofilizado,
sendo armazenado a -20 ÿC, até sua posterior utilização. O
extrato seco obtido foi suspenso em água Mili-Q (Milli pore
Corp., Bedford, MA, EUA), para proceder aos experimentos
de eletroforese de DNA e transformação bacteriana, ou
dissolvido em solução de NaCl 0,9% para executar o ensaios
de inativação bacteriana. Após enfermarias, foi esterilizado
por filtração através de membrana Millipore 0,22m.
Cloreto estanoso (SnCl2·2H2O) obtido da Sigma Chemicals
Co., EUA, foi empregado como controle positivo para induzir
quebras de DNA (Caldeira-de-Araújo et al., 1996; Dantas et
al., 1999; De Mattos et al. , 2000). A solução de SnCl2 (200g/
mL) foi preparada na hora em água Mili-Q antes de cada
experimento.
2.2. Cepas bacterianas e plasmídeo
Reparação de ADN de tipo selvagem E. coli K12 AB1157
(Howard-Flanders e Theriot, 1966), PQ35 (rfa)
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e PQ37 (rfa e uvrA) (Quillardet e Hofnung, 1985) . E. coli
DH5F'Iq (rec-)
(Hannanah, 1983) estirpe hospedada plasmídeo pUC 9.1.
Este plasmídeo, portador de um gene de resistência à
ampicilina, foi obtido pelo método de lise alcalina, conforme
descrito em Sambrook et al. (1989). As amostras de plasmídeo
foram ainda purificadas de contaminantes de RNA de alto peso
molecular, realizando precipitação com LiCl (concentração final
de 2,5 M), enquanto os contaminantes residuais de RNA foram
digeridos por tratamento com RNAse (20g/mL) por 30 min em
temperatura ambiente (25 ÿC) .
2.3. tratamento de DNA
Para avaliar a ação do extrato aquoso de C. icaco na
topologia do DNA, o plasmídeo pUC 9.1 (200 ng por tubo) foi
incubado com concentrações crescentes do extrato (0,7, 1,75,
3,5 e 7 mg/mL) ou com solução de SnCl2 200g/mL (controle
positivo) em tampão Tris-HCl 10 mM a pH 7,4. Em todos os
casos, a mistura reacional foi incubada à temperatura ambiente
por 40 min. Após a incubação, cada amostra foi misturada com
tampão de carregamento (0,25% de xileno cianol FF; 0,25%
de azul de bromofenol; 30% de glicerol em água) e aplicada
em câmara de eletroforese em gel horizontal de agarose a
0,8% em tampão Tris acetato-EDTA a pH 8,0 e operar a 6 V/
cm. Aqui, o ensaio de eletroforese foi realizado para separar
diferentes conformações estruturais de DNA de plasmídeo
tratado com extrato vegetal: forma I superenrolada (SC)
conformação nativa, forma II círculo aberto (OC), resultante de
quebras de fita simples, e forma III linear (L ), resultante de
quebras de fita dupla. O gel foi corado com brometo de etídio
(0,5g/mL) e as bandas de DNA foram visualizadas por
fluorescência sob um sistema ultravioleta (UV) transil luminator.
O ensaio foi repetido, no mínimo, cinco vezes, sendo o melhor
resultado digitalizado (Kodak Digital Science 1d, EDAS 120), e
as bandas quantificadas por meio do programa de computador
Gel-Pro Analyzer 3.0.
2.4. Análise estatística de quebras de DNA
ANOVA seguida do teste de comparações múltiplas de
Student Newman Keuls por meio do programa estatístico InStat
versão 3.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) foi
usado para comparar os resultados obtidos das diferentes
concentrações de extrato contra
483
o controle (não tratado). Adotou-se nível de significância de
5% para comparação dos dados.
Os dados coletados por densitometria nos forneceram a
porcentagem de eventos nulos (sem quebras = p(0;µ)) para
cada uma das concentrações de extrato aquoso testadas.
Assim, os valores médios de quebras por genoma para cada
uma das concentrações, usando a distribuição de Poisson,
foram obtidos da seguinte forma (Remington e Shor, 1985):
µ = ÿln p(0; µ)
2.5. Inativação bacteriana
As culturas de E. coli AB1157, PQ35 e PQ37 em crescimento
exponencial em meio LB (Miller, 1992) foram centrifugadas,
lavadas duas vezes em solução de NaCl a 0,9% e suspensas
na mesma solução. Amostras dessa suspensão foram
incubadas com o extrato aquoso (0,7, 3,5 e 7 mg/mL) ou SnCl2
(25g/mL) ou ambos os agentes, por 60 min a 37 ÿC. Em
intervalos de 20 minutos, alíquotas foram diluídas e espalhadas
em placas de Petri de vidro contendo meio LB solidificado
(1,5% de ágar).
As colônias foram contadas após incubação durante a noite a
37 ÿC, e as frações de sobrevivência (N/No) determinadas
como a média de três experimentos isolados. Os desvios
padrão não ultrapassaram 10%.
2.6. transformação bacteriana
Bactérias competentes (E. coli AB1157), sensíveis à
ampicilina, foram obtidas conforme descrito por Sambrook et
al. (1989). A eficiência de transformação do DNA plasmidial,
previamente tratado com diferentes concentrações do extrato
aquoso de C. icaco (0,7, 3,5 e 7 mg/mL), foi então analisada.
Em seguida, 200 L de suspensões bacterianas competentes
(ÿ109 células/mL) foram misturados com DNA plasmidial pré-
tratado (5 ng) e incubados em gelo por 30 min. Em seguida, os
tubos foram colocados em banho-maria a 42 ÿC por 2 min e
imediatamente incubados no gelo por 2 min. Em seguida,
foram adicionados 500 L de LB pré-aquecido (37 ÿC). As
amostras foram então incubadas por 1 h a 37 ÿC e as alíquotas
foram retiradas e semeadas em LB-agar suplementado com 60
g de ampicilina/mL. As placas foram incubadas a 37 ÿC por 24
horas e o número de colônias foi contado. Um valor médio de
cada concentração de extrato de C. icaco empregada foi obtido,
e a eficiência de transformação foi expressa como a per-
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484 SC Ferreira-Machado et al. / Toxicology Letters 151 (2004) 481–487

