Biologia Molecular

2º semestre
Rafaela Pires
 O que é Biologia molecular?

Estudo da conservação da informação genética e da sua expressão nas células.

Tem como alvos de estudo:

- A função e estrutura de ácidos nucleicos (DNA e RNA) e proteínas;

- Mecanismos moleculares: replicação, transcrição e tradução.

Intervém nas seguintes áreas:

- Diagnóstico de cancro
- Nutrigenética

- Bioinformárica
- Imunogenética, anticorpos recombinantes

- Eng. genética, terapia genética, clonagem

- Genoma, proteoma

- Nutrigenómica
- Terapêutica, Farmacogenómica

Aplicações

- Medicina: estudo de doenças, produção de medicamentos, produção de proteínas recombinantes,

vacinas, diagnóstico clínico, terapia génica/genética, deteção de agentes infeciosos…

- Alimentação: resistência das culturas, características melhoradas

- Criminalística

- Filogenética

História

1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON

mRNA é a molécula que leva informação do DNA nuclear para a maquinaria de produção de
proteínas no citoplasma

1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA

Sequências sucessivas de três nucleótidos do DNA determinam a sequência de aminoácidos de

uma proteína —> Codão e código genético

1970 – Purificação da 1ª enzima de restrição

1977 – Tecnologia de sequenciação de DNA

1985 - Técnica de PCR (Kary Mullis - Prémio Nobel em 1993)

1988 - 1ª clonagem de genes humanos

1996 - Sequenciação do genoma da levedura

1997 - Sequenciação do genoma da E. coli Clonagem

1999 - Sequenciação do 1º cromossoma humano (Cr 22)

2000 - 1º “rascunho” da sequência completa do genoma humano

DNA —> genes —> cromossomas —> núcleo —> células —> organismo

DNA
É o transmissor de informação genética.

Tem 2 cadeias de nucleotidos antiparalelas complementares enroladas em hélice devido à ligação entre
as duas cadeias pelas pontes de hidrogénio entre bases complementares (A-T – 2 pontes – e C-G – 3
pontes).

Os nucleotídeos são compostos por um grupo fosfato, uma molécula de açúcar de 5 carbonos e bases
azotadas.

Purinas: Adenina e guanina tem uma estrutura com 2 anéis ciclicos

Pirimidinas: Citosina e timina tem uma estrutura com 1 anel ciclico

O emparelhamento faz-se entre uma base purina e uma pirimidina

Fluxo de informação genética

O DNA encontra-se no núcleo e nos cromossomas. A molécula de DNA está organizada em unidades
funcionais que são os genes.

A informação contida no DNA é replicada e transcrita em moléculas de RNA. As moléculas de RNA

ribossómico (rRNA) e de transferência (tRNA) são activas por si só, enquanto que o RNA mensageiro
(mRNA) é utilizado como molde para a tradução, há a síntese de proteínas que após modificação pós-
tradução, se tornam biologicamente activas e desempenham uma determinada função celular.

Proteínas

São macromoléculas constituídas por uma ou mais cadeias de aminoácidos.

Tem diferentes tipos de estruturas (primária, secundária, terciária, quaternária, supramolécula) que tem
diferentes funções, como regulação, sinalização, estrutura, movimento, catalise e transporte.

Existem várias proteínas associadas ao DNA.

Dogma central da BM

Explica o fluxo de informações do código genético.

Sintetiza o paradigma da biologia molecular: os genes se perpetuam como ácidos nucleicos, mas
expressam-se na forma de proteínas, cuja sequência de aminoácidos é determinada pela sequência de
bases do RNA, o qual é transcrito a partir de uma das fitas da molécula de DNA.

O DNA tem a informação genética, passa para os RNA’s, sendo que quando este RNA é o mensageiro
leva à produção das proteínas. O DNA tem a capacidade de se autoreplicar através da replicação que
além da transcrição (passagem de informação de DNA para RNA) também pode haver uma passagem de
informação no sentido contrário, ou seja informação do RNA para o DNA com a ajuda de uma
transcriptase reversa.

 Métodos moleculares
Ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos e as proteínas são as macromoléculas mais estudadas em BM.

Os ácidos nucleicos são polímeros constituídos por nucleótidos, que são constituídos por uma pentose,
uma base heterocíclica azotada e um grupo fosfato (ácido fosfórico).

Existem riboses e desoxirriboses, ou seja, RNA e DNA. Elas distinguem-se pela ausência do oxigénio no
carbono C2’.

As bases azotadas derivam de purinas e pirimidinas, em que as purinas possuem 2 anéis cíclicos
(guanina e adenina) e as pirimidinas possuem 1 anel cíclico (uracilo, citosina e timina), e ligam-se através
de pontes de hidrogénio.

- Os nucleósidos são a ligação da purina com a pirimidina + ribose.

- Os nucleótidos são a ligação da purina com a pirimidina, a ribose e o grupo fosfato.

- Quando falamos de nucleósidos a terminação é -osina e -idina das bases azotadas.

• O DNA e o RNA possuem algumas diferenças. A estrutura primária do RNA é sempre uma cadeia
linear, depois consoante o tipo de RNA pode forma um tRNA (podem existir sequências que podem ser
complementares e vai emparelhar, formando uma única molécula a qual já não é linear), um mRNA (o
qual é linear), um rRNA. Temos também a diferença nas bases, etc.

• Os RNA’s existem nas células como um produto dos genes enquanto o DNA é uma sequência
nucleotídica em que tem informação para levar à formação de RNA.

A ligação entre os nucleótidos ocorre no sentido 3’-5’ fosfodiéster e o sentido de síntese do DNA é 5’-3’.
O facto de existirem extremidades distinta, uma que é a 5’fosfato e outra que é a 3’OH livre designa-se
de polaridade, não relativamente a serem cargas positivas ou negativas, mas sim relativamente ao facto
de as extremidades serem distintas e isso permite-nos distingui-las. Daí designar-se o DNA como uma
dupla hélice com duas cadeias antiparalelas.

Os grupos fosfatos do DNA/RNA vão apresentar cargas negativas em meio aquoso, levam a que toda a
molécula apresente cargas negativas o que pode ser útil na utilização de alguns métodos moleculares.

Os métodos moleculares por norma precisam de ferramentas auxiliares, sendo a maior parte delas
enzimas celulares. Temos as DNA polimerases, a transcriptase reversa, as RNA polimerases.

Enzimas celulares
• DNA polimerases
Capacidade de sintetizar uma nova cadeia de DNA, de 5’ – 3’, por cópia de uma cadeia molde, formando
polímeros - DNA pol I, II e III em procariotas, DNA

Estas requerem:

- Um primer/iniciador porque a DNA polimerase não consegue agarrar em 2 nucleótidos e ligá-los pela
primeira vez, é necessário estar sempre uma sequência inicial com um grupo 3’ – OH livre para a
enzima se conseguir ligar e consequentemente sintetizar.

- Uma cadeia de DNA molde

- Os 4 nucleótidos: A, C, G, T

- Mg2+

DNA polimerase termoestáveis

- As enzimas têm alguma sensibilidade a variações de temperatura.

- Têm a capacidade de ser ativas a temperaturas bastante elevadas (75-80º).

- A mais conhecida é a Taq DNA polimerase.

- Utilizadas em PCR.

• Transcriptase reversa
- Associada à síntese de DNA, é também uma DNA polimerase dependente de RNA porque copia a
molécula de RNA e sintetiza DNA (por isso é que é uma DNA pol).

- É utilizada em RT-PCR.

- Precisa dos mesmos elementos que a DNA polimerase

- Origina uma molécula híbrida designada de DNA complementar, ou seja, uma molécula que para além
de DNA tem RNA.

• RNA polimerases

Estas sintetizam RNA e são utilizadas na transcrição in vitro. RNA polimerase I, II e III.

• DNA ligases
Ligam sequências de DNA através de ligações fosfodiéster (entre o grupo OH 3’ de um nucleótido e o
grupo fosfato de outro nucleótido). A mais utilizada a nível de laboratório é a T4 DNA ligase – originária
do bacteriófago designado TA.

Fazem a ligação de sequências de DNA tanto de moléculas iguais como de moléculas diferentes.

Aplicações: na clonagem, mas sobretudo nas tecnologias de DNA recombinante.

• Nucleases
Permitem clivar/destruir moléculas de ácidos nucleicos. Se forem Dnases (desoxirribonucleases) e
Rnases (ribonucleases). As mais conhecidas são a Rnase 1 e 4.

Estas nucleases podem ter atividade de endonucleases, as quais clivam 1⁄2 cadeias (atua numa só
molécula integra em dupla hélice), de exonucleases as quais só podem atuar quando existe uma
extremidade livre, ou mistas.
Estas nucleases são utilizadas para destruir o RNA, de forma a garantir o estudo de DNA,
exclusivamente.

Enzimas de restrição
São enzimas (endonucleases de restrição) que normalmente são extraídas de microrganismos, quer de
fagos e quer de bactérias. Funcionam como tesouras in vitro. Nos microrganismos elas possuem a
função de os defender de moléculas de ácidos nucleicos estranhos.

Designam-se de restrição pois elas reconhecem sítios muito específicos de DNA, e só nesses locais é
que possuem a capacidade de clivar o DNA, a esses locais chamamos locais de restrição (são grupos de
4/6 pares de bases).

Estes locais são sempre os mesmos (são sequências de consenso) e para além disso são sequências
polídromas, que leêm-se de forma igual da esquerda para a direita e vice-versa.

Os fragmentos de DNA / de restrição são o que resulta destes cortes.

Dependendo da maneira como cortam o local de restrição, podem originar moléculas de DNA com
segmentos em que uma das cadeias é maior que a outra, e quando isto ocorre dizemos que a
extremidades que resultaram do corte são protuberantes ou coesivas relativamente à extremidade maior,
ou seja, se foi a extremidade 5’ que ficou maior designamos extremidade 5’ protuberante.

Se o corte a nível do local de restrição é simétrico temos as extremidades ditas rombas/cegas.

São utilizadas nas tecnologias de DNA recombinante.

Isto é importante para as técnicas, pois ao utilizar enzimas de restrição é possível clivar a molécula de
DNA de organismos diferentes e uni-los posteriormente com uma DNA ligase, pois o corte ocorre
exatamente no mesmo sítio, logo irá ter cadeias complementares.

Clonagem de DNA

- As enzimas de restrição são fundamentais na clonagem.

- O que se utiliza mais na clonagem são plasmídeos (molécula de DNA circular existentes nas bactérias,
DNA extra nuclear e também em outros microrganismos) devido a ser fácil de manipular.

- São utilizados como vetores genéticos. No entanto, também se podem utilizar fagos, cosmídeos,
cromossomas artificiais de leveduras como vetores (utilizados em grandes fragmentos de DNA).
- O vetor é o veículo de transporte que possibilita levar um determinado DNA até à célula onde nos o
queremos expressar. É o DNA que nos conhecemos, que iremos cortar, para introduzir a porção de
DNA que pretendemos estudar e depois a clonagem.

Características de vetores:

- Selecionáveis (se tem ou não plasmídeo)

São selecionáveis de forma bastante fácil a nível dos plasmídeos. As bactérias que têm plasmídeos por
norma possuem resistências aos antibióticos, logo a nível do meio de cultura podemos colocar um
antibiótico e verificar se possuem ou não resistentes a antibióticos.

- Local de clonagem (forma de introduzir o material genético)

Os plasmídeos têm de ter pelo menos um local de clonagem, mas de preferência deve ter vários. Esses
locais são os locais de restrição para diferentes enzimas. Ou seja, sítios possíveis de fazer a ligação do
DNA exógeno que pretendemos clonar.

- Fácil deteção
O plasmídeo recombinante é agora introduzido numa célula-alvo, a qual vai funcionar como hospedeira
para fazer a amplificação do DNA. Se for uma bactéria, é necessário ter a certeza que as bactérias têm o
vetor recombinante.

É possível fazer a introdução do DNA exogéneo no plasmídeo, mas não ser bem sucessivo, e existirem
bactérias com o plasmídeo normal. Esta deteção faz-se utilizando marcadores que existem no próprio
plasmídeo, sendo o mais utilizado o gene da lacZ. Este gene expressa um mRNA que ao ser copiado
leva a formação de uma enzima que é a β galactosidase, e esta tem a capacidade de degradar um
substrato que é especifico da mesma - o Xgal. Quando a β galactosidase degrada este substrato origina
um precipitado azul, o que permite distinguir as colónias.

Cor azul indica que o gene não foi interrompido e o plasmídeo está normal.

As colónias ficam brancas quanto têm DNA exógeno

- Promotor

Um promotor é uma sequência conservada que permite à RNA polimerase saber onde se vai ligar. Indica
onde é o início da transcrição. Existem promotores fracos e fortes, relacionados com a facilidade com
que a DNA polimerase se vai ligar ao mesmo, ou seja, quanto mais forte, a RNA polimerase liga-se
melhor ao promotor e mais rapidamente e eficazmente ocorre a transcrição.

- Origem de replicação
Para a célula se replicar tem que ocorrer a duplicação do DNA, e para a clonagem é importante que o
vetor tenha a capacidade de se replicar e não só o cromossoma da bactéria. Para isso acontecer é
necessário existir uma origem de replicação. Existem plasmídeos que têm uma replicação autónoma do
cromossoma bacteriano e outros que só se replicam quando o cromossoma bacteriano se replica, em
que o que é autónomo produz maior quantidade de moléculas de DNA exógeno no mesmo período de
tempo.

Em função do que se pretende é feita uma análise dos plasmídeos que existem disponíveis, das
enzimas, dos locais de restrição e posteriormente vê-se qual o mais adequado, ou seja, em função das
enzimas que conseguem cortar esse plasmídeo, que locais de restrição é que estes possuem, etc.
(mapeamento do plasmídeo).
Portanto, na clonagem temos um plasmídeo do qual se conhece os vários locais de restrição e quais as
enzimas que podem clivar esses locais, um DNA que se pretende estudar e gere-se o plasmídeo com a
enzima de restrição adequada, ficamos com o plasmídeo linear e
agarramos no DNA para estudo e promovemos uma ligação através da
DNA ligase e temos o DNA pronto a ser introduzido numa bactéria, numa
levedura, etc. É expressado o gene, como exemplo temos a insulina.

A clonagem possui as seguintes etapas:

- Preparação do DNA vetor (clivar o vetor)

- Preparação do DNA ou cDNA inserto

- Ligação do inserto ao vetor

- Seleção do sistema vetro/célula hospedeira (selecionar a célula hospedeira, em

função do objetivo e do vetor)

- Introdução de DNA recombinante na célula hospedeira

- Seleção e identificação de clones recombinantes (Xgal)

RFLP

Utiliza enzimas de restrição para, a nível de moléculas de DNA, aproveitar os polimorfismos da molécula
de DNA (trocas numa base azotada, que acaba por causar uma diferença a nível da sequência
nucleotídica) para obtermos fragmentos de restrição diferentes (a enzima numa molécula corta nos locais
de restrição normais e na outra não corta num deles, pois a base é diferente, logo origina fragmentos de
restrição de diferentes comprimentos) e com comprimentos diferentes.

Permite verificar se o DNA é exatamente igual (homozigótico) ou é diferente, logo este método permitiu a
descoberta de diversas doenças genéticas.

Eletroforese
- Separação de moléculas que nós queremos usar, ocorre a migração dos fragmentos das moléculas
que estão a ser estudadas. Esta migração ocorre, pois os fragmentos são inseridos num suporte, no
qual vai ser submetido a uma corrente elétrica, como o DNA está carregado negativamente devido aos
grupos fosfato, vai ocorrer a migração para o polo positivo do campo.

- Isto é feito num suporte sólido funcionando como uma espécie de rede, o que significa que as
moléculas vão ser separadas tendo velocidades de migração diferentes. Esta velocidade pode ser
influenciada pela quantidade de carga que a molécula tem (quanto mais, mais rápida); pelo tamanho
da própria molécula (quanto mais, mais pesada e mais lenta) e pela forma do DNA (linear ou enrolado).

Nesta técnica temos: um campo elétrico, molecular carregada, migração, separação/purificação de

macromoléculas e géis (suportes). Utilizam-se também colorações (marcadores fluorescentes) de forma a
determinar a dimensão dos fragmentos e assim poder compará-los com os já tabelados – marcadores.

- É a técnica mais utilizada para análise de preparações de ácidos nucleicos e que nos permite avaliar o
grau de pureza do DNA, a integridade do DNA (degradado ou inteiro), a identificação e caracterização
do DNA e permite também fazer a sequenciação do DNA.

A escolha da natureza do suporte e da concentração (agarose ou poliacrilamida) a usar depende da

massa molecular dos ácidos nucleicos em estudo. A agarose possui uma pior resolução para fragmentos
pequenos e a poliacrilamida é toxica.

Existem variações da técnica de eletroforese, e como exemplo temos o PFGE (eletroforese de campo
pulsado).
Os polos são posicionados de forma diferente para de x em x tempo, realizarem-se pulsos diferentes, há
uma alternância. Com esta alternância, a molécula como muda de direção, passa mais tempo a
reorientar-se do que a migrar, o que vai permitir que tenhamos várias bandas separadas e não todas
juntas.
Isto é utilizado especificamente para fragmentos de grandes dimensões.

Eletroforese de proteínas (PAGE)

É exatamente a mesma coisa que a anterior, no entanto é o utilizado o gel de poliacrilamida. Ocorre a
polimerização de monómeros de acrilamida, formando cadeias lineares que vão ligar-se umas às outras
de forma a formar uma espécie de rede e é através dessa rede que vão migrar as proteínas.

Utiliza-se um marcador mas para proteínas, em que existem pesos moleculares perfeitamente definidos,
que nos permitem fazer a correspondência com as bandas que vamos ler, em termos de peso molecular.

As tinas eletroforética são verticais.

Nos podemos fazer eletroforese de proteínas, nas que se possuem a sua configuração nativa (não
desnaturada (PAGE)) e nas que se encontram desnaturadas (SDS-PAGE).

Este SDS-PAGE, em que SDS é o elementos desnaturante da proteína, que a leva a sua forma primária e
para além disso aumenta as cargas negativas a nível da proteína, o que pode ajudar na separação das
mesmas.

Técnicas de hibridação

É sinónimo de emparelhamento, feito em laboratório. Permite-nos estudar a expressão génica.

- As nossas células têm todas os mesmos genes, mas depois nem todos os genes estão ativos nas
mesmas células. Permitem-nos identificar que genes estiveram ativos em determinado momento.

As técnicas de hibridação são caracterizadas pelo emparelhamento dos ácidos nucleicos,

posteriormente é realizada uma lavagem para se remover tudo o que não se ligou e vai se detetar as
moléculas que sofreram essa hibridação. Normalmente, estas técnicas podem ser realizadas quer em
fase líquida, quer em fase sólida (sendo que o sólido (algo extra célula) é o mais utilizado).

A hibridação também pode ser feita in situ, ou seja, utilizando as próprias células.

Exemplificando a hibridação in situ, se o interesse for saber se existe um determinado RNA na célula a
ser expresso.

Se for expresso significa que a célula o produziu, mas se o gene correspondente estiver inativo esse
mRNA não vai existir na célula porque não está a ser expresso. É possível então arranjar um segmento
de DNA que seja complementar ao mRNA que se pretende pesquisar. Se o DNA encontrar o RNAm
complementar vai emparelhar com ele e ocorre a hibridação, se não encontrar não se liga e acaba por
ser eliminado na lavagem. Para identificar este emparelhamento faz-se a ligação a um anticorpo
específico que esteja marcado com uma substância cromogénica/quimiogénica que me dá um sinal no
caso de aquela mólecula híbrida ser formada.

Isto é utilizado em técnicas que consistem em agarrar num gel em que ocorreu a separação do DNA e
fazer a transferência as bandas para um suporte solido, o qual costuma ser uma membrana de celulose,
e onde se vai promover a absorção ou uma ligação covalente dos fragmentos de DNA, e a partir daí
podemos depois estudá-los.