Fig. 1. Porcentagem de eletroforese em gel de agarose 0,8 e análise densitométrica do plasmídeo pUC 9.1 (200 ng) tratado com concentrações crescentes
de C. icaco ou com SnCl2 como controle positivo. Alíquotas de DNA do plasmídeo pUC 9.1 (200 ng) foram incubadas com diferentes concentrações de
extrato de C. icaco por 40 min em temperatura ambiente (25 ÿC). Cada amostra foi misturada com tampão de carga e submetida à eletroforese em gel de
agarose 0,8%. (A) O experimento foi realizado, no mínimo, cinco vezes e a melhor foto é apresentada aqui. (B) As medidas densitométricas foram obtidas
do gel, através do programa de computador Gel Pro Analyzer. Pistas: (1) pUC 9.1; (2) SnCl2 (200 g/mL); (3) 0,7 mg/mL; (4) 1,75 mg/mL; (5) 3,5 mg/mL e
(6) 7 mg/mL do extrato da planta.

porcentagem do valor máximo (100%), atribuído ao controle
(não tratado). Esta experiência foi realizada em triplicado e
os resultados apresentados são a média média. Os desvios
padrão não ultrapassaram 15% dos respectivos valores
médios. Os dados foram analisados por meio de ANOVA,
seguido do teste de comparações múltiplas de Student
Newman Keuls por meio do programa estatístico InStat
versão 3.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Para avaliar a significância da eficiência da transformação,
adotou-se um nível de significância de 5% para comparar
0,7–7,0 mg/mL. Este resultado pode classificar o extrato de
C. icaco como um indutor de quebra de cadeia fraca. Este
efeito genotóxico foi confirmado por análise densitometria.
As formas círculo aberto e superenrolado foram analisadas
e o resultado sugere que, em relação ao controle, houve um
aumento significativo (P < 0,001) no número de lesões
quando o DNA plasmidial foi tratado com C. icaco, sem ser
observada a forma linear (III).
0,45