Southern blotting
- Técnica de identificação de fragmentos específicos de DNA após a transferência de um gel para uma
membrana de nitrocelulose iSouthern (1975)
- Eletroforese técnica que nos permite separar fragmentos de DNA, proteínas, RNA que tenham
dimensões diferentes

Géis: podemos agarrar no gel onde ocorreu separação do DNA e fazer a sua transferência. As zonas
onde ficam os vários segmentos de DNA - bandas, transferimos os segmentos onde esta o DNA para
uma membrana de nitrocelulose onde se vai promover a absorção dos fragmentos do DNA ou uma
ligação covalente para ficarem bem agarrados a esses suportes.

O gel onde ocorreu a separação dos fragmentos do DNA, colocamos o mesmo em contacto com uma
membrana de nitrocelulose, em aparelhos próprios. O gel fica em contacto com uma solução alcalina a
qual vai ascender e consequentemente arrasta os fragmentos consigo e estes acabam por ficar retidos a
nível da membrana de nitrocelulose. Esta membrana possui uma rede bastante apertada onde os
fragmentos vão ficar retidos. Posteriormente faz-se uma fixação, por radiação ou calor, e pegamos na
membrana de nitrocelulose e colocamos em contacto com uma sonda marcada. Nesta sonda, quando
existirem segmentos de DNA que seja possível emparelharem com a sonda, vai ser possível detetá-los.

É principalmente aplicada no mapeamento de genes, localização de genes, estudo de novos genes.

Nothern blotting

- Variação da técnica anterior por análise de RNA

- Pesquisa e quantificação de expressão génica, verifica se um gene é transcrito e em que quantidade.

Estas técnicas permitem nos fazer pesquisa dos genes que estão ativos e quantificar a expressão
génica. Posso quantificar porque posso ter mais ou menos RNA. O RNA tem que estar sempre
desnaturado, porque fica na forma de uma cadeia simples, para depois ser mais fácil para emparelhar.

Transfere-se os segmentos para um suporte sólido, faz-se a fixação por calor ou UV e coloca-se essa
membrana em contacto com a sonda nos sítios onde existir RNA compatível que permita
emparelhamento com a sonda eu vou detetar. Essas sondas podem ser radioativas onde vamos detetar
por autoradiografia.

Western Blotting / Imunoblot

- Técnica para análise de proteínas
Muitas vezes é designada por Immunoblot, porque utilizamos anticorpos para detetar proteínas.

O anticorpo é específico para a proteína que queremos pesquisar. Se essa proteína lá estiver vai ligar-se,
e numa etapa seguinte vamos utilizar um segundo anticorpo que vai estar ligado a um marcador
fluorescente/radioativo. Se ocorrer a ligação da proteína ao 1º anticorpo, quando o 2º anticorpo for
colocado em contacto vai emitir um sinal quer de fluorescência quer de radioatividade. Se a proteína não
existir, o anticorpo é removido com a lavagem e o segundo anticorpo não emite nenhum sinal.

Dot / Slot blotting

É uma variação da técnica usada na pesquisa de DNA ou RNA total. O princípio é o mesmo que nos
anteriores, mas são utilizados para moléculas de menor dimensão. A vantagem desta técnica é que
podemos detetar DNA’s de interesse de um grande número de amostras em simultâneo. A população de
ácidos nucleicos é aplicada diretamente na membrana.

Nesta técnica não vão ser detetadas misturas de DNA, vão ser detetadas colónias que podem ter DNA’s
recombinantes diferentes em função das sondas utilizadas.

A diferença entre as duas técnicas é que os locais onde vão ser colocados os DNAs, a nível dos dot têm
uma forma esférica e a nível dos slot são uma espécie de retângulos. A zona de onde vai provir o sinal ao
nível do processo difere na forma. Ambas as técnicas constituem métodos rápidos e sensíveis para
análise simultânea (também comparativa).

Blotting de Colónicas / Placas

A hibridação de colónias permite a identificação rápida e simultânea de determinadas sequências de
DNA em diferentes estripes (diretamente da placa).

Utiliza-se um suporte de nitrocelulose. Incuba-se com sondas que permitem fazer a identificação dos
segmentos de DNA que interesse.

Arrays de DNA
• São arranjos de um elevado números de moléculas de DNA. São utilizados suportes sólidos onde vão
ser impressas várias moléculas de DNA.

• É uma análise do padrão de expressão genética em larga escala em que é possível saber quais os
genes que estão a ser transcritos ou não numa determinada célula.

- Macroarrays (diâmetro < 300 micrótomos)

- Microarrays (diâmetro < 250 micrótomos)
- Nanoarrays (diâmetro < 350m nanometros)

Extrai RNA da célula, é sintetizado cDNA in vitro a partir do DNA porque os chips estão preparados para
DNA e vou estudá-lo a nível dos Microarrays, ou seja, vou pegar nos cDNA e colocá-los junto dos
Microarrays. Depois em função do padrão e das cores que vão ser emitidas (em função das sonas
utilizadas também) consigo perceber se há genes que estão a ser expressos ou não e as cores também
dão uma ideia de quantificação.

Podemos trabalhar com uma célula normal e uma célula cancerígena e comparar a expressão dos genes
numa célula num determinado tecido que é normal e numa célula que é cancerígena e fazer uma
estimativa dos genes que estão a ser expressos. Permite-nos fazer diagnóstico e depois também estão a
evoluir estas técnicas em termos de nos ajudar a ter visão em futuro.

Isto é importante porque nos dá conhecimento de genes desconhecidos. Permite-nos saber como um
determinado processo fisiológico da célula vai reagir a determinadas condições ambientais e também
permite comparar a expressão dos genes de células cancerígenas e células normais e até quantificar as
células cancerígenas (permite o diagnóstico).

PCR - Reação de polimerização em cadeia

Aqui é amplificado o DNA exponencialmente. Com uma molécula de DNA inicialmente podemos ter ao
fim de um ciclo 2 moléculas, depois 4 e sucessivamente.
Tem-se um aparelho que se chama termociclador ou aparelho de PCR, que coloca-se pequenos tubos
com o meio reacional para que possam efetuar a polimeração em cadeia.

No tubo temos de ter:

- DNA como molde, nucleótidos (4)

- uma enzima que polimerize (DNA polimerase)

- tampão

- ião magnésio para servir de catião (Polimerases termoestaveis utilizadas no meio reacional normalmente precisam de
catiões e é ai que entra o magnésio.)

- 2 primers

- dNTP’s.


Vão existir vários ciclos em que as temperaturas irão aumentar exponencialmente ou seja vamos estar na
presença de 3 etapas:

1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso
proporciona um molde de cadeia simples para a próxima etapa.

2. Hibridização dos primers / Annealing


dos primers (55 - 65°C): Arrefece a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências
complementares no DNA molde de cadeia simples.

3. Extensão da sequência alvo/ Enlongação (72°C): Aumenta a temperatura da reação para que a
Taqpolimerase estenda os primers, de modo a que seja possível sintetizar novas cadeias de DNA.

Transcriptase reversa - PCR

Mais uma vez significa que vamos amplificar o que? Se utilizo primeiro uma transcriptase reversa
primeiro o passo inicial agarramos no RNA→DNA complementar, e depois é este DNA complementar
que vai ser utilizado na amplificação.

PCR em tempo real

RT-PCR também conhecido como PCR quantitativo é usado para amplificar e quantificar
simultaneamente um DNA alvo. É um upgrade da técnica do PCR tradicional.

- Difere da PCR padrão de uma forma que pode detectar o produto amplificado à medida que a reação
progride com o tempo, mas na PCR padrão o produto amplificado é detectado no final da reação por
eletroforese em gel de agarose.
- A RT-PCR é amplamente utilizada no perfil de expressão, para determinar a expressão de um gene ou
para identificar a sequência de um transcrito de RNA, incluindo os locais de início e fim da transcrição.

Vantagens: deteta e quantifica em tempo real ácidos nucleicos enquanto são amplificados, Ciclos mais
rápidos; mais específico; não é muito mais caro…

Desvantagens: requer habilidade técnica elevada e suporte; equipamentos de elevado custo.

Sequenciação de DNA

Sequenciar DNA é podermos saber a sequência do DNA, ou seja, quais são os nucleótidos e qual é a
ordem pela qual eles aparecem num determinado DNA.

Existem 4 tubos diferentes onde vai acontecer a mesma reação, a diferença entre eles é que cada um só tem um determinado
tipo de ddNTP, para ter a certeza que no meio reacional vai ser possível sintetizar todos os fragmentos possíveis que resultam
da copia daquele DNA.

Todos esses fragmentos vão distinguir-se uns dos outros a determinada altura num único nucleótido e é nisso que acaba por
consiste a sequenciação. Pega-se nos 4 tubos e vamos separá-los numa eletroforese, e em função da dimensão dos
segmentos, iremos ter bandas diferentes em cada uma das 4 colunas. Depois procede-se à leitura e interpretação da cadeia que
foi sintetizada através do molde.




 Genoma
Totalidade de DNA que constitui o património genético da espécie, presente em cada célula do
organismo:

- Num conjunto cromossomas (eucariotas)

- Num cromossoma único (bactérias)

- Numa molécula de DNA ou RNA (vírus)

É o DNA total do organismo, de uma célula haploide…

Quando se refere o genoma nas células eucariotas está a referir-se o genoma nuclear.

DNA mitocondrial

O tamanho e capacidade codificante do DNA mt variam nos diferentes organismos.

Também há o genoma mitocondrial.

Dimensão de genomas
• Valor C - Quantidade de DNA típico / característico de cada espécie.

• Paradoxo do valor C - A maior quantidade de DNA não se relaciona-se com a maior complexidade de
uma determinada espécie.

DNA
• nos procariotas
- Tem uma molécula de DNA circular onde estão contidos todos os genes que necessitam.

- A dimensão da molécula de DNA circular é variável em função das diferentes espécies.

• nas células humanas

- O DNA é linear.

- Estruturalmente está contido nos cromossomas.

- Tem 46 cromossomas logo tem 23 moléculas de DNA.

- Tem milhares de genes (entre 20-25 mil).

Os genes não codificam apenas proteínas, podem origina RNAm, RNAt, RNAr…

Genes e cromossomas
Gene - é uma sequência que está no DNA que codifica uma proteína ou um RNA funcional.

Estrutura do gene

- Uma zona codificante, que é a sequência de desoxirribonucleotidos que tem informação para o RNA
ou proteína.

- Existem outros sinais a nível do gene como os locais de iniciação (transcrição +1) (AUG), locais de
terminação, regiões promotoras (promotor).

• Promotor: relaciona-se com a transcrição (polimerização de novas moléculas de RNA) e vai promovê-
la. É uma sequência que relaciona a forma como a RNA polimerase se une ao gene que vai copiar.

Há promotores forte e fracos, dependendo da sua estrutura e sequência. Traduz-se numa transcrição
mais eficaz, mais rápida ou mais lenta.

• Sequências de consenso - sequência extremamente conservada / idêntica. Assim a RNA polimerase

reconhece facilmente aquela zona.

Organização dos genes nos procariotas

• Operão: é a unidade de transcrição dos procariotas

Tem genes que estão correlacionados ao produto

que formam.

Neste caso cada um tem informação para levar à

produção de uma proteína que vai ser uma enzima
envolvida na produção do aminoácido triptofano.

Tem um promotor / região de consenso onde se vai

agarrar a RNA polimerase, é a zona que vai
proporcionar uma maior ou menor eficácia da
transcrição.

Quando o RNA mensageiro tem informação e leva à formação de várias proteínas em simultâneo chama-
se RNAm policistrónico.

Organização dos genes nos eucariotas

Também temos várias enzimas (são 5) para levar a

produção do aminoácido triptofano.

A diferença é que os genes que codificam as enzimas

estão localizados em cromossomas diferentes. Ou seja
quando estes genes são transcritos cada um deles leva à
formação de um RNAm que por sua vez vai levar à
produção de uma proteína.

Quando são traduzidos e só levam à produção de uma

proteína diz-se que os RNAm são monocistrónicos.

Unidade de transcrição simples

RNA polimerase II vai transcrever e levar à formação de um

pré-mRNA ou RNA heterogénico nuclear (transcrito
primário).

Adicionar ao nível das extremidades 5’ chama-se

codificação de 5’ cap?

Cauda 3’ poly A protege os RNA da ação de nucleases.

Durante o processo há remoção dos intrões e ligação do exões que leva ao mRNA funcional que pode
ser traduzido.

Os intrões e exões também fazem parte dos genoma.

Os intrões são sequências que não são codificadas.

Temos 9 exões e 8 intrões em cada gene.

Há maior quantidade de DNA a nível dos intrões.

Unidade de transcrição simples porque tem o promotor, a região codificante onde estão as sequências
de intrões e exões…

Como a que a célula sabe que é um intrão e um exão?

Junto aos locais de splice 5’GU e AG3’ no pré-mRNA existem sequências de consenso.

Splicing

Na extremidade 5´ (5’ splice site) e na extremidade 3’ (3’ splice site) há uma sequência de consenso para
as células reconhecerem o intrão.

Ponto de ramificação ou branch Point é uma zona rica em bases pirimidinas (1 anel, ponte de hidrogénio)
é uma região de consenso.

Um grupo de ribossomas a transcrever um RNAm é um poliribossoma.

Um conjunto de muitas proteínas a participarem num processo é de splicing é um splisseossoma.

No local onde ocorre o agrupamento de proteínas que participam no splicing é no ponto de ramificação
e por isso é que há o ponto de consenso para as proteínas saberem onde é que se vão unir a nível do
intrão.

Unidades de transcrição complexas

- A grande diferença para as simples é que há a
possibilidade de 1 ou 2 RNAm diferentes.

A maneira como o pré-mRNA sofre o splicing pode

ser diferente - splincing alternativo.

Quando vão ser traduzidos as proteínas são muito

idênticas.

- Exões podem ser considerados como intrões, e

por vezes são transcritos para o mRNA e outras
vezes não.

- Poly-A Poly-A: pode ser finalizada mais cedo e fica mais curto ou mais tarde e fica mais longo.

- Dois locais Cap a funcionar como extremidade 5’ : Quando a transcrição é iniciada no exão que possui
a segunda modificação 5’CAP o primeiro acaba por funcionar como intrão.

Densidade de genes
Como são distribuídos nas moléculas de DNA

Quanto maior é a complexidade dos organismos menor é a densidade dos genes.

A maior parte da quantidade de DNA não tem informação.

Classes de DNA

• Classe dos genes que codificam de proteínas: dividem-se em genes solitários (aparece uma única
vez no genoma) e família de genes (genes sequência de nucleótidos muito idênticas)

• Classe de genes repetidos em tadem (RNA ribossomal). Uma célula tem de ter muitos ribossomas
para produzir muitas proteínas (ex: tecido embrionário). Se um gene vai ser duplicado depois de
ocorrer uma recombinação desequilibrada, significa que em vez de 1 gene dentro daquele DNA vamos
ter 2 genes exatamente iguais, próximos um do outro e quando copiados levam à formação do mesmo
produto génico.

• DNA repetitivo
- Sequências de inserção

Estas sequências de DNA repetidas podem movimentar-se de uma molécula de DNA para outra, em que
à molécula que dá o DNA designamos de molécula dadora e a molécula onde estas sequências vão ser
inseridas designamos DNA alvo.

Mecanismo de inserção não replicativo: esta sequência é cortada uma molécula de DNA dadora vai ser
transposta para um DNA alvo, ganha uma nova sequência nucleotida mas o dador deixou de a ter.

Mecanismo de inserção replicativo: vai ocorrer copia da sequência de inserção e o número vai aumentar.
Quem faz isto é a enzima transposase. Quem faz o preenchimento das zonas é a DNA polimerase.

• Elementos móveis: São elementos que também sofrem estes mecanismos de transposão só que uns
é uma transposão propriamente dita e outros chamamos a essa capacidade de se movimentarem de
um determinado DNA para outro local desse mesmo DNA ou até mesmo para outra molécula de DNA.

• Transposões
Ocorre clivagem no DNA dador, fica livre e depois pode ser inserido num DNA alvo.

- Retrotransposões LTR (sequência dadora de DNA que para ser inserida num DNA alvo, não se
perde a sequência inicial mas sim para um RNAm)

- Retrotransposões Não LTR: LINEs (ORF1 ORF2) e SINEs (família Alu)

• Pseudogenes: parece um gene mas não é, não se vai expressar.

 DNA
O genoma está distribuído nos cromossomas e a quantidade dos mesmo é específico de cada espécie.

O DNA não se encontra sozinho nem livre a nível das células (quer células que possuam núcleo para o
“guardar”, quer células de procariotas).

- O DNA a nível das células bacterianas vai interagir com as proteínas. O DNA das bactérias tem de
estar bem enrolado, mas de forma organizada (no seu interior) para que possa ser replicado e
transcrito sem ser destruído.

- Nos eucariotas o DNA vai estar inserido a nível dos cromossomas, ao nível do núcleo das células. Ao
nível do interior do núcleo chamamos de cromatina, e dentro da cromatina podemos ter a
heterocromatina e a eucromatina, em que a primeira é mais condensada e por isso tem os genes que
estão metabolicamente inativos e a segunda está menos condensada e os genes estão
metabolicamente ativos.

- Na cromatina nos eucariotas o DNA estende-se como uma dupla hélice continua que se vai enrolar em
torno de proteínas formando uma estrutura que se designa nucleossoma.

- O empacotamento do DNA envolve o seu enrolamento em torno de um core (centro) constituído por
proteínas histonas, mais especificamente 8 histonas (H2B, H2A, H4, H3 – duas de cada), o DNA dá
sempre duas voltas em torno deste octano. Logo designamos nucleossoma quando é constituído pelo
octano de histonas e as duas voltas de DNA.

- Quando se une ao nucleossoma a histona H1 este passa a designar-se cromatossoma. As histonas H1

são importantes pois elas vão interagir umas com as outras de forma a aproximar os cromatossomas
uns dos outros. Após a formação dos cromatossomas, o empacotamento prossegue.

- Entre um nucleossoma e outro existe DNA linker em que podem estar associadas outras proteínas não
histónicas para aumentar a estabilidade do DNA. Quando os nucleossomas se unem, forma a
estrutura do solenoide. As proteínas de Scaffold funcionam como base para sustentar o enrolamento
das estruturas em solenoide, em forma de ansas.

Histonas
As histonas que se encontram em torno do core designam-se histonas canónicas (iguais em qualquer
organismo).

- As histonas são altamente conservadas, encontram-se nos nucleossomas, e estes fazem parte da
estrutura dos cromossomas e tendo em conta que a estrutura dos cromossomas é idêntica para todos
os eucariotas, em termos evolutivos, tudo o que eram grandes variações à estrutura fundamental das
histonas ia sendo eliminado, pois era importante que o DNA se enrola-se bem e de forma estável e
que a estrutura tridimensional dos cromossomas fosse sempre idêntica.

- Existem, em menores quantidades, algumas variantes de histonas, nomeadamente a H2AX - variante

da H2 que existe em pequenas quantidades e em vários sítios da cromatina com o principal objetivo
de quando existem clivagens nas cadeias de DNA esta variante fica fosforilada e vai ajudar nos
mecanismos de reparação do DNA.

- CENP-A – variante da H3 que se localiza especificamente a nível dos centrómeros dos

cromossomas, sendo que estes estão relacionados com os cinetocoros, onde vai ocorrer a ligação
das fibras do fuso, para ocorrer separação pela mitose, é ai que esta variante vai ter um papel
 importante no rigor com que os microtubos se vão ligar no centrómero (importante para ocorrer a
correta separação dos cromossomas).

Na cromatina, as histonas possuem um papel muito importante na forma como o DNA está a interagir
com elas e também na forma como esse DNA depois vai estar mais ou menos acessível às enzimas que
levam à expressão dos genes e as enzimas que levam à própria recrutação do DNA.

As histonas são constituídas, em termos de aminoácidos, por dois grandes

domínios, um mais globular (+ interior) e outro que normalmente corresponde às
extremidades das cadeias de aminoácidos que está enrolada nessa forma globular.
Estas estão voltadas para o exterior da histonas, logo são as zonas mais flexíveis e
que vão ter mais capacidade de interagir de formas diversas com o DNA.

- Às extremidades das histonas designamos de caudas.

Quando a proteína é sintetizada (a histona) e depois de ocorrer a tradução, ocorrem modificações a nível
da proteína que foi sintetizada, mais especificamente a nível da cauda. Estas modificações que ocorrem
a nível das histonas são de extrema importância e por isso possuem, elas próprias, um código (análogo
ao código genético). Em função das modificações das histonas pode haver tipos de interação dessas
histonas com o DNA e com outras proteínas, que leve a diferenças em termos da expressão dos genes.

Este código de histonas vai influenciar a expressão dos genes a vários níveis, pois também vai
condicionar:

- A maior ou menor condensação da cromatina, consequentemente a sua função (hétero ou

eucromatina com funções diferentes

- A interação entre histonas e DNA

- Interações entre nucleossomas

- Transcriptoma das células (a maneira como os genes se vão expressar, maior ou menor produção de
RNA’s)

A estrutura oval representa o domínio globular das histonas. As

letras correspondem a aminoácidos

Modificações principais que vão ocorrer ao nível das histonas –

código de histonas são:

• Fosforilação: ocorre a nível de aminoácidos específicos

(principalmente a Serina e da Trionina)

• Metilação: ocorre a nível do aminoácido Arginina e Lisina

• Acetilação: ocorre a nível das lisinas.

A modificação que ocorre ao nível da histona é ao nível de um pequeno grupo e que é o facto de a lisina
ser um aminoácido que tem uma carpa positiva e o que acontece é que quando ocorre a acetilação
deste aminoácido, ele deixa de ter cargas, foi neutralizado.

- Uma histona que tem as suas lisinas sem estarem acetiladas, são lisinas com carga positiva. Em torno
das histonas vai ligar-se o DNA que possui cargas negativas devido ao grupo fosfato. Portanto, uma
histona com aminoácidos lisina com cargas positivas vai ter grande afinidade para o DNA, logo leva a
uma ligação mais forte.

- Uma cromatina em que as histonas tenham a lisina carregada positiva, vai ser mais condensada do
que uma histona que tenha sido acetilada e consequentemente tenha perdido a carga da lisina, pois
não existem opostos em termos de carga, logo não se atraem.

• Ubiquitina: molécula que se liga as histonas com a finalidade de influenciar a forma como estas
histonas vão poder interagir com o resto do DNA e com outras histonas. Ocorre ao nível da lisina.

Foram então feitas experiências para percepcionar efetivamente, em função das modificações das
caudas das histonas, se isso ia influenciar a maior ou menor condensação da cromatina. E, para além
disso, foi verificado que a cromatina que estivesse muito mais condensada, o seu DNA estaria menos
acessível ás enzimas. (processos de mecanismos genéticos, em particular, processos de expressão
genética implica a ação de enzimas que se vão ligar ao DNA).

Como exemplo de experiência temos esta, na qual se colocou, em paralelo:

• Eritroblastos (células em divisão) com 14 dias, logo células que estavam a expressar ativamente este
gene – globina.

• Células MSB (células indiferenciadas) logo não possuem aquele gene a ser expresso

Foram submeter estas células à concentração crescente de DNase (uma nuclease), depois foi extraído o
DNA nuclear de cada uma destas células e foram fazer atuar sobre o DNA extraído as enzimas de
restrição (cortam DNA).

Se eventualmente, tivesse ocorrido acesso fácil da DNase a nível deste gene, não se iria formar o
fragmento que resultaria da clivagem das enzimas de restrição.

Foi possível observar que no gene que se encontra nas células indiferenciadas, onde a cromatina está
muito mais condensada, as enzimas de restrição até atuaram, no entanto não conseguiram cortar o
fragmento, mantendo o mesmo nº de pares de bases – 4.6 KB.

No gene que se encontrava na cromatina descondensada, estava ativamente a produzir a globina logo a
sua descondensação permitiu o acesso a DNase, cortando o fragmento em bocados, logo não existem
os limites específicos para serem cortado pela enzima de restrição.

Eucromatina e Heterocromatina
• Heterocromatina: mais inativa, genes que não estão a ser expressos pelo papel das histonas, estão
mais protegidos. Aqui observam-se metilações.

• Eucromatina: mais ativa, genes que estão a ser expressos pelo papel das histonas. Aqui observam-se
metilações, fosforilações e acetilação – de forma a fazer com que a eucromatina esteja mais relaxada,
menos condensada.

Isto vai ter implicações nos genes que estão inativos e nos que estão ativos.

Em termos de estrutura da própria cromatina há uma influência clara na forma como os genes podem ou
não ser expressos (epigenética porque são modificações em sítios que não são fundamentais em termos
de gene, mas que podem afetar a sua expressão).

- Para que a metilação tenha um efeito de levar à maior condensação da cromatina, a metilação a nível
das histonas vai ser tripla.

- As histonas metiladas depois vão ter a capacidade de serem reconhecidas por uma proteína
designada HP1 e que é uma proteína de ligação à heterocromatina, que se vai ligar a essas zonas.
Esta metilação vai ocorrer no aminoácido lisina que se encontra a posição 9 das caudas das histonas
e, particularmente na histona H3.

- É a metiltransferase que vai fazer a metilação.

A proteína HP1 por um lado tem um domínio especifico que reconhece a

histona H3 metilada na lisina 9 e que se liga a esse local, mas por outro lado
também tem um outro domínio designado como domínio sombra, que tem a
capacidade de se ligar a outro domínio correspondente noutra HP1, ou seja,
ligam-se entre si levando a uma interação mais forte e a condensar a cromatina
(eucromatina a determinado momento passa a heterocromatina como no
cromossoma de Bar ou X).

A HP1 tem também um efeito de espalhar a heterocromatina ao longo de um

cromossoma, pois possuem a capacidade de se ligar à metiltransferase.

Resumindo, a HP1:
• Reconhece grupos metil da lisina 9 e agarra-se aos mesmo

• Agarra-se a outra HP1

• Possui uma zona que traz a enzima metiltransferase atrás de si, portanto, sempre que esta proteína

• HP1 se liga a um grupo metilo e estiver uma lisina adjacente, esta vai ser metilada

Territórios dos cromossomas

É um sítio específico em que cada um dos cromossomas estão.

Estes territórios foram descobertos através da marcação dos cromossomas. Logo, este processo está a
ocorrer sucessivamente de forma a propagar o efeito na heterocromatina.

Este efeito de propagação para em regiões que foram definidas como elementos de fronteira, que são
zonas com proteínas não histónicas, as quais se ligam ao HP1, a impossibilitam a propagação.

Expressão dos genes

O DNA de todas as nossas células é exatamente igual porque provém todas do mesmo, no entanto, a
forma como ele se expressão é que difere.

Genes nos procariotas

• Operão – conjunto de genes estruturais que vão ser expressos a nível da célula.

• Promotor – local específico reconhecido pela RNA pol e onde a mesma se liga.

• Operador – é o local específico de DNA onde se podem ligar proteínas reguladoras da expressão dos
genes e em função dessa proteína a transcrição pode ou não ocorrer e pode também ser mais ou
menos eficaz.

• Genes reguladores – se existe um operador onde tipicamente se vai poder ligar uma proteína
reguladora (fazem estímulo ou inibição da transcrição) então tem de existir genes que vão levar a
formação desta proteína. Esse mesmo gene vai ter por um lado a região codificante e por outro lado a
região reguladora desse mesmo gene.

• Região codificante – tem a informação para levar a síntese do RNA.

Existem estas sequências -35 e -10, que são sequências de

consenso, tipicamente designadas por qualquer coisa box,
que servem para as RNA polimerases saberem exatamente
onde vão encontrar o promotor. Estas sequências nestes
locais, a nível do promotor, são relativamente idênticas
independentemente das espécies e dos genes.

Genes nos eucariotas

O promotor proximal (zona de consenso) é a zona próxima do local de iniciação da transcrição, é aqui
que se vai ligar a RNA polimerase para iniciar o processo.

Existem outras zonas de consenso, como regiões de Enhancer/ativadoras que não se encontram
próximas do promotor proximal, por isso designam-se de sequências localizadas no promotor distal
(região fundamental para que, dependendo do processo, a RNA polimerase possa ou não ocorrer).

Se estas sequências de consenso localizadas no promotor distal forem enhancer’s/ativadoras – zonas

onde se vão ligar proteínas reguladoras – significa que quando a proteína reguladora se liga nesses
locais, vai favorecer a transcrição tornando mais eficaz a ligação da RNA pol no promotor proximal, o
que leva a um processo mais eficaz da RNA pol produzindo maior quantidade de molécula de RNA.

Se estas sequências de consenso foram sequências ditas silenciadoras significa que vão fazer o
processo contrário, vão fazer com que a RNA pol não se ligue de forma tão eficaz, produzindo muito
pouca quantidade de RNA.

Regulação da expressão de genes

Existem zonas específicas do DNA, sequências muito conservadas, onde há proteínas que se podem
ligar nessas zonas para regular a transcrição que vai ocorrer. Por estarem envolvidas na regulação
designam-se proteínas reguladoras.

Umas vão estimar e outras inibir a transcrição – proteínas ativadoras e repressoras.

Estas estruturas que regulam a transcrição podem ser classificadas de outra forma:

• Elementos reguladores cisacting (todas as sequências de consenso que aparecem no DNA e que ao
ligarem-se a elas qualquer coisa vai influenciar a expressão dos genes) – está sempre no mesmo sítio e
só influencia a expressão do gene onde essas sequências existem

• Elementos reguladores transacting (proteínas reguladoras) – podem influenciar a expressão do gene

onde atua ou noutro.

Estas possuem dois domínios, um de ligação ao DNA e outro que pode ser ativador ou repressor
dependendo da função da proteína.

O domínio ativador/repressor tem a função de interagir com fatores de iniciação da transcrição ou com a
própria RNA polimerase (seja para dificultar a sua ligação ou facilitar).

Estes vão ter estruturas especificas, e as mais conhecidas são as hélix-turn-hélix, estas em termo de
constituição possuem algumas zonas simétricas (uma hélice e outra) pois normalmente também vão
encontrar regiões palindrómicas a nível do DNA, as tais sequências de consenso.

Tanto os ativadores como os repressores faem regulação positiva e negativa.

Mecanismos de regulação da transcrição de genes

• Regulação positiva – a proteína reguladora vai fazer com que aconteça a transcrição, o operador
funciona como um local de ligação do ativador.

• Regulação negativa - a proteína reguladora quando unida ao DNA e ao operador, neste caso o
operador funciona como um local de ligação ao repressor, a transcrição não ocorre. Logo para ocorrer
a transcrição, o repressor tem de se desprender do DNA.

Existem ativadores e repressores que atuam por si próprios, ligam-se ao DNA e exercem a sua acção, e
outros que têm a capacidade de em determinadas circunstâncias ligar-se a um ligante específico,
designado por efetor, o qual causa uma alteração conformacional, levando a que a capacidade da
proteína se ligar ao DNA mude (quer no sentido de alterar de forma a se conseguir ligar ou o contrário,
ganhe ou perca afinidade com o DNA).

Regulação negativa

Impedimento alostérico
Podemos dizer que essa regulação pode relacionar-se com dois tipos
de sistemas reguladores, o sistema indutivel em que a ligação do
repressor ao DNA vai ser inibida quando se liga esse repressor a uma
molécula efetora ou sistema repressivel que é aquele que o efetor ao
ligar-se ao repressor vai fazer com que esse repressor atue e portanto
inviabilize o acontecimento da transcrição, aquando assim é o
repressor designa-se aporepressor em que o efetor é um co-
repressor, e juntos formam o repressor.

Aqui falamos de modificações na configuração do repressor, que vai

fazer com que deixe de poder atuar, portanto quando ele tem a
configuração adequada para se ligar ao operador e inibir a transcrição
designamos de impedimento alostérico.

 Regulação genética nos procariotas

As RNA polimerases nos procariotas possuem:

- 2 subunidades α

- 1 subunidade β e 1 subunidade β’

- 1 subunidade σ

As subunidades σ são muito importantes na transcrição pois reconhecem do local de início da

transcrição – promotor – basicamente ela é uma fator de iniciação da transcrição que vai iniciar e
promover essa transcrição. Esta subunidade atua apenas no início da transcrição e posteriormente vai
dissociar-se.

Funções comuns a todas as RNA polimerases:

• Reconhecer e ligar-se ao promotor

• Função helicasica de abrir a cadeia de DNA para copiar a molécula

• Fazer ligações entre ribonucleótidos por ligações fosfodiéster entre grupos 3’ OH e 5’ COOH

É o promotor mais forte da E.coli,

quanto maior a diferença de

nucleótidos tiver mais fraco se
torna.

Regulação no operão Lac - Modelo de Jacob-monod

Na imagem temos genes estruturais que quando são transcritos
levam a formação de um mRNA que tem informação para 3
proteínas

Estas proteínas são as enzimas:

- β-galactosidase que vai degradar a lactose em galactose e

glucose

- Lactose permease vai promover a entrada da lactose para a

célula

- Thlogalactoside transacetylase produzida pois com a lactose

entram tiogalactozitos e esta enzima vai inativá-los

Tendo em conta que a β-galactosidade vai degradar a lactose em galactose e glucose e que a glucose é
a molécula chave para a produção de energia a nível da célula. Como sabemos as células funcionam de
forma a poupar o máximo de energia, ou seja, não vão produzir algo que não é necessário logo é
importante a célula produzir uma enzima que vai degradar a lactose quando esta lactose existe dentro da
célula.

• Controlo negativo
Portanto, em situações normais em que não exista lactose no interior da célula bacteriana, na qual na
zona adjacente ao operão existe um gene regulador que produz o repressor. Então significa que este
repressor vai estar ligado ao operador (localizado junto ao promotor), logo mesmo que a RNA polimerase
se tente ligar ao promotor não consegue devido ao obstáculo formado pelo inibidor e consequentemente
não ocorre a transcrição.

Quando não há lactose no interior da célula bacteriana, o repressor

está perfeitamente ativo e possui uma grande afinidade para o
operador, ocorrendo a ligação ao mesmo e, portanto, não há síntese
de RNAm que leve a produção das proteínas.

Se existir muita lactose a entrar na célula, esta lactose chega ao

citoplasma da célula e vai ligar-se ao repressor (lactose funciona
como molécula efetora/ligante específico do repressor) causando a
alteração da sua conformação. Esta alteração causa a inativação do
repressor, ou seja, o repressor que está a ser produzido já não tem
capacidade de se ligar ao operador ou se já lá estiver ligado deixa de
ter afinidade para a molécula de DNA e desprende-se. Logo a zona
promotora fica livre para se ligar a RNA polimerase e este poder
transcrever os genes estruturais deste operão. A molécula de lactose
pode ser denominada de indutor pois induz a transcrição.

• Controlo positivo
A β-galactosidase cliva a lactose em glucose e galactose, sendo a glucose o açúcar principal a que a
célula recorre para obter energia.

Quando a concentração da glucose é baixa, e a célula consegue ter lactose no

meio então deverá ocorrer a transcrição do gene para a posterior degradação da
lactose. Só quando a glucose está muito baixa ao nível do citoplasma das
células é que vai ocorrer uma indução de uma enzima que se chama adenyl
cyclase, a qual vai converter ATP em AMP cíclico, este vai ligar-se a uma
proteína designada CAP (proteína ativadora do catabolito). Esse complexo que é
formado vai unir-se acima da zona do promotor e vai funcionar como estimulador
da ação da RNA pol, ou seja, esta RNA pol vai ficar com muito mais afinidade
para o promotor, vai ajudar a posicioná-la mais corretamente a nível do promotor
e posteriormente ela vai transcrever os genes estruturais com uma grande
eficiência, ou seja, é produzido mRNA em grande quantidade, para que eles
possam ser traduzidos e levarem a produção das enzimas, entre as quais a β-
galactosidase, para que a bactéria a partir da lactose possa obter glucose.

NOTA: O operão da lactose possui um local especifico para a proteína CAP (quando esta está ligada ao
AMPc).

Na ausência de lactose, mas na presença de glucose significa que não há lactose logo não é preciso β-
galactosidase, portanto, o repressor encontra-se ativo e liga-se ao operador impedindo a RNA pol de se
ligar ao promotor e não ocorre transcrição.

Se estiver disponível no meio lactose, mas a célula possuir muita glucose disponível não existe
necessidade de a célula ir produzir mRNA’s para a lactose, no entanto, se existir lactose no meio e
glucose, a lactose vai ligar-se ao repressor e alterar a sua conformação levando a que ele se desprenda
do operador, permitindo que a RNA pol se ligue ao promotor e consequentemente é feita a copia dos
genes estruturais. O que acontece é que, em simultâneo ocorre o tal controlo negativo. Como, neste
caso, a lactose existe em grande quantidade, a proteína CAP está livre mas não se liga ao AMP cíclico
porque este não foi formado (só é formado quando a glucose está baixa). O que vai acontecer é que a
RNA pol reconhece o promotor e até vai copiar os genes mas não é muito eficiente levando a uma baixa
produção de mRNA e consequentemente poucas enzimas vão ser produzidas.

Se existir lactose disponível e glucose baixa a célula vai recorrer a mecanismos metabolicos para obter
energia. Como não tem glucose, estimula a adenyl cyclase que vai fazer conversão de ATP em AMPc,
este liga-se à CAP e o complexo tem uma grande afinidade para se ligar ao local especifico no DNA, e
quando o faz interage com a subunidade sigma da RNA pol e faz com
que esta seja mais eficaz.

Para além do operador principal existem operadores secundários, e o

repressor vai ligar-se ao operador principal (junto do promotor) e a um
dos operadores secundários. Estes permitem que o repressor fique
estável. Como exemplos temos o O2 e o O3.

Normalmente em função dos promotores que são reconhecidos, os

quais se relacionam com os genes que vão ser transcritos, podem
existir fatores sigmas alternativos ao 10.

Regulação do operão trp

Elementos reguladores e genes estruturais

No operão do triptofano, quando os genes estruturais são transcritos levam à formação de um mRNA
que tem informação para enzimas que vão estar vocacionadas para produzir o aminoácido na célula, ou
seja, se este não existir em quantidade suficiente a célula tem de produzir as enzimas para produzir este
aminoácido.

Regulação do operão trp da E.coli

Aqui vai estar presente um mecanismo que leva à formação de uma enzima que vai estar relacionada
com a produção de uma molécula, portanto, normalmente, o repressor está inativo pois a célula precisa
do aminoácido triptofano (sempre que ele não exista tem se ser transcrito).

Quando existe este aminoácido em quantidade elevada, é o próprio aminoácido que vai funcionar como
molécula efetora, que se vai ligar ao repressor e altera a sua conformação, dando uma maior afinidade
para o operador e este repressor ativo vai ligar-se ao operador. Quando o repressor ativo se liga ao
operador, em termos de transcrição ocorre um bloqueio, o que significa que essas enzimas não são
necessárias porque a célula já tem o aminoácido em quantidade suficiente. O triptofano funciona como
um co-repressor (aporepressor).

A célula necessita de ter a certeza que efetivamente precisa ou não de fazer este bloqueio e vai fazê-lo
através de uma espécie de segundo mecanismo de controlo do trp que se designa como atenuação da
transcrição do operão trp.

Sequência leader – sequência de consenso. Esta

sequência leader é uma sequência que se o repressor
estiver inativo (circunstancias normais) vai ocorrer a
transcrição, mas pode existir alguma quantidade de
triptofano e como tal não faz sentido essa transcrição esteja
a acontecer.

Esta é uma sequência de nucleótidos que vai codificar um

mRNA, que por sua vez, tem a informação para um péptido,
e este péptido é constituído por 14 aminoácidos. Nesta
região Leader existe informação no DNA que leva à
formação de dois codões no mRNA, que por sua vez codificam dois aminoácidos triptofano.