esses dados. 0,4

0,35
0,3
0,25
Genoma
SSB/

3 Resultados e discussão 0,2

As mudanças conformacionais no DNA plasmidial pré-
tratado foram analisadas através de eletroforese em gel de
agarose. Nossos resultados mostraram que o DNA plasmidial
teve sua forma superenrolada (I) alterada para forma circular
aberta relaxada (II) após o tratamento com concentrações
crescentes de extrato vegetal (de 0,7 para 7 mg/mL) (Fig. 1 ) .
Assim, este extrato foi capaz de induzir quebras de fita
simples, como pode ser visto na Fig. 2. Por outro lado, um
padrão dose-resposta não foi obtido (Fig. 2), porque não
houve diferença significativa (P > 0,05) no número de
quebras induzidas no intervalo
0,15
0,1
0,05
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
[mg/mL] extrato de C. icaco
Fig. 2. Número de quebras de fita simples/genoma no DNA plasmidial
tratado com extrato de C. icaco . A análise dos dados densitométricos
realizada pelo programa de computador Gel Pro Analyzer, forneceu a
porcentagem de eventos nulos (sem quebras) para cada uma das
concentrações de extrato de C. icaco testadas. Utilizando a distribuição
de Poisson, o valor médio das quebras para cada uma das concentrações,
foi obtido da seguinte forma µ = ÿln p(0;µ). Número de quebras de fita
simples/valores do genoma são as médias de cinco experimentos isolados.
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SC Ferreira-Machado et al. / Toxicology Letters 151 (2004) 481–487 485

10 10

1
1 Sobrevivência
Fração
de
0,1
0,01
Sobrevivência
Fração
de
0,001
0,0001 0,00001
0,1
0 20 40 60 0 30 60

tempo de tratamento (min) hora (min)

Fig. 3. Efeito do extrato de C. icaco na sobrevivência de E. coli AB1157.
Células em crescimento exponencial, suspensas em solução de NaCl 0,9%,
foram tratadas com C. icaco por diferentes tempos de incubação. As frações
de sobrevivência foram determinadas: () NaCl 0,9%; () 0,7 mg/mL de extrato
de C. icaco ; () 3,5 mg/mL de extrato de C. icaco ; () 7 mg/mL de extrato de
C. icaco .
Fig. 5. Efeito do extrato de C. icaco na inativação induzida por cloreto
estanoso em E. coli PQ37 (rfa e uvrA). Células de crescimento exponencial
suspensas a 0,9% foram tratadas com SnCl2 (25 g/mL) por diferentes
tempos de incubação na presença ou ausência do extrato (7 mg/mL). A
fração de sobrevivência foi determinada: () 0,9% NaCl; () SnCl2; () Extrato
de C. icaco ; ()
Extrato de SnCl2 + C. icaco .

A inativação induzida em diferentes cepas de E. coli

proficientes no reparo de DNA por várias concentrações do
extrato aquoso também foi avaliada. Como pode ser
observado (Figs. 3–5), não houve diminuição importante
nas frações de sobrevivência, tanto no tipo selvagem
quanto no mutante de reparo testado (uvrA). Além disso,
uma diminuição importante dos níveis de sobrevivência
não foi observada em outras cepas de E. coli mutantes de
reparo (AB2463, recA; BW9091, xthA; BW544, xthA, nfo;
BW535, nth, nfo, xthA; GY5022, envA; e GY5027, envA,
uvrB) (dados não mostrados).
Esses resultados poderiam inicialmente sugerir a
ausência de toxicidade desse extrato, mas não podemos
descartar o fato de que as substâncias, presentes na
composição do extrato, não entraram nas células
bacterianas em quantidade suficiente para causar danos
ao material genético. Para elucidar este ponto, 5 ng da fração de plasmídeo tratado
10
1
Não)
(N/
foi usado para transformar células AB1157 com petentes
de tipo selvagem ( ampR ), conforme descrito na Seção 2.
Assim, a capacidade genotóxica deste extrato foi observada
neste ensaio (Fig. 6). De fato, houve uma diminuição na
eficiência de transformação do DNA plasmidial tratado com
o extrato, quando comparado ao controle e entre eles (P <
0,05). Neste sistema, a capacidade de uma célula
bacteriana de tipo selvagem transformada crescer em meio
seletivo é resultado de sua capacidade de reparar lesões
induzidas por DNA plasmático. Assim, as bactérias
transformadas foram incubadas por 1 h em meio LB, sem
ampicilina. Assim, permitiu-se que as bactérias recuperassem
o DNA plasmidial das lesões para codificar ainda mais o
gene plasmidial -lactamase que permitiria que as bactérias
se replicassem em LB sólido contendo meio de ampicilina (Hannanah,
120
100
80
eficiência
%