Estes dois aminoácidos trp são fundamentais, esta região leader depois de ser transcrita e traduzida do
mRNA leva a formação da proteína tryp que vai funcionar como mecanismo de atenuação da
transcrição.

NOTA: Quando falamos em péptido já estamos a falar da

tradução, mas a nível das bactérias quando o RNA é transcrito,
começa imediatamente a ocorrer a tradução do mRNA, ou
seja, ocorrem em simultâneo.

Quando ocorre a ativação da transcrição a nível da célula bacteriana mas apesar de tudo existe trp em
elevada quantidade, a região líder vai ser transcrita, vai começar a ser lida pelos ribossomas (traduzida) e
a certa altura o ribossoma chega ao local onde vai encontrar dois codões que codificam o aminoácido
trp e para que esse trp seja introduzido na proteína é necessário que o tRNA o transporte até ao
ribossoma, mas como a célula tem uma grande concentração de aminoácido trp os tRNA específicos
estão todos carregados. E se estão carregados, quando o ribossoma vai ler esta sequência nucleotídica
no mRNA muito rapidamente chega la tRNA, o que significa que o ribossoma rapidamente está a
sintetizar a proteína sem grande pausa e avança na leitura do mRNA e isso vai fazer com que duas
sequências que vão estar a funcionar como homologas rapidamente emparelham uma com a outra em
forma de ansa (estrutura terminadora). Isto vai dificultar o avanço do ribossoma.

Por outro lado, como estamos a falar de um mRNA que já está a ser produzido, mas ainda esta a ser
transcrito, a RNA pol. ainda vai atrás destas sequências de consenso que enrolam rapidamente e,
portanto, vai ter dificuldades em continuar a avançar na cópia do DNA devido à estrutura que oferece
obstáculos a nível do DNA.

É como se formasse uma ansa que vai obstruir a passagem e a ligação da RNA pol ao DNA, vai fazer
com que ela se estenda e portanto quando existe try em pouca concentração, esta sequência
terminadora vai impedir que a RNA polimerase continue a transcrever.

Se a concentração de triptofano for baixa na célula, o

ribossoma precisa que venha para o mesmo tRNA ligado
previamente ao aminoácido trp, só que a célula não tem
tryp logo os tRNA não conseguem estar carregados. Então
o ribossoma fica à espera que chegue um tRNA, e como ele
demora muito tempo, essa pausa funciona como sinal à
célula para que estas estruturas possam emparelhar. Vai
ocorrer a formação de uma ansa também, no entanto entre
a região 2 e 3, a esta ansa designamos de anti- terminador,
a qual ajuda a RNA pol a avançar e a continuar rapidamente
a transcrição.

 Controlo da expressão genética nos eucariotas

- Promotor proximal – sequência de consenso próxima do local de iniciação da transcrição, ao qual se
vai ligar a RNA polimerase.

- Promotor distal – sequências de consenso que podem existir quer a montante quer a jusante do local
de iniciação onde se vão ligar as proteínas reguladoras.

- Silencer – sequência que existe a nível do DNA que vai silenciar a expressão dos genes.

- Enhancer – são sequências que quando uma proteína as reconhece e se liga. Os enhanceosomas são
complexos em que estão ligados fatores de transcrição e pequenas proteínas que quando formados
estimulam a transcrição, quando ocorre a sua formação forma-se uma curva no DNA, ajudando a RNA
pol a ligar-se.

RNA polimerases

Todas as RNA’s possuem subunidades comuns e depois cada uma tem subunidades específicas
adicionais.

Cada uma das RNA’s polimerases vai transcrever genes específicos delas.

Expressão de genes
A expressão dos genes relaciona-se com a diferenciação celular pois muitas vezes as células vão
diferenciar-se em vários tecidos diferentes e é esta expressão dos genes é que define o local onde a
célula se irá diferenciar.

Um organismo pluricelular possui células com o mesmo DNA, ou seja, em função do tipo de célula só
são expressos determinados genes (uns estão ativos numa célula e inativos em outra). Com tipos de
células diferentes iremos obter diferentes proteínas.

As células têm capacidade para alterar a expressão dos seus genes nomeadamente em respostas a
fatores extracelulares ou intracelulares.

A forma como estas proteínas reguladoras se vão ligar ao DNA (cromatina) está relacionada com a maior
ou menor acessibilidade das mesmas aos locais de ligação, ou seja, o nível de condensação da
cromatina vai influenciar esta ligação pois quanto mais descondensada ela estiver mais facilidade as
RNA polimerases têm para se ligar.

As modificações pós-tradução nas histonas também influenciam a forma como os genes vão ser
expressos pois a acetilação das caudas das histonas promove uma maior distensão da cromatina,
tornando-se essa cromatina ativa, o que promove a expressão dos genes.

Regulação da expressão de genes

A expressão da maioria dos genes eucariotas é controlada por elementos de controlo:

- Elementos cis: São sequências de DNA que estão presentes nos promotores proximal e distal. São
reconhecidos por proteínas e quando a mesma se liga, isso vai conduzir a um aumento ou repressão
da transcrição. Aos elementos cis vão ligar-se ativadores ou repressores, os quais vão ligar-se a outras
proteínas designadas de mediadoras (que ajudam interagem na ligação das proteínas reguladoras ao
DNA).

- Elementos trans: São proteínas. Portanto os elementos trans ligam-se aos elementos cis.

- Ativadores e repressores: Possuem sempre dois domínios.

Os ativadores são proteínas modulares com vários domínios, um de ligação ao DNA, um domínio de
ativação que por norma vai interagir com as proteínas mediadoras e fatores de transcrição e um domínio
flexível de modo a permitir a adaptação da proteína à ligação dos outros domínios. A proteínas
mediadoras medeiam a interação entre o próprio ativador e os fatores de transcrição. Os repressores
inibem a transcrição, mas possuem um mecanismo semelhante aos ativadores.

A maior parte dos genes dos eucariotas são regulados ao nível de transcrição (gene – RNA – se for
mRNA - proteína)
- A transcrição a partir de um determinado promotor é controlada por fatores de transcrição (DNA-binding
proteins).
- A transcrição de um promotor pode ser controlada por vários fatores de transcrição em elementos de
controlo alternativos
- Existem vários elementos reguladores localizados a nível do DNA, como os elementos cis e trans que
podem estar localizados quer perto do local de iniciação da transcrição quer afastados a muitas Kb. Os
elementos cis são sequências de consenso que aparecem ao nível do DNA e os elementos trans são
proteínas que podem regular a expressão dos genes mais a distância.
- Existem diferentes RNA polimerases a sintetizar diferentes RNA’s.
- Existem vários fatores de transcrição que podem ligar-se a diferentes regiões a nível do DNA, sendo as
mesmas sempre específicas que podem estar localizadas quer a montante quer a jusante do promotor.
Este fator de transcrição por norma tem múltiplas formas para fazer a regulação.

Os fatores gerais de transcrição são proteínas, que funcionam como ativadores ou como repressores de
acordo com a forma como se ligam. Em qualquer uma das etapas da transcrição podem existir fatores de
transcrição, no entanto, eles são mais importantes na primeira etapa, a qual é fundamental em termos de
regulação da própria expressão dos genes.
Os elementos fundamentais neste controlo são os fatores de transcrição principalmente mas também os
elemento cis, que estão relacionados com mecanismos moleculares que podem acontecer a nível da
própria cromatina, como a alteração a nível da cauda das histonas que leva a que a cromatina esteja
mais compactada ou mais estendida e portanto o DNA está mais exposto à acção das RNA polimerases e
os complexos de mediadores.

Complexos de mediadores - conjuntos de proteínas que têm domínios de ligação ao DNA e domínios de
ligação a outros fatores/ a outras proteínas sendo que a nível destes complexos mediadores a nível da
etapa de transcrição o domínio destas proteínas vai se ligar/vai interagir com fatores de transcrição.

A nível da atividade dos factores de transcrição, esta depende de uma série de coisas que pode
acontecer a nível da célula, nomeadamente interações entre a proteínas de superfície a nível de células
vizinhas, e isto porque essa interação em termos de células vizinhas são sinais de comunicação entre
essas células e em função desses sinais, o mesmo serve para estes fatores extracelulares, para as
hormonas, para os fatores de crescimento. No fundo, a célula pode responder a estímulos que lhe são
dados, e a resposta dessa célula muitas vezes é levar a formação de uma proteína.

Em função da interação da célula com estes diversos elementos efetivamente pode haver necessidade de
a célula ir transcrever um gene ou pelo contrário, esse gene não ser necessário ser expresso e portanto
até é conveniente que esteja uma repressão feita para não estar a célula a produzir energia sem
necessidade.

Vamos falar de transcrição, mas a transcrição não esta solta a nível da célula diz também respeito a
outros processos que acontecem e a respostas da célula a estímulos/sinais químicos que muitas das
vezes são dados a estas células.

Fatores de transcrição
São proteínas, por norma diméricas, e podem ser dímeros iguais com monómeros constituintes iguais ou
diferentes (homo ou heterodiméricas).
Se um monómero se ligar a um monómero igual obtemos um homodímero
Se um monómero se ligar a um monómero diferente obtemos um heterodímero

Estas possibilidades diferentes originam uma série de fatores de transcrição diferentes, devido à
multiplicidade de monómeros diferentes e ao facto de poderem combinar-se entre si formando proteínas
diferentes (fatores de transcrição). Portanto existe uma grande variedade em termos de fatores de
transcrição o que aumenta também a possibilidade de em função dessas combinações esses fatores
conhecerem um sítio correto a nível do DNA e dessa forma influenciar a transcrição.

- Funcionam como ativadores ou repressores de acordo com a forma como se ligam, da transcrição.

- Podem existir em qualquer umas das etapas da transcrição, no entanto, eles são mais importantes na
primeira etapa, a qual é fundamental em termos regulação da própria expressão dos genes

- Possuem múltiplas formas de fazer a regulação

- Podem ligar-se a diferentes regiões a nível do DNA, sendo as mesmas sempre específicas que podem
estar localizadas quer a montante quer a jusante do promotor. Podem estar localizadas a nível do
promotor proximal, mas depois também se podem ligar a outras regiões distantes do próprio
promotor, e em particular os enhancers (sequências de consenso)

A atividade dos fatores de transcrição depende de:

- Interações entre as proteínas de superfície a nível de células vizinhas, e isto porque essa interação
representa sinais de comunicação entre essas células

- Fatores extracelulares

- Hormonas

- Fatores de crescimento

Em função da interação da célula com estes diversos elementos efetivamente pode haver necessidade
de a célula ir transcrever um gene ou pelo contrário, esse gene não ser necessário ser expresso e,
portanto, até é conveniente que esteja uma repressão feita para não estar a célula a produzir energia sem
necessidade.

Os fatores de transcrição ligam-se sempre a sequências reguladoras. Estas podem estar localizadas a
nível do promotor proximal, mas depois também se podem ligar a outras regiões distantes do próprio
promotor, e em particular os enhancers.
Enhancers são sequências de consenso no DNA que podem estar a milhares de pares de bases do
promotor (sinal de iniciação da transcrição) e influenciam, neste caso estimulam, a transcrição. Existem
ainda silenciadores e outros elementos reguladores. Forma um curva no DNA ajudando a RNA pol a ligar.
Os fatores de transcrição têm várias estruturas possíveis e têm vários domínios de ligação ao DNA para
se ligarem ao mesmo.

Domínios de ligação ao DNA

Este é um tipo de estrutura dos polímeros de ligação destes
fatores designada por HTH (helix-turn-helix). É uma ligação
cooperativa entre vários fatores de transcrição e também
proteínas de pequenas dimensões. Quando estamos a falar nesta
estrutura dos domínios dos fatores de transcrição, tendo em conta
que estes são proteínas, quando falamos em HTH falamos da
hélice das proteínas.

Estas hélices, uma delas vai repousar sobre a curvatura do DNA, portanto são estas zonas que são os
domínios de ligação ao DNA. Este tipo de estrutura, ou seja, estes motivos estruturais (as menores
unidades de sequência de aminoácidos/proteínas que se mantêm semelhantes em diversas estruturas) a
nível dos eucariotas designam-se de homeodomínios.
Estes homeodomínios, estes fatores de transcrição que têm estes motivos de ligação ao DNA muitas das
vezes são os fatores que vão estar relacionados com a ativação e respetiva repressão a nível de etapas
do desenvolvimento embrionário de muitos organismos. Quando ocorrem mutações a nível destes fatores
de transcrição pode ocorrer várias alterações a nível do organismo. Pois um erro a nível do fator de
transcrição, vai levar a proteínas diferentes e consequentemente a uma mutação a nível do organismo.

Temos também os motivos de dedos de zinco que é idêntico ao que falamos para
os procariotas. Neste motivos é necessário o ião zinco, o qual vai ligar-se a dois
pares de aminoácidos (um de cistidina e de histidina) e formam então os arranjos
designados por dedos de zinco. Estas estruturas vão depois encaixar no DNA.
Nota: O processo de ligação ao DNA é idêntico para os diferentes tipos de
motivos estruturais dos domínios de ligação. Tipicamente são motivos que são
conservados e vão reconhecer estruturas a nível da curvatura da hélice de DNA e
vão interagir de modo a realizar a sua função. O dedo 1 é o único que não vai
interagir diretamente com o DNA.
Os motivos de fechos de leucina são aqueles em que as leucinas fazem ponte
entre as hélices alpha da proteína.
Temos ainda o bHLH (helix-turn-helix básico) que apresenta uma hélice básica, um loop e depois uma
hélice. Designa-se de hélice básica pois a mesma é formada por aminoácidos com um pH básico.
Independentemente destes tipos de motivos estruturais dos domínios de ligação destas proteínas, aliás,
destes fatores de transcrição que se vão associar ao DNA a verdade é que há aqui sempre uma estrutura
que é fundamental e que se mantém sempre, comum e homóloga nos diferentes organismos no sentido
de serem lidos facilmente, vão reconhecer o DNA ligar-se a ele e desempenhar a sua função. Alterações
nestes fatores vão originar alterações a nível de fenótipo aos organismos.
A grande etapa da regulação da transcrição é a nível da iniciação.

Iniciação
Implica a formação de complexos de iniciação da transcrição, ou seja,
complexos de proteínas de fatores de transcrição.
Estes fatores de transcrição vão existir sempre nas outras etapas mas já
lá estão.
Vai ocorrer a união de uma série de fatores sobre as zonas promotoras
onde também vai encaixar a RNA polimerase e só depois de este
complexo inicial estar formado é que vai ser transcrito o gene.
- A RNA polimerase I copia os genes do RNA ribossomal.
- A RNA polimerase III cópia os genes do RNA de transferência, um RNA
ribossomal -5S e alguns pequenos RNA’s ricos em uracilo.
- A RNA polimerase II vai ler genes de RNA mensageiro e este
posteriormente vai ter informação para proteínas e portanto são obtidos produtos finais com grande
diversidade a nível das células eucariotas.
- O promotor mais habitual dos genes do RNAm é aquele em que vai existir a TATA box.

Genes de RNAm tipicamente os promotores, são constituídos por uma região de consenso a nível do
DNA designada por TATA box devido a ser rica em adeninas e timinas. Alguns alternativamente ou em
conjunto com esta TATA box possuem uma sequência iniciadora, ou seja, uma região de consenso à qual
alternativamente os vários fatores de iniciação se podem ligar a essa zona e iniciar a transcrição. Ambas
estas regiões são relativamente próximas do local de iniciação da transcrição (+1).
Existem alguns promotores que possuem algumas regiões que são ricas em citosinas e guaninas logo
designam-se de regiões CG as quais podem estar mais ou menos próximas do promotor (mas nunca
muito distantes). Estas regiões CG podem ser consideradas regiões de consenso próximas do promotor
que influenciam a forma como os genes se vão expressar.
Estas CG são consideradas elementos cis e é nestes elementos cis que os elementos trans se vão unir.

Iniciação da transcrição

Existe uma TATA box e o primeiro fator de transcrição a

entrar no complexo de iniciação é o TBP.
Este TBP é uma proteína que reconhece e liga-se à TATA
box.
De seguida vão unir-se a esse local outros fatores de
transcrição de forma ordenada, os quais se designam por
TFIIB, TFIIF, TFIIE e TFIIH. Este último, TFIIH, entra para
formar o complexo de pré-iniciação.
O TFIIH possui uma subunidade que vai ter a capacidade de
funcionar como helicase (permitem a abertura da dupla
cadeia de DNA) e possui outra subunidade que vai ter a
capacidade de fosforilar a cauda CTD da RNA polimerase I,
o que é essencial para que ocorra a transcrição.
Essencialmente os aminoácidos fosforilados são a serina e
tirosina.
Este fator de transcrição tem também a função de
recrutamento de enzimas de reparação do DNA.
A própria RNA polimerase tem uma extremidade CTD (a qual
é fundamental para que a transcrição aconteça de forma
correta) a qual tem uma série de aminoácidos típicos de RNA polII, os quais vão aparecer repetidos duas
vezes.
Neste complexo de pré-iniciação, as proteínas mediadoras ajudam os fatores de transcrição a interagir
com o DNA, logo estes complexos são extremamente complexos devido ao grande número de proteínas.
Posteriormente forma-se o complexo de iniciação final ao qual a RNA pol II se encontra ligada.

Estes mediadores proporcionam a alteração ao nível da conformação do DNA de forma a que os fatores
de transcrição estejam mais facilmente posicionados e as vezes a própria RNA polimerase estar
posicionada com mais facilidade.

Após o início da transcrição, passamos para fase de elongação da transcrição. O DNA começa então a
ser copiado pela RNA pol II, e aqui a extremidade CTD da própria RNA polimerase vai sofrer fosforilação,
e esta fosforilação vai ser feita pelo último fator de transcrição que se uniu ao complexo, o TFIIH.

Se estamos a falar de uma RNA polimerase sabemos que irá possível regulá-la ao nível das 3 etapas.

Controlo da terminação da transcrição

Os fatores de transcrição também irão ser importantes no que toca à sua ação na terminação, no sentido
de proporcionar uma libertação da enzima e a sua finalização.

Em função das RNA’s polimerases há sinais diferentes para conduzirem a essa finalização:
- RNA poli I: fator de transcrição que se liga diretamente ao DNA
- RNA poli II : vários locais possíveis para terminar a síntese do RNAm
- RNA poli II : enzima que faz a síntese de uma serie de resíduos de uracilo ( Resíduos U)
Ao nível das outras etapas também acontece esta regulação dos fatores de transcrição.

Controlo da expressão de genes

RNA polimerase I
Quando falamos de eucariotas, depois de ocorrer a transcrição colocamos um pré-RNA, que estas
moléculas quando acabam de ser sintetizadas nem sempre estão totalmente funcionais, algumas
precisam de ser processadas. É ao nível do processamento destes pré-RNA também poderá ter que
haver regulação da expressão dos genes, porque estamos a dizer que vão ocorrer etapas que irão
permitir que o RNA fique maduro e funcional. Se o processamento correu mal, o pré-RNA não consegue
ser um RNA funcional por isso funcionará como um bloqueio na expressão de determinado gene.

RNA polimerase III

Relativamente ao nível do RNAt no que toca a ação da RNA poli III também há uma série de
modificações.

RNA polimerase II
Ao nível da RNA poli II ( sintetiza os pré-RNAm) estes sofrem algumas modificações:
• Modificações pós-transcricionais:
- Adição 5’CAP
- Splicing
- Clivagem e poliadenliação

• Na expressão genética ocorre a integração dos acontecimentos transcricionais

• RNA transcription factory

Se os pré-RNAm forem corretamente processados podem ir para o citoplasma e participar na tradução,
se estiverem incorretas é logo e por norma é degradado nos lisossomas.

A regulação da expressão dos genes começa desde o momento em que os gene é reconhecido até ao
momento em que é finalizado.
A produção do RNA vai ocorrer em unidades de transcrição, as novas moléculas vão ser processadas
para serem funcionais, vão existir várias etapas que possibilitam a regulação da transcrição.
Há tipos de unidades de transcrição simples e as unidades de transcrição complexas, que são aquelas
que por norma estão relacionadas com o splicing alternativo.

Unidade de transcrição simples

- Aqui é tudo mais simples, temos um sinal CAP um sinal Poli A

Unidade de transcrição complexas

- Há uma maior diversidade de alterações
Se falamos de pré RNA que foram sintetizados estamos a dizer que há processamento de pré-RNAm
também implica uma etapa de controlo de regulação dos genes, ou seja controlo pós-transcricional.

- Significa que quando um pré-RNAm sofre alterações ao longo da sua estrutura depois de ser
sintetizado estamos a dizer que ocorrem modificações pós-transcricionais.

- Quando sofre processamento na extremidade 5’ quer dizer que ela já foi sintetizada e é aí que
acontece a modificação da extremidade.

- Falamos do splicing já depois da extremidade 3’Poly A já estar sintetizada e quando são unidades de
transcrição muito grandes o splicing começa a ocorrer antes da transcrição estar finalizada e por este
motivo muitas das vezes falamos de uma integração deste processamento em conjunto com a própria
transcrição.

- As modificações pós-traducionais estão a ocorrer exatamente no mesmo local onde os RNA’m estão a
ser sintetizados e por esse motivo falamos das fábricas de RNA.

O que são fábricas de RNA: Locais ao nível do núcleo onde estão reunidos todos os fatores
necessários para a transcrição e todos os fatores que vão ser necessários para o processamento dos
tRNA’s.

Adição 5’ CAP
Na extremidade 5’ linha vai ser adicionada 7-metilguanosina para
proteger esta extremidade. O primeiro nucleótido vai ter 3 grupos
fosfatos unidos à extremidade, protegendo-a e, por exemplo, evitando
que ocorra a sua degradação, aumentando também a sua semi-vida.

Numa primeira etapa a enzima capping vai ter a capacidade de ser uma
fosfohidrolase, que vai clivar a ligação entre os fosfatos, libertando o
fosfato gama da extremidade do primeiro nucleótido que faz parte do
mRNA.

Outra subunidade desta mesma enzima vai ter a capacidade de fazer a

transferência do grupo GMP do GTP, tendo como substrato um GTP, ou
seja, cliva as ligações entre os fosfatos provenientes do GTP, e vai ligar o
GMP que ficou como fosfato alpha aos dois grupos fosfatos que estão
localizados no nucleótido. Isto vai criar uma ligação 5’-5’, ou seja, uma
guanina vai ficar a proteger a extremidade do nucleótido.

A seguir a esta transferência, vai ocorrer uma transferência de grupos

metilo para o azoto 7 da guanosina, a partir da enzima guanina-7-metil
transferase, que vai buscar os grupos metilo a um outro substrato. No
fundo, vai buscar os grupos metil e transferi-los por um lado para o azoto
7 localizado a nível da guanina, mas também vai transferir grupos metil
para o oxigénio 2’ do primeiro nucleótido que faz parte do pré-mRNA.

Para além desta adição de grupos metilo, também vai ocorrer adição a
nível das próprias riboses dos primeiros ribonucleótidos que fazem parte da estrutura do pré-mRNA. Ou
seja, esta extremidade fica modificada e fica mais protegida contra a ação de enzimas que facilmente a
conseguiriam degradar. Isto vai também ter um papel importante em termos da exportação do mRNA
para o citoplasma e vai também ter importância em termos da junção do ribossoma ao mRNA para que a
tradução possa ser iniciada.

Clivagem e poliadenilação

A clivagem e poliadenilação acontece com o reconhecimento de sequências de consenso, sequências

que são estáveis a nível do pré-mRNA, e podem funcionar como sinal de poly-A. A jusante deste sinal,
vai existir também uma região de consenso guanina/uracilo, e algures entre estes dois locais, vai existir
um d-nucleótido que é sempre estável, que é constituído por citosina e adenina.

É neste local que vai ocorrer clivagem a nível da formação da cauda poly-A.

Além destas sequências também existem sequências a montante do sinal poly-A e que também vão ser
importantes em termos de classificar todo este processo.

Onde é que estas regiões de consenso se vão conseguir ligar?

Muitas das vezes, fatores que estão associados a esta poliadenilação vão se juntar nestas zonas de
consenso, fazem uma dobra e vão facilitar mais a frente a poliadenilação.

O primeiro fator a associar-se ao sinal poly-A é um fator específico para esse sinal, no entanto, este sinal
apresenta mais do que um fator específico, ou seja, o fator apenas se consegue ligar ao sinal, no
entanto, o sinal consegue-se ligar a mais do que um fator específico.

Estes fatores associam-se, formam um loop, e agora, está um loop formado com uma extremidade 3’
bem posicionada onde se vai ligar a PAP (polimerase poly-A). Esta enzima vai começar a adicionar muito
lentamente, depois de ocorrer a clivagem da extremidade no local poly-A, resíduos de adenina. Mais ou
menos quando adiciona cerca de 1 dúzia de ribonucleótidos, todos eles constituídos por adenina, vem
outro fator proteico, o PABP II, que, a partir do momento em que este fator se liga, vai funcionar como
um sinal para a enzima saber que pode começar a adicionar rapidamente.

Ou seja, primeiro a clivagem, o reconhecimento que essa clivagem foi feita, a adição dos primeiros
resíduos de adenina e só depois vem o fator para poder adicionar rapidamente. No mínimo são
adicionados cerca de 200 nucleótidos todos eles com a mesma base azotada. As funções da cauda
poly-A são muito idênticas às funções da 5’ CAP, proteger a extremidade, ou seja aumentar o tempo de
semi-vida do mRNA, facilitar a exportação para o citoplasma e participar na tradução.

Normalmente existem 3 tipos de poliadenilação:

- o tipo I é o tipo normal e que acontece tudo a nível das unidades de transcrição e existe um único
local poly-A. Quando o pré-mRNA se aproxima do fim, são reconhecidos os sinais de poliadenilação,
o sinal de clivagem é poliadenilado, e forma-se uma cauda poly-A.

- no tipo II existe mais do que um local de poliadenilação. Esses locais são locais alternativos, que têm
sempre a mesma sequência repetida, em função desse local que é reproduzido como sendo o local
poly-A para esse mRNA, significa que há a possibilidade de se formar mRNA diferentes mas que só
são diferentes a nível da dimensão da cauda poly-A. Em termos de proteínas, codificam exatamente a
mesma.

- no tipo III pode estar relacionada, ou com a exclusão de exões, em que em função do local poly-A,
em que existe o local poly-A1 e poly-A2, há mais ou menos GH (hormona de crescimento) que foi
transcrito, que vai funcionar como informação para a proteína, portanto podemos ter mRNA diferentes
em função deste local de reconhecimento. Por outro lado também há a possibilidade de por vezes
ocorrer a ativação do local de splicing, ou seja, em função do poly-A que é reconhecido, este pode
fazer com que a célula reconheça determinados sinais e o local de splicing. Associada à
poliadenilação tipo 3 podemos ter ou exclusão de exões ou ativação dos locais de splicing. No fundo,
os próprios poly-A estão relacionados com splicings alternativos que podem ocorrer a nível do pré-
mRNA.

Splicing

No splicing propriamente dito, é sobretudo este ponto de ramificação que vai ter um papel importante
em desencadear o splicing, porque é o único hidroxilo desta adenina e o seu oxigénio vai fazer uma
ligação hidrofílica com o fosfato, formando uma estrutura em laço.

Este mesmo oxigénio que fica localizado a nível do primeiro exão vai atacar o grupo fosfato que faz parte
do exão seguinte, e vai promovê-lo entre estes dois exões, ou seja, toda esta estrutura em laço não é
mais do que um intrão que vai ser removido, ficando com dois exões ligados. Isto em termos de reações,
não são mais do que duas reações de transesterificação que acontecem de forma sucessiva, para
promover a união entre esses dois exões.

Mais uma vez, para que isto tudo aconteça vai estar um grande número de proteínas envolvidas no
processo, que vão formar complexos bastante grandes, sendo que algumas dessas proteínas, não são
apenas proteínas, existem também pequenos RNA’s associados a essas
proteínas para levarem a um splicing correto.

Neste caso específico está representado um pequeno RNA nuclear U1 que

obrigatoriamente tem de fazer um emparelhamento da fronteira Intrão-
Exão. Se este emparelhamento não acontecer, o splicing não ocorre. Se
ocorrer uma mutação que impossibilita este emparelhamento, o splicing
desse mRNA não vai ocorrer.

Só depois de ser realizado esse emparelhamento correto é que ao

juntarem-se a este local, todos os fatores proteicos e alguns pequenos
RNA’s nucleares, vai então poder ocorrer o splicing propriamente dito. Todos os elementos que formam
este omplexo onde vai ocorrer o splicing, denominamos de spliceossoma.

Para além destas proteínas todas que vão existir no spliceossoma, vão existir outras proteínas que vão
ser fundamentais para o reconhecimento do exão certo. E estas proteínas em associação com todas as
outras que fazem parte do spliceossoma, normalmente denominam-se de complexo de reconhecimento
do exão. Isto serve para a célula saber em que local cortar, caso o RNA tenha múltiplos locais de
splicing.

Alguns intrões sofrem auto-splicing sendo que existem essencialmente dois tipos de auto-splicing. O
tipo I relaciona-se mais com RNA’s ribossomais, o tipo II com RNA’s que vão codificar proteínas, daí só
estar aqui representado o tipo II, visto que estamos a comparar pré-mRNA das nossas células.
Normalmente, este auto-splicing não acontece nas nossas células, acontece sobretudo em genes de
mitocôndrias e cloroplastos de plantas e de alguns fungos.

No auto-splicing, seja do grupo I, seja do grupo II, são os próprios intrões que de alguma forma
desencadeiam a sua produção, enquanto que a nível do splicing das nossas células, é necessária a
formação de um spliceossoma.

Edição de DNA

No processo de regulação da expressão dos genes que ocorre nos eucariotas, existe aquilo que se
denomina de edição de RNA.

Depois do mRNA estar formado a nível da célula, existe a capacidade de ocorrer este processo que é
designado de edição de RNA, que também faz parte alterações que podem ocorrer a nível desse RNA no
sentido de modificar coisas ligeiramente a nível do RNA. Essa edição a nível dos eucariotas não são mais
do que mudanças numa única par de base, não sendo mutações pois não ocorrem por erros a nível do
mRNA. Existem gRNA’s que vão dizer a célula exatamente o sítio onde vai ocorrer a modificação nesse
par de bases, e em função dessa modificação, podemos ter RNA’s que até foram expressos a partir do
mesmo gene, mas no final vão ser ligeiramente diferentes.

Isto ocorre por exemplo, para o mRNA da APOB-100. No fígado não ocorre qualquer modificação, mas
se tivermos a falar do mesmo gene que vai codificar o mRNA a nível das células intestinais, este mRNA
vai ser editado, modificando uma citosina para um uracilo (CAA → UAA), formando uma ApoB-48. O
gene é o mesmo, o pré-mRNA, só o mRNA é que vai sofrer uma modificação levando a uma proteína
diferente. Normalmente esta edição do mRNA acontece em função de um tipo de células, ou às vezes
em função da etapa de desenvolvimento dessas células VS etapa de desenvolvimento de organismos,
ou seja, que determinados mRNA podem sofrer edição na fase de desenvolvimento embrionário e não
sofrem edição num organismo adulto, ou vice-versa.

Transporte de mRNA

As proteínas FG nucleoporinas vão ser proteínas que vão ser fundamentais para a seleção do que passa
pelos poros nucleares. Em termos de dimensão, o diâmetro do poro é razoável para as dimensões
comparativamente à célula, que permitem a passagem de pequenas macromoléculas e moléculas, logo
tem que existir qualquer coisa que funcione como um filtro, que serão as nucleoporinas.

Estas vão ser fundamentais em termos de reconhecimento do mRNA, que tem que estar corretamente
processado, ou não irá para o citoplasma, e mais uma vez para este correto processamento, a cauda
CTD que tem que estar fosforilada para que o RNA possa ser sintetizado é fundamental, que também vai
ajudar no próprio splicing. É nesta cauda que os fatores que vão ser necessários nas fases seguintes vão
estar ligados, para por exemplo, quando chega a fase da poliadenilação, já estão naquele sítio específico
os fatores que são necessários para fazer o processo seguinte, se estivessem dispersos no núcleo era
mais difícil. O mRNA muitas das vezes vai ser transportado associado ao que se chama de partículas
ribonucleicas, pequenos RNA’s e proteínas associadas ao mRNA para auxiliar o processo do transporte.
Estes RNP’s, estas partículas, ou mais concretamente, as proteínas que fazem parte destas partículas
mRNP’s muitas vezes sofrem elas próprias algumas remodelação. Umas ligam-se só no núcleo e
desligam-se no momento antes desse mRNA ser transportado, outras podem-se ligar enquanto esse
mRNA ainda está a ser transportado. Esta remodelação no fundo é aquilo que vai ser necessário para
impulsionar o mRNA para o citoplasma. Ainda a nível do citoplasma, aquelas proteínas que vêm
associadas ao mRNA para o transportar até ao citoplasma e as que não ficam livres ainda no núcleo e
que chegam ao citoplasma, só são necessárias no citoplasma, portanto vão ter de voltar ao núcleo para
poderem funcionar num novo ciclo de transporte. Normalmente, o que acontece a estas proteínas é a
fosforilação reversível.

Regulação da expressão dos genes

Qualquer coisa que inviabilize a tradução da proteína é também uma etapa possível da regulação da
expressão dos genes. Isto pode acontecer se a célula decidir que já não necessita dessa proteína. Ainda
há a possibilidade de a proteína por qualquer razão não ser uma proteína, ou que adquira a correta
configuração, porque tem alguma alteração a nível da sua estrutura. Se a proteína for sintetizada, mas
existir um erro que seja sinalizado para ser degradada, vai ser uma proteína que não desempenha a sua
função, essa degradação também funciona como uma etapa que está a regular a expressão dos genes.

Mecanismos citoplasmáticos de controlo pós-trancricional

Ainda existe a regulação da expressão dos genes por outros RNA’s que não são modificados, quando
dizemos que não são modificados, significa que não são mRNA’s. Neste nível só chamamos a atenção
aos microRNA’s (miRNA) e aos pequenos RNA’s de interferência (siRNA na imagem), RNA’s que muitas
das vezes podem inibir e impedir a tradução, ou fazer com que a tradução seja menos eficiente ou
mesmo inibição total. Este microRNA é apenas uma inibição, pois este só afeta algumas zonas. No
siRNA (de interferência), todo o pequeno RNA de interferência está corretamente emparelhado com o
mRNA, o que significa que não ocorre o bloqueio da tradução propriamente dito, mas sim uma clivagem
do mRNA. Independentemente disto, seja microRNA ou de interferência, se emparelhar perfeitamente
com o mRNA normalmente ocorre o processo de degradação do mRNA. Se tiver algumas zonas
imperfeitas em termos de emparelhamento, no geral, desencadeia um processo de inibição. Ainda a nível
do citoplasma também pode acontecer o controlo da tradução através daquilo a que se chama a
poliadenilação citoplasmática, ou seja, à semelhança daquela série de resíduos de adenina que se junta
a nível da extremidade 3’ do mRNA também a essa extremidade pode ser adicionada mais adeninas a
nível do citoplasma. Isso acontece porque muitas das vezes, é necessária uma ponte estável entre as
duas extremidades, que, se não for estável o mRNA fica a espera que ocorra essa ponte.

Mecanismos de degradação de mRNA

A outra possibilidade do RNA de interferência, é acontecer a degradação do mRNA que acontece na

grande maioria das vezes, através de vias que são dependentes da desadenilação (a perda de adeninas
a nível da extremidade 3’ do mRNA). Alguns podem ser destruídos sem ser através de vias dependentes
da desadenilação, ou seja são independentes, em que uma endonuclease atua na extremidade 5’,
destrói esta extremidade, e todo o resto do mRNA pode ser facilmente destruído.

Naquelas em que ocorre a partir da destruição da extremidade 3’, normalmente ocorre devido:

- a uma exonuclease que vai começar a cortar a extremidade propriamente dita, e a partir do momento
em que é destruída, esse mRNA fica sinalizado e vai ser destruído a nível do exossoma localizado a
nível do citoplasma, idêntico ao do núcleo mas com outras proteínas;

- ou então devido a uma endonuclease corta algures sem ser numa extremidade propriamente dita do
mRNA, que depois vai ser degradado pelo exossoma.

 Vias de secreção
Targetting e Sortting de proteínas
Visão geral da principal via de distribuição de proteínas em eucariotas.
Todos os mRNAs codificados no núcleo são traduzidos nos ribossomas citosólicos.

Direita (vias não-secretoras):

- Etapa 1: A síntese das proteínas que não apresentam uma sequência-sinal para o RE é completada
nos ribossomas livres

- Etapa 2: Aquelas proteínas sem as sequências de direcionamento são libertadas para dentro do citosol
e lá permanecem.

As proteínas com sequência de direcionamento

organela-específica (cor-de-rosa) inicialmente são
liberadas no citosol.

- Etapas 3 a 6: são importadas para dentro das

mitocôndrias, dos cloroplastos, dos peroxissomas ou
do núcleo. As proteínas mitocondriais e as proteínas
dos cloroplastos, normalmente, passam através das
membranas externa e interna para entrar na matriz ou
no espaço do estroma respetivamente. Outras
proteínas são distribuídas por outros
subcompartimentos desses organelos noutras etapas
de distribuição.

As proteínas nucleares entram e saem através dos

poros nucleares visíveis no envelope nuclear.

Esquerda (Via secretora):

- Etapas 1, 2: Os ribossomas sintetizam proteínas nascentes, são direcionados para o retículo

endoplasmático (RE) rugoso por uma sequência-sinal do RE.

- Etapa 3: Após o final da tradução no RE, essas proteínas podem mover-se por vesículas de transporte
para o aparelho de Golgi.

- Etapas 4a, 4b: As etapas de distribuição adicionais transportam as proteínas para a membrana
plasmática ou para os lisossomas.

Vias de secreção

Etapas

- Síntese e translocação de proteínas através da membrana do RE.

- Folding (enrolamento) das proteínas e modificações no interior do RE.

- Transporte das proteínas em vesículas para o complexo de golgi, lisossomas ou superfície celular.

Ribossomas livres e associados ao RE

Embora todas as células secretam várias proteínas, certos tipos de células são especializados na
secreção de grandes quantidades de proteínas específicas.

As células acinares pancreáticas, sintetizam grande quantidade de enzimas digestivas. Contêm

organelos da via secretora (p. ex., RE e Golgi) em grande abundância, e têm sido utilizadas no estudo
dessa via, incluindo as etapas iniciais que ocorrem na membrana do RE.

A maioria das proteínas sintetizadas por esse tipo de célula deve ser secretada e é sintetizada nos
ribossomas aderidos à membrana.

Poucos dos ribossomas não aderidos à membrana (livres) também podem ser observados, sintetizando
proteínas citosólicas ou outras proteínas não secretadas.

Translocação de proteínas através da membrana do RER

Os ribossomas ligados à membrana e os ribossomas livres no citosol são idênticos.

Os ribossomas ligados à membrana são recrutados para o retículo endoplasmático durante a síntese
proteica de um polipeptídeo contendo uma sequência-sinal para o RE.

Sequência sinal marca proteínas para o RER

- Cerca de 20 aminoácidos

- 6 a 12 resíduos hidrofóbicos, ladeados por sequências polares

Proteínas com sinais de endereçamento para o RER

- Proteínas de secreção entram no RE
Experiências de marcação demonstram que as proteínas secretadas estão localizadas no lúmen do RE
logo após a síntese.