0,1
Transformação

60
Sobrevivência
Fração
de

0,01 40
0,001 20
0,0001 0
0 30 60 12345

Tempo de tratamento (min) Tratamento

Fig. 4. Efeito do extrato de C. icaco na inativação induzida por cloreto
estanoso em E. coli PQ35 (rfa). Células de crescimento exponencial
suspensas em 0,9% foram tratadas com cloreto estanoso (25 g/mL) por
diferentes tempos de incubação na presença ou ausência do extrato (7 mg/
mL). A fração de sobrevivência foi determinada: () 0,9% NaCl; () SnCl2; ()
Extrato de C. icaco ; () Extrato de SnCl2 + C. icaco .
Fig. 6. Eficiência de transformação do plasmídeo pUC 9.1 em E. coli AB1157
de tipo selvagem . Alíquotas do plasmídeo pUC 9.1 tratadas com
concentrações crescentes de extrato vegetal de C. icaco e solução de SnCl2
200 g/mL (controle positivo) foram misturadas à suspensão bacteriana
competente e submetidas à transformação. Os valores são a média de três
experimentos isolados: (1) pUC 9,1; (2) SnCl2; (3) 0,7 mg/mL; (4) 3,5 mg/
mL e (5) 7,0 mg/mL de extrato de C. icaco .
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486 SC Ferreira-Machado et al. / Toxicology Letters 151 (2004) 481–487
1983). A partir desses resultados, podemos sugerir que a
diminuição na eficiência de transformação pode ser devida
à incapacidade da bactéria em reparar o DNA plasmidial
sempre que concentrações aumentadas de extrato aquoso
de C. icaco são empregadas. Por outro lado, lesões ocultas
também deveriam ser geradas, mas não puderam ser
detectadas no âmbito da metodologia empregada neste
trabalho. Isso poderia explicar por que um padrão dose-
resposta nos experimentos de eficiência de transformação
foi observado (Fig. 6), mas não na eletroforese como diz,
em que havia apenas o DNA sendo lesado (Figs. 1–2). No
entanto, esses resultados podem refletir diferentes
eficiências de transformação, devido à dificuldade dos
plasmídeos danificados entrarem na célula, ao invés de
diminuir a capacidade de reparo dos plasmídeos lesionados.
Produtos naturais têm sido utilizados como antioxidantes
contra espécies reativas de oxigênio geradas pelo nosso
próprio metabolismo. Para testar se C. icaco tinha efeito
antioxidante, as linhagens PQ35 (rfa) e PQ37 (rfa e uvrA)
foram incubadas com SnCl2 (25 mg/mL) na presença ou
não do extrato (0,7 mg/mL ). A cepa PQ35, quando
comparada à deficiente no reparo por excisão (PQ37),
apresentou menor inativação, quando tratada apenas com
SnCl2 (Figs. 4–5). A associação do extrato com SnCl2
promoveu redução da letalidade em ambas as cepas,
quando comparada ao tratamento apenas com SnCl2. Essa
proteção celular foi mais importante no wild-type,
demonstrando que o produto do gene uvrA, ausente na
cepa PQ37, é importante para reparar o dano induzido
direta ou indiretamente pelo SnCl2. Estes resultados nos
levam a verificar se o extrato poderia também evitar as
quebras na indução, por cloreto estanoso, no DNA plasmidial.
Inesperadamente, houve a formação de um agregado
molecular, bloqueando a migração do DNA através do gel
de agarose (dados não apresentados).
Os resultados, à primeira vista, parecem contrastantes,
pois alguns indicam um potencial tóxico, enquanto outros
sugerem um efeito protetor contra os danos induzidos pelo
metal. O efeito letal pode estar associado a uma fração ou
combinação de frações da planta. Desta forma, já se sabe
da literatura (Fernandes et al., 2003) que as folhas de C.
icaco contêm alguns triterpenóides, capazes de induzir
apoptose em células de eritroleucemia K562. Por outro
lado, os compostos do extrato bruto poderiam: (i) quelar
íons estanosos, protegendo-os contra a oxidação e evitando
a geração de ROS; (ii) agindo como catadores de
radicais gerados pelo SnCl2. Da mesma forma, Melo et al.
(2001) demonstraram que o efeito letal do cloreto estanoso
foi reduzido pelo extrato de Cymbopogon citratus, Maytenus
ilicifolia e Baccharis genistel loides. Assim, esses dados
indicam que o DNA é um alvo importante para os efeitos
do extrato de C. icaco , enquanto a ação protetora induzida
contra o efeito letal do metal é provavelmente devido a
atividades inespecíficas como: eliminação de íons estanosos
antes de sua absorção em E . coli.
Por fim, os resultados apresentados neste trabalho
ratificam a necessidade de novos estudos toxicológicos de
substâncias tida como inócuas, que vêm sendo utilizadas
pela população sem prescrição médica.
Reconhecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas da Capes, UERJ,
CNPq e FAPERJ.
Referências
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