As células são incubadas por um breve período com aminoácidos marcados radioactivamente, de modo
que apenas as proteínas recém-sintetizadas fiquem marcadas.

As células são, então, homogeneizadas, partindo a membrana plasmática e fracionado o RE rugoso em

pequenas vesículas chamadas de microssomas.

Os microssomas têm uma densidade de flutuação muito maior do que outros organelos delimitadas por
membranas e podem ser separados destas por uma combinação de centrifugação diferencial e
centrifugação em gradiente de densidade de sacarose.

Os microssomas purificados são tratados com uma protease.

As proteínas de secreção marcadas, associadas com os microssomas, são digeridas pelas proteases
apenas se a barreira de permeabilidade da membrana microssomal for rompida pelo tratamento com
detergente.

Tudo isto indica que as proteínas recém-sintetizadas estão dentro dos microssomas.

Tradução e translocação de proteínas para o RER

Tradução e translocação ocorrem simultaneamente: A translocação das proteínas através da membrana

do RE ocorre durante a tradução.

Experiências demonstram que a translocação de proteínas secretadas para dentro dos microssomas
está ligada à tradução.

O tratamento dos microssomos com EDTA, responsável pela quelação dos iões Mg2+, permitindo o
isolamento de microssomas livres de ribossomas, equivalentes às membranas de RE.

A síntese proteica ocorre em um sistema isento de células contendo ribossomas funcionais, tRNAs, ATP,
GTP e enzimas citosólicas às quais é adicionado um mRNA que codifica uma proteína secretada:

(a) A proteína secretora é sintetizada na ausência de microssomos

(b) mas é transportada através da membrana da vesícula e perde sua sequência-sinal (resultando em
diminuição no peso molecular) apenas se os microssomos estiverem presentes durante a síntese da
proteína.

Signal recognition Particle (SRP)

Estrutura da partícula de reconhecimento de sinal (SRP).

(a) Domínio de ligação à sequência-sinal: a proteína bacteriana

Ffh é homóloga à porção da P54 que se liga às sequências-sinal para o RE.
Este modelo de superfície mostra o domínio de ligação em Ffh, que contém
uma grande fenda revestida por aminoácidos hidrofóbicos (roxo) cujas cadeias
laterais interagem com as sequências-sinal.

(b) Domínio de ligação a GTP e ao receptor: a estrutura de GTP ligada a

proteínas FtsY ilustra como a interação entre essas proteínas é controlada
pela ligação e hidrólise de GTP.
- Ffh e FtsY ligam-se , as duas moléculas ligadas de GTP e encaixam-se na
interface entre as subunidades proteicas e estabilizam o dímero.

A formação do dímero semissimétrico permite a formação de dois sítios ativos

para a hidrólise de ambas as moléculas de GTP ligadas.

A hidrólise para GDP destabiliza a interface, causando a dissociação do dímero.

Translocação Cotraducional de proteínas para o RER

Etapas 1, 2: uma vez que a sequência-sinal para o RE emerge do ribossoma, ela é ligada por uma
partícula de reconhecimento de sinal (SRP).

Etapa 3: a SRP encaminha o complexo ribossoma/polipeptídeo nascente para o receptor de SRP na

membrana do RE. Essa interação é fortalecida pela ligação de GTP à SRP e ao seu receptor.

Etapa 4: a transferência do ribossoma/ polipeptídeo nascente para o translocon leva à abertura deste
canal de translocação e à inserção da sequência- sinal e do segmento adjacente do polipeptídeo
crescente para dentro do poro central. Tanto a SRP quanto o receptor de SRP, uma vez dissociados do
translocon, hidrolisam seu GTP ligado e estão prontos para iniciar a inserção de outra cadeia
polipeptídica.

Etapa 5: enquanto a cadeia polipeptídica se alonga, ela atravessa o canal do translocon para dentro do
RE, onde a sequência-sinal é clivada por uma peptidase-sinal e é rapidamente degradada.

Etapa 6: a cadeia peptídica continua a se alongar enquanto o mRNA é traduzido em direção à

extremidade 3'. Como o ribossoma está ligado ao translocon, a cadeia crescente é expelida através do
translocon para o lúmen do RE.

Etapas 7, 8: uma vez que a tradução esteja completa, o ribossoma é libertado, o resto da proteína é
transferido para o lúmen, o translocon fecha-se e a proteína assume sua conformação.

Sec61 -alfa é um componente do translocon

O translocon foi identificado pela primeira vez por mutações no gene de levedura que codifica a Sec61a,
o que causou um bloqueio na translocação das proteínas secretoras para o lúmen do RE.

Foi observado que três proteínas, chamadas complexo Sec61, formam o translocon dos mamíferos:

- a Sec61a, proteína integral da membrana com 1 O hélices a cruzando a membrana,

- e duas proteínas menores, chamadas Sec6113 e Sec61.

- Experiências químicos de ligações cruzadas, nos quais as cadeias laterais de aminoácidos de uma
proteína secretora nascente podem se tornar ligadas covalentemente à subunidade Sec61a,
demonstraram que a cadeia polipeptídica em translocação entra em contato com a proteína Sec61a,
confirmando sua identidade como o poro do translocon .

- Experimentos de interligação mostraram que a Sec61a é um componente do translocon que faz o

contato com a proteína de secreção nascente quando ela passa ao lúmen do RE.

- Um mRNA que codifica os 70 aminoácidos da extremidade N-terminal da proteína de secreção

prolactina foi traduzido em um sistema acelular contendo microssomos.

- O mRNA não tinha um codão de terminação da cadeia e continha um codão de lisina próximo à
metade da sequência

- Embora todo o mRNA tenha sido traduzido, o polipeptídeo completo não pode ser libertado do
ribossoma sem um códão de terminação da cadeia e, portanto, ficou preso ao atravessar a membrana
do RE.

- As misturas de reações foram, então, expostas à luz intensa, tornando a cadeia nascente
covalentemente ligada a quaisquer proteínas próximas no translocon.

- Quando o experimento foi realizado usando microssomos de células de mamíferos, a cadeia nascente
se tornou ligada covalentemente à Sec61a.

Translocação pós-tradução através da membrana do RER- : Translocação pós-traducional.

Este mecanismo é bastante comum nas leveduras e é provável que ocorra, em alguns casos, nos
eucariotas superiores. As setas pequenas dentro do translocon representam os deslizamentos aleatórios
polipeptídeo em translocação para dentro e para fora. Ligações sucessivas de BiP·ADP com os
segmentos do polipeptídeo que estão entrando previnem que a cadeia deslize de volta para o citosol.

Inserção de proteínas na membrana do RER

Em capítulos anteriores foram encontrados, diversos representantes entre a vasta gama de proteínas
integrais (transmembrana) que estão presentes nas células.

Cada uma dessas proteínas tem uma única orientação em relação à bicamada fosfolipídica da
membrana.

As proteínas integrais de membrana localizadas no RE, no Golgi e nos lisossomas, bem como as
proteínas na membrana plasmática, todas sintetizadas no RE rugoso, continuam embebidas na
membrana na sua exclusiva orientação à medida que se movem para o seu destino final ao longo da
mesma via seguida pelas proteínas de secreção solúveis.

Durante esse transporte, a orientação da proteína de membrana é preservada; isto é, os mesmos

segmentos da proteína sempre estão voltados para o citosol, enquanto os demais segmentos sempre
estão voltados para a direção oposta.

Desse modo, a orientação final dessas proteínas de membrana é estabelecida durante sua biossíntese
na membrana do RE. Nesta seção, inicialmente será visto como as proteínas integrais podem interagir
com as membranas, e então como vários tipos de sequências, coletivamente conhecidas como
sequências que direcionam a inserção na membrana e a orientação de várias classes de proteínas
integrais na membrana.

Esses processos ocorrem pelas modificações do mecanismo básico utilizado para translocar as
proteínas de secreção solúveis pela membrana do RE.

Classes topológicas de proteínas integrais de membrana

Orientações diferentes entre estas proteínas isto fez com que se dividisse as proteínas nestas 4 tipos.

Sequências que definem a tipologia das proteínas integrais

Há sequências também designadas com sequências sinais, mas com mais qualquer coisa para
distinguirmos daquela sequência sinal que e reconhecida pela partícula de SRP.

Há sequências que são conservadas para determinada proteína não conservadas entre as várias
proteínas. As que definem a tipologia das proteínas integrais, mais uma vez estas sequências
normalmente são HELICE ALFA, as sequências vão funcionar como um papel de uma sequência que vai
ficar integrada mesmo na membrana.

Por um lado, sequência sinalizadora marcadora da proteína para que ela seja uma proteína integral mas
em simultâneo é essa sequência marcadora que vai funcionar como hélice alfa na bicamada fosfolipídica

20-25 aminoácidos hidrofóbicos, e o hidrofóbicos porque é fundamental que estes favoreçam interações
com a bicamada fosfolipídica e sequenciação em hélice alfa das proteínas integrais que não e mais do
que zonas de aminoácidos que estão a interagir fundamentalmente com as caudas hidrofóbicas.

- Hélices alfa

- 20-25 aminoácidos hidrofóbicos

- Contributo para interações energicamente favoráveis no interior hidrópico da bicamada fosfolipídica

Olhando para o que acontece durante o processo de síntese, como e que de alguma forma estas
proteínas ficando integradas na membrana, começando pelas proteínas classificadas como proteínas e o
single pass significa que tem uma única hélice a atravessar a membrana onde vai ficar a fazer parte da
estrutura seja de um organito seja da membrana celular:

- Single pass: uma única hélice alfa

- Multi-pass: várias hélices alfa integradas na membrana

Proteínas single-pass tipo I

A síntese da proteína acontece numa fase inicial como foi abordado para as vias de secreção.

1. Sequência Sinal a ser sintetizada

2. Reconhecida pela partícula SRP

3. SRP une-se ao nível da membrana do reticulo ao seu recetor

4. Posicionamento sobre o translocão

5. Começa a ocorrer a síntese para o interior

6. Clivagem da sequência sinal

7. Proteína começa a ser sintetizada

8. Tradução e translocação a ocorrer em simultâneo.

Mas a determinada altura da síntese da proteína surge uma segunda sequência sinal que é ancoradora
ou seja funciona como:

- uma sequência STOP para ocorrer a transferência da proteína, em que esta transferência é a tal
translocação quando ela esta a passar para o interior do lumen do retículo.
Há uma sequência que para vai dizer à célula para parar a transferência, significa que esta sequência vai
ficar inserida na bicamada fosfolipídica do retículo.

Depois vai deslocar-se lateralmente nessa bicamada e quando tudo isto acontece, quando a nível do
translocão é encontrada a sequência STOP de transferência, o próprio translocão modifica a sua
estrutura, onde vai deslizar lateralmente na bicamada fosfolipídica.

O translocao vai fechar durante algum tempo e depois vai continuar nos ribossomas posicionado. Tudo
funciona bem na célula, pois o ribossoma vai continuar a produção da proteína, porque ainda tem mRNA
a ser copiado.

Mas quando o translocao fecha, e esta proteína esta agarrada à membrana do reticulo endoplamastico,
e o que acontece é que o resto da proteína vai ser sintetizado para fora da membrana.

Ou seja a fase inicial foi a mesma, esteve a ocorrer translocação e tradução em simultâneo:

a diferença fundamental é a sequência sinalizadora que diz á célula para parar de transferir a proteína
contida no retículo, mas a tradução vai ter que acontecer e tudo o que vai ser sintetizado a partir do
momento em que ocorreu inserção desta sequência STOP transferência em simultâneo sequência
ancoradora, todo o resto da proteína é sintetizado para fora do retículo.

Vamos ficar com uma proteína em que a extremidade aminica fica em contacto com o lumen do
retículo, e a extremidade carboxílica para fora.
Se a proteína for encaminhada para a membrana celular, aminica fica em contacto com o meio
extracelular.

Pensamos sempre que há sequências sinalizadoras para tudo a este nível e o que e que cada uma
dessas sequências faz.

Sequência sinal: direciona a proteína para a membrana do retículo

Sequência que pára a transferência e é ancoradora: vai fazer com que a proteína fique agarrada a essa
membrana, estamos a falar de uma variação em termos dos sinais que vao sendo sintetizados e que não
fundo estão ao nível do RNAm.

Proteínas single pass tipo II

É a mesma coisa mas há uma inversão no posicionamento das
extremidades:

- Carboxílica: fica apontada para o interior do lumen

- Aminica: voltada para o citosol.

A sequência sinal neste caso concreto não esta na ponta da

extremidade aminica mas esta um pouco mais para a frente da
extremidade aminica. Quando é sintetizada e sai do reticulo
endoplasmático, esta a sequência sinal que a SRP reconhece faz
uma pausa na solução e encaminha o complexo.

O ribossoma posiciona-se mas não há clivagem da sequencia

sinal porque agora a sequencia sinal também é em simultâneo uma sequencia ancoradora.
Quando ela entra no translocao não é mais do que uma sequência de aminoácidos que vai adquirir a tal
estrutura em hélice alfa e que agora vai deslizar lateralmente para a bicamada fosfolipídica.

A proteína é sintetizada sempre da extremidade aminica para a carboxílica

Começou a ser sintetizada no primeiro aminoácido e imediatamente antes da síntese da sequência sinal.

Os sinais de (+) representados: são aminoácidos que tem carga positiva e que vão ajudar a posicionar a
extremidade aminica no local certo junto ao translocao.

A partir do momento em que é feito o posicionamento, a síntese é retomada e a sequência sinal não é
clivada porque não esta localizada na extremidade aminica, e por outro lado porque é uma sequência
ancoradora, deslizou para a bicamada fosfolipídica.

O que vai acontecer é que ocorre translocação em simultâneo com tradução mas com uma orientação
diferente de uma proteína que fica no lumen ou da proteína anterior.

São nestas sequências marcadoras que vai estar o truque da célula para saber como é que se vai
posicionar.

Proteínas single pass tipo III

Novamente temos uma inversão das extremidades, e
fundamentalmente mais uma vez há repetição das cargas
positivas.

Os aminoácidos com as cargas positivas vem depois da

sequência sinal ser sintetizada.

Quando a sequência sinal esta localizada ao nível do

translocao, desliza, funciona como ancora e continua a
ser sintetizada a proteína, mas agora fica a extremidade
aminica voltada para o interior do lumen e a
extremidade carboxílica para fora.
É idêntico ao que foi falado anteriormente, mas agora são as multipases que atuam, proteínas que
tem várias hélices alfa inseridas ao nível da membrana.
Estas proteínas tem uma sequência interna que foi sinalizada como sendo uma sequência ancora, vai
deslizar pela camada fosfolipídica do retículo, mas não há nada que impeça que a tradução continue, ou
seja a proteína vai continuar a entrar para o lumen do RE.

A determinada altura vem uma serie de aminoácidos que são uma sequência sinal, que funciona como
STOP. Uma funciona como ancora outra como STOP.

Ou seja se funciona como STOP quer dizer que para a transferência da proteína para o interior do lumen,
mas a tradução vai continuar a ocorrer, significa que vai continuar a crescer a proteína nascente mas
agora para o exterior do RE.

A determinada altura pode ser sintetizada outra sequência sinal, e esta sequência sinal volta a ficar
inserida na membrana do retículo, mas nada faz com que a proteína pare.

Com a intercalação de sequências sinais e sequências para parar a transferência, fazem com que pare a
translocação ou seja passagem da proteína que esta a ser sintetizada, e é retomado o sentido inverso.

GPI – anchored proteins

- GPI – glicosil-fosfatidil-inositol

- GPI como uma das ancoras principais que são integrais para que não são transmembranares.

- A proteína e exatamente sintetizada e depois vai ser processada e dai vai resultar a ligação á ancora
GPI. Fica ligada através de uma ancora que não é proteica mas que faz com que esta proteína seja na
mesma integral.

Proteínas integrais de membrana

- Sequências topogénicas determinam a orientação das proteínas do RE
O esquema resume as varias propriedades das proteinas integrais e para recordar que estas proteinas
em termos de topologia que vao adquirir ao nível da membrana vao ser determinadas pelas tais
sequencias.

Estao aqui as sequencias STOP que param a transferência e funcionam como ancoras.(STA)

Ou são as sequencias internas que so vao funcionar como ancoradoras (SA).

Tambem esta representado uma chamada de atenção para os aminoacidos que tem carga (+) e que e
importante em termos de definiçao inicial em termos se uma extremidade fica para fora da membrana ou
se fica voltada para o interior do RE.

Depois a proteína começou a ser sintetizada ate já foi enrolada

Processamento de proteínas no RE

Glicosilação
Adição e processamento inicial dos oligossacarídeos N-ligados.

- Etapa 1: o precursor Glc3Man9(GlcNAc)2 é transferido do de dolicol para um resíduo de asparagina

suscetível a uma proteína nascente tão logo a asparagina cruza para o lado luminal do RE.

- Etapa 2: Em três reações separadas, primeiro um resíduo de glicose;

- Etapa 3 : depois dois resíduos de glicose

- Etapa 4: E finalmente, um resíduo de manose são removidos.

- Etapa 3a: A readição de um resíduo de glicose tem como função o enrolamento correto das varias
proteinas no R.

- O processo de glicosilaçao N-ligada a uma proteína de secreçao solúvel, é mostrado aqui mas as
porções luminais de uma proteína integral de membrana podem ser modificadas nos resíduos de
aspargina pelo mesmo mecanismo.

- Modificações pos traducionais se não ocorrerem da forma correta, irão certamente modificar a forma
como os genes se vão expressar seja por motivos de desencadear a formação de novos RNA’s de modo
a que a célula substitua as proteínas que não estão processadas corretamente.

Quando o produto final de um gene de alguma forma não esta funcional e não vai desencadear a sua
função ao nível da célula então indiretamente ocorreu reprodução dessa expressão.

É fundamental que ocorra este processamento, mesmo a nível de controlo de qualidade onde estão
estas situações associadas ao nível do RE. E uma destas modificações é a glicosilação.

Temos a noção que nem sempre a proteína é pura e se pensarmos nas proteínas que estão localizadas
ao nível da membrana muitas delas são glicoproteínas. Para estas proteínas estarem ligadas a
componentes glicídicos, normalmente essa modificação é chamada glicosilação e começa a
ocorrer ao nível do próprio RE.
No RE ocorre essencialmente, aquilo a que se chama N-glicosilação, e tem a ver com o átomo onde
se vai ligar o componente glicídico.

Por norma, este componente glicídico é previamente sintetizado ao nível do RE sendo que a principal
função do RE é a síntese de lípidos.

Dolichol

síntese no RE deste percursor que vai ser fundamental depois para a glicosilação das proteinas, e
que chamamos dolichol.
vai estar localizado ao nível do reticulo e é a partir dele que vai transferido um grupo glicidico que depois
se vai unir à proteína que esta a ser sintetizada.

Ou seja mais uma vez falamos de modificações pos traducionais como se a proteína tivesse totalmente
sintetizada, mas normalmente esta sintetizada aquela parte da proteína que começa a ser processada, e
muitas da vezes tudo isto acontece em simultâneo ao nível da célula.

O que aqui esta representado é uma serie de passos, em que esta glicosilação ainda acontece quando a
proteína esta ligada ao Ribossoma. Depois vai ser o próprio componente glicídico que vai processar.

A proteína depois de estar processada vai ser encaminhada para o resto da via de secreção.

Este componente glícido vai ligar-se a um aminoácido de aspargina, para depois formar a proteína
(glcioproteina) final que depois vai continuar a ser processada mas a nível do complexo de Golgi.

Formação e rearranjo de ligações dissulfureto

Ligações de dissulfureto acontecem entre átomos de enxofre e estão posicionados relativamente

próximo para que seja possível fazer essas pontes dissulfureto.

Para que ocorra a formação das pontes de dissulfureto vai existir no retículo endoplasmático uma
enzima que vai catalisar esse processo – Enzima PDI
PDI – vai ter a capacidade de fazer variações entre as formas reduzidas das proteinas e as
reduzidas são aquelas que não tem ligação para o dissulfureto e as formas oxidarias não é mais
do que ocorrer ligação dupla entre estes 2 atomos de enxofre.
A PDI oxidase tem também a capacidade de quando perde as ligações dissulfureto fica ela própria
reduzida e oxidou a proteína.

No lumen pode acontecer :

- Formaçao de pontes de dissulfureto

- Ou essas pontes já foram fomadas no lumen do reticulo, mas não estão ainda na sua forma correta e a
PDI vai ter a capacidade de reconhecer que as pontes não são as corretas e fazer rearranjos ao nível
dessas pontes.

- Quando são formadas as ligações dissulfureto estão a

contribuir para o correto folding (enrolamento) da proteína.

Há outra designação para a PDI oxidase que é Isomerase

dissulfureto.
Em suma, a PDI é uma isomerase que tem a capacidade de
variar estados de oxidação dela própria e da proteína onde
ela vai atuar, fazendo com que haja:
- Ligações dissulfureto ao nível da proteína;
- Rearranjos ou nível dessas ligações, ou seja, mudanças
dos átomos de enxofre que estão envolvidos nessas
ligações.
Com a ligação aos átomos de enxofre, a proteína já consegue ter uma configuração em que estes
átomos de enxofre estariam muito distantes uns dos outros para fazer estas ligações fiquem próximos, e
agora a enzima já tem a capacidade de fazer com que haja uma reorientação das ligações dissulfureto

Enrolamento de proteínas

Enrolamento da configuração da proteína nativa em que normalmente, estão envolvidas proteinas das
Chaperons, e é a proteína Bip que quando a proteína esta a ser sintetizada que Chaperon :

- dao estabilidade á proteína, mantem direitinha, enquanto o péptido esta a ser sintetizado

- Auxilia a proteína no seu enrolamento em função da necessidade ao nível do local da celula.

Neste caso concreto as Bips vao contribuir para que a proteína seja sintetizada para o lumen, e
vao adquirir facilmente o enrolamento.

Este esquema é mais complexo e não e para saber decor, so para ter uma noção.

- Vemos uma correta aquisição da hemaglutinina.

- Esta a ser sintetizada

- As BIP’s ajudam a puxar a proteína para o interior do lumen do reticulo

- Começa a ligar-se a isomerase para fazer a ligação das pontes dissulfureto
- Adição dos componentes glicídicos
- Configuração dos péptidos
E neste caso concreto como a hemaglutinina é uma estrutura constituída por varias subunidades, já se
trata de uma estrutura mais complexa, por tudo isto ocorreu isoladamente nas 3 subunidades diferentes
e que depois vao interagir para formar a proteína final de estrutura quaternária.

Quando são estruturas quaternárias como o nome indica, tem mais do que uma subunidade proteica a
fazer parte da sua constituição. Portanto inicialmente temos uma estrutura com 3 subunidades (terciária)
e como produto final vamos ter uma proteína com 4 subunidades proteicas (quaternária) que depois vai
desempenhar a sua função.

Clivagem de proteínas
Uma outra Modificaçao pos traducional é o facto de as proteínas, muitas das vezes tem aminoácidos a
mais e vão ter que sofrer rearranjos e terão que ocorrer algumas clivagens ao nível das proteínas.

É o que acontece para que a proteína albumina fique funcional.

O que acontece é que :

- temos a síntese da proalbumina

- depois há clivagem

So de ocorrer essa clivagem e que ficamos com a proteína madura, que posteriormente ira
desempenhar a sua função ao nível da célula. O mesmo acontece com a insulina e outras proteínas.

Resposta a proteínas unfolded

Quando as proteinas que por qualquer razão não adquirem a correta configuração, não ficam funcionais ,
a celula vai ter uma resposta para a deteção dessas proteinas.

Há uns sinais de alerta ao nível da própria membrana do RE

Falamos das Bips, depois ligam a umas secs, e as bips estão ligadas vao desligar-se para puxar as
proteínas quando é preciso mas quando ela entrou no lumen, largam-nas, a proteína adquire correta
configuração e elas voltam a estar ligadas às respetivas proteinas integrais da membrana do reticulo

É como se fosse uma espécie de uns recetores para essas BIP’s.

O que acontece é que quando essas proteinas, por qualquer razão não consigam a configuração correta,
estas BIP’s continuam ligadas a estas proteinas, é como um alerta para a célula

Desencadeia-se uma serie de processos.

Vai acontecer com que estas proteinas aproximem-se e vao formar dímeros, e vao emitir sinais para os
RNA’m que estão no citoplasma que ainda não sofreram splicing, ao receberem estes sinais vao sofrer
splicing , ficam maduros e depois vao ser traduzidos.

Quando são traduzidos vao produzir uma proteína que não e mais do que um fator de transcrição, e vai
ser encaminhado para o núcleo, para comunicar à celula para produzir RNA’m para determinada
proteína, porque há alguma coisa que não esta correta e a proteína não foi sintetizada.

Processamento de proteínas no Golgi

Processamento de N-oligossacáridos
Mas algumas das proteinas que fazem parte da via de secreçao, vao depois algumas delas chegar a
membrana celular e ate mesmo ao lumen do exterior da celula.

A ordem pela qual isto acontece:

temos o RE a funcionar como o local de síntese das proteinas

depois a serem encaminhadas ou no lumen das vesiculas ou inseridas nas membranas das vesiculas.

Depois do RE normalmente as vesiculas levam a proteinas para o Golgi e onde vao continuar
nomeadamente o processamento dos N-oligossacáridos.

Já foram adicionados, e agora podem ser modificados ao nível do golgi. E algumas dessas modificações
ao nível dos componentes glicídicos que chamam a atenção para as proteinas lisossomais.

Ou seja, uma proteína que vai para o lisossoma faz parte desta via de secreçao, mas é durante a própria
via de secreção que a célula vai reconhecendo sinais a nível da proteína de modo a saber para onde a
vai direcionar.

Especificamente uma proteína que esteja marcada, ou seja, todas as enzimas dos lisossomas tem este
sinal

Sinal: manose-6-fosfato.

Manose-6-fosfato
- vai determinar que aquela proteína tem como destino final o lisossoma, o que significa que algures
no processo, esta no golgi adquiriu este sinal que é uma modificação deste componente glicidico em
que foi adicionado um grupo manose-6-fosfato e a partir daí vai ficar no lumen dos lisossomas e não
continua na via de secreção, parou aqui o seu processamento.

Avançando na via de secreção

Do golgi saem vesiculas, e quando chegam a superfície da celula ou ficam integradas na sua membrana
ou libertadas para o seu interior.

Também acontece modificações no golgi como a acetilação, metilações, acilações.

Todas as modificações acontecem ao nível da vida de secreção, umas iniciadas no RE e outras

finalizadas no complexo de golgi.

Marcação de proteínas lisossomais

Olhamos para a célula como um todo se pensarmos nas células que tem região apical, domínio
basolateral, tudo isto e complexo a nível da célula. Para alem destes sinais todos para saber onde e
como a proteína vai ser sintetizada,

Todas as vesiculas, como já foi referido que transportante as proteinas , também vao ter sinais
específicos para que a própria célula saiba para onde vao ser direcionadas essas vesiculas. Ou seja, por
um lado os sinais das proteinas a dizer a celula, a forma como essa proteína vai ser sintetizada, onde vai
ser sintetizada e para onde vai ser direcionada. Depois, em paralelo, também temos sinais a nível das
vesiculas para que cada uma delas vao.

Ao nível das membranas das vesiculas há outros sinais químicos que estão relacionados com proteinas.

Alem das proteinas que fazem parte da via de secreçao, para alem das proteinas que tem que ser
encaminhadas para os organitos celulares (mitocondria, cloroplastos, peroxissoma), também há
sequencias sinais especificas

 Proteínas sintetizadas nos Ribossomas livres

Proteinas sintetizadas ao nível dos ribossomas livres que na sua totalidade que são sintetizadas ao nível
do citosol no citoplasma, mas depois vao ter alguns sinais que as vao direcionar para os organitos
específicos que vao exercer as suas funções.

Mitocondria
Tem uma membrana interna e uma membrana externa e isso por si so vai criar um subcompartimento ou
espaço intermembranar e ainda tem matriz mitoncondrial

O que significa que uma proteína que é sintetizada ao nível do citosol pode ser depois endereçada a
qualquer um destes.

Teoria endossimbiótica
Teoria endossimbiótica é para explicar a questão dois 2 organitos celulares terem material genético
próprio.

As mitocôndrias, há muitos defensores que afirmam que são organitos com duas membranas porque
resultaram de uma teoria endossimbiótica, e de alguma forma tenta explicar o facto de a mitocôndria ser
como é a mesma coisa para o cloroplastos porque se pensa que foi uma bactéria que tinha
incapacidade de realizar o processo de respiração e foi incorporada por uma célula eucariota, depois
envolui essa bactéria para um organito celular dessa celula, que depois lhe ofereceu algumas
necessidades como o fornecimento de energia.

A teoria endossimbiótica para explicar a questão dos 2 organitos celulares terem material genético
próprio.

mtDNA
DNA circular – serie de genes que vao codificar RNAr e RNAt e depois alguns dos genes também
codificam proteína, nomeadamente proteinas dos citocromos

O genoma mitocondrial é uma molécula de dna circular, tem uma serie de genes que vao codificar quer
RNAr, RNAt.

Depois alguns dos genes também codificam proteinas, nomeadamente proteinas da família dos
citocromos, subunidades que vao fazer parte:

das ATPases : que vao ser essenciais na ação da respiração que vai ocorrer ao nível da mitocondria

subunidades da NADH-desidrogenase: enzimas que vao estar relacionadas com o processo fundamental
que ocorre ao nível da mitocondria e que é a respiração celular.

Se dizemos que há genes para apenas algumas mitocôndrias significa a mitocondria tem DNA próprio ou
seja ocorre, replicação, transcrição, tradução ou seja síntese de proteinas, mas há poucos genes ao
nível do DNA mitocondrial que codificam proteinas.

mtDNA

Mas temos os RNA’s ribossomais, os RNAt e o grupo de genes que codificam proteínas. Há uma
imensidão de proteinas cuja informação esta contida ao nível do DNA nuclear e portanto, vão ser
sintetizadas nos tais ribossomas e que se são proteinas que tem informação para desempenhar uma
determinada função na mitocondria então vao ter que ser endereçadas para essa mitocondria

Transcrição do mtDNA

Os genes que codificam as proteínas mitocondriais e que estão ao nível do DNA mitocôndria e por isso
são transcritos.

E aqui a transcrição é um pouco diferente relativamente ao que acontece na transcrição standart dos
genes nucleares e sobretudo é um processamento dos RNA’s que vão ser formados.

Normalmente o transcrito primário a nível da mitocôndria é uma molécula única.

Aqui vemos que mesmo transcrito primário temos informação quer para RNA’s de transferência quer
para RNA ribossomais

Portanto genes que codificam RNA’r e RNA’t ao nível da mitoncondria tem a particularidade de quando
são transcritos originarem um transcrito primário único e esse transcrito vai ser processado e nesse
processamento tem de ser tudo rigoroso .

Os RNA’s de transferência funcionam como se fossem ‘’pontos finais ‘’ para se saber o que é que o
RNA’m vai codificar ou seja que proteína.

São estes RNA’s de transferências que estão contidos no transcrito primário quando este é processado
origina os RNA’m que depois irao condificar as repectivas proteinas.

Código genético – Exceções à universidade

Os codões muitas vezes funcionam de forma diferente ao nível da tradução da mitocôndria. Aqui muitas
vezes são codões que codificam aminoácidos.

Se estamos a falar da tradução normal “standard” que ocorre ao nível do citoplasma e que ao nível da
mitocôndria funciona como sendo um codão STOP.

Notas :

As proteinas que estão marcadas para as mitocôndrias continuam a ter uma sequencia sinal e é essa
sequencia que vai funcionar como sinal para que essa proteína seja encaminhada para a mitocondria.

Função da Sequência Sinal : marcar a proteína e encaminha-la para um local especifico da célula.

Sequencia sinal :

- depois vai ser clivada também

- há particularidades especificas da sequencia sinal nas mitocôndrias e que normalmente é constituída

por uma hélice anfipática (hidrofóbica e hidrofílica).

- Tem mais ou menos 20 a 50 residuos de aminoácidos.

- Normalmente tem um dos lados uma sequencia que é rica em arginina e lisina e depois do outro lado
da helice tem uma sequencia que é rica em aminoácidos hidrofóbicos.

Targeting e sorting de proteinas

As primeiras experiencias que foram feitas onde foi possível perceber se havia uma sequencia sinal que
fazia com que estas proteinas entrassem nas mitocôndrias foi esta representada

Fez-se estudos ‘’in vitro’’

Isolamos as proteinas

Proteinas foram colocadas num tubo contendo mitocôndrias ( ativas)

Depois foram tratadas com tripsina que é uma protéase que de degrada proteínas.

Em paralelo foi também feito num outro tubo um tratamento direto com a tripsina

Verificou-se que no tubo onde existem mitocôndrias as proteinas foram degradadas pela tripsina e no
tubo onde existiam as mitocôndrias ativas percebeu-se que as proteinas tinham entrado para essas
mitocôndrias e portanto a tripsina não teve a capacidade de atuar sobre as mesmas.

Targetting e sorting de proteinas para a matriz

Começando pela marcação e pelo movimento das proteinas que são encaminhadas para a matriz
mitocondrial.

Principios que são comuns ao que foi falado no RE.

Temos uma sequencia sinal que marcada a proteína mas agora para a mitocondria

Depois ao nível da membrana externa da mitocondria (que é a que esta + próxima do citoplasma) temos
uma serie de recetores. Algures neste processo tem que haver sempre :

Encaminhamento

Interação da proteína com esses recetores.

Esta sequência sinal é mesmo uma sequencia que marca as proteinas para a matriz mitocondrial.

Por vezes são estas proteinas que tem esta sequencia sinal ou muitas das vezes vao ser chamadas pré-
proteinas .

Pré- proteína _ porque esta sequencia sinal so serve para encaminhar a proteína para a matriz, mas
depois as sequencias sinais vao ser clivadas. Ou seja, a proteína madura (final) que vai desempenhar a
sua função é desprevenida dessa sequencia sinal.

Targeting e sorting de proteinas mitocondriais para a matriz

No caso das proteinas mitocôndrias a sequencia sinal é sempre anfipática e esta localizada na
extremidade aminica da proteína.

A proteína é sintetizada nos ribossomas livres, existe no citosol e tem a sequencia sinal para a matriz
mitocondrial onde a proteína vai ser encaminhada, vai ter que entrar.

Passar pela membrana, vai ser mais fácil entrar um fio direito do que ser um novelo.

Portanto, ao nível do citoplasma vao existir proteinas que são:

chaperons :

- são proteinas que funcionam como enzimas e as vezes ate lhe chamam acompanhantes de outras
proteinas no sentido de as ajudarem a estar mais enroladas ou menos enroladas

- vao ligar-se à proteína nascente para ainda ser sintetizada ou aquela proteína que acabou
recentemente de ser sintetizada e vao ligar-se a essas proteinas para as manter na sua forma linear,
senão aumentavam o nível de complexidade da sua estrutura ( terciária, quaternária…).

Para manterem as proteinas na sua estrutura primária ( linear) as chaperons vao necessitar de energia e
aqui é o primeiro nível onde há consumo de energia ao nível da célula para que seja possível ocorrer a
importação de proteinas na mitocondria.

Proteinas recentemente sintetizadas ou quando ainda estão a ser as chaperons ligam-se a elas,
hidrolisam ATP e utilizam essa energia para manterem as proteinas lineares.

A sequência sinal N-Terminal para a matriz é suficiente endereçar uma proteína para a matriz
mitocondrial e essa proteína apenas entra se estiver desenrolada.

Targetting e sorting de proteinas para a membrana interna da mitocôndria

Estas proteinas lineares tem a tal sequencia que vai fazer com que elas sejam encaminhadas para a
membrana externa da mitocondria onde vao existir recetores específicos em que estes, normalmente,
vao estar relacionados com a translocação da proteína, ou seja vao tomar um papel de translocases,
TRANSLOCÕES OU TRANSLOCONS.

A sigla do nome destas proteinas é translocase da membrana externa (out) e interna (in)

TOM

TIM

Começam por interagir , pois tem a sequencia sinal que as marca para a mitocôndria, com o recetor que
é uma TOM20 e uma TOM 22 localizada ao nível da membrana externa da mitocôndria e desta interação,
no fundo confirmação de que aquela proteína é uma proteína mitocondrial, esses recetores vão depois
posicionar a proteína junta da outra translocase que é a translocase TOM 40 que vai funcionar como um
canal passivo por onde passam todas as proteinas para o interior da mitocondria.

Independentemente das outras TOM’s serem diferentes é a TOM 40 que esta envolvida na passagem
propriamente dita.

Foi reconhecida, interagiu foi posicionada na TOM 40 e começa assim a ser encaminhada para o interior
da mitocondria.

Sendo que esta proteína tem um sinal para a matriz, o emparelhamento é feito em zonas em que a
membrana interna e a membrana externa das mitocôndrias estão muito próximas, mas á priori à uma
zona de proximidade suficiente para que a proteína consiga passar, não so pela translocase que esta
localizada ao nível da membrana externa da mitocondria mas também começa logo a ser translocada
usando a translocase utilizada ao nível da membrana interna.

Estas translocases tem agora designação de TIM’s porque estão localizadas na membrana interna. São
normalmente as TIM 23 e as 17 que estão envolvidas nesta passagem.

Para que esta passagem seja unidirecional e facilitada normalmente vai estar a ajudar este processo uma
ajuda de uma chaperon que esta localizada ao nível da matriz mitocondrial que continua a utilizar a
hidrolise de ATP ou seja a utilizar energia e o segundo ponto e vai faze lo porque ela tem a capacidade
de estar posicionada no sitio certo porque ela tem a capacidade de estar no sitio certo para puxar a
proteína que esta a entrar na matriz mitocondrial.

Vai estar no sitio certo, porque a chaperon esta a interagir com outro recetor que é uma TIM 44, para que
quando a proteína passar, se ligar a ela e mantê-la desenrolada e ajudar no fundo a puxa-la para a matriz
mitocondrial.

Quando e ela chega à matriz mitocondrial e as vezes ainda esta a passar através desta trabslocases ,
onde a sequencia sinal vai ser clivada por uma protéase que existe ao nível da matriz e que esta
vocacionada para quando reconhecer a sequencia sinal a clivar e então ficamos com a proteína normal
que em algumas circunstancias tem a capacidade de enrolar sozinha sendo que na maior parte das
vezes vai extir a ação de umas proteinas que chamamos chaperoninas vao promover o correto
enrolamento das proteinas que a partir desse momento passam a ser ativas e realizam a função para a
qual foram sintetizadas.

Algumas das proteinas que são sintetizadas na matriz mitocondrial com formação dos genes
mitocondriais por vezes há subunidades da proteína funcional madura ou seja proteinas que veiram do
citoplasma podem ter que se juntar a outras proteinas que vieram da matriz mitocondrial para originar
proteinas de estrutura quaternária. Ou seja nem todas as subunidades da proteína foram localizadas no
mesmo local da célula, pode ser uma subunidade do citosol outra da matriz e quando se reúnem formam
a proteína fina.

Targeting e sorting de proteinas para o espaço intermembranar da mitocôndria

Relativamente a marcação continuamos a ter uma marcação que marca a proteína para a matriz, há
depois algumas variações ao nível dos mecanismos de entrada e isso gerou pelo menos 3 vias possíveis
de entrada. A sequencia sinal para marcar a proteína para a matriz continua a existir.

Sequencia sinal vai ser reconhecida por aquelas TOM’s que estão localizadas ao nível da membrana
externa da mitocondria, esse reconhecimento vai afzer com que a proteína seja corretamente
posicionada junto à TOM 40 e tal pode gerar importação e a proteína ai vai começar a passar.

Essencialmente é esta proteína que faz a passam e esta passagem acontece em zonas onde a
membrana externa e interna estão muito próximas e portanto vamos ter novamente a participação de
proteinas internas , translocases a 23 e a 17.

Portanto continua a entrar, e a haver clivagem da sequencia sinal e contimua a existir a ação de uma
chaperon corretamente posicionada junto da translocase que faz importação desta proteína e vai estar
mais uma vez a interagir com uma TIM 44 que esta localizada na membrana interna, e tem que estar
bem posicionada para garantir que a proteína vai ser puxada para dentro.

Alem da marcação para a matriz estas proteinas vao ter uma sequencia mais interna que vai parar a
transferência da proteína.

Quando essa sequencia entra em contacto com o canal TIM 23/17 que esta a translocar a proteína para
o interior da matriz a transf para, e ao parar vai sofrer deslocamento ao nível da bicamada fosfolipídica e
fica posicionada ao nível da membrana interna.

No fim temos a extremidade aminica da proteína que tinha a sequencia sinal voltada para a matriz
mitocondrial e a extremidade carboxílica ao nível do espaço intermembranar.

Na outra via para a importação das proteinas mantém-se mais ou menos o mesmo principio, ou seja :

- Marcação da sequencia sinal que define que a proteína tem que ser encaminhada para a matriz
mitocondrial

- Toda a primeira etapa do processo é a mesma, entra através do canal localizado na membrana externa,
vai em simultaneamente começar a entrar através TIM 23/17 e por isso mantém-se o mesmo principio

Com uma chaperon a atuar e ajudar na interação , a puxar a proteína, mas esta chaperon agora não esta
a interagir com nenhum recetor localizado ao nível da membrana interna e é aqui a primeira diferença.

E isto e o suficiente para que toda a proteína entre na matriz mitocondrial, ou seja, aqui há uma
sequencia que para a transferência e dai a necessidade da chaperon estar num sitio que não vai atuar
em toda a proteína.

Quando entra a proteína para a matriz mitocondrial, o que é clivado na matriz é a sequencia sinal, a
proteína vai adquirir alguma estrutura com auxilio de chaperoninas, mas dessas interações ao nível da
proteína vao ser detetadas duas sequencias que marcam as proteinas para a membrana interna da
mitocondria, e estas vao ser reconhecidas por outros recetor que é o OXA 1.

OXA 1 vai interagir com as sequencias internas que definem que esta proteína tem que ir para a
membrana interna da mitocondria, e dessa interação o que acontece e que ele puxa a proteína para a
membrana.

As sequencias que marcam a proteína para a membrana, vao adquirir estrutura em helice e vao ficar ao
nível da bicamada fosfolipídica.

A grande diferença é mesmo a prenseça do OXA 1

Temos outra via :

Que também vai encaminhar as proteinas para a mebrana interna da mitocondria, com um
reconhecimento diferente.

Algumas das proteinas tem apenas sequencias internas que marcam a proteína para o interior da
mitocondria, mas já não tem a sequencia sinal que marca a proteína para a matriz.

Neste caso há proteinas que não tem a sequencia sinal, mas que tem varias sequencias internas ao nível
da proteína que define que é aquela proteína que tem de ser encaminhada para a mitocondria.

Sequências vao ser reconhecidas mais uma vez pelos recetores que estão localizados na membrana
externa, a proteína vai entrar através do poro geral e quando entra vao ser transportadas por outras
proteinas que estão localizadas ao nível da membrana interna mas agora de uma natureza diferente.

São então TIM 22 e a TIM 54 que não vao translocar a proteína na sua totalidade para a matriz
mitocondrial mas cada vez que reconhecem cada uma dessas sequencias internas da proteína essa
sequencia é como se funcionasse como sequencia ancoradora ao nível da membrana interna

Aqui relativemente ao moviment em termos de translocação, vai correr ao nível a membrana externa
mas não na totalidade ao nível da membrana interna.

Cada vez que é reconhecido pela interação com a TIM 22 e a TIM 54, esta sequencia vai difundir
lateralmente ao nível da bicamada da membrana interna e funciona como uma sequencia acoradora.

Posteriormente irá continuar a transferência.

EM SUMA:

Sequências sinais das 3 vias que se referiram.

Temos a via A e B temos sequencias sinais ao nível da extremidade aminica da proteína que depois vai
ser clivada.

No caso de ser apenas uma proteína que vai ser inserida apenas com uma helice, uma única sequencia
que para a transferência.

Uma proteína que tenham mais do que uma helice vao ter por norma as sequencias internas que vao ser
reconhecidas pela OXA1. Estas sequencias fazem com que a proteína entre totalmente na matriz e so
depois vao ser reconhecidas pela OXA1.

Na ultima via, referiu se que não tem sequencia sinal e nunca vai chegar a atingir a matriz porque fica
retida na membrana interna

Proteinas que vao para o espaço intermembranar e estas vao ter algumas semelhanças em termos da
interação inicial. Vamos ter outra vez a sequencia sinal que vai encaminhar a proteína para os recetores
de membrana externa ( TOM 20 e 22). A função destes recetores é posicionar a proteína junto a TOM 40
para que ela possa ser translocada. Temos uma zona de proximidade entre as membranas. A TIM 44 vai
estar a interagir com a TIM 23/17 e é esta que faz o movimento de trabslocaçao da proteína. Vai ocorrer
a clivagem da sequencia sinal e quando ocorre a clivagem é reconhecida uma sequencia que vai marcar
a proteína para o espaço intermembranar.

A diferença é que a sequencia sinal quando chega a zona que esta a ser translocada funciona como uma
sequencia a parar a transferência da proteína. Essa proteína vai difundir lateralmente porque há a TIM 44
que vai ajudar nesse processo.

Existe uma protéase que é uma enzima que esta inserida na membrana interna da mitocondria. Quando
a TIM 44 reconhece aquela sequencia que marca a proteína para o espaço intermembranar é parar a
transferência dessa proteína, há difiusao lateral ao nível da membrana interna. A protéase reconhece
então essa sequencia e vai processar a proteína, ou seja, vai cliva-la na zona adjacente ao sinal. Se
parou a via de transferência o resto da proteína vai começar a migrar para o espaço intermembranar.

Proteinas localizadas ao nível da membrana externa da mitocondria

- Tem uma sequencia sinal que as encaminha para a mitocondria e depois tem uma sequencia que para
a transferência. Ou seja, quando a proteína começa a ser transcrita para o interior da mitocondria há uma
sequencia que para a translocação e por isso a proteína vai difundir lateralmente ao nível da membrana
externa da mitocondria e fica posicionada a esse nível.

MARCAÇAO PARA O CLOROPLASTO

Plastos

Aqui é uma referencia em termos da origem dos cloroplasto que é a mesma referente há origem das
mitocôndrias mas a diferencia é que a bactéria que foi fagocitada, onde as células que a fagocitaram a
incorporaram na sua constituição e passaram a ter determinada capacidade.

Atualmente os cloroplastos podem ser formados a partir dos cloroplastideos, que são os plastos
percursores dos outros plastos produzidos ao nível da celula.

Aqueles que adquirem clorofila no seu interior e resulta pela exposição dos proplastos à radiação
luminosa, vao ficar a formar os tilacoides com a clorofila e foram designados cloroplastos.

Fazem fotossíntese onde estão inerentes diferentes fases.

O próprio cloroplasto também tem DNA cloroplastídeal e há uma serie de genes que codificam proteínas
dentro dos próprios cloroplastos.

Mas há outras que não são codificadas pelos genes dos cloroplastos e por isso tem de ser invocadas
por estes.

Mais uma vez a sequencia sinal para as proteinas dos cloroplastos esta localizada na extremidade
aminica, também vai ser removida depois de ocorrer tradução.

Muitas das sequencias sinais são ricas em :

Serina

Teonina

Tem também pequenos resíduos hidrofóbicos

Targeting e sorting de proteínas para os tilacoides

As sequencias sinais marcam as proteinas para o cloroplastos

Há duas vias que encaminham as proteinas para o interior dos tilacoides do cloroplasto

As sequencias sinais marcam as proteinas para o tilacoide., vai interagir com os recetores que são
TOC’S

Ao nível da membrana externa do cloroplasto, ao interagir vai entrar através de uma translocase e mais
uma vez em zonas que a membrana interna e externa estão próximas.

Vai passar também através de um complexo que funciona como translocase ao nível da membrana
interna.

Como entra para o estroma, clivagem da sequência sinal e é a mesma coisa que foi dito para a
mitcondria.

Quando a sequencia sinal é clivada, é logo seguida de uma segunda sequencia marcadora para que
marca a proteína para o tilacoide ( é umas membranas que estão empilhadas umas nas outras,
participam na fotossíntese, clorofila).

Uma proteína que tem sequencia sinal que marca a proteína para o estroma que é seguida de uma
sequencia sinal que marca a proteína para a membrana do tilacoide, então a sequencia sinal foi
reconhecida e fez com que a proteína entra-se

A sequencia sinal é clivada e vai expor a segunda sequencia marcadora que é a sequencia que marca a
proteína para o tilacoide.

O que acontece e que no estroma do cloroplasto vai haver uma SRP especifica do cloroplastos que
existe nos estroma ( partícula reconhedora do sinal). Vai reconhecer a sequencia sinal que marca a
proteína para o interior do tilacoide e o que vai fazer é ligar-se à sequencia sinal e vai conduzir a proteína
para a membrana do tilacoide.

Depois vai haver uma translocase localizada ao nível da membrana do tilacoide, que vai possibilitar a
entrada da proteína junto dessa translocase existe uma endoprotease que vai cortar a segunda
sequencia marcadora e a proteína vai adquirir a sua correta conformação e pode desempenhar a sua
função no interior do cloroplastos.

Neste processo também há ação das chaperons que ajudam a proteína a entrar.

Na segunda via, são normalmente metaloproteínas e que tem na mesma forma sequencia sinal para o
estroma do cloroplastos, depois a segunda sequencia marcadora para a membrana dos tilacoides mas
agora a diferença e que nestas proteinas há dois resíduos um de argininina ( a iniciar a extremidade de
sequencia marcadora para os tilacoides) e esses dois resíduos de arginina em simultâneo com
gradientes de pH que existem ao nível do estroma do cloroplastos vao fazer com que estas proteinas se
liguem ao estroma.

As proteinas entram nos diversos destinos desenroladas, em que a proteína adquire o seu folding ao
nível do estroma e depois vai entrar num canal com uma conformação diferente que e indicativo que a
proteína já vai enrolada. Quando entra para o tilacoide , os dois resíduos de arginina são clivados e a
proteína fica funcional e desempenha a sua função ao nível dos tilacoides.

Peroxisssoma

Organitos celulares que são parecidos com lisossomas e que ao nível do nosso organismo, que existem
em grande quantidade no fígado. Catalase existe no peroxissoma.

Reaçoes de oxidação, metabolismo de ácidos gordos.

Biogénese de peroxissomas

Vao ser inseridas proteinas especificas da membrana do peroxissoma, e a partir do momento em que
essas proteínas vao ser inseridas nessa membrana, significa que passa a ser reconhecido como uma
espécie de peroxissoma para onde podem ser importadas as proteinas que estao a ser sintetizadas ao
nível do citosol

Muitas vezes é o próprio peroxissoma que já esta maduro e tem a capacidade de se dividir e originar
dois peroxissomas que depois aumentam o seu volume, pelo mesmo processo. Proteinas que são
sintetizadas no citosol, tem os sinais para o peroxissoma e vao encaminhadas para lá.

Targetting e sorting de proteínas peroxissomais

Independentemente dos modelos biogénicos dos peroxissomas, a verdade é que as proteinas também
vao ser encaminhadas para este organito.

Ao nível de sequencias que marcam as proteinas para os próprios peroxissomas estao localizadas ao
nível da extremidade carboxílica, e outras estao localizadas amina.

As sequencias marcadoras marcam a proteína para ser encaminhada para o peroxissoma e vao fazer
parte da própria proteína que vai estar funcional do processo.

Pex 1 : marca a proteína para o peroxissima

Estas sequencias sinais vao ser reconhecidas por recetores que existem solúveis ao nível do citoplasma
que se vao ligar ao nível do citoplasma e são estes recetores que vao encaminhar a proteína para a
mebrana do peroxissoma.

Ao chegar a membrana vao interagir com proteinas que vao ter um papel de translocases e que são
todas elas as PEX, interagem com estas translocases, vao entrar para o lumen do peroxissoma, não
perdem a sequencia sinal e vao adquirir o correto enrolamento e vao desempenhar a sua função.

Estes recetores são citosólicos, depois vao interagir com outros recetores ao nível da membrana do
peroxissoma também com designações PEX 2, 10, 12, 14,

Núcleo

Pela natureza do núcleo tem que haver sinais muito específicos, pois nem tudo pode chegar ao núcleo,
porque e o organito que guarda a informação genética da célula.

Os poros nucleares (complexo do poro nuclear) tem um diâmetro razoável e constitudo por varias
proteinas, e é formado pelo que chamos os ‘’cestos de basket’’ , e essas proteinas da sua constituição,
que junto do poro estao associados filamentos citoplasmáticos e que tem a função de ajudar a
passagem das substancias.

Este poro e constitudo por uma serie de proteinas que muitas delas são designadas por purinas? E há
uma serie de repetições do aminoácido de felinanina e glicina. Vai aparecer depois como FG.

Tem um papel importante de reconhecer os sinais para que as proteinas sejam libertadas para o exterior
do núcleo.

No núcleo tem varias sequencias sinais, são múltiplas.

- Transporte através dos complexos dos poros nucleares

Foi feita uma experiencia em que no no citoplasma da celula temos uma fluorescência e que
corresponde a uma proteína que so encontra ao nível do citoplasma da célula. Ou seja se a proteína for
normal ela vai estar so localizada ao nível do citoplasma das células por esse motivo ela não aparece
muito no núcleo. Se se fizer uma proteína quimérica em que se utilize essa mesma proteína mas se
adiciona uma sequencia sinalizadora para o núcleo (NLS), a verdade é que essas proteinas vao todas
para o núcleo.

Aqui temos a versão da mesma proteína, mas agora quimérica porque se fundiu a sequencia sinalizadora
para o núcleo, e isso e o suficiente para que ela entre para o núcleo.

Esta la a sequencia sinal e a célula sabe que tem que encaminhar a proteína para o núcleo.

- Mantem se com um conjunto de 7 aminoacidos para a sequencia sinal

Distribuição de Ran/GTP junto ao NCP

Ao nível de transporte nuclear, já falamos de exportação de RNA’s que são sintetizados no núcleo mas
depois tem que ir participar na tradução.

Muitas das vezes o que regula a passagem das substancias desses RNA’s , as partículas proteicas
associadas ao RNA e depois a sua reciclagem que não são necessárias no citoplasma

Muitas das vezes o transporte ao nível do núcleo, seja importação seja exportação há fosforilação a
funcionar como interruptores.

Há proteólise que também acontece no enderaçemento das proteinas nos outros organitos, mas ao nível
da importação das proteinas para o nucleoplasma há outro elemento importante e que tem a ver com
variações das RAN’s

As RAN’S estao associadas ao GTP.

Há gradientes de concentração entre o citoplasma e os complexos da proteína associada à molécula de

GTP.

Normalmente ao nível do núcleo, o nucleoplasma é mais rico em RAN’s ligadas a GTP e ao nível do
citoplasma é normalmente mais rica em RAN ligada a GDP

Por outro lado, há uma variação entre outras enzimas no nucleoplasma:

GEF : fator proteico que promove a troca rápida entre GDP e GTP, vai fazer com que as RAN’S que estao
associadas ao nucleoplasma estejam ligadas ao GTP.

GAP: junto a face citosólica do poro nuclear, e a é designada como a proteína ativadora de GTPase, faz
com que rapidamente quando as RAN’s atingem o citoplasma junto ao poro nuclear estejam intactas a
GDP e sejam trocadas rapidamente pelas GTP.

Gradiente de concentração mais concentrado junto a zona citosólica do poro nuclear e temos a RAN
ligada à GTP

Importação nuclear

Utiliza-se a variação de concentração das RAN’s ou seja elas estao ligadas a GTP, e agora há preferência
em relação há molécula se e no nucleoplasma ou no citosol.

Podem também ligar-se a outras proteinas que podemos designar de importinas

Importinas : proteinas que de alguma forma vao reconhecer as sequencias sinalizadoras de proteinas
que tem que ser encaminhadas para o núcleo.

Sequencias sinais : NLS? A importina liga-se a esta sequencia na proteína que vai funcionar como a
carga.

Fez-se reconhecimento entre importina e proteína carga e que é feita através da sequencia NLS.

O complexo entra para o poro nuclear

Há um papel importante das proteinas que estao localizadas na zona central do poro nuclear que se
pensa que tem um papel importante em termos de interação neste complexo entre importina proteína
que esta a ser transportada.

E que são designadas são chamadas nucleoporinas, e o FG ( varias repetição fenilalanina e glicina)
aminoácidos que aparecem repetidos aqui

Vai depois ocorrer a formação das RAN’s ligadas à GDP e que esta sempre a contecer ao nível do
nucleoplama.

É a RAN ligada à GTP que vai interagir com a importina altera a sua configuração e deixa de ter afinidade
para a carga que esta a transportar e a proteína que esta a ser transportada, fica livre no nucleoplasma e
pode desempenhar a sua função

Desta ligação com a RNA GTP ao alterar a conformaçºao faz com que não tenha muita estabilidade
para estar no nucleoplasma e vai encaminha-la novamente para o poro nuclear mas agora para ocorrer a
exportação.

Quando a RAN ligada ao GTP e ligada a importina é fundamental que deixe de acontecer para libertar a
importina para que depois seja possível a RAN ter o seu papel ativo

Aqui vai atuar a GAP que vai ter o papel de passar a GDP- GTP e a importina fica livre e as RAN’s voltam
a estar a elevadas concentrações novamente.

- RAN- GDP + ABUNDANTE AO NIVEL DO NUCLEOPLASMA; RAN – GTP – MAIS ABUNDANTE AO

NIVEL DO CITOSOL : é fundamental para a importação das proteinas.

Regulação da importação nuclear de fatores de transcrição

Importinas e exportinas (canderinas)

Proteolises

Fosforilações

Algumas das proteinas que vao ser importadas para o núcleo são proteinas que tem como função atuar
ao nível da ttanscriçao ( ou seja fatores de transcrição)

É fundamental que esta importação haja uma relação muito especifica a relação da NLS com as
proteinas, pois se elas entrarem a mais no núcleo podem ser prejudicais para os mecanismos genéticos,
e se os fatores não reagirem no nucleoplasma a transcrição nunca iria ocorrer

Não é uma regulação direta ao nível da expressão génica mas de alguma forma pode influenciar a forma
como a expressão génica ocorre.

Pode influenciar a eficiência da transcrição e é essencial a sua correta passagem para o interior do
núcleo.

Exportação nuclear

São as próprias proteína que vao influenciar a exportação e importação.

São importantes as importinas, as exportinas, as proteólises , mas ao nível deste contexto o que é
mesmo importante para um bom transporte são os gradientes de concentração das RAN’S ligadas ao
GDP e ao GTP que existem no nucleoplasma e das GAPS ao nível do citosol, aspectos que influenciam a
forma como estes mecanismos vao ser eficientes.

Aqui no núcleo também há exportação relaciona-se com os mesmos fatores:

RAN’S ligadas ao GDP

RAN’S ligadas ao GTP

Há sequencias exportadoras que são independentes destas proteinas RAN’s

Aqui interessa-nos que a exportação de RNAt, RNAm, RNAr preferimos genericamente e que são
fundamentais para estarem envolvidos ao nível da tradução.

Aqui na tabela, as importinas ou seja proteinas que existem a nível do citosol que vao reconhecer a
sequencia NLS

E as exportinas que reconhecem as sequencias que fazem com que as proteinas saiam do núcleo

Carioforinas : importinas e exportinas ( reconhecimento de sinais relativamente ao que se vai passar ao

nível dos poros nucleares.